Made available in DSpace on 2016-06-02T20:35:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6656.pdf: 3440001 bytes, checksum: e741a521796c90cb1416917d9ca4cb14 (MD5) Previous issue date: 2015-03-27 / Universidade Federal de Sao Carlos / The aim of this work is search for cysteine proteases inhibitors using a bioactivity-guided assay. We have selected different plants for the initial screening. Among all evaluated extracts, the ones obtained from Myrcia lingua Berg. showed to be the most potent. Cathepsin B and L are cysteine proteases which play a role in the degradation of extracellular matrix and facilitate tumor progression. Among the obtained inhibitors, flavonoids were the most active against CTSB (IC50 values from 4.9 to 37.2 μM). On the other side, triterpenes were more potent against CTSL (IC50 values from 2.4 to 39.5 μM). The triterpenes showed competitive inhibition and the flavonoids showed uncompetitive inhibition. Aiming to explore enzyme inhibition on tumor cells, we report proteolysis assay using live cell 3D model that allows to localize and to quantify proteolysis in live triple negative breast cancer cells. The natural inhibitors isolated from plants were evaluated against proteases on cell lysate but did not demonstrate good inhibition and we decided to evaluate synthetic cathepsin B inhibitors. A dipeptide nitrile compound (JK_1) was synthesized and then complexed with ruthenium II (JK_2). Caged bioactive molecules that can be active upon irradiation became a strategy to reduce side effects in surrounding tissues and facilitate spatial control over cysteine protease activity. On pure enzyme activity assay JK_2 was less active under dark (IC50 3.4 μM) comparing with light irradiation (IC50 0.3 μM), corresponding to a ratio of 12:1. Proteolysis assay using live cell demonstrated the inhibition of DQ-collagen IV by reducing fluorescence. Thus, the outcomes of this study could contribute to identify new hits for the development of potential anticancer drugs, once live cell imaging proteolysis assay is useful for verifying the efficacy of cathepsin inhibitors prior to testing in in vivo models. / Este trabalho apresenta o estudo biomonitorado de espécies de plantas do cerrado paulista na busca de inibidores enzimáticos de catepsinas B e L. Dentre todos os extratos avaliados, a espécie Myrcia lingua Berg. se destacou pela elevada potência. Para avaliação da inibição enzimática foram selecionadas as catepsinas B e L, que são cisteíno proteases responsáveis pela degradação da matriz extracelular. Foram isolados compostos bioativos de diferentes classes sendo que os flavonoides foram os mais ativos sobre CTSB (IC50 entre 4,9 - 37,2 μM) e os triterpenos mais eficazes sobre CTSL (IC50 entre 2,4 - 39,5 μM). Os triterpenos foram identificados como inibidores competitivos da CTSL e os flavonoides como inibidores incompetitivos da CTSB. Com intuito de realizar investigação mais detalhada ao nível celular, optou-se por realizar ensaios de avalição da proteólise tumoral in vitro em linhagens de câncer de mama triplamente negativa. Os inibidores naturais apresentaram resultados pouco satisfatórios e com isso buscou-se avaliação de inibidores sintéticos de proteases. O composto sintético dipeptídeo nitrila (JK_1), inibidor da CTSB, foi complexado com rutênio II (JK_2) e através da reação de fotoativação buscou-se uma estratégia para delimitar a ação tecidual dos inibidores como forma de obter uma melhor localização do efeito terapêutico na região tumoral. Sobre a catepsina B o inibidor JK_2 foi menos ativo no escuro (IC50 3,4 μM) quando comparado ao exposto a radiação (IC50 0,3 μM) apresentando uma razão de 12:1. Nos ensaios de proteólise tumoral 3D vizualizou-se inibição da degradação de DQ-colágeno IV através da redução da fluorescência. Deste modo, os resultados obtidos contribuem para a busca de novos protótipos, uma vez que os ensaios proteolíticos em células permitem uma avaliação mais detalhada dos inibidores das proteases, antes de serem encaminhados para testes in vivo.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:35:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseMRA.pdf: 5275801 bytes, checksum: 8e03e586571c9a0adab0d1525691c66a (MD5) Previous issue date: 2003-11-18 / Universidade Federal de Sao Carlos / This work describes the phytochemical study of two plant species Galipea bracteata and Ravenia infelix belonging to the family Rutaceae, aiming the isolation and structure determination of componds from leaves and branches of these plants. This work is also directed to the search of trypanocidal and leishmanicidal compounds from these plants. The following models were used to check the biological activities of the isolated compounds: antiparasitc activity - trypomastigote form of Trypanosoma cruzi in vitro , enzymatic inhibitory activity on gGAPDH (Glyceraldeyde 3- phosphate dehidrogenase) of T. cruzi