Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-04T18:27:51Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2010-Dissertação-MarinaPitta.pdf: 3603877 bytes, checksum: 08fe7b230ca59625d092d37b1c8148ad (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-04T18:27:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2010-Dissertação-MarinaPitta.pdf: 3603877 bytes, checksum: 08fe7b230ca59625d092d37b1c8148ad (MD5) Previous issue date: 2010 / O câncer é uma das principais causas de morte no mundo e acolhe intensos e crescentes investimentos em pesquisa oriundos dos setores público e privado. Considerando os alarmantes indicadores epidemiológicos registrados e a visível carência de medicamentos mais eficazes e menos tóxicos para esta patologia, o Laboratório de Planejamento e Síntese de Fármacos vem, desde o final da década de 1980, desenvolvendo moléculas com potenciais propriedades anticâncer. A meta é minimizar o impacto dessa doença no Brasil e no mundo. Para tanto, conhecendo-se as propriedades anticâncer de derivados da acridina, este trabalho teve como objetivo preparar, determinar as características físico-químicas, caracterizar estruturalmente e avaliar a atividade anticâncer de nove moléculas originais derivadas da acridina. Nos ensaios in vitro foram utilizadas linhagens celulares SF-295 (Sistema Nervoso Central), MDA-MB435 (melanoma) e HCT-8 (carcinoma de cólon). Para a realização das sínteses, foram realizadas reações de N-alquilação,condensação, ciclização e adição de Michael. As moléculas obtidas foram comprovadas através de métodos espectroscópicos no infravermelho, ressonância magnética nuclear de hidrogênio e espectrometria de massas utilizando a técnica de electrospray. Os resultados colimados revelam que os compostos 3-acridin-9-il-metil-5-acridin-9-il-metileno-tiazolidina-2,4-diona, 3-acridin-9-il-metil-5-(4-metóxi-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona e 3-acridin-9-il-metil-5-(4-bromo-benzilideno)-tiazolidina-2,4-diona destacaram-se entre os mais ativos da série, pois apresentaram,respectivamente, 92,4%, 86,7% e 96,6% de inibição da proliferação celular contra a linhagem de carcinoma de cólon; enquanto que a doxorrubicina, fármaco de referência, apresentou 95,2% de inibição contra a mesma linhagem de células.Estes resultados ratificam a importância de derivados tiazacridínicos no combate do câncer. / Cancer is a leading cause of death worldwideand conceals intense and growing investment by public and private sectors.Taking into account the alarming epidemiological data recorded and visible lack of drugs more effective and less toxic to treat this pathology, the Laboratório de Planejamento e Síntese de Fármacos hasbeen producing compounds, since the late 80's. Thepurpose isminimizethe impact of this disease in Brazil and in the world. Therefore, considering the anticancer properties of the acridine derivatives, the aimof this work was the synthesis, determination of the physico-chemicalproperties, structural characterization and in vitroantiproliferative activityagainst human cancer cell linesHL-60 (promyelocytic leukemia), MDA-MB435 (breast carcinoma) and HCT-8 (colon carcinoma), of nine new bis-thiazacridine and thiazacridinesderivatives. The syntheses were carried outwithN-alkylation, condensation, cyclization and Michael addition reactions. The obtained molecules were analysedby mass spectrometry usingthe electrospray techniqueand spectroscopic methods, such as infraredandnuclear magnetic resonance of hydrogen. The compounds 3-acridine-9-yl-methyl-5-acridine-9-yl-methylene-thiazolidine-2,4-dione, 3-acridine-9-yl-methyl-5-(4 --methoxy-benzylidene)-thiazolidine-2,4-dione and 3-acridine-9-yl-methyl-5-(4-bromo-benzylidene)-thiazolidine-2,4-dione werethe most active of the series, and presented, respectively, 92.4%, 86.7% and 96.6% of inhibition of cell proliferation against the colon carcinoma, whereas doxorubicin, the reference drug, presented 95.2% of inhibition against same cell line. These results confirm the importance of thiazacridine derivatives in combat of cancer.

