Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

CCR5 et CXCR4 sont les corécepteurs d'entrée du VIH utilisés par le virus in vivo en plus du récepteur principal CD4 pour infecter les cellules. Au début et tout le long de l'infection, on retrouve chez les patients infectés par le VIH, des virions R5 utilisant le corécepteur CCR5 pour infecter les cellules. Dans les stades tardifs de l'infection et chez environ la moitié des personnes infectées par le VIH, on observe en plus de ces souches R5, l'apparition de souches X4, utilisant le corécepteur CXCR4 pour infecter les cellules. Cette apparition de souches X4 est un facteur d'aggravation de la maladie. Les causes de cette commutation de R5 vers X4 sont mal définies. Le but de mon travail de thèse a été de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques visant l'un ou l'autre de ces corécepteurs. La première partie de mon travail compare les deux isoformes de CXCR4 en tant que corécepteurs du VIH. Ces deux isoformes, CXCR4-A et CXCR4-B, diffèrent de 9 acides aminés en NH2 terminal suite à un épissage alternatif. Nous avons montré que l'isoforme CXCR4-B est la plus performante en tant que corécepteur du VIH mais que ces deux variants sont équivalents pour la migration vers leur ligand commun SDF-1. Ainsi, nous proposons qu'en ciblant exclusivement l'isoforme B qui est la plus favorable à l'infection, via par exemple des siRNA, il serait possible de limiter les infections par des souches X4 tout en gardant une partie des fonctions essentielles de ce récepteur dans l'organisme, assurées par l'isoforme A. Nos résultats suggèrent également que l'infection par des souches R5 augmente le ratio en ARNm CXCR4-B / CXCR4-A dans des PBMC, et que ce ratio est en partie responsable de la commutation de R5 vers X4 associée à une aggravation de la maladie. Cibler cette isoforme CXCR4-B pourrait donc se révéler bénéfique. La deuxième partie de cette thèse étudie la modulation de la fonction de corécepteur du VIH de CCR5 par S1P1, un autre membre de la famille des récepteurs couplés aux protéines G qui permet la remise en circulation des lymphocytes après leur séjour dans les organes lymphoïdes secondaires par chimiotactisme vers son ligand S1P, abondant dans le sang. Nous montrons que S1P1 interagit physiquement avec CCR5 et gêne l'entrée des virus R5 dans la cellule-hôte. A l'inverse, S1P1 active les étapes post-entrée du cycle viral, notamment l'expression génique virale. La résultante de ces effets opposés est une augmentation de la production virale par des cellules infectées in vitro. Ce projet a également montré que l'utilisation de FTY720, un antagoniste fonctionnel de S1P1, diminue l'infection de cellules dendritiques par des virus HIV-R5 in vitro, ainsi que la virémie dans un modèle de souris SCID infectées après reconstitution immunologique. La mise en évidence des interactions entre CCR5 et S1P1 ouvre donc des perspectives thérapeutiques. / CCR5 and CXCR4 are the two HIV entry coreceptors used by the virus in addition to the main receptor CD4 in vivo to infect cells. R5 virions, that use CCR5 as a coreceptor to infect cells, are detected in most HIV patients. At late stages of infection and in about half of HIV infected persons, there is an emergence of X4 virions that use CXCR4 as a coreceptor, in addition to R5 virions. This emergence is associated with an increase in disease progression. The reasons for this R5 to X4 switch are poorly understood. The goal of my PhD work was to find new therapeutic strategies that target these coreceptors.The first part of this work compares the two CXCR4 isoforms as HIV coreceptors. Those two isoforms, CXCR4-A and CXCR4-B, differ by 9 amino acids at their NH2 terminal extremity as a consequence of an alternative splicing. We have shown that CXCR4-B isoform is more efficient as an HIV coreceptor but that those two variants are equivalent in terms of chemotaxis toward their common ligand SDF-1. Thus, we propose that by targeting specifically the B isoform that supports infection, via siRNA by example, it is possible to limit X4 development while keeping essential functions of this receptor. Our results also suggest that R5 infection increases CXCR4-B / CXCR4-A mRNA ratio in PBMC and that this ratio is in part responsible for R5 to X4 switch. Thus, targeting CXCR4-B isoform could be beneficial.The second part of this PhD thesis studies the effect on CCR5 coreceptor function of S1P1, another G protein-coupled receptor that enables lymphocytes egress from lymph nodes by chemotaxis toward its ligand S1P that is abundant in blood. We have shown that S1P1 physically interacts with CCR5 and blocks R5 virus entry. On the other hand, S1P1 activates post-entry steps of the viral cycle, in particular gene expression. The resulting effect is an increase in viral production by infected cells in vitro. We also showed that the use of FTY720, a S1P1 functional antagonist, decreases dendritic cell infection by R5 viruses in vitro, and in vivo infection in a SCID mouse model. The emphasis of CCR5 and S1P1 interactions opens new therapeutic strategies.

