A puberdade é uma fase do desenvolvimento marcada pelo surgimento de características sexuais secundárias e que culmina na capacidade reprodutiva do organismo. A puberdade inicia com a ativação dos neurônios que expressam o peptídeo hormônio liberador de gonadrotrofinas (GnRH), que resulta em modificação do padrão de liberação do hormônio luteinizante (LH) pelos gonadotrofos, e aumento da produção gonadal de 17β-estradiol (E2). O sistema kisspeptidérgico, composto pelo peptídeo kisspeptina (KiSS-1) e o receptor de kisspeptina (KiSS1r), parece ser um dos responsáveis pela ativação dos neurônios que secretam GnRH para o início da puberdade. Alguns trabalhos sugerem que esse sistema é modulado por sinais periféricos que sinalizam o estado de desenvolvimento e reserva de energia do organismo, como o fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-1) e o hormônio leptina, respectivamente. Estudos em humanos sustentam que há um adiantamento da idade de início da puberdade em meninas, atribuindo o excesso de adiposidade como um possível fator causal. Em condições de excesso de tecido adiposo, as concentrações de leptina e IGF-1 estão aumentadas, sugerindo que estes fatores possam exercer modulação sobre o sistema kisspeptina e adiantar a instalação da puberdade. Assim, o presente estudo analisou a ingestão alimentar e o desenvolvimento de obesidade sobre a instalação da puberdade e a participação de fatores-chave para a instalação da puberdade em fêmeas de rato Wistar alimentadas com Dieta de Cafeteria a partir do desmame. Foram utilizadas fêmeas de rato Wistar desmamadas aos 21 dias de vida. Os animais foram alocados para o grupo Controle (ração padrão e água ad libitum) e grupo Dieta de Cafeteria (alimentos processados consumidos por humanos). Diariamente, os animais foram inspecionados para a abertura vaginal (indicador de instalação da puberdade) e a ingestão alimentar foi monitorada. No dia da abertura vaginal, os animais foram decapitados e o encéfalo e sangue foram coletados e armazenados. Nas amostras contendo a Banda Diagonal de Broca e hipotálamo foi analisada a expressão dos genes Gnrh1, Kiss1, Kiss1r e Lepr. No soro, quantificou-se a concentração de LH, E2, leptina e IGF-1. Também foram dissecados e pesados o tecido adiposo intraabdominal, o útero, os ovários e as adrenais. Os resultados revelaram aumento da ingestão de energia e lipídeos e adiantamento da abertura vaginal no grupo Dieta de Cafeteria. O peso dos ovários foi aumentado pela Dieta de Cafeteria, embora o peso do útero e o peso das adrenais não tenham sido alterados. Esses animais tiveram menor peso corporal, porém com aumento do tecido adiposo intra-abdominal e da concentração de leptina, ambos associados entre si e com o dia da abertura vaginal no grupo Dieta de Cafeteria. A Dieta de Cafeteria não alterou a concentração sérica de LH e E2 no dia da abertura vaginal. O tratamento com Dieta de Cafeteria não modificou a expressão de Gnrh1 mRNA, Kiss1 mRNA e Kiss1r mRNA, porém aumentou a expressão de Lepr mRNA em amostras contendo a Banda Diagonal de Broca e hipotálamo. A maior concentração de leptina não foi correlacionada com a maior expressão de Lepr mRNA. Os resultados sugerem que a introdução precoce de alimentos processados pode alterar o padrão fisiológico de ingestão alimentar e estimular o desenvolvimento do tecido adiposo intra-abdominal e a liberação de leptina. Um limiar de concentração de leptina parece ser um elemento permissivo para a instalação da puberdade em condições controle, porém uma elevação precoce pode estimular os reguladores fisiológicos e adiantar o início da puberdade. / Puberty is a stage of development marked by the appearance of secondary sexual characteristics, culminating in the achievement of reproductive capacity. Some observational studies support the notion that there is an early onset of puberty in girls related to obesity. Puberty starts with the activation of gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) neurons, which stimulate the release of luteinizing hormone (LH) by gonadotrophs, and increased gonadal production of 17β-estradiol (E2). The kisspeptidergic system, comprising the kisspeptin peptide (KiSS-1) and the kisspeptin receptor (KISS1R), seems to activate GnRH neurons and puberty onset. The kisspeptidergic system is modulated by peripheral signals related to the body energy storage, such as the insulin-like growth factor 1 (IGF-1) and the leptin. In an obesity situation, the levels of leptin and IGF-1 are increased, suggesting that these factors may exert modulation of the kisspeptidergic system and the puberty onset. Thus, this study examined the effect of obesity on puberty onset in female rats and the expression of key genes (GnRH, kisspeptin and its receptor) and its potential regulators (leptin, IGF-1 and E2). Wistar female rats weaned at 21 days were allocated to the Control group (chow and water ad libitum) or to the Cafeteria Diet group (processed foods consumed by humans). Every day, the animals were inspected for vaginal opening (puberty onset signal) and the food intake was measured. On the day of vaginal opening, the animals were decapitated and the brain and blood were collected and stored. Expression of genes Gnrh1, Kiss1, Kiss1r and Lepr were analyzed in the collected brains by qPCR. Serum LH, E2, leptin and IGF-1 were analyzed by ELISA. Intra-abdominal adipose tissue, the uterus, the ovaries and adrenal glands were also dissected and weighed. The results have shown higher energy and fat intake and early vaginal opening in the Cafeteria Diet group. The ovarian weight was increased by the Cafeteria Diet, although the weight of the uterus and adrenal have not changed. These animals demonstrated lower body weight, but with increased intra-abdominal adipose tissue and high leptin levels, both associated with each other and with the day of vaginal opening in Cafeteria Diet group. The Cafeteria Diet has not changed serum LH and E2 on the day of vaginal opening. Treatment with Cafeteria Diet has not changed the expression of Gnrh1 mRNA, Kiss1 mRNA and Kiss1r mRNA, but increased the expression of Lepr mRNA in brain samples from Diagonal Band of Broca and hypothalamus. The higher concentration of leptin was not associated with the increased expression of Lepr mRNA. The results suggest that early access to processed foods can change the physiological pattern of food intake and stimulate the development of obesity and the release of leptin. A leptin threshold appears to be a permissive factor for puberty onset under control conditions, but it may overlap other physiological regulators and trigger early puberty onset in obesity conditions.

