O aumento da obesidade infantil tem sido correlacionado com a prevalência da puberdade precoce. Em animais pré-puberes verifica-se que a administração da dieta hiperlipídica induz a antecipação da puberdade. Estudos sugerem que a leptina pode influenciar o eixo reprodutivo por meio de sua ação em neurônios que expressam kisspeptina, no hipotálamo. Uma subpopulação de neurônios kisspeptidérgicos do núcleo arqueado coexpressa a dinorfina e neuroquinina B, que exercem uma ação autorreguladora sobre a secreção de kisspeptina. Considerando que a leptina, a kisspeptina, neuroquinina B e dinorfina são apontados como reguladores do início da puberdade e da função reprodutiva, este trabalho investigou como a dieta hiperlípidica (HFD) pode influenciar esses moduladores ao longo do início do desenvolvimento puberal e após a maturação sexual. Camundongos fêmeas Kiss1-hrGFP foram tratadas com a HFD ou dieta controle a partir do desmame e foram decapitadas aos 28, 32 e 63 dias (Diestro II) e o sangue coletado para dosagem plasmática de leptina, LH e estradiol. Um segundo grupo de fêmeas, tratadas com HFD ou dieta controle, receberam com 32 e 63 dias (Diestro I) uma injeção intraperitoneal de leptina (0,5 mg/kg) ou de veículo, 45 minutos após a injeção foram anestesiadas e submetidas à perfusão cerebral. Cortes hipotalâmicos foram utilizados para realização da técnica de imunoistoquímica para dupla marcação: Kiss1-p-STAT3/ p-STAT3-CART/ Kiss1-Dyn e Kiss1-NKB. Verificamos que a HFD administrada após o desmame, quando comparada à dieta controle, antecipou a abertura vaginal, o primeiro estro e o ínicio da ciclicidade em fêmeas Kiss1-hrGFP. Como indicativo de ativação do eixo reprodutivo neste grupo, foi observado aumento do peso do útero e ovário, aos 32 dias. Esses efeitos estiveram associados com: a) o aumento da concentração plasmática de leptina; b) aumento da ativação de p-STAT3 no núcleo arqueado (ARC) e c) aumento de p-STAT3 em neurônios Kiss1-hrGFP e em neurônios CART do ARC em resposta ao estímulo da leptina. A HFD não afetou a colocalização entre Kiss1-Dyn e Kiss1-NKB em fêmeas no início do desenvolvimento puberal. Em fêmeas Kiss1-hrGFP (63 dias) a administração da HFD por 6 semanas não alterou a regularidade do ciclo estral, houve elevação da leptina plasmática associada com diminuição da expressão da p-STAT3 no ARC em resposta ao estímulo com leptina, sem alterar a responsividade dos neurônios Kiss1-hrGFP a este hormônio. Em conclusão, 9 os resultados demonstram que a antecipação da puberdade induzida pela HFD está associada com o aumento da ação central da leptina, que ao estimular o sistema kisspeptidérgico, direta ou indiretamente, por meio de neurônios CART, pode aumentar o tônus excitatório sobre o eixo reprodutivo. A administração da HFD após o desmame (6 semanas) promoveu uma redução à resposta da leptina no ARC na vida adulta, porém não afetou a responsividade dos neurônios Kiss1-hrGFP a este hormônio e nem a regularidade do ciclo estral nas fêmeas Kiss1-hrGFP. Em conjunto, esses resultados indicam que as ações da leptina nesses neurônios foram preservadas, mesmo com a resistência parcial de suas ações no ARC. Estudos adicionais deverão ser realizados para se avaliar os efeitos a longo prazo da HFD sobre o eixo reprodutivo. / The increase of childhood obesity has been correlated with the early onset of puberty. In prepubertal animals it appears high fat diet (HFD) induces anticipation of puberty. Several studies have indicated that the effect of leptin on reproductive axis can be mediated by its action on Kiss1 neurons in the hypothalamus.A subpopulation of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus also shows co-expression of neurokinin B and dynorphin A,presenting a self-regulatory action kisspeptin secretion. Since leptin, kisspeptin, neurokinin B and dynorphin are identified as regulators of puberty onset and reproductive function, this study investigated the influence of high fat diet on these modulators along puberty onset and after sexual maturation. A group of Kiss1-hrGFP-female mice received the HFD or regular chow after weaning. The Kiss1-hrGFP females were decapitated at 28, 32 and 63 days old (Diestrus II) and blood was collected for measurement of plasma leptin, LH and estradiol. A second group of females, treated with HFD or chow after weaning, received at 32 and 63 days old (Diestrus I) an intraperitoneal injection of leptin (0.5 mg / kg) or vehicle, and 45 minutes after they were anesthetized and subjected to cerebral perfusion. Immunohistochemistry was performed for double labeling: Kiss1-p-STAT3/ p-STAT3-CART/ Kiss1-Dyn and Kiss1-NKB in the hypothalamus. It was found that, compared to controls; the HFD anticipated the vaginal opening, the first estrus and the beginning of cyclicity in Kiss1-hrGFP females. An increase in the uterine weight and ovaries, confirmed the activation of reproductive axis in the HFD group at 32 days old. These effects were associated with: a) an increase in plasma leptin concentration; b) the activation of p-STAT3 in the arcuate nucleus (ARC) and c) the increase of p-STAT3 in Kiss1-hrGFP neurons and in CART neurons of the ARC in response to the stimulus of leptin. HFD didnt affect colocalization between Kiss1-Dyn and Kiss1-NKB in females mice at hte pubertal onset . Kiss1-hrGFP female mice (63 days old), exposed to HFD for 6 weeks,exhibited regular estrous cycles, increased plasma levels of leptin associated with a decreased p-STAT3 expression in the ARC after leptin stimulation, with no changes in the responsiveness of Kiss1-hrGFP neurons to this hormone, compared to controls. In conclusion, 11 the results demonstrate that the early puberty induced by the HFD is associated with increased central leptin action, by stimulating the kisspeptidergic system, directly or indirectly, through CART neurons that can increase the excitatory tone in the reproductive axis. The administration of HFD after weaning (6 weeks) induced a decrease on the response to leptin in the ARC in adulthood, but without changes in the responsiveness of Kiss1-hrGFP neurons to this hormone and the regularity of the estrous cycle in Kiss1-hrGFP females. Taken together, these results indicate that the actions of leptin in kisspeptin neurons were preserved after 6 weeks of HFD, despite the partial resistance to this hormone in the ARC. Additional studies should be conducted to evaluate the long-term effects of HFD in the reproductive axis.