and enzymatic inhibitory activity on APRT (Adheninephosphoribosyl- transferase) of Leishmania tarentolae. The leaves extract of G. bracteata afforded tirtheen quinoline alkaloids. Among these compounds seven have been described for the first time: 2-(3 ,4 -methylenedioxyphenylethyl)quinoline, 4- methoxy-2-(propan-1 -ona)quinoline (inedit), 4-methoxy-2-(1 ,2 -transepoxypentyl) quinoline (inedit), 4-methoxy-2-n-heptylquinoline, 2-(1 ,2 -transepoxypentyl) quinoline (inedit), 4-methoxy-2-(3 ,4 - methylenedioxyphenylethyl)quinoline, 4-methoxy-2-(1 ,2 -trans-epoxypropyl)quinoline (inedit), 4-methoxy-2-n-propylquinoline, 2-n-pentylquinoline, 2-(propan-1 - one)quinoline (inedit), 4-methoxy-2-(pentan-1 -one)quinoline (inedit), 2-(pentan-1 - one)quinoline (inedit), a mixture of steroids campesterol, stigmasterol and sitosterol, one furoquinoline alkaloid evolitrine, a mixture of seco-furoquinoline alkaloids Edimethylrhoifolinate and Z-dimethylrhoifolinate, a pentacylclic triterpene arborinol and norsesquiterpene 3,5-dihydromegastigma-6,7-diene-9-one. From the branches of R. Infelix were isolated the carbazole alkaloids: 3-methylcarbazole and girinimbin, the steroids: 7-oxo-stigmasterol and 7-oxo-sitosterol, the indol 3-carboxaldeheide and mixtures of amides: N-trans and N-cis-feruloyltyramine, and N-trans and-cis-pcumaroyltyramine. The pure compounds had their trypanocidal and leishmanicidal activities determined. / O presente trabalho descreve o estudo fitoquímico de duas espécies de plantas pertencentes à família Rutaceae, no intuito de elucidar estruturas de micromoléculas presentes nas folhas e galhos. O estudo de Galipea bracteata e Ravenia infelix (Rutaceae) está também associado à busca de metabólitos com atividades tripanocida e leishmanicida, através dos seguintes modelos experimentais selecionados para verificação da atividade biológica: atividade antiparasitária forma tripomastigota de Trypanosoma cruzi in vitro , inibição enzimática in vitro (gGAPDH - Gliceraldeído- 3-fosfato-desidrogenase de T. cruzi) e inibição enzimática in vitro (APRT Adenina-fosforribosil-transferase de Leishmania tarantolae). Dos extratos das folhas de Galipea bracteata foram isolados treze alcalóides quinolínicos, dentre estas substâncias sete estão sendo descritas pela primeira vez: 2-(3 ,4 - metilenodioxifeniletil)quinolina, 4-metoxi-2-(propan-1 -ona)quinolina (inédita), 4- metoxi-2-(1 ,2 -trans-epoxipentil)quinolina (inédita), 4-metoxi-2-n-pentilquinolina, 4-metoxi-2-n-heptilquinolina, 2-(1 ,2 -trans-epoxipentil)quinolina (inédita), 4-metoxi-2- (3 ,4 -metilenodioxifeniletil)quinolina, 4-metoxi-2-(1 ,2 -trans-epoxipropil)quinolina (inédita), 4-metoxi-2-n-propilquinolina, 2-n-pentilquinolina, 2-(propan-1 - ona)quinolina (inédita), 4-metoxi-2-(pentan-1 -ona)quinolina (inédita), 2-(pentan-1 - ona)quinolina (inédita), mistura dos esteróides campesterol, estigmasterol e β- sitosterol, um alcalóide furoquinolínico evolitrina, uma mistura de alcalóides seco furoquinolínicos E e Z-rhoifolinato de dimetila, o triterpeno pentacíclico arborinol e o norsesquiterpeno 3,5-diidromegastigma-6,7-dieno-9-ona. Dos galhos de R. infelix foram isolados os alcalóides carbazóis: 3-metilcarbazol e girinimbina, os esteróides: 7-oxo-estigmasterol e 7-oxo-β-sitosterol, o indol: indol-3-carboxaldeído e misturas das amidas N-trans e N-cis-feruloiltiramina e N-trans-p e N-cis-p-cumaroiltiramina. Estas substâncias puras foram submetidas a testes para verificação das atividades tripanocida e leishmanicida.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2066.pdf: 3869548 bytes, checksum: 919d361643b7d2da104c8bf183496f29 (MD5) Previous issue date: 2008-07-18 / Financiadora de Estudos e Projetos / This work presents the phytochemical study and biological assays carried out with organic extracts of fruits and seeds from Trichilia claussenii, T. elegans and inflorescence from T. catigua against S. frugiperda. Among the extracts assayed, the methanol extracts of seeds from T. claussenii and inflorescence from T. catigua presented the highest insecticidal activity, with 64,0 and 64,4 % of mortality, respectively. The bioassay-guided study of the methanol extract of seeds from T. claussenii led to identification of ��-phenylalkyl and alkenyl fatty acids, active substances in this extract. The flavonoid ent-catequin was isolated from the methanol extract of inflorescence from T. catigua and it was associated with the insecticidal activity found in this extract. Fatty acids with the methylene chains ranging from C-5 to C-16 were assayed against S. frugiperda. Tests showed that the hexanoic, nonanoic and decanoic acids, displayed the highest rate of mortality at concentration of 10,0 mg/mL. The study of the three species allowed isolating and identifying the following compounds: a mixture of ��-phenylalkyl and alkenyl fatty acids, ��-lactonas, 4-hydroxy-N-methylproline, N-methylproline, uridine, uracile, entcatequin, 