Pubarca precoce (PP), definida como o surgimento de pelos pubianos antes dos oito anos de idade em meninas após exclusão de causas secundárias, tem sido associada a maior prevalência de componentes da síndrome metabólica e desenvolvimento da síndrome dos ovários policísticos (PCOS) na adolescência. Em mulheres com PCOS, foi relatado aumento da massa ventricular esquerda (MVE) e disfunção diastólica, associados à resistência insulínica (RI). Os objetivos dos estudos foram: 1) avaliar a MVE e a função cardíaca sistólica e diastólica através de ecocardiografia em meninas com PP e controles, além de analisar a associação entre os parâmetros cardíacos com androgênios e marcadores de RI; 2) determinar a frequência da PCOS em uma coorte de meninas com PP na pós-menarca e avaliar se existem preditores para o desenvolvimento da PCOS. Variáveis clínicas, hormonais e metabólicas, ecocardiografia e composição corporal foram obtidas em 35 meninas com PP e 35 controles saudáveis pareadas pela idade (artigo 1). Trinta e quatro meninas com mais de dois anos pós-menarca da coorte de PP da Unidade de Endocrinolgia Ginecológica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (UEG/HCPA) foram classificadas em PCOS e não-PCOS e seus dados pré-puberais foram analisados para detectar preditores do desenvolvimento de PCOS e comparados com os de 17 meninas controles saudáveis da mesma idade (artigo 2). Após ajuste para gordura corporal total, a MVE foi maior no grupo PP (97,31 ± 33,37 vs. 81,25 ± 19,06 g, p = 0,017), bem como a onda A’ (5,66 ± 1,34 vs. 5,09 ± 0,98 cm / s, p = 0,025), uma medida da função diastólica. O índice de androgêncios livres (FAI) e gordura corporal total foram preditores independentes de maior MVE e, juntamente com HOMA-IR contribuíram com 72% da variabilidade da MVE no grupo PP (artigo 1). No segundo artigo, 44,1% das meninas com PP foram diagnosticadas com PCOS na pósmenarca. Na pré-puberdade, esse grupo apresentou maior índice de massa corporal (IMC) e HOMA-IR em relação às controles, bem como níveis mais elevados de testosterona, escore de hirsutismo e insulina em jejum quando comparadas às não-PCOS e às controles. O risco para o desenvolvimento de PCOS entre as PPs esteve associado ao IMC z-escore ≥ 2 (odds ratio [OR] = 4; intervalo de confiança 95% [IC] 1.33 – 18.66); escore de Ferriman-Galwey ≥ 4 (OR = 2,7; IC 95% 1,15-5,14); HOMA-IR ≥ 2,42 (OR = 7; IC 95% 1,39-12,0) e volume ovariano ≥ 1,17 mL (OR = 8; IC 95% 1,60-39,9) no período pré-puberal. Em conclusão, meninas com PP apresentaram maior MVE associada aos níveis de androgênios, RI e gordura corporal total. Além disso, foi encontrada alta freqüência de PCOS na coorte de PP da UEG/HCPA. Obesidade, maior escore de hirsutismo, RI e volume ovariano na pré-puberdade foram preditores de desenvolvimento da PCOS na adolescência. / Precocious pubarche (PP) in girls, defined as idiopathic appearance of pubic hair before the age of eight years, has been associated with higher prevalence of components of metabolic syndrome and post pubertal development of polycystic ovary syndrome (PCOS). Increased left ventricular mass (LVM) and diastolic dysfunction have been reported in women with PCOS associated with insulin resistance (IR). The aims of the studies were: 1) to assess LVM and cardiac systolic and diastolic function using echocardiography in girls with PP and controls, and to analyze the relationship between cardiac parameters with androgens and IR; 2) to determine the frequency of PCOS in a cohort of postmenarcheal PP girls and to assess whether possible predictors exist for development of PCOS Clinical, hormonal and metabolic profiles, echocardiography and body composition were examined in 35 PP girls and 35 healthy age-matched controls (article 1). Thirty-four postmenarcheal girls with PP of the Gynecological Endocrinology Unit, Division of Endocrinology of Hospital de Clínicas de Porto Alegre (GEU/HCPA) clinic cohort were classified as PCOS and non-PCOS and prepubertal data were analyzed to detect PCOS development predictors and compared with data of 17 age-matched controls (article 2). After adjusting for total body fat, LVM was higher in the PP group (97.31 ± 33.37 vs. 81.25 ± 19.06 g, p = 0.017) as well as A’ wave (5.66 ± 1.34 vs. 5.09 ± 0.98 cm/s, p=0.025), a measurement of diastolic function. Free androgen index (FAI) and total body fat were independent predictors of higher LVM, and together with HOMA-IR contributed with 72% of LVM variability in the PP group (article 1). In the second article, fifteen (44.1%) PP girls were classified as PCOS and had higher body mass index standard deviation score (BMI SDS) and HOMA-IR than controls, as well as higher testosterone, hirsutism score and fasting insulin than non-PCOS girls and controls in prepubertal period. The risk for PCOS development among PP girls increased with prepubertal BMI SDS ≥ 2 (odds ratio [OR] = 4; 95% confidence interval [CI] 1.33 – 18.66), Ferriman-Galwey hirsutism score ≥ 4 (OR = 2.7; 95% CI 1.15 - 5.14), HOMA-IR ≥ 2.42 (OR = 7; 95% CI 1.39 - 12.0) and ovarian volume ≥ 1.17 mL (OR= 8; 95 CI 1.60 – 39.9). In conclusion, PP girls had greater LVM associated with higher androgen levels, IR, and total body fat, occurred early in pubertal development. In addition, we found high frequency of PCOS in Southern Brazil PP cohort. Obesity, clinical androgenism, IR and ovarian volume were predictors of development of PCOS later.