O anel aziridínico é conhecido desde o final do século XIX e apresenta alta reatividade devido a sua alta energia de ligação e tensão do anel, o que o torna um valioso aliado na síntese orgânica, especialmente em reações com nucleófilos. Estas características também o tornam reativo frente à nucleófilos biológicos, tais como os ácidos nucléicos. Tal fato leva a uma toxicidade celular e pode ser dirigida a substratos específicos, como no caso de quimioterápicos, levando à alquilação de DNA em células tumorais. Este anel pode ser sintetizado a partir de ?-aminoálcoois, cuja classe de compostos apresenta conhecidas atividades, presentes em importantes moléculas biologicamente ativas. Diante disto, realizouse neste trabalho um estudo a partir de um padrão estrutural envolvendo as duas classes mencionadas, aziridinas e ?-aminoálcoois, a fim de se identificar uma possível atividade antitumoral frente à enzima LSD1. Para este caso, se explora a similaridade estrutural entre aziridina e ciclopropano, presente na estrutura da tranilcipromina. Além disso, realizou-se o estudo deste padrão estrutural frente a dois outros alvos: células de câncer de mama e o parasita T.cruzi, com o intuito de expandir o conhecimento sobre a reatividade de tais compostos sobre estas células. O desenvolvimento desta biblioteca de compostos permitiu uma análise preliminar das relações entre a estrutura química e atividade biológica observada. Neste estudo, foi possível identificar aziridinas com atividade antumoral, mais potentes que cisplatina (IC50 abaixo de 40?M). O mecanismo de ação, por sua vez, ainda deverá ser estudado, considerando que os compostos não inibiram LSD1. / The aziridine ring is known since the end of the XIX century and presents high reactivity due to its high strain energy and ring tension, which makes it a valuable ally in organic synthesis, especially with nucleophiles. These characteristics also culminate in reactivity towards biological nucleophiles, such as nucleic acids. This fact leads to cellular toxicity and can be directed to specific sites, which is the case in chemotherapy agents, resulting in DNA alkylation in cancer cells. This ring can be obtained from ?-amino alcohols, which also present known activities and are present in important molecules with biological activity. As a result, this work performed a study of a structural pattern involving those two classes mentioned above, targeting a potential antitumoral activity towards the LSD1 enzyme. In this case, it is explored the structural similarity between the aziridine ring and the ciclopropane, present in the tranylcipromine structure. Furthermore, this structural pattern was studied for other two targets: breast cancer cells and the T.cruzi parasite, in order to expand the knowledge about the reactivity of those compounds in those biological systems. The development of this library allowed a preliminary analysis between the chemical structure and the observed biological activity. In this project it was possible to identify aziridines with antitumoral activities, showing higher potency than cisplatine (IC50 below 40?M). However, the mechanism is yet to be studied, considering that those compounds didn\'t inhibit the LSD1 enzyme.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Magíster en Química área de Especialización en Química Medicinal y Memoria para optar al Título de Química Farmacéutica / El presente trabajo de investigación informa sobre la preparación de dos familias de compuestos: cationes lipofílicos derivados del ácido cafeico y bromoésteres derivados de ácido cafeico como compuestos citotóxicos mitocondriotrópicos selectivos para células tumorales. Para el diseño de las moléculas, se consideró: (1) Largo de cadena entre los componentes farmacofóricos. (2) Presencia o ausencia de carga que permita o no dirigirlas hacia la mitocondria (3) Incorporación de grupos funcionales con capacidad antioxidante Las moléculas fueron ensayadas en las líneas celulares: HCT-116, H1975, HeLa, MCF-7, HL60 y Vero, con MTT y Rojo Neutro, dando como resultado mayor citotoxicidad para los cationes lipofílicos fosforados, mejores resultados para ésteres bromados y cationes fosforados con cadena de 10 carbonos y mayor selectividad para HeLa con 9-P / This research work provides information on the preparation of families of compounds: lipophilic cations derived from caffeic acid and bromoesters derived from caffeic acid as selective cytotoxic mitochondrotropic compounds for tumor cells. For the design of the molecules, it was considered: (1) Chain length between the pharmacophoric moieties. (2) Presence or absence of charge that allows or does not direct them towards the mitochondria (3) Presence of antioxidant groups The molecules were tested in the cell lines: HCT-116, H1975, HeLa, MCF-7, HL60 and Vero, with MTT and Neutral Red, resulting in greater cytotoxicity for the phosphorus lipophilic cations, better results for brominated esters and phosphorus cations with chain of 10 carbons and greater selectivity for HeLa with 9-P / Conicyt; Fondecyt