5-O-cafeoylquinic acid and the steroids 3-��-O-��-Dglucopyranosilsitosterol, ��-sitosterol, campesterol, estigmasterol e sitostenone. The limonoids 11��-acetoxyobacunone and 1,2-dihiyro-1��-acetoxy-11��-acetoxy-14,15-epoxycneorin R were isolated for the first time from a Trichilia species. / Este trabalho apresenta o estudo fitoquímico e os ensaios biológicos realizados com os extratos orgânicos dos frutos e sementes das espécies Trichilia claussenii, T. elegans e inflorescências T. catigua sobre Spodoptera frugiperda. Dentre os extratos ensaiados, os extratos metanólicos das sementes de T. claussenii e inflorescências de T. catigua foram os que apresentaram a mais alta atividade inseticida, com 64,0 e 64,4 % de mortalidade, respectivamente. O estudo biomonitorado do extrato metanólico das sementes de T. claussenii levou a identificação dos ácidos ��-fenil alcanóicos e alquenóicos, substâncias ativas neste extrato. Do extrato metanólico das inflorescências de T. catigua foi isolado o flavonóide ent-catequina, associado à atividade inseticida encontrada neste extrato. Ácidos graxos com cadeias metilênicas variando entre C-5 a C-16 foram testados sobre S. frugiperda. Ensaios mostraram que os ácidos hexanóico, nonanóico e decanóico apresentaram altas taxas de mortalidade na concentração de 10,0 mg/mL. Através do estudo dessas três espécies foi possível isolar e ou identificar as substâncias: ácidos ��-fenil alcanóicos e alquenóicos, ��-lactonas, 4-hidróxi-N-metilprolina, N-metilprolina, uridina, uracila, ent-catequina, ácido 5-O-cafeoilquínico, os esteróides 3-��-O-��-D-glucopiranosil sitosterol, ��-sitosterol, campesterol, estigmasterol e sitostenona. Sendo os limonóides 11��-acetoxiobacunona e 1,2 diidro-1��-acetoxi-11��-acetoxi-14,15-epoxicneorina R isolados pela primeira vez no gênero Trichilia.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2615.pdf: 18346818 bytes, checksum: cbb0d052858bc090e2fec94d65898822 (MD5) Previous issue date: 2009-09-11 / Universidade Federal de Minas Gerais / The control of agriculture plague is relevant to Brazil that has large crop area. The control, by natural product, generally low toxic to humans and to animals and specific to target plague, is recommended. This work presents the phytochemical and insecticide assays carried out with organic extracts of leaves and stems of Rauia sp. Among the tested extracts, the stem extracts were more active on leaf cutter ants (Atta sexdens rubropilosa) and the extracts of leaves were more active against fall armyworm (Spodopera frugiperda). The study of dichloromethane extracts of the stem led to the identification of active substances: sitosterol, stigmasterol, campesterol, clovane-2β,9α-diol, apigenin 6-C-neohesperidosyl-8-Cglucopyranoside, apigenin 6-C-glucopyranosyl-8-C-neohesperidoside, 2 -Orhamnosyl- vitexin, 2 -O-rhamnosyl-isovitexin, vitexin, isovitexin, apigenin 6-C-β- D-glucopyranosyl-8-C-(2 -O-α-L-arabinopyranosyl-β-D-glucopyranoside), apigenin 6-C-(2 -O-α-L-arabinopyranosyl-glucopyranosyl)-8-C-β-Dglucopyranoside, vicenin-2, schaftoside, neoschaftoside, isoschaftoside e neoisoschaftoside. The sesquiterpene clovane-2β,9α-diol and glycosides flavonoids were been reported for the first time in the genus Rauia. / O controle de pragas agricolas e muito relevante para o Brasil, que tem grandes areas plantadas. Este controle, realizado por produtos naturais, geralmente menos toxicos ao ser humano e animais e especifico a determinada praga, e altamente recomendado. Este trabalho apresenta o estudo fitoquimico e os ensaios inseticidas realizados com os extratos organicos de folhas e caule de Rauia sp. Dentre os extratos ensaiados os do caule foram mais ativos sobre formigas cortadeiras (Atta sexdens rubropilosa) e os extratos das folhas foram mais ativos sobre a lagarta do cartucho-do-milho (Spodoptera frugiperda). O estudo quimico do extrato diclorometano do caule levou a identificacao das substancias: sitosterol, estigmasterol, campesterol, clovane-2β,9α-diol, apigenina 6-C-neohesperidosil-8-C-glucopiranoside, apigenina 6-Cglucopiranosil- 8-C-neohesperidoside, 2 -O-raminosil-vitexina, 2 -O-raminosilisovitexina, vitexina, isovitexina, apigenina 6-C-β-D-glucopiranosil-8-C-(2 -O-α- L-arabinopiranosil-β-D-glucopiranoside), apigenina 6-C-(2 -O-α-Larabinopiranosil- glucopiranosil)-8-C-β-D-glucopiranoside, vicenin-2, schaftoside, neoschaftoside, isoschaftoside e neoisoschaftoside. Dentre os compostos isolados, o sesquiterpeno clovane-2β,9α-diol e os flavonoides glicosilados sao relatados pela primeira vez no genero Rauia.