Sickle cell anaemia (SCA), the most prevalent hereditary disease in the world, presents, among many complications, endocrine-metabolic changes, especially growth retardation and puberty in children and adolescents. The final height of adults with SCA is, however, still controversial and there are few studies about it in literature. This dissertation consists of two original articles. In the first article, "Growth and puberty in a prospective cohort of patients with sickle cell anemia: assessment in ten years", it was observed that patients with SCA showed growth impairment and pubertal delay when compared to healthy controls, however, albeit belatedly, they reach normal sexual maturation. Moreover, they reached normal height in adulthood, unlike what occurred with weight and BMI, finding even more evident in males. In the second article, "Endocrine-metabolic profile of adults with sickle cell anemia", it was observed that men with SCA had higher levels of gonadotropins than controls. Levels of high density lipoprotein (HDL) and low density lipoprotein (LDL) cholesterol were lower in the SCA group. The high prevalence of low HDL (96%) in the SCA group and its positive correlation with the hemoglobin concentration and its negative correlation with reticulocytes count and leukocytes count the possibility of HDL be considered a marker to assist in predicting adverse clinical events in this population. Although it has not been observed difference in the levels of 25-hydroxyvitamin between the groups, there was a higher prevalence of its deficiency and insufficiency in SCA group, which enhances the risk, already existing in this population, of osteoporosis. The findings of both studies characterize patients with SCA about the evolution of their growth and development into adulthood and show endocrinemetabolic changes that deserve to be investigated during follow-up, in order to prevent other complications that can compromise their quality life. / A anemia falciforme (AF), doença hereditária mais prevalente no mundo, apresenta, dentre diversas complicações, alterações endócrino-metabólicas, destacando-se retardo de crescimento e puberdade em crianças e adolescentes. A estatura final dos adultos com AF, entretanto, ainda é controversa e pouco estudada na literatura. Esta dissertação é composta por dois artigos originais. No primeiro artigo, “Crescimento e puberdade em uma coorte prospectiva de pacientes com anemia falciforme: avaliação em dez anos”, observou-se que os pacientes com AF apresentaram comprometimento de crescimento e atraso puberal quando comparados a controles saudáveis, todavia, ainda que tardiamente, atingiram maturação sexual normal. Além disso, alcançaram estatura normal na idade adulta, diferentemente do que ocorreu com peso e IMC, achado ainda mais evidente no sexo masculino. No segundo artigo, “Perfil endócrino-metabólico de adultos portadores de anemia falciforme”, observou-se que os homens com AF apresentaram maiores níveis de gonadotrofinas. Níveis das lipoproteínas de alta densidade (HDL) e baixa densidade (LDL) também foram menores no grupo AF. A elevada prevalência de HDL reduzido (96%) no grupo AF e sua correlação positiva com a concentração de hemoglobina e negativa com contagem de reticulócitos, contagem de leucócitos apontam para a possibilidade de o HDL poder se configurar um marcador que auxilie na predição de eventos clínicos adversos nesta população. Apesar de não ter havido diferença dos níveis de 25-hidroxivitamina entre os grupos, constatou-se maior prevalência de sua deficiência e insuficiência no grupo AF, o que potencializa o risco, já existente nesta população, de osteoporose. Os achados de ambos os estudos caracterizam os pacientes com AF em relação à evolução de seu crescimento e desenvolvimento até a fase adulta e mostram alterações endócrinometabólicas que merecem ser investigadas durante seu seguimento, a fim de prevenir outras complicações que possam comprometer sua qualidade de vida.

Introdução: Na adolescência ocorre importante período de desenvolvimento sexual e acentuado crescimento corporal, caracterizado por alterações na quantidade e distribuição de gordura e massa magra diferente entre os sexos com importante impacto no estado nutricional, tanto atual como futuro. Objetivo: Analisar a associação entre maturação sexual e adiposidade em crianças e adolescentes. Método: Foi realizado estudo longitudinal com 617 estudantes de 8 a 18 anos de idade de duas escolas do município de São Paulo. Foram realizadas três coletas de dados com intervalo de 6 meses.. Dados de peso, estatura, perímetro da cintura foram coletados. O excesso de peso foi classificado com base nos valores críticos do índice de massa corporal (IMC) para crianças e adolescentes brasileiros. Valores de resistência (R), reactância (Xc), ângulo de fase e composição corporal foram obtidos por meio de impedância bioelétrica. O estágio de maturação sexual (EMS) foi auto-avaliado e os indivíduos foram distribuídos em quartis de idade segundo EMS e sexo. Foram comparados os indivíduos com maturação relativamente acelerada com os demais indivíduos. Resultados: Foi observada associação negativa entre escore z do IMC e idade de início da maturação sexual em meninos. A maturação sexual relativamente acelerada se associou com excesso de peso e com maior incremento nos valores de escore z do IMC. Meninas com maturação relativamente acelerada apresentaram maior adiposidade central. A maturação acelerada se associou a R/E, Xc/E e ângulo de fase e quantidade absoluta de massa magra. Menores vetores de impedância foram observados em meninas com maturação acelerada. Conclusão: A maturação sexual acelerada associouse a alterações nos parâmetros bioelétricos, composição corporal, maior incremento no IMC e obesidade em crianças e adolescentes / Adolescence is considered an important period of sexual development and an increase body-growth, characterized by changes in the amount and distribution of fat and lean mass distinct between sexes, with a significant impact on nutritional status, current and future. Objective: To evaluate the association between sexual maturation and adiposity in children and adolescents. Method: We conducted a longitudinal study with 617 students 8-18 years old from two schools in São Paulo. Were performed three data collections at intervals of six months. Data on weight, height, waist circumference were collected. Overweight was classified based on cutoffs of body mass index (BMI) for Brazilian children and adolescents. Resistance (R), reactance (Xc), phase angle (PA) and body composition values were obtained by bioelectrical impedance. The sexual maturation stage (SMS) was self-assessed and subjects were divided into quartiles of age second sex and SMS. We compared the subjects with relatively rapid maturation with other individuals. Results: We observed a negative association between BMI z score and age of onset of sexual maturation in boys. The relatively rapid sexual maturation was associated with overweight and greater increase in the values of z scores of BMI. Girls with relatively rapid maturation had higher central adiposity. The accelerated maturation was associated with R/H, Xc/H and PA and the absolute amount of lean mass. Lower impedance vectors were observed in girls with accelerated maturation. Conclusion: The accelerated sexual maturation was associated with changes in bioelectrical parameters, body composition, greater increase in BMI and obesity in children and adolescents