Este estudo avaliou o crescimento físico e desenvolvimento puberal de crianças e adolescentes de 10 anos a 18 anos e 6 meses com fissuras labiopalatinas (FLP). Foi realizado um estudo descritivo transversal, de uma amostra com 346 pacientes com fissuras labiopalatinas, atendidas no ambulatório do Hospital de Reabilitação de Anomalias Craniofaciais, da Universidade de São Paulo (HRAC-USP), Bauru, São Paulo. Os pacientes foram analisados separadamente por gênero e foram agrupados de acordo com o tipo de fissura em três grupos: Grupo 1 - fissura de lábio isolado (FLI); Grupo 2 - fissura de lábio e palato (FL+P); e Grupo 3 - fissura de palato isolado (FPI). Foram excluídos os pacientes com síndromes associadas, ou com doenças que comprometam o estado geral e o crescimento. Foram obtidas medidas de peso e estatura. Para o cálculo do percentil e do escore z da estatura e do Índice de Massa Corporal (IMC) foi utilizado o programa WHO AnthroPlus (version 1.0.4, 2009). O estadiamento puberal foi avaliado segundo os Estágios de Tanner. Para comparar as estaturas entre os pacientes dos três grupos de FLP, nos diferentes Estágios de Tanner, foi utilizado o teste de ANOVA. O IMC dos meninos e das meninas, a frequência de puberdade atrasada nos meninos e meninas e a frequência de puberdade precoce nas meninas, com FLP, foi semelhante ao esperado para adolescentes da população geral. A estatura das meninas com FPI foi significantemente menor que a das meninas com outros tipos de FLP, mas somente nos estágios finais do desenvolvimento puberal. Não foram encontradas diferenças significantes entre as estaturas dos meninos com diferentes tipos de FLP, para a faixa etária estudada. / This study evaluated growth and puberty in children and adolescents from 10 to 18 years and 6 months of age with cleft lip and palate(CLP). A descriptive cross-sectional study of a sample of 346 patients with cleft lip and palate treated at the Hospital for Rehabilitation of Craniofacial Anomalies, University of São Paulo (HRAC-USP), Bauru, São Paulo was performed. Patients were analyzed separately by gender and were grouped according to the type of cleft into three groups: Group 1 - isolated cleft lip (ICL); Group 2 - cleft lip and palate (CL+P); and Group 3 - cleft palate alone (ICP). Patients with associated syndromes or diseases that compromise the overall status and growth were excluded. Measurements of weight and height were obtained. To calculate the percentile and z-score for height and Body Mass Index (BMI) WHO AnthroPlus program (version 1.0.4, 2009) was used. The pubertal stage was assessed according to Tanner stages. For comparison of height among three groups of patients with CLP in different stages of Tanner, the ANOVA test was used. The BMI of boys and girls, the frequency of delayed puberty in boys and girls and the frequency of precocious puberty in girls with CLP were similar to those expected for the general population of adolescents. The height of girls with ICP was significantly lower than girls with other type of CLP, but only in the final stages of pubertal development. No significant differences were found between the height of children with different types of FLP, for the age group studied.

Três experimentos foram desenvolvidos para avaliar protocolos hormonais de sincronização de estro e ovulação em fêmeas Nelore, extratificadas nas três principais categorias de fêmeas (vacas secas, novilhas e vacas paridas) comumente encontradas nas propriedades. Os experimentos possuíam objetivos de comparar a performance reprodutiva das categorias supra citadas, sobre a taxa de detecção do estro, taxa de prenhez na IA (exp. I e II) e/ou IATF (exp III) e no repasse, de fêmeas submetidas a protocolos de sincronização do estro e ovulação. EXP I: Foram utilizadas vacas Nelore não lactantes (n=286), blocadas em um esquema fatorial 2x3, e receberam no D0 o CIDR e 2mg de benzoato de estradiol (BE). O CIDR permaneceu por 5 dias (D5) ou 7 dias (D7), no dia da remoção do CIDR, as vacas receberam PGF2&alpha; (12,5mg, 25mg ou 50mg), formando os tratamentos: 5d12,5mg, 5d25mg, 5d50mg, 7d12,5mg, 7d25mg e 7d50mg. O estro foi detectado em 83.2% (238/286) das vacas, onde D7 (88,0%) foi superior (P<0,05) ao D5 (78,7%). Não houve diferença no tempo médio para detecção do estro que foi de 70,1 ±17,2 h. A taxa de concepção não diferiu entre os tratamentos. A taxa de prenhez à IA foi maior (P<0,05) para o D7 (54,2%) quando comparado ao D5 (39,6%). A taxa de prenhez no repasse e na prenhez total não diferiram entre os tratamentos. EXP II: Utilizou-se 407 novilhas Nelore pré-puberes, blocadas em um esquema fatorial 4x2, as novilhas receberam no D0 o CIDR e 2 mg de BE, o CIDR permaneceu por 5, 7, 9 ou 11 dias. No dia da remoção do CIDR, as novilhas receberam 25mg de PGF2&alpha; e 300 UI eCG. Além disso metade das novilhas receberam 1 mg de BE 48 horas após a retirada do CIDR. A detecção do estro foi maior (P<0,05) para as novilhas que receberam BE (87,3%) quando comparado aos s/BE (54,6%). O tempo médio para detecção do estro foi de 68,1 ±17,3 h. A taxa de concepção não foi influênciada pelos tratamentos, porém a taxa de prenhez da inseminação da sincronização foi maior para o grupo BE (18,8%) quando comparado ao s/BE (12,4%). A taxa de prenhez final não diferiu entre os tratamentos e foi de 62,3%. EXP III: Foram utilizadas vacas Nelore lactantes (n=191), divididas em dois tratamentos: 1xPGF-5d (as vacas permaneceram com o CIDR por 7 dias, sendo que 25mg de PGF2&alpha; foi aplicada no D5); 2xPGF-0/7d (as vacas permaneceram com o CIDR por 7 dias, sendo realizadas duas aplicações de 12,5mg de PGF2&alpha;, no D0 e D7). O CIDR foi retirado no D7, e aplicou-se 0,3 ml de ECP e 300 UI de eCG. Após 50 horas todas as vacas foram submetidas à IATF. No momento da inserção do CIDR 24% das vacas estavam ciclícas. O estro foi detectado em 54,45% (104/191) das vacas, sendo similar entre os tratamentos. O tempo médio para detecção do estro foi de 36,4 ± 8,7 h. Não houve diferença na concepção à IATF, que foi de 59,5 e 59,6% para os tratamentos 1xPGF-5d e 2xPGF- 0/7d, respectivamente. A taxa de prenhez ao final da estação de monta não diferiu e foi de 82,9% para 1xPGF-5d e 86,6% para 2xPGF-0/7d. Em todos os experimentos foi realizada a detecção do estro, com o auxilio de rufiões por até 5 dias após a remoção do CIDR, sendo novamente detectado 10 dias após por um periodo de até 10 dias. Os animais dos exp. I e II foram inseminadas de acordo com o protocolo AM/PM. O diagnóstico de gestação foi realizado de acordo com a caracteristica de cada experimento, mas sempre com o objetivo de identificar e quantificar a origem da prenhez (IA ou repasse). Em vacas Nelore não lactantes, a utilização de protocolos de 7 dias, possui uma performance reprodutiva melhor do que 5 dias de permanência do CIDR. Em novilhas pré-puberes a utilização de BE 48 horas após a remoção do CIDR, aumentou a taxa de detecção de estro, impactanto diretamente no incremento da taxa de prenhez à IA. A utilização do protocolo 7d BE+CIDR, apresenta bons resultados reprodutivos, sendo que podemos reduzir o número de manejos sem o comprometimento da performance reprodutiva, realizando a aplicação de 12,5mg na inserção e na retirada do CIDR. / Three experiments were designed to evaluate estrus synchronization protocols in Nellore females of three different class (dry cows, heifers and lactating cows) commonly found in properties. The experiments had aim to compare a reproductive performance of the categories mentioned above, at the estrus detection, pregnancy rate at AI (exp. I and II) or TAI (exp. III), pregnancy rate at rebreeding, of females submited to estrus synchronization program and ovulation. EXP I: Nonlactating Nellore cows (n=286), were randomized in a 2x3 fatorial arrangement. All