Made available in DSpace on 2014-07-29T16:11:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MARCELO DO NASCIMENTO capitulos.pdf: 46847 bytes, checksum: 9184c68b4afbd4f8c18e081f4c9274be (MD5) Previous issue date: 2009-06-15 / In the field of a research line that seeks the planning, the synthesis and the pharmacologycal evaluation of new candidates to prototypes of anti-inflammatory drugs, we will describe in this project the planning of derived new pyrazolics (LQFM 002-003), originally drawn starting from the nerolidilcatecol (24) and arylsulfonilpiperazines, (25) that present profile inhibition of the enzyme sPLA2. The compounds (E)-N-(3,7-dimethylocta-2,6-dienyl)-1,3-dimethtyl-1-H-pyrazol-5-amine (LQFM 002) and (E)-N-(3,7-dimethylocta-2,6-dienyl)-1,3-dimethyl-4-((4-methylpiperazin-1-il) methyl)-1H-pyrazol-5-amine (LQFM 003), were submitted to pharmacologycal rehearsals in vitro, seeking to evaluate the enzymatic inhibition activity of the sPLA2. For the prototype (LQFM 002) the inhibition halos were 14,43 ± 6,28%, 16,68 ± 2,45%, 23,61 ± 2,62%, 37,06 ± 3,25%, in the doses of 250, 500, 1000 and 2000 μg/mL respectively. For the compound (LQFM 003), the halos were 1,85 ± 1,38%, 9,29 ± 3,33%, 7,82 ± 3,32%, 13,21 ± 3,22%, respectively. Subsequently the rehearsal in vivo was accomplished to evaluate the profile of cellular migration. Being also analyzed the concentration of plasmatic protein by the methodology of the Evans of blue once the inflammatory process was induced. The compound (LQFM 002) presented inhibition on cellular migration of 50,46 ± 14,34% in the peritonit test, 68,7 ± 2,65% in the pleurisy test and reduction of 40,1 ± 6,40% of the plasmatics proteins for the method of coloration of the Evans of blue. The compound (LQFM 003) presented 25,89 ± 5,39% inhibition, in the doses of 50 mg/Kg, characterizing, significant anti-inflammatory profile for the prototype (LQFM 002). Parallel to the pharmacologycal synthetic work and, we carried out theoretical studies through the application of molecular dynamics. The parameters of the enzyme sPLA2 was more effective through the applications of the water box's, once the smaller state energy observed was of -175000kcal/mol. At the end of this project, we can conclude that the structural planning applied in the project was validated through the applications of the pharmacologycal rehearsals, once both molecules were recognized by the enzyme sPLA2 and they presented anti-inflammatory activity in the rehearsal of cellular migration. In addition, the applied synthetic methodology for obtaining of the prototypes pyrazolics (LQFM 002-003) studied was satisfatory. / No âmbito de uma linha de pesquisa que visa o planejamento, a síntese e a avaliação farmacológica de novos candidatos a protótipos de fármacos anti-inflamatórios, descreveremos neste trabalho o planejamento de novos derivados pirazólicos (LQFM 002-003), originalmente desenhados a partir do nerolidilcatecol (24) e arilsulfonilpiperazínicos (25), que apresentam perfil inibitório da enzima sPLA2. Os compostos (E)-N-(3,7-dimetilocta-2,6-dienil)-1,3-dimetil-1-H-pirazol-5-amina (LQFM 002) e (E)-N-(3,7-dimetilocta-2,6-dienil)-1,3-dimetil-4-((4-metilpiperazina-1-il) metil)-1H-pirazol-5-amina (LQFM 003), foram submetidos a ensaios farmacológicos in vitro, visando avaliar a atividade de inibição enzimática da sPLA2. Para o protótipo LQFM 002 os halos de inibição foram 14,43 ± 6,28%, 16,68 ± 2,45 %, 23,61 ± 2,62 %, 37,06 ± 3,25 %, nas doses de 250, 500, 1000 e 2000 μg/mL respectivamente. Para o composto LQFM 003, os halos foram 1,85 ± 1,38 %, 9,29 ± 3,33 %, 7,82 ± 3,32 %, 13,21 ± 3,22 %, respectivamente. Posteriormente foram realizados os ensaios in vivo o qual avalia o perfil de migração celular para cavidade peritoneal e pleural. Sendo também analisada a concentração de proteína plasmática pela metodologia do azul de Evans quando induzido o processo inflamatório. O composto LQFM 002 apresentou inibição sobre a migração celular de 50,46 ± 14,34 % no teste de peritonite, 68,7 ± 2,65 % no teste de pleurisia e redução de 40,1 ± 6,40 % das proteínas plasmáticas pelo método de coloração do azul de Evans. O composto LQFM 003 apresentou inibição de 25,89 ± 5,39%, nas doses de 50 mg/Kg, caracterizando, desta forma, perfil anti-inflamatório significativo para o protótipo (LQFM 002). Paralelamente ao trabalho sintético e farmacológico, foi realizado estudos teóricos através do emprego de dinâmica molecular. A parametrização da enzima sPLA2 foi mais efetiva através do emprego de caixa de água, uma vez que o estado de menor energia observado foi de -175000kcal/mol. Ao término deste trabalho, podemos concluir que o planejamento estrutural empregado no mesmo foi validado através dos ensaios farmacológicos empregados, uma vez que ambas as moléculas foram reconhecidas pela enzima sPLA2 e apresentaram atividade anti-inflamatória no ensaio de migração celular. Ademais, a metodologia sintética empregada se mostrou satisfatória para a obtenção dos protótipos pirazólicos (LQFM 002 - 003) estudados.