O Hipogonadismo hipogonadotrófico isolado (HHI) congênito é uma síndrome clínica rara causada por defeito na produção ou secreção do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) pelo hipotálamo ou por resistência hipofisária à ação do GnRH. O HHI é mais prevalente em homens e cerca de 50% a 60% dos indivíduos afetados apresentam anosmia ou hiposmia associada, caracterizando a síndrome de Kallmann. Diversos genes já foram associados à patogênese do HHI congênito, porém, a maioria dos casos ainda permanece sem diagnóstico molecular definido. Até recentemente, a identificação das causas genéticas dos pacientes com HHI era realizada por sequenciamento de genes candidatos, empregando a técnica de Sanger. No entanto, com o número crescente de genes descritos nos últimos anos, esse processo vem se tornando impraticável. Novas metodologias de sequenciamento (sequenciamento paralelo em larga escala) foram desenvolvidas permitindo a genotipagem simultânea de diversas regiões, com maior velocidade e menor custo relativo. O atual projeto foi desenvolvido com o objetivo de rastrear genes candidatos em pacientes portadores de HHI congênito utilizando-se o sequenciamento paralelo em larga escala, visando ampliar o conhecimento genético do HHI. Realizamos o sequenciamento paralelo em larga escala (SPLE) de 130 pacientes com HHI congênito utilizando um painel contendo 36 genes relacionados ao HHI. Inicialmente, identificamos 104 variantes, potencialmente patogênicas em 77 pacientes (59,2%). Após a filtragem inicial, foi realizada uma análise individualizada de cada variante e com isso foram mantidos 41 (31,5%) pacientes com variantes classificadas como patogênicas ou provavelmente patogênicas. Os genes KAL1, FGFR1, CHD7 e GNRHR foram os mais frequentemente afetados. Esses resultados confirmam a importância dos genes classicamente associados ao HHI congênito. Destaca-se a alta prevalência de variantes no CHD7 (10,8%), gene bastante extenso, levando à dificuldade técnica de sequenciá-lo pelos métodos tradicionais, até então sem estudos nessa coorte. O CHD7 é um gene originalmente associado à complexa síndrome de CHARGE, porém, nos últimos anos vem sendo cada vez mais associados ao HHI congênito. Dentre os resultados, ressaltamos a identificação de uma mutação inédita no gene GNRH1, causa rara de HHI, e a identificação de variantes deletérias no gene IGSF10, recentemente descrito associado ao atraso puberal, mas sem papel claro no fenótipo de HHI, em dois pacientes que tiveram reversibilidade do hipogonadismo. Variantes provavelmente patogênicas em genes com poucas descrições ou até mesmo sem relatos de associação ao fenótipo de HHI (SPRY4, FLRT3, IGSF1, NSMF, SOX10 e OTX2) também foram identificadas nessa coorte, ampliando nosso conhecimento genético do HHI. A oligogenicidade, previamente descrita com prevalência de 2,5% a 7%, em nosso estudo esteve presente em 22% dos pacientes, demonstrando uma ampliação das descrições de oligogenicidade quando comparados aos estudos prévios utilizando somente a técnica de Sanger. A nova técnica de sequenciamento genético (SPLE), utilizada em nosso estudo, foi capaz de ampliar de 22% para 31,5% (41 em 130 pacientes) a porcentagem de pacientes com diagnóstico molecular definido, quando comparado aos dados prévios utilizando a técnica de Sanger, mostrando-se rápida, confiável e eficaz / Congenital isolated hypogonadotropic hypogonadism (IHH) is a rare condition caused by GnRH deficiency, due to defective hypothalamic gonadotropin-releasing hormone (GnRH) production or secretion, or by pituitary resistance to the GnRH action. Congenital IHH is more prevalent in men and about 50% to 60% of affected individuals present with associated anosmia or hyposmia, characterizing Kallmann\'s syndrome. Several genes have already been associated with the pathogenesis of congenital IHH, but most cases still remain without a molecular diagnosis. Until recently, identification of the genetic causes of IHH was performed by sequencing candidate genes using the Sanger technique. However, with the growing number of genes and the genetic complexity of IHH, it has become almost impossible to keep the screening of all candidate genes updated using the traditional techniques. The advent of next-generation sequencing (NGS) has allowed the simultaneous genotyping of several regions, faster and with lower relative cost. The present project was developed with the objective of tracking candidate genes in patients with congenital IHH using large-scale parallel sequencing, in aiming to increase the genetic knowledge of this rare condition. A total of 130 unrelated patients with IHH was studied by targeted NGS, using a panel containing 36 IHH associated genes. Initially, 104 potentially pathogenic variants were identified in 77 patients (59.2%). However, after an individualized analysis of each variant, the number of patients considered to carry pathogenic or probably pathogenic variants dropped to 41 (31.5%). The genes KAL1, FGFR1, CHD7 and GNRHR were the most frequently affected and these results confirm the importance of genes classically associated with IHH. It is noteworthy the high prevalence of variants in CHD7 (10.8%), a rather extensive gene, leading to technical difficulty of sequencing by traditional methods, which had not been studied in this cohort. CHD7 is the causative gene of CHARGE syndrome, however it has been recently identified in a growing number of congenital IHH patients with or without additional features of the syndrome. Among the results, we emphasize a novel mutation in the GNRH1 gene, a rare cause of IHH, and the identification of deleterious variants in the IGSF10 gene, recently associated with pubertal delay but without a clear role in the IHH phenotype, in two patients with reversible hypogonadism. Probably pathogenic variants in genes with few descriptions or even no reports of association with the IHH phenotype (SPRY4, FLRT3, IGSF1, NSMF, SOX10 and OTX2) were also identified in this cohort, increasing the genetic knowledge of IHH. Oligogenicity, previously described with a prevalence of 2.5% to 7%, was observed in 22% of our patients, demonstrating an increase in oligogenicity cases when compared to previous studies using only the Sanger sequencing. In conclusion, targeted NGS was able to increase the percentage of patients with molecular diagnosis from 22% to 31.5% in our cohort when compared to the previous data using the Sanger sequencing, and has been shown to be a fast, reliable and effective tool in the molecular diagnosis of congenital IHH

Orientador: Wilma De Grava Kempinas / Texto em português e inglês / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T10:45:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Perobelli_JulianaElaine_D.pdf: 9640563 bytes, checksum: dea242a152c4f569490c3cdf5d5010c1 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Os desreguladores endócrinos são agentes químicos capazes de agir como agonistas ou antagonistas dos hormônios endógenos, interferindo na homeostasia do organismo. Como o sistema endócrino tem papel crítico sobre o desenvolvimento e função do sistema genital, este pode ser considerado um alvo particularmente vulnerável a perturbações endócrinas. A literatura apresenta dados sobre a exposição aos antiandrogênicos durante a vida pré-natal e adulta e suas consequências sobre a função reprodutiva de machos. Entretanto, poucos estudos se atentaram para as consequências da privação androgênica durante a pré-puberdade sobre o sistema genital masculino. A pré-puberdade corresponde à fase em que o epidídimo, órgão reprodutor masculino responsável pela maturação e estocagem dos espermatozoides, passa por importantes mudanças morfofuncionais, além de consistir em período de maior susceptibilidade aos desreguladores endócrinos. O objetivo do presente estudo foi avaliar as possíveis consequências da privação de andrógenos durante a pré-puberdade sobre a morfofisiologia do sistema genital masculino de ratos púberes e adultos, com ênfase