animals received the CIDR and 2 mg of EB at D0, the CIDR remained for 5 days (D5) or 7 days (D7). At day of CIDR removal, cows received PGF2&alpha; treatments (12.5mg, 25mg and 50mg), the treatments followed: 5d12.5mg, 5d25mg, 5d50mg, 7d12.5mg, 7d25mg and 7d50mg. Estrus was detected in 83.2% (238/286) of cows, where D7 (88.0%) was higher (P<0.05) than D5 (78.7%). The onset of estrus did not differ among groups and was 70.1 ± 17.2 hours. Conception rate did not differ among treatments. The pregnancy rate at AI was greater (P<0.05) for D7 (54.2%) compared to D5 (39.6%). The pregnancy rate at rebreeding and overall pregnancy did not differ among treatments. EXP II: Prepubertal Nellore heifers (n=407), randomized in a 4x2 factorial arrangement. Heifers received CIDR and 2 mg EB at D0, CIDR remained for 5, 7, 9 or 11 days. On day of CIDR removal, heifers received 25mg of PGF2&alpha; and 300 IU of eCG. Half of the heifers received 1 mg of EB 48 hours after CIDR removal. Estrus detection was greater in EB (87.3%) when compared to NoEB (54.6%). The onset of estrus did not differ among treatments and was 68.1 ± 17.3 hours after CIDR removal. Conception rate was similar among treatments. The pregnancy rate at AI of synchronization was higher for EB (18.8%) compared with NoEB (12.4%). The final pregnancy rate did not differ among treatments. EXP III: Lactating Nellore cows (n=191) were randomized in two groups, 1xPGF-5d (cows received CIDR for 7 days, and 25 mg of PGF was applied on D5); 2xPGF-0/7d (cows received CIDR for 7 days, and two injections of 12.5mg of PGF, on D0 an D7). CIDR was removed on D7, and was associate with injections of 0.3 ml ECP and 300 IU of eCG. TAI was performed 50 h after CIDR removal. Estrus was detected in 54.45% (104/191), and did not differ between groups. The onset of estrus did not differ, and was 36.4 ± 8.7 hours after CIDR removal. The conception rate at TAI did not differ and was 59.5 and 59.6% for 1xPGF-5d and 2xPGF-0/7d, respectively. The final pregnancy rate at the end of breeding season did not differ and was 82.9% for 1xPGF-5d and 86.6% for 2xPGF- 0/7d. All experiments were performed estrus detection with teasers for 5 days after CIDR removal, and was detected again after 10 days, and performed for 10 days. All animals of exp. I and II were inseminated according AM/PM protocol. The pregnancy diagnosis was performed according to caracteristic of each experiment, but always with the goal of identifying and quantifying the origin of pregnancy (AI or rebreeding). Data were analyzed using the statistical program SAS 9.9, for binominal variables we used GLIMMIX procedure and MIXED procedure for continuous variables. In nonlactating Nellore cows, the use of protocols for 7 days, has a better reproductive performance than 5 days of CIDR. In prepubertal heifers using BE 48 hours after CIDR removal, allows for greater estrus detections and increased number of inseminations, and increasing the pregnancy rate at AI. The use of 7d EB+CIDR program yields good reproductive results, and we can reduce a number of handlings without reduce a reproductive performance.

O objetivo deste estudo foi avaliar o fornecimento crônico de leptina recombinante ovina (oLeptina) e do nível de energia da dieta na idade, peso vivo (PV), escore de condição corporal (ECC) e composição corporal à puberdade, assim como avaliar seus efeitos no desenvolvimento dos folículos ovarianos e no consumo de matéria seca (CMS). Foram utilizadas 36 novilhas da raça Nelore, com média de 18 a 20 meses de idade, 276,1 ± 17,9 kg PV e ECC de 4,7 ± 0,46, distribuídas aleatoriamente em três tratamentos: A) Dieta de alta energia; B) Dieta de baixa energia, BL) Dieta de baixa energia com administração subcutânea de oLeptina. Os animais foram alojados de 2 baias coletivas de acordo com a dieta oferecida. As dietas foram formuladas para promover um ganho de peso médio diário (GMD) de 0,3 kg PV/dia e 1,0 kg PV/dia. O controle de consumo foi feito através da pesagem diária das sobras e manutenção dessas entre 5 e 10% do total oferecido. Os animais foram pesados e tiveram o ECC avaliado duas vezes por semana, para acompanhamento do GMD. Foi administrado 12 g de óxido de cromo/animal/dia por deglutição forçada por 10 dias, com coleta de amostras de fezes, dieta e sobras nos últimos 5 dias, para estimativa do consumo individual de MS e energia, através da determinação do cromo nas fezes e do FDNi nas fezes, dietas e sobras. O grupo BL recebeu 4,8 µg de oLeptina/kg PV, via subcutânea, duas vezes ao dia (6:00 e 18:00 horas) por 56 dias, enquanto os grupos A e B receberam 2 ml de solução salina. O diâmetro máximo do folículo dominante (FD) e a presença de corpo lúteo (CL) foram avaliados através de ultrassonografia transretal duas vezes por semana, até o momento da puberdade. No momento da ultrassonografia, foram coletadas amostras de sangue, por punção da veia jugular, para dosagem da concentração sérica de progesterona. A idade à puberdade foi considerada como a idade na primeira detecção de um CL, confirmado como sendo funcional por dosagem de progesterona acima de 1 ng/ml. Após a confirmação da puberdade os animais foram abatidos para estimativa da composição corporal, através da determinação do teor de água em cortes da 9a-10a-11a costelas. O maior teor de energia na dieta reduziu a idade e aumentou o ECC à puberdade (P<0,05). A leptina não teve efeito na idade, PV ou ECC à puberdade (P>0,05). Tanto o maior consumo de energia quanto a leptina aumentaram a velocidade de crescimento e determinaram maior diâmetro médio do FD (P<0,05), entretanto a velocidade de crescimento do FD do grupo BL voltou a diminuir, igualando-se à do grupo BL, após cerca de 30 dias de tratamento, comportando-se de forma quadrática à análise de regressão. O maior consumo de energia determinou maior teor de extrato etéreo e menores teores de proteína, matéria seca e matéria mineral no corpo vazio, além de maior espessura de gordura subcutânea e área de olho de lombo na carcaça (P<0,05). A aplicação de leptina não alterou a composição corporal das novilhas à puberdade (P>0,05). Não houve diferença no CMS (kg MS/dia) entre os grupos, entretanto o grupo A teve menor CMS em % PV, além de maior consumo de energia digestível, metabolizável e líquida para ganho (P<0,05). A leptina não reduziu o CMS das novilhas (P>0,05) tanto em kg MS/dia quanto em % PV. A energia acelera a obtenção da puberdade e altera a composição corporal à puberdade de novilhas zebuínas. A aplicação de leptina não acelerou a obtenção da puberdade de novilhas zebuínas em baixo consumo de energia, mas aumentou temporariamente a taxa de crescimento folicular desses animais. / This study was carried out to evaluate the effects of chronic administration of recombinant ovine leptin (oLeptin) and the energy level of the diet on age, body weight (BW), body condition score (BCS) and body composition at puberty, as well as to evaluate its effects on dominant follicle (DF) development and dry matter (DM) intake. Thirty six Nellore heifers, 18 to 20 months old, with 276.1 ± 17.9 kg BW and BCS of 4.7 ± 0.46 were randomly distributed into three treatments: H) High energy diet; L) Low energy diet; LL) Low energy diet with subcutaneous administration of oLeptin. Heifers were housed in two collective pens according to the diet offered. Diets were formulated to promote an average daily gain (ADG) of 0.3 kg BW/day and 1.0 kg BW/day. Intake was controlled daily by weighting the orts and keeping it between 5 and 10% of the total offered. Heifers were weighed and had their BCS was evaluated twice weekly, in order to control the ADG. Heifers received 12 g of chromic oxide/animal/day by forced swallowing for 10 days, while feces, diet and orts were sampled in the last 5 days, in order to estimate