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2881.pdf: 3532657 bytes, checksum: 5670ee3071139d4a77feaf760225b2f8 (MD5) Previous issue date: 2010-03-05 / Universidade Federal de Minas Gerais / Studies about interaction between microorganisms and plants are focused mainly in the vegetal tissues like roots, steam and leaves. Fruits are a right target for microorganism attacks. Nevertheless, endophytic microorganisms isolated from fruits, seems to be not so explored in chemical point of view. Thus, in this work, it was developed the chemical study about the metabolism referred to endophytic microorganisms from edible fruits, commonly consumed in Brazil: banana, pear, apple and guava fruit. Through HPLC/UV analysis, it were realized and compared, the isolated microorganisms metabolic development, in different media cultures. It was included the media with the proper host fruits. The indolic alkaloid n-acetiltryptamine was isolated from a extract of the bacteria associated to the pear fruit (BP1). From the extracts of guava fruit endophytic fungus, Cladosporium uredinicola (FG1), it were isolated four new depsides in literature: 3-hidroxi-2,5-dimetilfenil 2,4-diidroxi-3,6-dimetilbenzoate (D1), 3-hidroxi-2,4,5-trimetilfenil 2,4-diidroxi-3,6-dimetilbenzoate(D2), 3-hidroxi-2,5- dimetilfenil 3-[(2,4-diidroxi-3,6-dimetilbenzoatoil)oxi]-6-hidroxi-2,4-dimetilbenzoate (D3) e 3-hidroxi-2,4,5-trimetilfenil 3-[(2,4-diidroxi-3,6-dimetilbenzoatoil)oxi]-6- hidroxi-2,4-dimetilbenzoate (D4). The identification of these metabolites was performed according to the respective data from RMN 1 D and 2D, and MS of high and low resolution. It was checked the MIC intervals of D1, D3 and D4 against five tested bacteria. It was realized the bactericide activity of D1 in a concentration of 25μg/mL against Pseudomonas aeruginosa and Bacillus subtilis. It was also verified the photosynthesis inhibitory activity of depsides D1 and D3 produced by the fungus. The fungus C.uredinicola, showed a great depsides production ability. However, this production showed signifcants alterations when fenolic substrates were given to the fungus, in a usual culture media. The estimative of D3 and D4 production curve was also established. The LC-MS/MS technique use, allowed the selective depsides D3 and D4 detection in guava fruit extract, in low concentration ranges. / Estudos envolvendo a interação entre micro-organismos e plantas enfocam predominantemente tecidos vegetais como raízes, caules e folhas. Embora os frutos sejam alvos fáceis de ataques microbianos, micro-organismos endofíticos de frutos parecem não ser tão explorados do ponto de vista químico. Sendo assim, neste trabalho, buscou-se enfatizar o estudo químico do metabolismo referente à microbiota endofítica de frutos comestíves popularmente consumidos no Brasil, a banana, a pêra, a maçã e a goiaba. Através de análises por HPLC/UV, foram verificados e comparados os desenvolvimentos metabólicos, em diferentes meios de cultura, dos micro-organismos isolados, incluindo àqueles constituídos com as próprias frutas hospedeiras. Foi isolado o alcalóide indólico Nacetiltriptamina a partir de um extrato da bactéria associada à pêra (BP1). Dos extratos do fungo Cladosporium uredinicola (FG1), associado à goiaba, foram isolados quatro novos depsídeos na literatura: 2,4-diidroxi-3,6-dimetilbenzoato de 3-hidroxi-2,5- dimetilfenila (D1), 2,4-diidroxi-3,6-dimetilbenzoato de 3-hidroxi-2,4,5-trimetilfenila (D2), 3-[(2,4-diidroxi-3,6-dimetilbenzoatoil)oxi]-6-hidroxi-2,4-dimetilbenzoato de 3- hidroxi-2,5-dimetilfenila (D3) e 3-[(2,4-diidroxi-3,6-dimetilbenzoatoil)oxi]-6-hidroxi- 2,4-dimetilbenzoato de 3-hidroxi-2,4,5-trimetilfenila (D4). A identificação destes metabólitos foi realizada de acordo com os respectivos dados de RMN 1 D e 2D e EM de alta e baixa resolução. Foram verificados os intervalos de MIC para D1, D3 e D4, frente a cinco bactérias testadas, destacando-se a atividade bactericida de D1, a 25μg/mL, contra Pseudomonas aeruginosa e Bacillus subtilis. Verificou-se também a atividade inibitória da fotossíntese de D1 e D3. Contudo, o fungo C.uredinicola, mostrou-se como um potente produtor de depsídeos. Esta produção mostrou significativas alterações quando compostos fenólicos foram administrados ao fungo junto ao meio de cultura usual de crescimento. Foi também estabelecida a estimativa da curva de produção para os metabólitos D3 e D4 produzidos pelo fungo. A utilização da técnica LC-MS/MS permitiu a detecção seletiva dos depsídeos D3 e D4 em extrato da fruta goiaba em baixas faixas de concentração.