sobre o epidídimo e qualidade espermática. A escolha por um agente antiandrogênico foi devida à vasta exposição ambiental e ocupacional da população mundial a este grupo de contaminantes. Ratos machos da variedade Wistar foram alocados em: grupo flutamida (25mg/Kg/dia de flutamida, via oral, do dia pós natal 21 ao 44) e controle (óleo de milho, via oral, durante o mesmo período). Os animais foram avaliados aos 50 dias e 75 dias de idade. Foram analisados os níveis séricos dos hormônios sexuais (LH, FSH e testosterona), níveis de testosterona intratesticular, peso de órgãos, histologia testicular e epididimária, imunohistoquímica para marcação de receptor androgênico (AR), proteína espermática 22 (SP22), calmodulina (CALM) e Rab11A em tecido epididimário, além de marcação de CALM e Rab11A no testículo e western blot para AR no epidídimo. Avaliações adicionais foram realizadas nos animais de 75 dias, como comportamento sexual, fertilidade após acasalamento natural e inseminação artificial, motilidade e morfologia espermática, contagens espermáticas nos testículos e epidídimos, análise do perfil proteico de membrana espermática e contagem de células de Sertoli. No grupo tratado com flutamida, os animais púberes apresentaram redução do peso dos órgãos sexuais, relacionado à diminuição na testosterona sérica, além de alteração no padrão de imunomarcação para AR e CALM no epidídimo. Os demais parâmetros foram comparáveis entre os grupos experimentais. Nos animais de 75 dias de idade que receberam flutamida observou-se alteração no padrão de imunomarcação para AR, CALM e Rab11A no epidídimo, diminuição do potencial de fertilidade após inseminação artificial, comprometimento da motilidade espermática, diminuição do número de espermatozoides na cabeça/corpo e cauda do epidídimo, aceleração do trânsito espermático nestas regiões epididimárias e alteração na concentração de CALM e Rab11A na membrana espermática. Os demais parâmetros foram similares entre os grupos experimentais. Os resultados obtidos mostram que a privação de andrógenos durante a pré-puberdade causou alterações na qualidade dos espermatozóides prejudicando o potencial de fertilidade dos indivíduos na idade adulta. Tais resultados parecem estar associados a mudanças no perfil proteico da membrana dos espermatozoides e na expressão de determinadas proteínas no epitélio epididimário, sugerindo que o desenvolvimento pós-natal do epidídimo pode ter sido comprometido, acarretando danos funcionais permanentes ao órgão / Abstract: Endocrine disrupters are chemicals that can act as agonists or antagonists of endogenous hormones, interfering with the homeostasis of the organism. Since the endocrine system plays a critical role in the development and function of the male reproductive system, this is an especially vulnerable target of potential endocrine perturbations. The literature presents data on exposure to antiandrogens during the prenatal life and adulthood and its consequences on the male reproductive function. However, few studies have investigated the possible effects on the male reproductive system of rats after androgen deprivation during prepuberty. The prepubertal period comprehends the phase in which the epididymis, male reproductive organ responsible for the sperm maturation and storage, undergoes significant morphofunctional changes, besides being a period of more vulnerability to endocrine disrupters, possibly due to hormonal imprinting. The aim of this study was to evaluate the possible consequences of androgen deprivation during the prepuberty on morphophysiology of male reproductive system of pubertal and adult rats, focusing on the epididymis and sperm quality. The choice of an antiandrogen agent was due to extensive environmental and occupational exposure of the general population to this group of contaminants. For this purpose, Wistar male rats were divided into flutamide group (flutamide 25mg/Kg/day, orally, from postnatal day 21 to 44) and control group (corn oil, orally, during the same period). The animals were evaluated at 50 days and 75 days of age. At both ages it was evaluated the serum sexual hormone levels, intra-testicular testosterone levels, organ weights, testicular and epididymal histopathology, immunohistochemistry for androgen receptor (AR), sperm protein 22 (SP22), calmodulin (CALM) and Rab11A in epididymal tissue, besides immunostaining for CALM and Rab11A in the testis and Western blot for AR in the epididymis. Furthermore, additional parameters were assessed in 75-day-old animals, such as sexual behavior, fertility after natural mating and after artificial insemination, sperm motility and morphology, sperm counts in the testis and epididymis, proteomic of sperm membrane by bi-dimensional electrophoresis and Sertoli cells counts. Pubertal animals showed reduced reproductive organs weight, probably due to a decrease in serum testosterone and changes in the pattern of immunostaining for AR and CALM in the epididymis. The other parameters were comparable between the groups. In animals at 75 days old changes in the pattern of immunostaining for AR, CALM and Rab11A in the epididymis, decreased fertility potential after artificial insemination, impaired sperm motility, decrease in the sperm numbers in the caput/corpus and cauda epididymis, acceleration of sperm transit time through these epididymal regions, and modifications in three proteins of sperm membrane were observed. Other parameters were similar between the groups. The results show that androgen deprivation during prepuberty impairs sperm quality affecting the fertility potential of the animals at adulthood. These results seem to be related to the changes in protein profile of sperm membrane and protein expression in the epididymis, suggesting that the postnatal development of the epididymis may have been compromised, causing permanent damage to the organ function / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

A ghrelina, hormônio secretado principalmente por células gástricas, liga-se ao seu receptor, o receptor de secretagogo de GH (GHSR - Growth hormone secretagogue receptor), localizado no hipotálamo e na hipófise, estimulando a síntese e secreção do GH. Recentemente foram identificadas mutações no gene GHSR em crianças com baixa estatura idiopática (BEI) e com deficiência isolada de GH (DGH). No presente estudo investigamos a presença de mutações no gene GHSR em crianças com DGH isolada de causa não identificada e crianças com BEI, incluindo um subgrupo de crianças com atraso constitucional de crescimento e desenvolvimento (ACCD). Foram selecionados 14 pacientes com deficiência isolada de GH sem alterações anatômicas da região hipotálamo-hipofisária e 96 pacientes com BEI, destes 31 (32%) apresentavam ACCD. Também foram estudados 150 controles adultos e 197 crianças controle com crescimento e puberdade normais. A região codificadora do GHSR foi amplificada utilizando-se oligonucleotídeos iniciadores específicos, seguida de purificação enzimática e seqüenciamento automático. Encontramos 6 variantes alélicas em heterozigose no GHSR: nenhuma delas presente nos controles estudados, e quatro destas variantes estão localizadas em regiões conservadas do gene. Uma variante foi encontrada em uma paciente do grupo DGH (p.Val249Leu) e as outras cinco (c.-6 G>C, p.Ser84Ile, p.Val182Ala, p.Ala169Thr e p.Ala358Thr) foram encontradas em pacientes do subgrupo ACCD do grupo BEI. As variantes missense foram submetidas a estudo funcional que evidenciou que as mutações p.Ser84Ile e p.Val182Ala possuem diminuição na atividade basal associadas à diminuição da expressão do receptor na superfície celular. Adicionalmente, a mutação p.Ser84Ile também apresenta redução na atividade do GHSR induzida pelo ligante. A variante p.Val249Leu foi encontrada em uma paciente do sexo feminino com diagnóstico de DGH isolado. A falta de segregação familiar associada à ausência de déficit funcional da variante nos estudos in vitro sugere que, neste caso, a variante p.Val249Leu não é a causa do fenótipo de DGH nesta família e trata-se de uma variante alélica rara. As 5 variantes alélicas no GHSR (c.