individual DM and energy intake, which was done by feces determination of chromic oxide, and diet and, feces and orts determination of iNDF. The LL group received 4.8 µg oLeptina/kg BW, subcutaneously, twice a day (at 06:00 and 18:00), for 56 days, while H and L groups received 2 ml of saline solution. Maximum DF diameter and presence of corpus luteum (CL) were evaluated twice weekly by transrectal ultrasound, until heifers achieved puberty. At the time of ultrasound evaluation, blood was sampled by jugular venipuncture for serum progesterone determination. Age at puberty was considered as age at first detection of a CL confirmed to be functional by serum progesterone above 1 ng/ml. After puberty confirmation heifers were slaughtered for body composition estimation, which was done by water determination on 9a-10a-11a rib cuts. High energy intake reduced age and enhanced BCS at puberty (P<0.05). Leptin administration did not affect age, BW or BCS at puberty (P>0.05). The high energy intake as well as leptin administration accelerated the DF growth and determined greater DF diameter (P<0.05), however the rate of growth on the LL group decreased after around 30 days of treatment equaling the rate of growth of the L group, and behaving in a quadratic manner at regression analysis. High energy intake enhanced ether extract and lowered protein and minerals proportion on empty body (P<0.05). It also enhanced carcass subcutaneous fat and the longissimus muscle area (P<0.05). Leptin administration did not alter the body composition of heifers at puberty (P>0.05). There was no difference on DM intake (kg DM/day) between groups, however the H group had higher DM intake in terms of % BW, as well as higher intake of digestible, metabolizable and net energy for gain (P<0.05). Leptin did not reduce DM intake neither in terms of kg BW/day nor % BW (P>0.05). Energy intake accelerates the onset of puberty and alters body composition at puberty of zebu heifers. Leptin administration did not accelerate puberty onset of zebu heifers receiving low energy diet, but temporarily enhanced the follicular growth rate of these animals.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_viviane_rohrig_rabassa.pdf: 822002 bytes, checksum: 6cb1224c07c478b2394f81620c16151f (MD5) Previous issue date: 2012-02-28 / The somatotropin (ST), which has its effects mediated by insulin-like growth factor I, has positive effects on gametogenesis and steroidogenesis, and can be used as an alternative treatment for infertile men. Exogenous somatotropin supplementation improves testicular development, gametogenesis and steroidogenesis, anticipating onset of puberty. However, no studies aiming to determine the mechanisms of action of this hormone on testicular function and age at puberty in healthy young boars were performed. Thus the hypothesis of this study were: 1) prepubertal male pigs receiving exogenous ST have accelerated testicular growth due to the mitogenic actions of IGF-I; 2) an increase in gametogenesis and teroidogenesis with consequent antecipation of age at puberty and 3) improvement of semen quality after the establishment of puberty. To confirm this hypothesis four experiments were performed. The Experiment 1 aimed to determine the interval between applications of porcine ST (pST), based on the determination of IGF-I. Experiment 2 aimed to measure the proliferation of testes cells in boars subjected to pST administration, as well as its effect on the metabolism. In Experiment 1, the mean concentration of serum IGF-I for pST Group was higher (P<0.05) than for Control Group, with differences between groups within the first three days after injection, determining the interval between injection to be used in the following experiments. In Experiment 2 there was a increase in the testicular weight (P=0.06) in pST Group, but a decrease in the number of seminiferous tubules and sertoli cells in this group (P<0.05). Experiment 3 aimed to determine the effect of pST administration during the prepubertal period on the metabolic profile, testicular development and anticipation of the sexual maturity. The pST Group had higher circulating concentration of testosterone after five months of age (P<0.05), which was concomitant with the onset of reproductive activity. These boars also had higher libido (P<0.05). The Experiment 4 aimed to determine the effect of pST on the semen quality after the establishment of puberty. It was observed an increase in vigor, volume, total sperm concentration and total number of inseminating doses (P<0.05). Still, the pST Group had a higher testicular weight at 12 months of age (P<0.05). In conclusion, the use of pST in young pigs is present positive effects on the testicular development, testosterone levels, libido and semen quality after the establishment of puberty. an alternative to increase reproductive efficiency, increasing the semen quality and the number of inseminating doses produced from one ejaculate. / A somatotrofina (ST), a qual tem muitos de seus efeitos mediados pelo fator de crescimento semelhante à insulina I (IGF-I), tem efeito positivo sobre a gametogênese e a esteroidogênese, sendo utilizada como alternativa de tratamento em homens com infertilidade. Quanto ao seu efeito sobre a idade à puberdade, em humanos com deficiência endógena, a sua suplementação causa maior desenvolvimento testicular, gametogênese e esteroidogênese e antecipação da puberdade. Porém, não há estudos que determinem os mecanismos de ação deste hormônio sobre a função testicular e idade à puberdade em suínos sadios. Dessa forma as hipóteses deste estudo foram: 1) machos suínos pré-púberes recebendo ST exógena tem seu crescimento testicular acelerado, devido à ação mitogênica do IGF-I; 2) incremento na gametogênese e esteroidogênese, com consequente antecipação da idade à puberdade; e 3) melhora da qualidade espermática após o estabelecimento da puberdade. Para confirmar estas hipóteses foram realizados quatro experimentos. O Experimento 1 teve o objetivo de determinar o intervalo entre aplicações de ST suína (pST), a partir da determinação dos níveis de IGF-I. O Experimento 2 teve o objetivo de avaliar a proliferação de células testiculares em animais submetidos à administração de pST, bem como seu efeito sobre o metabolismo de leitões. No Experimento 1, os níveis séricos médios de IGF-I do Grupo pST foram superiores (P<0,05) aos do Grupo Controle, com diferença entre grupos até o 3º dia após aplicação do hormônio, determinando o intervalo entre doses a ser utilizado nos próximos experimentos. No Experimento 2 houve um aumento no peso testicular (P=0,06) no Grupo pST, porém uma diminuição do número de túbulos seminíferos e células de Sertoli neste grupo (P<0,05). O Experimento 3 teve o objetivo de determinar o efeito da administração de pST durante o período pré-puberdade sobre o perfil metabólico, desenvolvimento testicular e início do desenvolvimento sexual de suínos jovens. O grupo pST apresentou maiores níveis circulantes de testosterona a partir dos cinco meses de idade (P<0,05), o qual coincidiu com o início da atividade reprodutiva destes animais, além de apresentar maior libido (P<0,05). O Experimento 4 teve o objetivo de determinar o efeito do pST sobre a qualidade espermática após o estabelecimento da puberdade. Na avaliação da qualidade espermática foi observado aumento do vigor, volume espermático, da concentração espermática total e do número de doses inseminantes no grupo pST (P<0,05). Ainda, o grupo pST apresentou maior peso testicular aos 12 meses de idade em relação ao grupo controle (P<0,05). Concluindo, o uso de pST em suínos jovens apresenta efeitos positivos sobre o desenvolvimento testicular, níveis de testosterona, libido e qualidade espermática após o estabelecimento da puberdade.