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3319.pdf: 2932784 bytes, checksum: aa83dbe471fd9212cf9627499f143f8a (MD5) Previous issue date: 2010-08-13 / Universidade Federal de Minas Gerais / Alzheimer's disease is associated with decreased rates of acetylcholine (ACh) in synaptic process, decreasing the cortical cholinergic transmission, and other neurotransmitters such as norepinephrine, dopamine, serotonin, glutamate and substance P in lesser extension. Some drugs used to treat Alzheimer's disease available in the market are inhibitors of acetylcholinesterase enzyme (AChE). The aim of this work was synthesize and evaluate a library of coumarins with respect to inhibitory activity against AChE in IMERs (Immobilized Enzyme Reactor). This study could contribute to establish the structure-activity relationships and the rational design of possible drugs to treat the Alzheimer's disease. During the development of the project it was used the Knoevenagel condensation between salicyladehydes and diethyl malonate to obtain coumarins. The functionalization of the coumarins had been carried by amidation, nucleophilic substitution, multicomponent and cross coupling reactions. The Suzuki reaction has proved to be an interesting tool to obtain 8-substituted coumarins, a method that has not yet been described in the literature. In total 23 compounds were synthesized. The inhibitory activity of the synthesized compounds was evaluated using Ellman s method adapted to a IMER, which offers the advantage of the stationary phase retains the activity of the enzyme with superior stability and thus it can be used multiple times and in flow. Among the synthesized coumarins, ethyl 2-oxo-7-(2-(piperidin-1- yl)ethoxy)-2H-chromene-3-carboxylate proved to be the best inhibitor for AChE, with an IC50 of 6.3 μM. / A Doença de Alzheimer está associada à redução das taxas de acetilcolina (ACh) no processo sináptico, diminuindo a neurotransmissão colinérgica cortical, além de outros neurotransmissores como noradrenalina, dopamina, serotonina, glutamato e substância P em menor extensão. Alguns medicamentos empregados para o tratamento da Doença de Alzheimer disponíveis no mercado são inibidores da enzima acetilcolinesterase (AChE). Este trabalho teve como objetivos: sintetizar uma coleção de cumarinas, avaliar os compostos sintetizados com relação à atividade inibitória da enzima AChE em IMERs (Immobilized Enzyme Reactor), a fim de fornecer subsídios para o estudo da relação estrutura-atividade destes compostos e o desenho racional de possíveis fármacos para o tratamento da doença de Alzheimer. Durante o desenvolvimento do projeto empregou-se a condensação de Knoevenagel entre salicilaldeídos e malonato de dietila para a obtenção da estrutura padrão da cumarina. As derivações na estrutura das cumarinas foram realizadas através de reações de amidação, substituição nucleofílica, reação multicomponente e acoplamento cruzado. A reação de Suzuki se mostrou uma ferramenta interessante para a obtenção de cumarinas substituídas na posição 8, visto que não se tem relatos na literatura sobre o emprego de reações acoplamento cruzado para a síntese de cumarinas substituídas nesta posição. No total foram sintetizados 23 compostos. A atividade inibitória dos compostos sintetizados foi avaliada utilizando o método de Ellman adaptado a um IMER, que oferece a vantagem da fase estacionária produzida manter a atividade da enzima com superior estabilidade e assim poder ser utilizada múltiplas vezes e em fluxo. Dentre a coleção de cumarinas sintetizada, o 2- oxo-7-(2-(piperidin-1-il)etoxi)-2H-cromeno-3-carboxilato de etila mostrou-se como o melhor inibidor para a AChE, apresentando um IC50 de 6,3 μM.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3759.pdf: 3526304 bytes, checksum: 5340c2ab2de2d5301e6ee064d889911f (MD5) Previous issue date: 2011-08-11 / Universidade Federal de Sao Carlos / Chagas disease is a tropical neglected illness; nearly 10 million people are infected, in 2008 it was responsible for the deaths of about 10 thousand people. At present, only two medicines (benznidazol and nifurtimox) are available to treat this disease and they lack of efficacy/safety in chronic phase. This scenario is changing due to advances in the search for new trypanocidal agents. The glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), a glycolytic enzyme of Trypanosoma cruzi appears as a suitable target for drug discovery. In the present work, a kinetic study using Isothermal Titration Calorimetry (ITC) were carried out to investigate the activity of eight NAD+ analogs against GAPDH. ITC was been used to measure the heat exchange during reactions making it a powerful tool of identification of bioactive compounds. Study compounds showed inhibitory activity on TcGAPDH enzyme and its homologous human GAPDH. The apparent inhibition constant values (Ki app) were in the range from 15,98 to 91,25 M describing competitive inhibition mechanisms. Important steps in medicinal chemistry maybe biochemical followed by cell-based assays were, for instance, Saccharomyces cerevisiae could be used as a model to assess the cytotoxic activity of compounds. The technique used to study the action of chemical compounds in yeast was the fluorescence spectroscopy. Five out of eight compounds showed no activity against S. cerevisiae. This is a good indication that study compounds have low cytotoxicity, which makes them candidates for in vitro studies on the parasite. / A doença de Chagas e uma doença tropical negligenciada que afeta