A doença de Chagas, causada pelo Trypanosoma cruzi, é uma doença tropical que aflige milhões de pessoas, gerando consequências sócio-econômicas devastadoras. Ela tem sido considerada uma doença tropical super-negligenciada, já que os únicos fármacos disponíveis para o seu tratamento apresentam baixa eficácia e causam vários efeitos colaterais. Além disso, os mesmos foram introduzidos há mais de três décadas. Com esse cenário, é evidente a necessidade da descoberta, desenvolvimento e introdução de novos fármacos para o tratamento eficiente e seguro da doença de Chagas. A enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) é um alvo biomacromolecular atraente para a descoberta de novos fármacos contra os tripanossomatídeos, em virtude das enzimas da via glicolítica exercerem um papel fundamental no fornecimento de energia para a sobrevivência do parasito. Essa enzima foi selecionada neste trabalho de tese para a realização de estudos em química medicinal com base em quiminformática com o objetivo de identificar potenciais inibidores enzimáticos e do T. cruzi. Na primeira etapa desta tese, o ensaio virtual baseado na estrutura do alvo (SBVS) foi usado na identificação e seleção dos compostos. Como resultado do planejamento in silico, vinte compostos foram selecionados e avaliados experimentalmente na segunda etapa do trabalho empregando a técnica de calorimetria de titulação isotérmica (ITC). Destes, onze inibiram a GAPDH de T. cruzi resultando numa elevada taxa de acerto (>= 20%). Os novos inibidores apresentam excelente eficiência do ligante (LE), bem como mostram ligeira seletividade pela enzima do parasito. O ensaio dos inibidores contra a forma tripomastigota do T. cruzi identificou dois compostos capazes de inibir essa forma infectiva e um deles também mostrou ser um potente inibidor da forma amastigota do parasito, além de apresentar baixa toxidez. As duas melhores classes de inibidores da GAPDH e do parasito foram selecionadas para o estabelecimento de relações quantitativas entre a estrutura química e a atividade biológica (QSAR). Estudos de QSAR 2D (HQSAR) forneceram modelos com elevada capacidade preditiva e proporcionaram a identificação de características estruturais importantes para a otimização dos ligantes a compostos-matrizes. / Chagas disease, caused by Trypanosoma cruzi, is a tropical disease, which afflicts millions of people, thus generating devastating socio-economic consequences. It has been pointed out that it is a super-neglected tropical disease, based on available drugs with low efficacy and that give rise to many side effects. In addition, these drugs were introduced three decades ago. With this scenario, it is clear the necessity of the discovery, development and introduction of new efficient drugs to treat Chagas disease. The enzyme glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is a promising target for the development of new drugs against trypanosomatides, since the enzymes of the glycolytic pathway display a fundamental role in the energy supply to parasite survival. In this thesis, this enzyme was selected for medicinal chemistry within the cheminformatics framework aiming at the identification of potential enzymatic and parasite inhibitors. In the first part, structure-based virtual screening (SBVS) methods were employed in the selection and identification of compounds. Based on the in silico design, twenty compounds were selected and experimentally evaluated in the second part using the isothermal titration calorimetry (ITC) technique. Out of these, eleven compounds inhibited the T. cruzi GAPDH, resulting in high hit rates (>= 20 %). The new selected inhibitors display excellent ligand efficiency (LE), as well as some selectivity for the parasite enzyme. The inhibitors assay against the trypomastigote form of T. cruzi was used to identify two compounds able to inhibit this infective form, and one showed to be a strong amastigote parasite inhibitor, also disclosing low cytotoxicity profile. The best two classes of GAPDH and parasite inhibitors were selected for the establishment of a quantitative structure-activity relationship (QSAR). 2D QSAR (HQSAR) studies resulted in linear models with high predictive power, amenable for the identification of important structural features in the process of hit-to-lead optimization.

O propacetamol é um pró-fármaco do acetoaminofeno, administrado por via intravenosa, utilizado para o controle da febre e da dor do período perioperatório em terapias do tipo multimodal. No organismo o propacetamol é hidrolisado rapidamente pelas esterases plasmáticas em dietilglicina e acetoaminofeno, seu metabólito ativo, cujo mecanismo de ação é a inibição da síntese de prostaglandinas resultantes da hidrólise do ácido araquidônico pela enzima ciclo-oxigenase 2. Em altas doses, o acetoaminofeno sofre oxidação pela isoforma CYP2E1 do sistema de enzimas do citocromo P450 biotransformando-se em N-acetil-p-benzoquinona imina (NAPQI), um metabólito extremamente reativo e hepatotóxico. Embora seu amplo uso e boa tolerabilidade, observa-se um número reduzido de dados literários sobre o prófármaco alvo ou possíveis metabólitos. Assim, inicialmente investigou-se a aplicação de protocolos existentes na literatura visando à síntese do cloridrato de propacetamol, sendo a rota sintética estabelecida em dois passos reacionais. Logo, uma metodologia clássica usando catálise com iodeto foi eficiente em gerar o pró-fármaco com rendimento global de 25%. Além disso, um método assistido por micro-ondas foi testado a fim de melhorar o rendimento e otimizar as condições reacionais. Este protocolo permitiu isolar o pró-fármaco desejado em excelente rendimento comparado a outras abordagens sintéticas descritas na literatura. Este método também apresenta algumas vantagens adicionais como a ausência de catalisador e um menor volume de solvente no meio reacional. Logo, o cloridrato de propacetamol foi sintetizado em 10 minutos a 120°C com 98% de rendimento. Depois de sintetizado, o pró-fármaco foi submetido à avaliação do efeito antipirético mostrando-se eficiente na inibição da febre estimulada por lipopolissacarídeo (LPS) na dose de 600 mg/kg de massa corpórea, a qual equivale à dose de 300 mg/kg de acetaminofeno. Na última parte deste trabalho foram realizados ensaios de metabolismo in vitro por meio de reações microssomais, a fim de identificar a formação de metabólitos via espectrometria de massas por captura de íons (ion trap), os quais mostraram que o principal metabólito foi o acetaminofeno, já que o uso da estratégia de pró-fármacos em química medicinal objetiva a liberação de fármacos pelo metabolismo enzimático. Portanto, os estudos realizados são considerados satisfatórios, visto que a síntese assistida por microondas foi o melhor método para o preparo do cloridrato de propacetamol em excelente rendimento e a atividade antipirética