O objetivo deste estudo foi avaliar o fornecimento crônico de leptina recombinante ovina (oLeptina) e do nível de energia da dieta na idade, peso vivo (PV), escore de condição corporal (ECC) e composição corporal à puberdade, assim como avaliar seus efeitos no desenvolvimento dos folículos ovarianos e no consumo de matéria seca (CMS). Foram utilizadas 36 novilhas da raça Nelore, com média de 18 a 20 meses de idade, 276,1 ± 17,9 kg PV e ECC de 4,7 ± 0,46, distribuídas aleatoriamente em três tratamentos: A) Dieta de alta energia; B) Dieta de baixa energia, BL) Dieta de baixa energia com administração subcutânea de oLeptina. Os animais foram alojados de 2 baias coletivas de acordo com a dieta oferecida. As dietas foram formuladas para promover um ganho de peso médio diário (GMD) de 0,3 kg PV/dia e 1,0 kg PV/dia. O controle de consumo foi feito através da pesagem diária das sobras e manutenção dessas entre 5 e 10% do total oferecido. Os animais foram pesados e tiveram o ECC avaliado duas vezes por semana, para acompanhamento do GMD. Foi administrado 12 g de óxido de cromo/animal/dia por deglutição forçada por 10 dias, com coleta de amostras de fezes, dieta e sobras nos últimos 5 dias, para estimativa do consumo individual de MS e energia, através da determinação do cromo nas fezes e do FDNi nas fezes, dietas e sobras. O grupo BL recebeu 4,8 µg de oLeptina/kg PV, via subcutânea, duas vezes ao dia (6:00 e 18:00 horas) por 56 dias, enquanto os grupos A e B receberam 2 ml de solução salina. O diâmetro máximo do folículo dominante (FD) e a presença de corpo lúteo (CL) foram avaliados através de ultrassonografia transretal duas vezes por semana, até o momento da puberdade. No momento da ultrassonografia, foram coletadas amostras de sangue, por punção da veia jugular, para dosagem da concentração sérica de progesterona. A idade à puberdade foi considerada como a idade na primeira detecção de um CL, confirmado como sendo funcional por dosagem de progesterona acima de 1 ng/ml. Após a confirmação da puberdade os animais foram abatidos para estimativa da composição corporal, através da determinação do teor de água em cortes da 9a-10a-11a costelas. O maior teor de energia na dieta reduziu a idade e aumentou o ECC à puberdade (P<0,05). A leptina não teve efeito na idade, PV ou ECC à puberdade (P>0,05). Tanto o maior consumo de energia quanto a leptina aumentaram a velocidade de crescimento e determinaram maior diâmetro médio do FD (P<0,05), entretanto a velocidade de crescimento do FD do grupo BL voltou a diminuir, igualando-se à do grupo BL, após cerca de 30 dias de tratamento, comportando-se de forma quadrática à análise de regressão. O maior consumo de energia determinou maior teor de extrato etéreo e menores teores de proteína, matéria seca e matéria mineral no corpo vazio, além de maior espessura de gordura subcutânea e área de olho de lombo na carcaça (P<0,05). A aplicação de leptina não alterou a composição corporal das novilhas à puberdade (P>0,05). Não houve diferença no CMS (kg MS/dia) entre os grupos, entretanto o grupo A teve menor CMS em % PV, além de maior consumo de energia digestível, metabolizável e líquida para ganho (P<0,05). A leptina não reduziu o CMS das novilhas (P>0,05) tanto em kg MS/dia quanto em % PV. A energia acelera a obtenção da puberdade e altera a composição corporal à puberdade de novilhas zebuínas. A aplicação de leptina não acelerou a obtenção da puberdade de novilhas zebuínas em baixo consumo de energia, mas aumentou temporariamente a taxa de crescimento folicular desses animais. / This study was carried out to evaluate the effects of chronic administration of recombinant ovine leptin (oLeptin) and the energy level of the diet on age, body weight (BW), body condition score (BCS) and body composition at puberty, as well as to evaluate its effects on dominant follicle (DF) development and dry matter (DM) intake. Thirty six Nellore heifers, 18 to 20 months old, with 276.1 ± 17.9 kg BW and BCS of 4.7 ± 0.46 were randomly distributed into three treatments: H) High energy diet; L) Low energy diet; LL) Low energy diet with subcutaneous administration of oLeptin. Heifers were housed in two collective pens according to the diet offered. Diets were formulated to promote an average daily gain (ADG) of 0.3 kg BW/day and 1.0 kg BW/day. Intake was controlled daily by weighting the orts and keeping it between 5 and 10% of the total offered. Heifers were weighed and had their BCS was evaluated twice weekly, in order to control the ADG. Heifers received 12 g of chromic oxide/animal/day by forced swallowing for 10 days, while feces, diet and orts were sampled in the last 5 days, in order to estimate individual DM and energy intake, which was done by feces determination of chromic oxide, and diet and, feces and orts determination of iNDF. The LL group received 4.8 µg oLeptina/kg BW, subcutaneously, twice a day (at 06:00 and 18:00), for 56 days, while H and L groups received 2 ml of saline solution. Maximum DF diameter and presence of corpus luteum (CL) were evaluated twice weekly by transrectal ultrasound, until heifers achieved puberty. At the time of ultrasound evaluation, blood was sampled by jugular venipuncture for serum progesterone determination. Age at puberty was considered as age at first detection of a CL confirmed to be functional by serum progesterone above 1 ng/ml. After puberty confirmation heifers were slaughtered for body composition estimation, which was done by water determination on 9a-10a-11a rib cuts. High energy intake reduced age and enhanced BCS at puberty (P<0.05). Leptin administration did not affect age, BW or BCS at puberty (P>0.05). The high energy intake as well as leptin administration accelerated the DF growth and determined greater DF diameter (P<0.05), however the rate of growth on the LL group decreased after around 30 days of treatment equaling the rate of growth of the L group, and behaving in a quadratic manner at regression analysis. High energy intake enhanced ether extract and lowered protein and minerals proportion on empty body (P<0.05). It also enhanced carcass subcutaneous fat and the longissimus muscle area (P<0.05). Leptin administration did not alter the body composition of heifers at puberty (P>0.05). There was no difference on DM intake (kg DM/day) between groups, however the H group had higher DM intake in terms of % BW, as well as higher intake of digestible, metabolizable and net energy for gain (P<0.05). Leptin did not reduce DM intake neither in terms of kg BW/day nor % BW (P>0.05). Energy intake accelerates the onset of puberty and alters body composition at puberty of zebu heifers. Leptin administration did not accelerate puberty onset of zebu heifers receiving low energy diet, but temporarily enhanced the follicular growth rate of these animals.