aproximadamente 10 milhões de indivíduos, no ano de 2008 foi responsável pela morte de cerca de 10 mil pessoas. Os tratamentos que existem atualmente são empregados apenas na fase aguda da doença, utilizando os fármacos benzonidazol e o nifurtimox, demonstrando ambos diversos efeitos indesejáveis. Apesar da existência de alguns estudos na área, não ha registro de nenhum novo fármaco para o tratamento da doença de Chagas. Dessa forma, a busca por novas moléculas bioativas para o tratamento desta doença e de fundamental importância. A enzima gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) de Trypanosoma cruzi aparece como um alvo promissor para pesquisa de novos fármacos para doença de Chagas, uma vez que essa enzima participa da via glicolitica, que a principal via para obtenção de energia do parasito. Neste trabalho foram realizados ensaios de inibição utilizando uma classe de compostos contra a TcGAPDH. A técnica utilizada para o estudo dos compostos foi a calorimetria de titulação isotérmica (ITC), que mede a troca de calor observada durante uma reação e vem sendo utilizada atualmente para a determinação de parâmetros termodinâmicos e cinéticos. Os compostos estudados apresentaram atividade inibitória frente a enzima TcGAPDH e sua homologa GAPDH de humanos. Foram estudados oito compostos análogos ao cofator NAD+. Os valores da constante de inibição aparente (Ki app) dos compostos estão no intervalo de 15,98 a 91,25 M com mecanismo de inibição competitivo. A descoberta e desenvolvimento de fármacos baseiam-se em sistemas modelos introduzidos no inicio dos projetos em química medicinal. A otimização in vitro usando ensaios bioquímicos e cultura de células representa uma opção viável no novo paradigma da química medicinal moderna. No caso dos estudos celulares, modelos são estudados para mimetizar as células humanas, especialmente com relação a atividade da GAPDH. Dessa forma, o Saccharomyces cerevisiae foi usado como modelo para que a atividade VII citotóxica dos compostos fosse detectada por espectroscopia de fluorescência. Cinco dos oito compostos não apresentaram atividade contra a levedura, sendo um bom indicativo que as moléculas apresentam baixa cito toxidade tornando-as candidatas para os estudos in vitro no parasito T.cruzi.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3869.pdf: 12129966 bytes, checksum: 7f17c5b063ae127e4d58be4e1f14b434 (MD5) Previous issue date: 2011-07-27 / Financiadora de Estudos e Projetos / The Chagas disease, described in 1909 by the Brazilian sanitary physician, scientist and bacteriologist Dr. Carlos Chagas, is caused by the Trypanosomatid parasite Trypanosoma cruzi. Current treatments involve the use of drugs benznidazole and nifurtimox, which are effective only in the early stage of the disease (acute phase), but have severe side effects. The enzyme cruzain is a validated target for searching small molecules to act against Chagas disease. Cruzain inhibition has been studied for the discovery and development of new drugs. In this work, the planning strategy was based on molecular fragments, using a computational approach for selecting them. Using GRID/CPCA, important residues such as Ser207 and Asp69 were identified in an adjacent cavity to the S2 sub-site of the enzyme. These residues can take part on hydrogen-bond interactions and have not been explored in the search for inhibitors for this target. In addition, we identified patterns of molecular recognition of the enzyme, based on the structures deposited in the Protein Data Bank, which are co-crystallized with inhibitors at the site of the enzyme. These inhibitors were used to guide the search via SMARTS pattern to build a fragment database. Docking and molecular dynamics were used to select the fragments for an in vitro assay. Many fragments were acquired and tested against cruzain using the technique of fluorescence spectroscopy. One fragment (Nequimed147) showed activity, inhibiting the enzyme with IC50 equal to 2.39 mM, resulting in a ligand efficiency of 0.23 kcal mol-1 weight atom-1. Based on this fragment, new inhibitors were identified with IC50 between 1.25 and 4.29 mM. Their ligand efficiencies were in the range of 0.21 and 0.26 kcal mol-1 weight atom-1 whose molecular recognition features are suitable for the search of new enzyme inhibitors likely to bind the cavity near the S2 sub-site that has not been explored yet. / A Doença de Chagas, descrita em 1909 pelo médico sanitarista brasileiro Dr. Carlos Chagas, é causada pelo parasito tripanossomatídeo Trypanosoma cruzi. Os tratamentos atuais consistem no uso dos fármacos benzonidazol e nifurtimox que são eficazes apenas no estágio inicial da doença (fase aguda), mas possuem efeitos colaterais severos. A enzima cruzaína constitui um alvo validado contra a doença de Chagas e sua inibição vem sendo estudada para o planejamento de fármacos. Neste trabalho a estratégia adotada