-6 G>C, p.Ser84Ile, p.Val182Ala, p.Ala169Thr e p.Ala358Thr) encontradas nos pacientes com BEI foram identificadas apenas naqueles com puberdade atrasada, ou seja, pertencentes ao subgrupo ACCD (3 do sexo masculino e 2 do sexo feminino). A freqüência de variantes neste grupo de pacientes foi de 16%, significativamente maior que nos outros grupos, e a ausência de variantes gênicas novas no grupo de crianças obesas com altura normal e mesmo no grupo de crianças com BEI sem ACCD sugere que nosso achado não foi casual e que as alterações descritas podem estar associadas ao fenótipo de ACCD. Os estudos in vitro mostraram prejuízos funcionais em 2 destas variantes (p.Ser84Ile e p.Val182Ala) porém, devido à limitação dos estudos funcionais (celulas heterólogas) não podemos afastar que as demais não tenham algum impacto funcional in vivo. Em conclusão, nossos resultados sugerem um envolvimento dos defeitos no GHSR na etiologia do atraso constitucional do crescimento e desenvolvimento em uma parcela de pacientes com esta condição / Ghrelin, hormone secreted by gastric cells, stimulates growth hormone secretion by acting on its receptor GHSR, located in the hypothalamus and pituitary. Recently, mutations in the GHSR gene were described in patients with growth hormone deficiency (GHD) and idiopathic short stature (ISS). In the present study we analyzed the GHSR gene in patients with isolated GHD and patients with ISS, including a subgroup of patients with constitutional delay of growth and puberty (CDGP). We studied 14 GHD patients with normal pituitary magnetic resonance imaging and 96 patients with ISS, 31 of them with CDGP. We also studied 150 adults and in 197 children with normal stature. The entire coding region as well as the exon-intron boundaries of GHSR were PCR amplified in all patients and control group and PCR products were bidirectionally sequenced. Six different heterozygous variants in GHSR were identified: none of them were found in the control group and four of these amino acid substitutions occurred at a conserved position within the GHSR. One variant (p.Val249Leu) was found in a GHD patient and the other five (c.-6 G>C, p.Ser84Ile, p.Val182Ala, p.Ala169Thr e p.Ala358Thr) were found in patients with CDGP. The missense variants were submitted to functional studies. Two of these variants (p.Ser84Ile and p.Val182Ala) result in a decrease in basal activity that was in part explained by a reduction in cell surface expression. The p.Ser84Ile mutation was also associated with a defect in ghrelin potency. The p.Val249Leu variant, found in a female patient with isolated GHD, did not segregate with the phenotype in the family and had no functional impairment in vitro. This suggests that p.Val249Leu is not the cause of the GHD in the family and may be a rare allelic variant. The other variants (c.-6 G>C, p.Ser84Ile, p.Val182Ala, p.Ala169Thr e p.Ala358Thr) were identified only in patients with CDGP (3 male and 2 female). The frequency of allelic variants observed in this group (16%) was higher than expected by chance in contrast with ISS and GHD children, and the absence of other GHSR mutations in the large group of control children suggests that the association between GHSR mutations and CDGP phenotype is unlikely to be fortuitous. Functional studies revealed that two of the identified missense variants (p.Ser84Ile and p.Val182Ala) are functionally significant. These functional studies were performed in heterologous cell expression systems; therefore it is not possible to completely rule out that the other identified variants might cause some unrevealed impairment on GHSR function or expression in vivo. In conclusion, our data raise the possibility that abnormalities in ghrelin receptor function may be implicated in the ethiology of CDGP in some patients

A ghrelina, hormônio secretado principalmente por células gástricas, liga-se ao seu receptor, o receptor de secretagogo de GH (GHSR - Growth hormone secretagogue receptor), localizado no hipotálamo e na hipófise, estimulando a síntese e secreção do GH. Recentemente foram identificadas mutações no gene GHSR em crianças com baixa estatura idiopática (BEI) e com deficiência isolada de GH (DGH). No presente estudo investigamos a presença de mutações no gene GHSR em crianças com DGH isolada de causa não identificada e crianças com BEI, incluindo um subgrupo de crianças com atraso constitucional de crescimento e desenvolvimento (ACCD). Foram selecionados 14 pacientes com deficiência isolada de GH sem alterações anatômicas da região hipotálamo-hipofisária e 96 pacientes com BEI, destes 31 (32%) apresentavam ACCD. Também foram estudados 150 controles adultos e 197 crianças controle com crescimento e puberdade normais. A região codificadora do GHSR foi amplificada utilizando-se oligonucleotídeos iniciadores específicos, seguida de purificação enzimática e seqüenciamento automático. Encontramos 6 variantes alélicas em heterozigose no GHSR: nenhuma delas presente nos controles estudados, e quatro destas variantes estão localizadas em regiões conservadas do gene. Uma variante foi encontrada em uma paciente do grupo DGH (p.Val249Leu) e as outras cinco (c.-6 G>C, p.Ser84Ile, p.Val182Ala, p.Ala169Thr e p.Ala358Thr) foram encontradas em pacientes do subgrupo ACCD do grupo BEI. As variantes missense foram submetidas a estudo funcional que evidenciou que as mutações p.Ser84Ile e p.Val182Ala possuem diminuição na atividade basal associadas à diminuição da expressão do receptor na superfície celular. Adicionalmente, a mutação p.Ser84Ile também apresenta redução na atividade do GHSR induzida pelo ligante. A variante p.Val249Leu foi encontrada em uma paciente do sexo feminino com diagnóstico de DGH isolado. A falta de segregação familiar associada à ausência de déficit funcional da variante nos estudos in vitro sugere que, neste caso, a variante p.Val249Leu não é a causa do fenótipo de DGH nesta família e trata-se de uma variante alélica rara. As 5 variantes alélicas no GHSR (c.-6 G>C, p.Ser84Ile, p.Val182Ala, p.Ala169Thr e p.Ala358Thr) encontradas nos pacientes com BEI foram identificadas apenas naqueles com puberdade atrasada, ou seja, pertencentes ao subgrupo ACCD (3 do sexo masculino e 2 do sexo feminino). A freqüência de variantes neste grupo de pacientes foi de 16%, significativamente maior que nos outros grupos, e a ausência de variantes gênicas novas no grupo de crianças obesas com altura normal e mesmo no grupo de crianças com BEI sem ACCD sugere que nosso achado não foi casual e que as alterações descritas podem estar associadas ao fenótipo de ACCD. Os estudos in vitro mostraram prejuízos funcionais em 2 destas variantes (p.Ser84Ile e p.Val182Ala) porém, devido à limitação dos estudos funcionais (celulas heterólogas) não podemos afastar que as demais não tenham algum impacto funcional in vivo. Em conclusão, nossos resultados sugerem um envolvimento dos defeitos no GHSR na etiologia do atraso constitucional do crescimento e desenvolvimento em uma parcela de pacientes com esta condição / Ghrelin, hormone secreted by gastric cells, stimulates growth hormone secretion by acting on its receptor GHSR, located in the hypothalamus and pituitary. Recently, mutations in the GHSR gene were described in patients with growth hormone deficiency (GHD) and idiopathic short stature (ISS). In the present study we analyzed the GHSR gene in patients with isolated GHD and patients with ISS, including a subgroup of patients with constitutional delay of growth and puberty (CDGP). We studied 14 GHD patients with normal pituitary magnetic resonance imaging and 96 patients with ISS, 31 of them with CDGP. We also studied 150 adults and in 197 children with normal stature. The entire coding region as well as the exon-intron boundaries of GHSR were PCR amplified in all patients and control group and PCR products were bidirectionally sequenced. Six different heterozygous variants in GHSR were identified: none of them were found in the control group and four of these amino acid substitutions occurred at a conserved position within the GHSR. One variant (p.Val249Leu) was found in a GHD patient and the other five (c.