A kisspeptina, codificada pelo gene KISS1, é um neuropeptídeo crucial na regulação do início da puberdade. A kisspeptina estimula a secreção hipotalâmica do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) após se ligar ao seu receptor GPR54. Mutações inativadoras do GPR54 são atualmente consideradas como uma causa rara de hipogonadismo hipogonadotrófico isolado (HHI) normósmico. Recentemente, uma mutação ativadora no receptor GPR54 foi implicada na patogênese da puberdade precoce dependente de gonadotrofinas (PPDG). Com base nesses achados, levantamos a hipótese de que alterações no gene KISS1 poderiam contribuir para a patogênese de distúrbios puberais centrais. O objetivo do presente estudo foi investigar a presença de variantes no gene KISS1 em pacientes com PPDG e HHI. Sessenta e sete crianças brasileiras com PPDG (63 meninas e 4 meninos) e 61 pacientes com HHI (40 homens e 21 mulheres) foram selecionados, incluindo casos esporádicos e familiares em ambos os grupos. A população controle consistiu de 200 indivíduos com história de desenvolvimento puberal normal. A região promotora e os 3 exons do gene KISS1 foram amplificados e submetidos a sequenciamento automático. Duas novas variantes no gene KISS1, p.P74S e p.H90D, foram identificadas em duas crianças não relacionadas, portadoras de PPDG idiopática. Ambas as variantes estão localizadas na região amino-terminal da kisspeptina-54 e estavam ausentes em 400 alelos controles. A variante p.P74S foi identificada em heterozigose em um menino que desenvolveu puberdade com um ano de idade. Sua mãe e avó materna, que apresentavam história de desenvolvimento puberal normal, eram portadoras da mesma variante em heterozigose, sugerindo penetrância incompleta e/ou herança sexo-dependente. A variante p.H90D foi identificada em homozigose em uma menina com PPDG, que desenvolveu puberdade aos seis anos de idade. Sua mãe, com história de menarca aos dez anos de idade, era portadora da mesma variante em heterozigose. Células transfectadas estavelmente com GPR54 foram estimuladas com concentrações crescentes de kisspeptina-54 (kp-54) humana selvagem ou contendo as mutações (kp-54 H90D e kp-54 P74S) e o acúmulo de fosfato de inositol (IP) foi medido. Nos estudos in vitro, a kp-54 P74S apresentou uma capacidade de ativação do receptor GPR54 semelhante à kp-54 selvagem. A kp-54 p.H90D mostrou uma ativação da sinalização do receptor significativamente mais potente que a kp-54 selvagem, sugerindo que essa é uma mutação ativadora. No grupo de HHI, uma nova variante (c.588-589insT) foi identificada em heterozigose na região 3 não traduzida do gene KISS1 em um paciente do sexo masculino. O papel dessa variante no fenótipo de HHI permanece indeterminado. Em conclusão, duas mutações no gene KiSS1 foram descritas pela primeira vez em associação com PPDG. / Kisspeptin, encoded by the KISS1 gene, is an important regulator of puberty onset. After binding to its receptor GPR54, kisspeptin stimulates gonadotropin-releasing hormone secretion by the hypothalamic neurons. Inactivating GPR54 mutations are a rare cause of normosmic isolated hypogonadotropic hypogonadism (IHH). Recently, a unique GPR54 activating mutation was implicated in the pathogenesis of gonadotropin dependent precocious puberty (GDPP). Based on these observations, we hypothesized that mutations in the KISS1 gene might be associated with central pubertal disorders. The aim of this study was to investigate KISS1 mutations in idiopathic GDPP and normosmic IHH. Sixty-seven Brazilian children (63 girls and 4 boys) with idiopathic GDPP and 61 patients with normosmic IHH (40 men and 21 women) were selected. Familial and sporadic cases were included in both groups. The control population consisted of 200 individuals who had normal timing of puberty. The promoter region and the 3 exons of the KISS1 gene were amplified and automatically sequenced. Two novel KISS1 missense mutations, p.P74S and p.H90D, were identified in two unrelated children with idiopathic GDPP. Both mutations were absent in 400 control alleles and are located in the amino-terminal region of kisspeptin-54. The p.P74S mutation was identified in the heterozygous state in a boy who developed puberty at 1 yr of age. His mother and maternal grandmother, who had normal pubertal development, were also heterozygous for the p.P74S mutation, suggesting incomplete penetrance and/or sex-dependent inheritance. The p.H90D mutation was identified in the homozygous state in a girl with GDPP, who developed puberty at 6 yr of age. Her mother, who had menarche at 10 yr of age, carried the p.H90D mutation in the heterozygous state. CHO cells stably transfected with GPR54 were stimulated with different concentrations of synthetic human wild type or mutant kisspeptin-54 (KP54) and inositol phosphate (IP) accumulation was measured. In vitro studies revealed that the capacity of the p.P74S mutant KP54 to stimulate IP production was similar to the wild type. The p.H90D kisspeptin-54 showed a significantly more potent activation of GPR54 signaling in comparison to the wild type in vitro, suggesting a gain-of-function mutation. In the IHH group, a heterozygous variant in the 3 UTR of the KISS1 gene (c.588-589insT) was identified. The role of this variant in the IHH phenotype remains to be determined. In conclusion, two KiSS1 mutations were described for the first time in association with GDPP.

LEITE, F. Influência da restrição de crescimento intra-uterino na idade da menarca: estudo da coorte de nascidos vivos de Ribeirão Preto de 1978/9. 2008. 85 p. Dissertação (Mestrado) apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP. A idade da menarca é um marco da puberdade e, quando antecipada, parece estar associada a um maior risco de desenvolvimento de câncer de mama, síndrome metabólica e obesidade. É possível que alterações no ambiente intrauterino, como a restrição de crescimento do feto, levem a interferências no sistema hipotálamo-hipófise-gonadal resultando em alterações na idade da menarca. Em vista da controvérsia dos fatores que influenciam na idade da menarca, este estudo testou a hipótese da associação entre restrição de crescimento intra-uterino (baixo peso ao nascer, pequeno para idade gestacional, restrição intra-uterina de Kramer) e antecipação da idade da menarca. Em uma sub-amostra foi testada a possível interação entre a restrição de crescimento intra-uterino e o índice de massa corpórea. Para esse estudo foram utilizadas informações coletadas nos seguimentos de 1987/9 e 2004/5 de 1056 meninas nascidas em Ribeirão Preto, provenientes do estudo de coorte dos nascidos vivos em Ribeirão Preto de 1978/9. Menarca antecipada foi definida como primeiro sangramento vaginal ocorrido antes dos 12 anos de idade. Análise univariada foi seguida de análise bivariada e multivariada por meio de modelo generalizado empregando distribuição de Poisson para estimativa de riscos relativos e erro padrão por meio de método robusto. Os fatores de confusão controlados foram idade, escolaridade e situação conjugal da mãe, número de irmãos, comprimento ao nascer, prematuridade e índice de massa corpórea (apenas para a subamostra). Em média, a menarca ocorreu aos 12,3 anos (DP=1,5). A ocorrência de menarca antecipada foi de 27,7% (n= 293) para a coorte inteira e de 29,1% (n= 172) na sub-amostra. Foi encontrada associação negativa entre restrição de crescimento intra-uterino, seja representado por baixo peso ao nascer (Risco Relativo, RR= 0,47; Intervalo de Confiança de 95%, IC95%: 0,26-0,84), pequeno para idade gestacional (RR = 0,57;IC95%:0,37-0,89) ou restrição de Kramer (RR= 0,65; IC95%:0,47-0,92), com a antecipação da idade da menarca. Os resultados foram semelhantes na análise da sub-amostra, porém sem significância estatística. Quando o índice de massa corpórea foi considerado na análise da sub-amostra, não houve modificação dos resultados. Desta forma, este estudo demonstrou associação negativa entre restrição de crescimento intra-uterino e antecipação da idade da menarca, ou seja, a restrição de crescimento foi fator de proteção da menarca antecipada. / LEITE, F. Influence of intrauterine growth restriction on the age of menarche: the cohort study of live births of Ribeirao Preto in 1978/9. 2008. 85 p. Dissertation (Master) submitted to the Faculty of Medicine of Ribeirao Preto/USP. This study tested the hypothesis of association between intrauterine growth restriction and early age of menarche. For this study, follow-up data (n = 1056) from the population based livebirth cohort study of Ribeirao Preto of 19789 were analyzed. Early menarche was defined as having the first menstrual event before 12 years-old and intrauterine growth restriction was defined by three measurements: low birthweight (< 2500grs), small for gestational age (< 10% Williams growth curve) and fetal growth ratio (< 0.85 mean weight for gestational age). Relative risks were estimated by generalized estimation equations (Poisson distribution) with robust method for estimation of standard errors. Analyzes were adjusted for maternal age, education and marital status, number of siblings, birth length and preterm. Body mass index was tested as intervenient or interaction factor in a subsample of the cohort examined at 9 yrs-old. The mean age of menarche was 12.3 years (Standard Deviation = 1.5). Early menarche was observed for 27.7% for the entire cohort and 29.1% for the sub-sample. Negative association was observed between intrauterine growth restriction and early menarche. The adjusted relative risks and respective confidence intervals (95% CI) for low birth weight, small for gestational age and fetal growth ratio were respectively: 0.47 (95% CI: 0.26-0.84), 0.57 (95% CI: 0,37-0,89), and 0.65 (95%CI: 0,47-0, 92). No evidence that body mass index was an intermediate or interaction factor was observed. Thus, this study showed a negative association between intrauterine growth restriction and anticipation of age of menarche.