foi o planejamento baseado em fragmentos moleculares, através de uma abordagem computacional para a seleção dos mesmos. Utilizando a técnica GRID/CPCA, foram identificados resíduos importantes, como Ser207 e Asp69, em uma região adjacente ao sub-sítio S2 da enzima. Estes resíduos são capazes de realizar interações do tipo ligação de hidrogênio e ainda não foram explorados na busca de inibidores para esse alvo. Além disso, foram identificados padrões de reconhecimento molecular da enzima, baseado nas estruturas depositadas no Protein Data Bank com inibidores cocristalizados no sítio da enzima, que foram utilizados para fazer uma busca guiada com a utilização de padrão SMARTS para construção de um banco de fragmentos. As técnicas de docagem e dinâmica molecular foram usadas para selecionar os fragmentos, os quais foram adquiridos para os ensaios in vitro. Vários fragmentos foram testados contra a enzima cruzaína utilizando a técnica de fluorimetria, sendo que um deles (Nequimed147) mostrou-se capaz de inibir a enzima com IC50 igual a 2,39 mM, resultando em uma eficiência do ligante de 0,23 kcal mol-1 átomo pesado-1. Baseado nesse fragmento, novos inibidores foram identificados com potência entre 1,25 e 4,29 mM e eficiência do ligante entre 0,21 e 0,26 kcal mol-1 átomo pesado-1, com características apropriadas para o reconhecimento molecular pela enzima cruzaína na região do sub-sítio S2.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4321.pdf: 5011742 bytes, checksum: 61d67530b35683f34c3ef4b4e30917aa (MD5) Previous issue date: 2012-03-30 / Financiadora de Estudos e Projetos / Sugarcane bagasse ash is a byproduct of sugar and alcohol industry with potential for field application. However, the presence of organic contaminants such as dioxins turns necessary the development of strategies for removal of those pollutants, such as bioremediation. Because of the high toxicity of dioxins, it is wise to develop effective and low risk methods for initial evaluation of microbial degradation capacity of those compounds by using less dangerous alternatives such as screening tools to select possible microorganisms as candidates for bioremediation. In such context, this work aimed to apply statistical models to evaluate microbial growth capacity under influence of components of a compost windrow already used for other sugarcane industry residues, and also development of qualitative and quantitative methods to evaluate microbial degradation of the dye RBBR and 1,2,3,4-TCDD, molecules selected as model compounds. The Scott-Knott method grouping multiple means showed good results, indicating microbial growth inhibition of all fungi in culture medium with compost windrow, and microbial growth promotion for Aspergillus strains in sugarcane ash doped medium. Furthermore, quantification of RBBR dye in liquid broth was developed, validated and applied through a dilute-and-shoot technique followed by LC-MS/MS, where it was possible to detect up to 4,8pM of dye, being observed a degradation from 40-99% of dye over 30 days. In a similar way, it was developed and validated a GC-MS method to quantify 1,2,3,4-TCDD in liquid broth after extraction, with detection limits of 10ppb, observing a removal of up to 20% of dioxin after 30 days. Another point evaluated was the identification of RBBR degradation products, where it was observed the presence of four dye metabolites during the course of the experiment, which allowed us to propose a degradation pathway of RBBR dye by Aspergillus flavus. / A cinza do bagaço da cana-de-açúcar é um subproduto da indústria sucroalcooleira que apresenta potencial para aplicação no campo. Porém, a presença de contaminantes orgânicos como dioxinas torna necessário o desenvolvimento de estratégias para a remoção destes poluentes, como a biorremediação. Por serem as dioxinas extremamente tóxicas, é sensato o desenvolvimento de métodos eficazes e de baixo risco para avaliação inicial da capacidade microbiana de degradação destes compostos usando alternativas menos perigosas como ferramentas de triagem e seleção de micro-organismos candidatos à biorremediação. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo o uso de modelos estatísticos para avaliação do crescimento microbiano em componentes de uma composteira já utilizada para tratamentos de outros resíduos sucroalcooleiros, bem como o desenvolvimento de métodos analíticos qualitativos e quantitativos de avalição da capacidade microbiana de degradação do corante RBBR e da 1,2,3,4-TCDD, moléculas selecionadas como modelos. O agrupamento de médias por Scott-Knott apresentou bons resultados na avaliação do crescimento microbiano, apontando inibição do crescimento de todos os fungos pela composteira, e promoção de crescimento das cepas de Aspergillus no meio com cinza. Ademais, foi desenvolvido e validado um método para quantificação do corante RBBR direto do meio de cultura líquido usando a técnica dilute-and-shoot seguido por LC-MS/MS, onde foi possível detectar até 4,8pM de corante, sendo observada uma degradação entre 40-99% do corante em 30 dias. Da maneira similar, foi desenvolvido e validado um método por GC-MS para quantificação da 1,2,3,4-TCDD em meio líquido após extração, com limites de detecção de 10ppb, onde foi observada uma remoção de até 20% da dioxina em 30 dias de cultivo. Outro ponto avaliado foi a identificação dos produtos de degradação do RBBR durante o experimento, sendo observada a presença de quatro metabólitos do corante nas amostras, o que nos permitiu propor a rota de degradação do corante por Aspergillus flavus.