-6 G>C, p.Ser84Ile, p.Val182Ala, p.Ala169Thr e p.Ala358Thr) were found in patients with CDGP. The missense variants were submitted to functional studies. Two of these variants (p.Ser84Ile and p.Val182Ala) result in a decrease in basal activity that was in part explained by a reduction in cell surface expression. The p.Ser84Ile mutation was also associated with a defect in ghrelin potency. The p.Val249Leu variant, found in a female patient with isolated GHD, did not segregate with the phenotype in the family and had no functional impairment in vitro. This suggests that p.Val249Leu is not the cause of the GHD in the family and may be a rare allelic variant. The other variants (c.-6 G>C, p.Ser84Ile, p.Val182Ala, p.Ala169Thr e p.Ala358Thr) were identified only in patients with CDGP (3 male and 2 female). The frequency of allelic variants observed in this group (16%) was higher than expected by chance in contrast with ISS and GHD children, and the absence of other GHSR mutations in the large group of control children suggests that the association between GHSR mutations and CDGP phenotype is unlikely to be fortuitous. Functional studies revealed that two of the identified missense variants (p.Ser84Ile and p.Val182Ala) are functionally significant. These functional studies were performed in heterologous cell expression systems; therefore it is not possible to completely rule out that the other identified variants might cause some unrevealed impairment on GHSR function or expression in vivo. In conclusion, our data raise the possibility that abnormalities in ghrelin receptor function may be implicated in the ethiology of CDGP in some patients

O complexo de sinalização kisspeptina-GPR54 é um regulador chave para ativação dos neurônios de GnRH e do eixo reprodutivo. Mutações inativadoras no GPR54 foram identificadas em pacientes com hipogonadismo hipogonadotrófico normósmico isolado (HHIn). A partir desse achado, hipotetizamos que mutações ativadoras no GPR54 resultariam na liberação prematura de GnRH e, conseqüentemente, no aparecimento de puberdade precoce, dependente de gonadotrofinas (PPDG). No presente estudo, investigamos a presença de mutações ativadoras e/ou polimorfismos em pacientes com PPDG, assim como a presença de mutações inativadoras e/ou polimorfismos em pacientes HHIn ou retardo constitucional do crescimento e desenvolvimento puberal (RCCP). Cento e catorze pacientes com distúrbios puberais centrais idiopáticos foram selecionados, sendo 53 com PPDG, 33 com HHIn e 28 com RCCP. Cento e cinqüenta controles brasileiros que relatavam desenvolvimento puberal normal foram estudados. A região codificadora do GPR54 de todos os pacientes foi amplificada utilizando-se oligonucleotídeos intrônicos específicos, seguida de purificação enzimática e seqüenciamento automático. No grupo de puberdade precoce, identificamos uma nova variante em heterozigose no exon 5 do GPR54, que se caracterizou pela troca do aminoácido arginina por prolina na posição 386 (R386P) do receptor. Esta substituição foi encontrada em uma menina adotada com PPDG e estava ausente nos controles normais. Estudos in vitro demonstraram que as quantidades de fosfatidil-inositol (IP) e o grau de fosforilação da quinase regulada por sinal extracelular (pERK) em condições basais não foram significativamente diferentes entre as células transfectadas com o receptor selvagem ou com o receptor contendo a mutação R386P, indicando que não havia ativação constitutiva do receptor. No entanto, estudos por tempos mais prolongados demonstraram que a quantidade de IP e o grau de pERK permaneceram significativamente mais altos nas células transfectadas com o receptor mutante quando comparadas ao selvagem, indicando ativação da sinalização intracelular, porém por um mecanismo não-constitutivo. No grupo de hipogonadismo, duas novas variantes foram identificadas em três pacientes. Uma mutação do tipo inserção/deleção (indel) em homozigoze no sítio aceptor de splicing no intron 2 (IVS2-4_-2delGCAinsACCGGCT) do GPR54 foi identificada em dois irmãos com HHIn. Uma troca em heterozigose, E252Q, foi identificada em um paciente com HHIn esporádico. As duas alterações estavam ausentes no grupo controle. Polimorfismos foram encontrados nos pacientes com RCCP. Em conclusão, descrevemos a primeira mutação ativadora do GPR54 associada ao fenótipo de PPDG. Descrevemos uma nova mutação inativadora em sítio de splicing em pacientes com HHIn, entretanto mutações inativadoras do GPR54 são uma causa rara de HHIn. / The kisspeptin-GPR54 signaling complex is a gatekeeper of pubertal activation of GnRH neurons and of the reproductive axis. Inactivating mutations in the GPR54 receptor were identified in patients with normosmic isolated hypogonadotropic hypogonadism (nIHH). Based on this observation, we hypothesized that gain-of-function mutations of the human GPR54 receptor might be associated with premature activation of GnRH release, leading to gonadotropin-dependent precocious puberty (GDPP). In the present study, we investigated the presence of GPR54 activating mutations or polymorphisms in patients with GDPP and inactivating mutations or polymorphisms in patients with nIHH or constitucional delay of puberty (CDP). A hundred fourteen patients were selected; 53 with GDPP, 33 with nIHH and 28 with CDP. A hundred and fifty Brazilian controls who reported normal pubertal development were also studied. The entire coding region of GPR54 of all patients was amplified using specific intronic oligonucleotides followed by enzymatic purification and automated sequencing. We have identified a novel variant in heterozygous state in exon 5 of GPR54, R386P, in an adopted girl with GDPP. This substitution was absent in all controls. Basal inositol phosphate (IP) and phosphorilated extracellular signalregulated kinase (pERK) levels in cells transfected with WT or R386P GPR54 were not significantly different indicating that there was not a constitutive activation of the receptor. However, studies performed in more prolonged times demonstrated that the IP and the pERK levels were significantly higher in cells transfected with the mutant receptor when compared to the wild type, indicating that the signaling pathway was still activated although by a non-constitutive mechanism. In the nIHH cohort, we have identified two novel variants in three patients. The first variant was an insertion/deletion (indel) in homozygous state within the constitutive acceptor splice site of intron 2 of GPR54 (IVS2-4_-2delGCAinsACCGGCT) identified in two male siblings with nIHH. The second variant was the change E252Q in heterozygous state in a patient with sporadic nIHH. Both alterations were absent in the control population. We have found only polymorphisms in patients with CDP. In conclusion, we have described the first activating mutation in GPR54 associated with the GDPP phenotype. We have also described a novel splice site inactivating mutation in patients with nIHH however, inactivating mutations of GPR54 represent a rare cause of nIHH.