A maioria dos casos de puberdade precoce central (PPC) em meninas permanece idiopática. A hipótese de uma causa genética vem se fortalecendo após a descoberta de alguns genes associados a este fenótipo, sobretudo aqueles implicados com o sistema kisspeptina (KISS1 e KISS1R). Entretanto, apenas casos isolados de PPC foram relacionados à mutação na kisspeptina ou em seu receptor. Até recentemente, a maioria dos estudos genéticos em PPC buscava genes candidatos selecionados com base em modelos animais, análise genética de pacientes com hipogonadismo hipogonadotrófico, ou ainda, nos estudos de associação ampla do genoma. Neste trabalho, foi utilizado o sequenciamento exômico global, uma metodologia mais moderna de sequenciamento, para identificar variantes associadas ao fenótipo de PPC. Trinta e seis indivíduos com a forma de PPC familial (19 famílias) e 213 casos aparentemente esporádicos foram inicialmente selecionados. A forma familial foi definida pela presença de mais de um membro afetado na família. DNA genômico foi extraído dos leucócitos do sangue periférico de todos os pacientes. O estudo de sequenciamento exômico global realizado pela técnica ILLUMINA, em 40 membros de 15 famílias com PPC, identificou mutações inativadoras em um único gene, MKRN3, em cinco dessas famílias. Pesquisa de mutação no MKRN3 realizada por sequenciamento direto em duas famílias adicionais (quatro pacientes) identificou duas novas variantes nesse gene. O MKRN3 é um gene de um único éxon, localizado no cromossomo 15 em uma região crítica para a síndrome de Prader Willi. O gene MKRN3 sofre imprinting materno, sendo expresso apenas pelo alelo paterno. A descoberta de mutações em pacientes com PPC familial despertou o interesse para a pesquisa de mutações nesse gene em 213 pacientes com PPC aparentemente esporádica por meio de reação em cadeia de polimerase seguida de purificação enzimática e sequenciamento automático direto (Sanger). Três novas mutações e duas já anteriormente identificadas, incluindo quatro frameshifts e uma variante missense, foram encontradas, em heterozigose, em seis meninas não relacionadas. Todas as novas variantes identificadas estavam ausentes nos bancos de dados (1000 Genomes e Exome Variant Server). O estudo de segregação familial em três dessas meninas com PPC aparentemente esporádica e mutação no MKRN3 confirmou o padrão de herança autossômica dominante com penetrância completa e transmissão exclusiva pelo alelo paterno, demonstrando que esses casos eram, na verdade, também familiares. A maioria das mutações encontradas no MKRN3 era do tipo frameshift ou nonsense, levando a stop códons prematuros e proteínas truncadas e, portanto, confirmando a associação com o fenótipo. As duas mutações missenses (p.Arg365Ser e p.Phe417Ile) identificadas estavam localizadas em regiões de dedo ou anel de zinco, importantes para a função da proteína. Além disso, os estudos in silico dessas duas variantes demonstraram patogenicidade. Todos os pacientes com mutação no MKRN3 apresentavam características clínicas e hormonais típicas de ativação prematura do eixo reprodutivo. A mediana de idade de início da puberdade foi de 6 anos nas meninas (variando de 3 a 6,5) e 8 anos nos meninos (variando de 5,9 a 8,5). Tendo em vista o fenômeno de imprinting, análise de metilação foi também realizada em um subgrupo de 52 pacientes com PPC pela técnica de MS-MLPA, mas não foram encontradas alterações no padrão de metilação. Em conclusão, este trabalho identificou um novo gene associado ao fenótipo de PPC. Atualmente, mutações inativadoras no MKRN3 representam a causa genética mais comum de PPC familial (33%). O MKRN3 é o primeiro gene imprintado associado a distúrbios puberais em humanos. O mecanismo preciso de ação desse gene na regulação da secreção de GnRH necessita de estudos adicionais / Most cases of central precocious puberty (CPP) in girls remain idiopathic. The hypothesis of a genetic cause has been strengthened after the discovery of some genes associated with this phenotype, particularly those involved with the kisspeptin system (KISS1 and KISS1R). However, genetic defects in KISS1 and its receptor are rare and have been identified in only a few patients with CPP.over the past years. To date, most genetic studies in CPP was based mainly on a candidate gene approach, including genes selected in animal studies, human models of patients with hypogonadotropic hypogonadism or in genome wide association studies. In the present study, we used whole exome sequencing, a more advanced method of sequencing, to identify variants associated with CPP. Thirty-six patients with the familial form of CPP (19 families) and 213 apparently sporadic cases were initially selected. The familial form was defined by the presence of more than one member affected in the family. Genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocytes in all patients. Whole exome sequencing performed by ILLUMINA technique in 40 members of 15 families with CPP, identified inactivating mutations in a single gene, MKRN3, in five out of these families. Analysis of MKRN3 mutations performed by automatic sequencing in two additional families (four patients) identified two novel mutations. MKRN3 is an introless gene located on chromosome 15, in the Prader Willi syndrome critical region, and it is expressed only by the paternal allele due to the maternal imprinting. Following the initial findings, we searched for MKRN3 mutations in 213 patients with apparently sporadic CPP using polymerase chain reaction followed by direct enzymatic purification and automated sequencing (Sanger). Three new mutations and two previously reported, including four frameshifts and one missense variant was identified in six unrelated girls with CPP. All variants were not described in the two databases (1000 Genomes and Exome Variant Server). The familial segregation analysis performed in three out of these girls with apparently sporadic CPP and MKRN3 mutations confirmed the autosomal dominant inheritance with complete penetrance and exclusive transmission through the paternal allele, revealing familial inheritance in apparently sporadic cases. Most of these MKRN3 mutations were frameshifts or nonsense, leading to premature stop codons and truncated proteins, thus demonstrating positive genotype- phenotype correlation. The two missense mutations (p.Arg365Ser and p.Phe417Ile) identified were located within zinc finger motifs, regions predicted to be essential for the protein function. Besides that, all missense mutations were predicted to be pathogenic by in silico analysis. All patients carrying MKRN3 mutations exhibited typical clinical and hormonal features of premature activation of the reproductive axis. The median age of puberty onset was 6.0 years in girls (ranging from 3.0 to 6.5) and 8.0 years in boys (ranging from 5.9 to 8.5). In view of the imprinting phenomenon, methylation analysis was also performed in a subgroup of 52 patients with CPP by MSMLPA technique, but no methylation abnormalities were detected. In conclusion, our work has identified a new gene associated with CPP. Currently, inactivating mutations in MKRN3 represent the most common genetic cause of familial CPP (33%). MKRN3 is the first imprinted gene associated with pubertal disorders in humans. However, its precise mechanism of action in the regulation of GnRH secretion needs further studies