foi confirmada por meio de ensaios farmacológicos in vivo. Além disso, o presente trabalho pode contribuir com o estudo de metabolismo in vitro usando a espectroscopia de massas como ferramenta analítica na identificação de metabólitos. / Propacetamol is an acetaminophen prodrug of intravenous administration used to control fever and pain of perioperative period in multimodal analgesia therapy. After injection, it is completely converted by plasma esterases into dietylglycine and acetaminophen, its active metabolite whose mechanism of action is the inhibition of prostaglandins, which arose from hydrolysis of arachidonic acid by cyclooxygenase 2. In overdose, acetaminophen is converted to N-acetil-p-benzoquinone imine (NAPQI) by biotransformation mediated by P450 enzymes, mainly CYP2E1. This toxic metabolite is highly reactive and responsible for hepatic injury. The propacetamol has a good tolerability and a wide use, although there are restricted number of articles about it and its possible metabolites. We started the work by investigating the application of some methods described in literature to synthesize the propacetamol hydrochloride in two reaction steps. Thus, a classical methodology using iodine as catalyst was efficient to produce the prodrug in 25% global yield. In addition, a microwave-assisted method was tested to enhance the yield and optimize the reaction conditions. To our delight, it has allowed the isolation of the desired prodrug in excellent yield compared to other synthetics approaches described in literature. This method also has some extra advantages such as the absence of catalyst and lower solvent volume in reaction medium. Therefore, propacetamol hydrochloride was synthesized in 10 min at 120°C in 98% reaction yield. The synthesized molecule was undergone a pharmacologic evaluation and the prodrug was efficient in inhibiting fever induced by LPS. The dosage of propacetamol (600mg/kg) was equivalent to acetaminophen (300mg/kg) to inhibit fever until four hours after administration. The last part of this research was the in vitro metabolism essay by means of microssomal reaction in order to determine the metabolite formation through ion trap tandem mass spectrometry. That essay showed that the main produced metabolite was acetaminophen since the use of prodrug strategy in medicinal chemistry aims the drug release by enzymatic metabolism. In summary, the performed studies may be seen as satisfactory since the microwave-assisted synthesis was the best way to prepare propacetamol hydrochloride in an excellent yield and the antipyretic activity was confirmed by in vivo pharmacologic essays. Furthermore, the present work may contribute with an in vitro metabolism study using mass spectrometry as analytical tool for metabolite identification.

A doença de Chagas, uma infecção causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é um grave problema de saúde pública. Atualmente, cerca de dez milhões de pessoas em todo o mundo estão infectadas, sendo que a situação é mais crítica na América Latina, onde a doença é endêmica. A necessidade de novas alternativas terapêuticas é grande, pois os fármacos disponíveis apresentam sérias limitações, como baixa eficácia e alta toxicidade. A enzima cruzaína, uma cisteíno-protease essencial à sobrevivência do parasita, é considerada um importante alvo para o desenvolvimento de novos agentes antichagásicos. Neste trabalho, o objetivo foi o desenvolvimento de novos inibidores da enzima cruzaína empregando como modelo um composto hit (1) com propriedades anti-T. cruzi. Este inibidor competitivo (um derivado imidazólico), que apresenta elevada potência e afinidade contra a enzima alvo (IC50 = 1 µM e Ki = 120 nM, respectivamente), foi identificado em trabalhos anteriores de nosso grupo por meio da integração de técnicas computacionais (triagem virtual) e experimentais (avaliação bioquímica in vitro). A presente proposta de planejamento molecular, empregando métodos de química medicinal, levou a investigação de padrões estruturais explorando a complementaridade entre as moléculas pequenas e os resíduos de aminoácidos dos subsítios da cruzaína. Um conjunto promissor de 38 compostos foi planejado, sintetizado e avaliado em ensaios in vitro frente à enzima cruzaína e posteriormente, contra o parasita. Entre os derivados do composto hit (1), que apresentaram valores de IC50 contra a enzima alvo na faixa nano- e micromolar, destaca-se o composto 14 (IC50 = 120 nM e Ki = 20 nM), um inibidor competitivo, potente e de alta afinidade contra a enzima alvo, que também apresentou atividade in vitro e in vivo contra o parasita. A integração de métodos experimentais e computacionais foi útil no processo de otimização de inibidores inéditos da cruzaína. As relações entre a estrutura e atividade obtidas são de grande relevância para o desenvolvimento de candidatos a novos fármacos para a terapia da doença de Chagas. / Chagas´ disease, an infection caused by Trypanosoma cruzi, is a serious public health problem. Currently, about ten million people are infected worldwide, and the situation is more critical in Latin America, where the disease is endemic. The need for new therapies is urgent, since the drugs available have serious limitations, such as low efficiency and high toxicity. The cruzain enzyme, an essential cysteine protease for the parasite survival is considered an important target for the development of new antichagasic agents. In this work, the goal was the development of new cruzain inhibitors based on modifications of a hit compound (1) with properties anti-T. cruzi. This competitive inhibitor (an imidazole derivative), shows high affinity and potency (IC50 = 1 µM and Ki = 120 nM, respectively), and was identified in a previous work in our group by integrating computational techniques (virtual screening) and experimental (in vitro biochemical evaluation). The proposed molecular design, employing methods of medicinal chemistry, aimed to investigate structural patterns exploiting the complementarity between small molecules and amino acid residues of the subsites of cruzain. A promising set of 38 compounds was designed, synthesized and evaluated in in vitro assays against the cruzain enzyme and subsequently against the parasite. Among the derivatives of the hit compound (1), which had IC50 values against the target enzyme in the nano- and micromolar range, the compound 14 (IC50 = 120 nM and Ki = 20 nM), a potent and high affinity competitive inhibitor against cruzain showed activity in vitro and in vivo against the parasite. This work illustrates the importance of the integration of experimental and computational methods in the optimization process of novel cruzain inhibitors. The structure-activity relationship studies revealed in this work are useful for the development of new drug candidates for the treatment of Chagas´ disease.