Mutações inativadoras nos genes TAC3 e TACR3, os quais codificam a neurocinina B (NKB) e o seu receptor NK3R, respectivamente, foram descritas em pacientes com hipogonadismo hipogonadotrófico isolado (HHI) normósmico. A partir desse achado, hipotetizamos que mutações ativadoras na NKB e/ou NK3R resultariam na secreção prematura de GnRH e, consequentemente, no desenvolvimento de puberdade precoce dependente de gonadotrofinas (PPDG). Nesse estudo, investigamos a presença de mutações ativadoras e/ou polimorfismos nos genes TAC3 e TACR3 em pacientes com PPDG, bem como mutações inativadoras e/ou polimorfismos nesses genes em pacientes com retardo constitucional do crescimento e desenvolvimento (RCCD), e HHI normósmico. Duzentos e trinta e sete pacientes com distúrbios puberais centrais idiopáticos foram selecionados, sendo 114 com PPDG, 50 com RCCD, e 73 com HHI normósmico. Um grupo de 150 indivíduos que apresentaram desenvolvimento puberal normal foi utilizado como controle. As regiões codificadoras dos genes TAC3 e TACR3 foram amplificadas pela reação em cadeia da polimerase, seguido de purificação enzimática e seqüenciamento automático direto. Análises in silico e in vitro foram realizadas. Um nova variante foi identificada no gene TAC3, p.A63P, em uma paciente do sexo feminino com PPDG, a qual desenvolveu puberdade aos sete anos de idade. Essa variante (p.A63P) está localizada na proneurocinina B, e análises in silico sugeriram que ela não altera sítios constitutivos de splicing e é benigna para a estrutura da proteína. A análise de segregação familiar mostrou que a mãe da paciente, a qual apresentou um desenvolvimento puberal normal, também apresentava a alteração p.A63P em heterozigose, sugerindo que essa variante não desempenha um papel direto no fenótipo de PPDG. Uma nova variante em heterozigose no gene TACR3, p.A449S, foi identificada em uma paciente do sexo feminino com RCCD, que teve início puberal aos treze anos de idade. A análise do grau de conservação da alanina na posição 449 mostrou que esse aminoácido não é conservado entre as diferentes espécies, e análises in silico sugeriram que essa variante não altera os sítios constitutivos de splicing, e é benigna para a estrutura do NK3R. Três novas variantes no NK3R foram identificadas, p.G18D, p.L58L (c.172C>T) e p.W275*, em três pacientes do sexo masculino não relacionados com HHI normósmico. As variantes p.G18D e p.L58L foram identificadas em heterozigose, enquanto que a variante p.W275* foi identificada em heterozigose associada a variante silenciosa p.L58L (c.172C>T), e em homozigose em outro paciente. Análises in silico sugeriram que a variante p.G18D poderia afetar a funcionalidade do NK3R. Estudos in vitro dessa nova variante foram realizados, e mostraram que a mesma não altera a função do NK3R, visto que o aumento na produção de fosfatidil inositol não diferiu significativamente entre o receptor mutado e selvagem. Todas as novas variantes descritas nos genes TAC3 e TACR3 não foram identificadas em 300 alelos controles. Em conclusão, nosso trabalho identificou novas variantes nos genes TAC3 e TACR3 em pacientes brasileiros com distúrbios puberais centrais idiopáticos, e confirmou o envolvimento do complexo NKB/NK3R na etiologia do HHI normósmico / Inactivating mutations of the TAC3 and TACR3 genes, which encode the neurokinin B (NKB) and its receptor, NK3R, respectively, were described in patients with normosmic isolated hypogonadotropic hypogonadism (IHH). Based on these observations, we hypothesized that gain-of-function mutations in the NKB and/or NK3R might be associated with premature activation of GnRH release, leading to gonadotropin-dependent precocious puberty (GDPP). In this study, we investigated the presence of activating mutations and/or polymorphisms in the TAC3 and TACR3 genes in patients with GDPP, and inactivating mutations and/or polymorphisms in these genes in patients with constitutional delay of growth and puberty (CDGP) and normosmic IHH. It was selected 237 patients with idiopathic central pubertal disorders: 114 with GDPP, 50 with CDGP, and 73 with normosmic IHH. Indeed, a group 150 individuals who had puberty at adequate age was used as controls. The coding regions of TAC3 and TACR3 genes were amplified by polymerase chain reaction followed by enzymatic purification and direct automatic sequencing. In silico and in vitro analyses were performed. A new heterozygous variant in the TAC3 gene, p.A63P, was identified in a Brazilian girl with GDPP who had puberty onset at seven years of age. The p.A63P variant was located in the proneurokinin B and in silico analysis suggested that this variant does not alter constitutive splice sites, and it was benign to the protein. The segregation analysis revealed that her mother was heterozygous for the p.A63P variant (who had a normal pubertal development), suggesting that this variant does not play a role in the GDPP phenotype. It was identified a new heterozygous variant, p.A449S, in the TACR3 gene in a Brazilian girl with CDGP, who had puberty onset at thirteen years of age. Conservation degree analysis of alanine at position 449 showed that this amino acid is not a conserved residue among different species. In silico analyses suggested that this new variant does not alter splice sites or affects the structure of NK3R. Indeed, it was identified three new distinct variants in the TACR3 gene, p.G18D, p.L58L (c.172C>T) and p.W275*, in three unrelated males with normosmic IHH. Both p.G18D and p.L58L (c.172C>T) were identified in heterozygous state, and the p.W275* variant was identified in two of these males, since one in homozygous and in another in heterozygous state in association with the silent variant p.L58L (c.172C>T). In silico analyses suggested that p.G18D might be damaging to the NK3R. In vitro studies of this variant (p.G18D) showed that the amount of inositol phosphate (IP) was not significantly different in cells transfected with the p.G18D mutant receptor than in cells transfected with the wild type receptor, indicating that this variant did not alter the function of the neurokinin B receptor. All new variants identified in the TAC3 and TACR3 genes were absent in 300 control alleles. In conclusion, we identified new variants in the TAC3 and TACR3 genes in Brazilian patients with idiopathic central pubertal disorders. We confirm the key role of the NKB/NK3R complex in the etiology of normosmic IHH