A puberdade é um processo biológico complexo do desenvolvimento sexual que tem início no final da infância e se caracteriza pela maturação do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal, pelo desenvolvimento dos caracteres sexuais secundários, aceleração do crescimento e finalmente pela capacidade reprodutiva. Nos últimos anos, o peptídeo kisspeptina e seu receptor KISS1R têm sido fortemente envolvidos na regulação da secreção pulsátil do GnRH hipotalâmico e, portanto, com o início da puberdade humana. Mutações nos genes KISS1R e KISS1 foram identificadas em crianças brasileiras com puberdade precoce central (PPC). Estudos em famílias e em irmãs gêmeas estimaram que 50-70% da variação na idade de menarca pode ser hereditária, porém, até pouco tempo atrás, não se tinha conhecimento de variantes genéticas comuns que influenciassem no tempo de puberdade. Recentemente, quatro estudos independentes de associação ampla do genoma estabeleceram que marcadores genéticos próximos ou dentro do gene LIN28B estavam relacionados com a idade da menarca em mulheres normais. Além disso, mutações recessivas no gene lin28 levaram ao desenvolvimento precoce no C. elegans. Camundongos que superexpressam Lin28a apresentaram um retardo no desenvolvimento sexual. Com base nesses achados, investigamos a presença de variantes conhecidas ou novas nos genes KISS1, KISS1R e LIN28B em um grupo de crianças portadoras de PPC idiopática com o intuito de estabelecermos a prevalência dessas mutações na etiologia do desenvolvimento sexual prematuro em humanos. Cento e sete crianças com PPC (101 meninas e 6 meninos) foram selecionados, incluindo casos esporádicos e familiares. A população controle consistiu de 200 indivíduos adultos com história de desenvolvimento puberal normal em idade apropriada. A região promotora e os três exons do gene KISS1, os cinco exons do gene K1SS1R e os quatro exons do gene LIN28B foram amplificados e submetidos à sequenciamento automático. Uma variante em homozigose no gene KISS1, descrita anteriormente por pesquisadores do nosso laboratório, p.H90D, foi identificada em mais três crianças não relacionadas, portadoras de PPC idiopática. Essa variante está localizada no exon 3 do KISS1, levando a substituição de uma histidina por um ácido aspártico na posição 90 da kisspeptina-1 (p.H90D), correspondendo à região amino-terminal da kisspeptina-54 e estava ausente em 200 controles brasileiros. Estudos prévios in vitro com a variante p.H90D não revelaram alterações na capacidade de ligação ou ativação do KISS1R e na resistência a degradação. As mutações ativadoras p.R386P do KISS1R e p.P74S da kisspeptina, previamente descritas em puberdade precoce central, não foram identificadas no estudo atual. Uma nova e rara variante em heterozigose no gene LIN28B, p.H199R, foi identificada em uma menina brasileira com PPC idiopática. Essa variante está localizada no exon 4 do LIN28B, levando a substituição de uma histidina conservada por uma arginina na posição 199 da proteína (p.H199R) e estava ausente em 200 controles brasileiros. O pai da paciente, que apresentou desenvolvimento puberal normal, era portador da mesma variante em heterozigose. Estudos in vitro revelaram que a variante p.H199R não afeta a função de LIN28B na regulação da expressão do miRNA let-7. Outra variante alélica no gene LIN28B foi identificada numa menina com PPC. Essa variante estava localizada no íntron 2 do gene e uma análise computacional demonstrou que ela não altera o sítio de splicing no RNA maduro. Em conclusão, observamos que mutações nos genes KISS1 e KISS1R têm uma baixa prevalência em crianças com puberdade precoce central idiopática. Descrevemos uma nova e rara variante no gene LIN28B (p.H199R) numa menina com puberdade precoce central e os estudos funcionais do LIN28B selvagem ou contendo a variante p.H199R sugeriram que essa variante não está relacionada ao fenótipo de puberdade precoce / Puberty is a complex biological process of sexual development that begins in the late childhood and it is characterized by the maturation of the hipothalamic-pituitary-gonadal axis, secondary sexual characteristics development, growth acceleration and acquisition of the reproductive capacity. Over the last years, the kisspeptin peptide and its receptor KISS1R have been envolved in the regulation of the pulsatile hipothalamic GnRH secretion and consequently with the beginning of the puberty human. Researchers from our laboratory identified mutations in the KISS1R and KISS1 genes in Brazilian children with central precocious puberty (CPP). Studies performed in families and twins estimated that 50%-70% of the variation in the menarce age can be hereditary, however, until last years, we did not have knowledgment of the influence of commun genetic variants in the puberty time. Recently, four independent Genome-Wide Association Studies established that genetic markers near or inside of LIN28B gene were related with the menarce age in normal women. Furthermore, recessive mutations in the LIN28B gene caused a precocious develpment in C. elegans. Interestingly, mouse that overexpress Lin28a exhibited a sexual development delay. Accordingly with these datas investigated the presence of known or new variants in the KISS1, KISS1R and LIN28B genes in a larger cohort of children with CPP to establish the prevalence of these mutations in the etiology of premature sexual development in humans. 107 children with CPP (101 girls and 6 boys) were selected, including sporadic and familial cases. The control population consisted of 200 adults with normal pubertal development. The promoter region and the three exons of KISS1 gene, five exons of KISS1R and four exons of LIN28B were amplified and automatically sequenced. A homozygous variant previously described by researchers from our laboratory in the KISS1 gene, p.H90D, was identified in more 3 no related children with CPP idiophatic. This variant is located in exon 3 of KISS1, resulting in substitution of a histidine to an aspartic acid at position 90 of kisspeptin-1 (p.H90D), in the amino-terminal region of the protein-54 and was absent in 200 Brazilian controls. Previous studies in vitro with the p.H90D variant did not show alterations in the binding or activation capacity and in the resistance to degradation. The activating mutations p.R386P of the KISS1R and p.P74S of the kisspeptin, previously described in central precocious puberty, were not identified in the present study. A new and rare heterozygous variant in the LIN28B gene, p.H199R, was identified in a Brazilian girl with CPP idiophatic. This variant is located in exon 4 of the LIN28B, resulting in substitution of a histidine to an arginine at position 199 of protein (p.H199R) and was absent in 200 Brazilian controls. Her father, which had normal pubertal development, carried the same heterozygous variant. Studies in vitro revealed p.H199R did not affect the function of Lin28B in the regulation of let-7 miRNA expression. Another allelic variant in the LIN28B gene was identified in a girl with CPP. This variant was located in intron 2 of the gene and an in silico analysis showed that it does not change the splicing site in mature RNA. In conclusion, we observed that mutations in the KISS1 and KISS1R genes have a low prevalence in children with idiopathic central precocious puberty. We described a new and rare variant in LIN28B gene (p.H199R) in a girl with central precocious puberty and functional studies of the wild LIN28B or containing p.H199R variant suggested that p.H199R variant of the LIN28B is not related to the precocious puberty phenotype