Os cânceres de próstata e de mama estão entre as neoplasias mais comuns diagnosticadas na população ocidental. No Brasil, estes dois tipos de neoplasia são as principais causas de morte cuja incidência continua crescendo anualmente, sendo mais comum na população acima de 40 anos. As terapias utilizadas para os tratamentos de ambas as neoplasias estão baseadas principalmente nos receptores de hormônio (andrógeno e estrógeno). Embora muitos fármacos tenham sido desenvolvidos para os tratamentos destas patologias ao longo do tempo, eles perdem eficácia em caso de neoplasias resistentes, que apresentam mutações nas macromoléculas alvo. Assim, novas substâncias bioativas estão sendo investigadas a partir dos alvos biológicos consolidados e também para novos alvos. Neste trabalho, ensaios in vitro foram utilizados para avaliar as atividades farmacológicas e citotóxica de novas substâncias bioativas desenvolvidas no Grupo de Química Medicinal (NEQUIMED), a partir de duas linhagens celulares hormônio-dependentes para o estudo do câncer de próstata (LNCaP) e de mama (MCF-7). A partir das triagens realizadas, duas substâncias foram as mais potentes (Neq0502 e Neq0504) que levaram a morte das linhagens LNCaP e MCF-7 com IC50 na ordem de 20 a 30 µmol/L, respectivamente. No ensaio de ciclo celular, Neq0502 apresentou um perfil semelhante a enzalutamida (fármaco usado como referência), sem perturbações substanciais no ciclo. No entanto, Neq0504 teve um perfil bem distinto do raloxifeno (fármaco usado como referência) para a perturbação do ciclo celular. Finalmente, o índice de seletividade estabelecido a partir dos ensaios com as células de fibroblasto (Balb/C 3T3 clone A31) demonstrou que Neq0502 foi uma substância com a maior seletividade e baixa citotoxicidade em relação à célula não tumoral dentre toda a série estudada. A partir destes dados as novas substâncias poderão ser otimizadas usando Neq0502 como matriz em estudos futuros. / Prostate and breast cancers are among the most common cancers diagnosed in the western population. In Brazil, these two types of cancer are the leading causes of death whose incidence continues to increase annually and is more common in older population than 40 years. The therapies used for the treatment of both cancers are mainly based on the hormone receptors (androgen and estrogen). Although many drugs have been developed for the treatment of these pathologies over time, lose efficacy in case of resistant cancers which have mutations on the target macromolecules. Thus, new bioactive substances are being investigated based on stable biological targets and for new targets. In this study, in vitro assays were used to evaluate the pharmacological and cytotoxic activities of new bioactive substances developed in Medicinal Chemistry Group (NEQUIMED) from two hormone-dependent cell lines for the study of prostate (LNCaP) and breast (MCF-7) cancer. From trials screenings carried out, two compounds were found the most potent (Neq0502 and Neq0504) leading to death of LNCaP and MCF-7 lines with IC50 in the range of 20 to 30 µmol/L, respectively. In the cell cycle assay, Neq0502 made a similar profile to enzalutamide (drug used as a reference), without substantial disruption in the cycle. On the other hand, Neq0504 had a very different profile from raloxifene (a drug used as a reference) to the perturbation of the cell cycle. Finally, the selectivity index established from tests with fibroblast cells (Balb/C 3T3 clone A31) demonstrated that Neq0502 was a substance with high selectivity and low cytotoxicity in order to non-tumor cell from all the substances on the screening. From these data, new substances can be optimized using Neq0502 as a template in future studies.