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4425.pdf: 4096750 bytes, checksum: d77921e33ac24b167ed701cea4759eb0 (MD5) Previous issue date: 2012-04-18 / Financiadora de Estudos e Projetos / Plant cell walls are composed of approximately 65% cellulose microfibrils and pectin. The latter is proteolytically degraded by the so-called pectinases enzymes (also known as pectinolytic enzymes). Pectinases may be either depolymerizing. They are produced by plants, filamentous fungi, bacteria, and yeast. Due to the wide commercial use of pectinase, one has testified a growing number of studies devoted to understand the activities of such enzymes. Bioinformatics tools were employed throughout this work in order to study fungal polygalacturonase (PG) under two aspects. Firstly, all stored fungal PG sequences in databases (2093) were analyzed in order to evaluate through searching for sequential motifs and phylogenetic studies the possibility to classifying the enzymes as either Endo- or Exo-PG. After excluding those with less than 70 amino acids, those that corresponded to the hypothetical protein , and those that were neither PG nor fungal PG, there were 957 sequences left. Those sequences were separated according to genus and species. For each group, multiple sequence alignments were made by using ClustalW software. The alignments were analyzed and the sequences displaying 100% identity were then expunged, thus resulting in a database of unique sequences of fungal PG. By means of the alignment, the study of structural motifs, and the construction of phylogenetic trees, one was able to classify all the sequences according to their mode of action in either Endo- or Ex-PG. Throughout the second part of our research, protein homology-modeling methods were employed while constructing a three-dimensional model of a L. gongylophorus fungal polygalacturonase, symbiont of leaf-cutting ant. The model was validated by PROCHECK, VERIFY 3D, and WHAT IF software. By analyzing the 3D model of the L. gongylophorus PG, a catalytic mechanism of the enzyme was outlined, which may take place by inverting the configuration of sugar anomeric carbon (substrate). / A parede celular de células de plantas é composta de aproximadamente 65% de rede de celulose e rede de pectato. Essa última é proteoliticamente degradada por enzimas chamadas pectinases ou enzimas pectinolíticas. As pectinases podem ser despolimerizantes ou desesterificantes e são produzidas por plantas, fungos filamentosos, bactérias e leveduras. Impulsionado pelas aplicações comerciais que pectinases representam, é crescente o estudo para o melhor entendimento sobre as atividades dessas enzimas. Ferramentas de bioinformática foram usadas neste trabalho para estudar poligalacturonases (PG) de fungos, sob dois aspectos. Na primeira parte do trabalho, todas as sequências de PG de fungos depositadas em bancos de dados (2093) foram analisadas e avaliadas quanto à possibilidade de classificação das enzimas em Endo- ou Exo-PG através de busca de motivos sequenciais e estudos filogenéticos. Após exclusão daquelas com menos de 70 aminoácidos, das que correspondiam a 'proteína hipotética' e ainda das que não eram PG ou mesmo não eram PG de fungos restaram 957 sequências. Essas sequências foram separadas por gênero e espécie e para cada grupo foram realizados alinhamentos múltiplos de sequências usando o programa ClustalW . Os alinhamentos foram analisados e as sequências com 100% de identidade foram retiradas, resultando em um conjunto de dados com 417 sequências únicas de PG de fungos. Através dos alinhamentos, do estudo de motivos estruturais e da construção de árvores filogenéticas foi possível classificar todas as sequências de acordo com seu modo de ação em Endo- ou Exo-PG. Na segunda parte do trabalho foi usado o método de modelagem por homologia na construção do modelo tridimensional de uma poligalacturonase do fungo L. gongylophorus, simbionte de formigas cortadeiras. O modelo foi validado com os programas PROCHECK, VERIFY 3D e WHAT IF. Através da análise do modelo 3D da PG do L. gongylophorus foi possível propor um mecanismo de ação da enzima, que deve ocorrer com inversão da configuração do carbono anomérico do açúcar (substrato).