O planejamento de moduladores da dinâmica dos microtúbulos, a partir da ligação à αβ-tubulina, constitui importante estratégia para a terapia do câncer. Os efeitos de inibição da polimerização da tubulina ou de estabilização dos microtúbulos são promovidos pela interação de compostos em cavidades específicas da proteína alvo. A interferência com a dinâmica dos microtúbulos nas células em rápida multiplicação provoca o bloqueio do ciclo celular, disparando sinais bioquímicos que culminam em apoptose. Os taxanos são os agentes antimitóticos mais importantes dentre os estabilizadores de microtúbulos, ao passo que os alcalóides da vinca e a colchicina são membros representativos dos inibidores da polimerização. Entretanto, o aparecimento de resistência, baixa biodisponibilidade e reações adversas graves são fatores que têm impulsionado a pesquisa por novos agentes anticâncer. Dentre os ligantes identificados recentemente para o sítio do taxol, o discodermolídeo e a dictiostatina, produtos naturais de origem marinha, são potentes estabilizadores de microtúbulos que apresentam maior solubilidade que o taxol e atividade contra células de câncer resistentes aos taxanos. Por essa razão, o modo de ligação desses compostos à cavidade de interação da β-tubulina tem sido objeto de investigação. Modelos preditivos de HQSAR foram desenvolvidos para derivados sintéticos do discodermolídeo e utilizados em conjunto com estudos baseados na estrutura do receptor, em concordância com evidências experimentais, para a proposição de modelos de interação para os análogos na cavidade do taxol. Os modelos de conformação bioativa foram utilizados no alinhamento estrutural do conjunto de dados para estudos de QSAR 3D CoMFA e comparação com o alinhamento baseado nas estruturas minimizadas dos ligantes. A caracterização de padrões de reconhecimento molecular foi útil para a proposição de um modelo farmacofórico baseado nas estruturas dos produtos naturais estabilizadores de microtúbulos. Um modelo farmacofórico simplificado foi integrado ao processo de triagem virtual consistindo na aplicação de filtros hierárquicos sucessivos para a identificação de novos estabilizadores de microtúbulos. Caseobliquinas foram ensaiadas como estabilizadoras de microtúbulos, enquanto que intermediários sintéticos da dictiostatina foram avaliados quanto aos seus efeitos na polimerização da tubulina. Nos últimos anos, tem sido intensificada a busca por novos ligantes do sítio da colchicina, dentre os quais os indóis estão entre os mais relevantes. Para quatro conjuntos de dados totalizando 170 derivados de indóis, modelos de HQSAR foram desenvolvidos para a avaliação virtual de uma base de dados. Estudos de QSAR 3D CoMFA e CoMSIA baseados nos farmacóforos foram comparados para 3 conjuntos de dados. Os resultados sugerem que o núcleo indólico pode interagir de maneiras diferentes na cavidade de interação da proteína. Chalconas do tipo 1, inspiradas em ligantes clássicos do sítio da colchicina, foram avaliadas em ensaios celulares e de polimerização da tubulina, levando a síntese e avaliação de uma nova série de chalconas com propriedade antiproliferativa significativa. Por outro lado, derivados de N-acil-hidrazonas apresentaram atividade antimitótica semelhante à colchicina, enquanto as tiosemicarbazonas citotóxicas não interagiram diretamente com a tubulina. / Inhibition of microtubule function is one of the most important approaches to anticancer therapy. Two main effects can be elicited by tubulin/microtubule-interactive agents: inhibition of tubulin assembly or microtubule stabilization. Interference with either the assembly or disassembly of microtubules within the mitotic spindle in rapidly dividing cells disrupts the normal process of cell division and provokes chemical signals that induce apoptosis. On one hand, taxanes are the most prominent among the microtubule-stabilizing antimitotic agents, while on the other hand, colchicine and the vinca alkaloids are representative members of the tubulin polymerization inhibitors. However, due to poor pharmacokinetic properties, high toxicity and resistance, their clinical utility has been limited, generating new opportunities for the development of novel anticancer agents. In recent years, structurally diverse taxoid-site ligands have been identified, including the potent microtubule-stabilizers discodermolide and dictyostatin. These marine sponge-derived natural products have higher water solubility than taxol and exhibit activity against taxane-resistant cell lines. Therefore, the elucidation of their binding modes is important in drug design. Predictive conformation-independent hologram QSAR models were developed for a series of synthetic discodermolide analogs as antiproliferative agents. Receptor-based studies were integrated with molecular recognition patterns, in agreement with experimental evidences, leading to ligand-binding conformations for discodermolide analogs in the taxol-site. The bioactive conformation models were used to the structural alignment of the data set for the development of 3D QSAR CoMFA models, and for comparison with the models constructed with the rigid-body alignment based on minimized structures of the ligands. A set of structural features related to the interaction with the taxol cavity was identified and the molecular recognition patterns were employed to the construction of pharmacophore models based on the microtubule-stabilizing natural products. A final simplified pharmacophore model was integrated in a virtual screening procedure consisting of consecutive hierarchical filters targeting the identification of novel microtubule-stabilizers. Caseobliquins were screened as microtubule-stabilizers, while intermediates for the synthesis of dictyostatin were evaluated by their effects on tubulin assembly. Recently, the search for more simple anti-tubulin agents has renewed the interest in the development of colchicine analogs, often discarded for their high toxicity. Considering the structurally diverse ligands of the colchicine site, the indole derivatives are among the most important ones. Hologram QSAR models were developed for four data sets consisting of 170 indole derivatives, and used to evaluate a data set of commercially available compounds. Pharmacophore-based 3D QSAR CoMFA and CoMSIA models were constructed and compared to three of the individual data sets. The results indicated that the indole nucleus bind to the protein cavity in different ways. Type 1 chalcones, designed based on classical colchicine site ligands, have been screened for their anti-proliferative activity and tubulin assembly inhibition, leading to the synthesis and assessment of a novel series of chalcone analogs with substantial antiproliferative properties. Some N-acylhydrazone derivatives behaved as mitotic arresters in a way similar to that of colchicine, while cytotoxic thiosemicarbazones did not exhibit tubulin-interacting properties.

A doença de Chagas, uma infecção parasitária amplamente distribuída na América Latina, é um problema grave de saúde pública com consequências devastadoras em termos de morbidade e mortalidade humana. O arsenal terapêutico contra a doença é bastante limitado e insuficiente em todos os aspectos clínicos. Visando o desenvolvimento de novos agentes antichagásicos, várias proteínas do parasita têm sido exploradas como alvos terapêuticos. Neste contexto, a enzima cruzaína, uma cisteíno protease envolvida nos estágios de desenvolvimento e diferenciação do Trypanosoma cruzi, foi selecionada para os nossos estudos, visando a identificação de inibidores através do uso do método de planejamento de fármacos baseado na estrutura do receptor (SBDD, do inglês, structure-based drug design). Esta metodologia engloba uma diversidade de estratégias, empregando estruturas cristalográficas de proteínas alvo, disponíveis usualmente no Protein Data Bank (PDB). Entre as técnicas modernas utilizadas no SBDD, destaca-se a triagem virtual baseada na estrutura do receptor (SBVS, do inglês, structure-based virtual screening), que possibilita a seleção de novos candidatos a ligantes de proteínas alvo, a partir de grandes bases de dados de compostos. No presente trabalho de dissertação, a seleção de 19 estruturas da enzima cruzaína, em complexo com ligantes, permitiu a aplicação de métodos de SBDD. Um conjunto com cerca de 3,4 milhões de compostos, com característica líder-similar (do inglês, lead-like), e outro conjunto com aproximadamente 450.000 compostos, com característica fragmento-similar (do inglês, fragment-like), foram coletados da base de dados ZINC. O programa DOCK 3.5.54 foi empregado na triagem virtual das bases de dados utilizando-se a estrutura cristalográfica PDB ID: 3KKU. Um subconjunto com 35.000 moléculas foi selecionado para estudos posteriores com os programas GOLD e Surflex. As 500 melhores moléculas selecionadas por cada um dos programas foram analisadas visualmente considerando-se diversas características estruturais dos subsítios da enzima cruzaína e dos ligantes (e.g., complementaridade molecular, flexibilidade, lipofilia do subsítio S2, presença de doadores e aceptores de hidrogênio entre os subsítios S2 e S1). Desta forma, um conjunto final de 18 compostos foi priorizado para os ensaios bioquímicos frente a enzima cruzaína. Destes 18 compostos, 6 apresentaram atividade inibitória frente a cruzaína, com destaque para os 2 mais promissores, com valores de IC50 (concentração de inibidor necessária para reduzir em 50% a atividade enzimática) de 20 µM e 580 nM. O inibidor mais potente da série foi selecionado da base fragmento-similar e apresentou um valor de eficiência do ligante (EL) de 0,53 kcal/mol/átomo, considerado significativo para otimização em química medicinal. A integração de técnicas computacionais e experimentais permitiu a descoberta de ligantes com inovação estrutural, abrindo novas perspectivas para o planejamento de inibidores mais potentes e seletivos da enzima cruzaína de T. cruzi. / Chagas disease, a parasitic infection widely distributed in Latin America, is a serious public health problem with devastating consequences in terms of human morbidity and mortality. The therapeutic arsenal against the disease is very limited and insufficient in all clinical aspects. This has led to a new paradigm for the discovery of new agents that act on specific enzymes or metabolic pathways. The enzyme cruzain, a cysteine protease essential for the survival of the parasite Trypanosoma cruzi, has been selected in this work as an attractive target for the development of new inhibitors through the use of structure-based drug design (SBDD). This approach brings together a diversity of strategies, which employs crystal structures of target proteins, usually available in the Protein Data Bank (PDB). Structure-based virtual screening (SBVS), one of the most important techniques used in SBDD, allows the selection of new ligands of target proteins from large libraries of compounds. In this work, 19 crystal structures of the cruzain enzyme, in complex with ligands, allowed the application of SBDD methods. A data set of about 3.4 million compounds, with lead-like characteristics, and a second data set, with approximately 450,000 compounds, with fragment-like characteristics, were collected from the ZINC data base. The docking program DOCK 3.5.54 was employed in the virtual screening of the data sets using the crystal structure PDB ID: 3KKU. A subset of 35,000 compounds was selected for further studies with the programs GOLD and Surflex. The 500 top ranked molecules for each of the programs were visually inspected considering a number of structural characteristics of the subsites of the cruzain enzyme, as well as of the ligands (e.g., molecular complementarity, flexibility, the hydrophobic S2 subsite, and the presence of hydrogen donors and acceptors between the subsites S2 and S1). Thus, a final subset of 18 compounds was prioritized for the biochemical assays against the cruzain enzyme. Six out of 18 compounds exhibited enzyme inhibition, with the most two promising inhibitors having IC50 values (IC50 refers to the concentration of compound required for 50% inhibition of cruzain) of 20 µM e 580 nM. The most potent inhibitor of the series was selected from the fragment-like data set and showed a ligand efficiency of 0,53 kcal/mol/atom, which is considered significant in drug design. The integration of computational and experimental approaches allowed the discovery of compounds with innovative structures, providing new perspectives for the design of inhibitors of T.cruzi cruzain having increased potency and selectivity.