La protéine GPR50, qui fait partie de la famille des récepteurs de la mélatonine, est classée, avec une centaine d’autres protéines à sept domaines transmembranaires (7TM), dans la catégorie des récepteurs couplés aux protéines G hétérotrimériques (RCPG) orphelins, c’est-à-dire pour lesquels aucun ligand n’a pu être identifié. De plus en plus d’études montrent que les 7TM peuvent avoir des fonctions indépendantes d’un ligand. C’est le cas de GPR50 qui inhibe les fonctions du récepteur de la mélatonine MT1 en interagissant directement avec lui. Nous avons cherché à identifier d’autres partenaires associés à GPR50 en appliquant la technique de purification par affinité en tandem et avons mis en évidence son interaction avec un récepteur du facteur de croissance Transforming Growth Factor ß (TGFβ), le récepteur de type I (TβRI).Nous décrivons ici la formation d’un complexe entre GPR50 et le récepteur TβRI au niveau de la membrane plasmique, avec pour conséquence l’induction d’une activité constitutive du récepteur et des voies de signalisation en aval en l’absence de TGFβ, mais également en l’absence du récepteur TßRII qui est habituellement indispensable pour l’activation de TβRI par phosphorylation. Cette activité constitutive se traduit par la phosphorylation des protéines Smad2 et Smad3, leur intégration dans un complexe avec Smad4, la translocation du complexe dans le noyau et finalement l’activation de la transcription de leurs gènes-cibles. Nous avons décrypté les mécanismes moléculaires de cette activation constitutive en montrant que GPR50 entre en compétition, pour l’interaction avec TβRI, avec le régulateur négatif FKBP12, une protéine inhibitrice de l’activité basale du récepteur en l’absence de ligand. Nous avons identifié dans la queue intracytoplasmique de GPR50 un motif répétitif similaire à la séquence de FKBP12 impliquée dans son interaction avec TβRI , motif qui constitue la base moléculaire de cette compétition.Nous avons étudié les conséquences fonctionnelles de cette activation en surexprimant GPR50 de manière stable dans la lignée cellulaire MDA-MB-231, dérivée d’un cancer de sein. Nous avons observé dans ces cellules des effets pro-migratoires et anti-prolifératifs similaires à ceux causés par l’administration de TGFβ.En conclusion, ce travail décrit un nouveau mode d’activation du récepteur TβRI en l’absence de ligand, mais identifie également une nouvelle fonction indépendante d’un ligand pour le RCPG orphelin GPR50. En perspective de ce travail, nous allons essayer d’identifier des conditions biologiques où cette interaction pourrait prendre place afin de confirmer ces résultats dans un contexte plus physiologique. / During the last years, it became more and more accepted, that orphan G Protein coupled receptors (GPCRs) with a transmembrane spanning heptahelical core (7TM) can have ligand-independent functions. One of those 100 orphan GPCRs is GPR50, a 7TM protein with a long cytosolic domain. Recently, studies revealed ligand-independent functions for GPR50, where it has the capacity to modulate the activity of other proteins upon complex formation. By applying a tandem affinity purification approach we sought to identify further putative interacting partners of GPR50. One of the identified binding partners is the transforming growth factor β (TGFβ) receptor type I (TβRI).The TGFβ-dependent signal transduction pathway of serine/threonine kinases is a pathway with direct signal flow from ligand over the receptor to its substrates, the Smads which translocate into nucleus where they bind DNA and regulate gene expression. An important question concerns the generation of specificity and fine-tuning of TGFβ-dependent signaling. Throughout the years, an important number of proteins which regulate the activity of the TGFβ signal transduction pathway in a positive or negative manner have been identified. Most of them act in a cell-context-dependent manner, allowing the regulation of TGFβ signaling adapted to the particular circumstances.We report here the complex formation of GPR50 and TβRI on the plasma membrane. The consequence of this interaction is the GPR50-mediated induction of a constitutive activation of the TβRI and its downstream signaling in a TGFβ ligand-independent manner. This has been monitored by Smad2/3 phosphorylation, Smad2/3-Smad4 complex formation and their subsequent translocation into the nucleus, where they activate Smad-dependent gene expression. In order to decipher the molecular mechanism that allows this activation, we showed that GPR50 competes with the negative regulator, that prevents leaky TGFβ signaling, the gatekeeping molecule FKBP12, for binding to the TβRI. We identified a motif in FKBP12 involved in the interaction with TβRI with similarities to a motif in GPR50, providing a molecular basis for the replacement of FKBP12 by GPR50 in the TβRI complex. We showed that GPR50 is capable of activating the TβRI even in the absence of the TβRII, which normally is required for activating the TβRI by phosphorylation. This reveals a previously unknown mode of activation of the TβRI in absence of the TGFβ ligand and TβRII. In order to identify the functional consequences of this crosstalk, we studied migration and growth of MDA-MB-231 breast cancer cells stably overexpressing GPR50. In these cells, TGFβ-like pro-migratory and anti-proliferative effects have been observed.Future research will help to identify tissues and biological circumstances, where this crosstalk could take place for putting this novel mode of regulation of TGFβ signaling pathway into a context-dependent-manner. Additionally our work established another ligand-independent task for the orphan 7TM protein GPR50, consolidating its function as binding partner and activity modulator.

Résumé confidentiel / Confidential abstract

Le développement des anticorps monoclonaux thérapeutiques est en plein essor notamment à cause de leur bénéfice important pour le traitement des cancers. Cependant, à l’heure actuelle, aucun anticorps monoclonal sur le marché ou en phase III ne cible de RCPGs, en dépit de l’implication grandissante de ces récepteurs dans la carcinogenèse. Parmi les RCPGs les plus pertinents pour l’oncologie, souvent cités dans la littérature et dont certains inhibiteurs chimiques sont en phase clinique avancée, on trouve les deux sous-types de récepteurs des endothélines ETAR et ETBR. Dans ce contexte, mon projet de thèse a consisté à produire des anticorps monoclonaux capables de lier spécifiquement les récepteurs des endothélines, puis à les caractériser dans le but d’évaluer leur potentiel antitumoral. Grâce à une stratégie d’immunisation génique, un ensemble de 27 anticorps monoclonaux, tous spécifiques de la forme native d’ETBR, a été obtenu. Un de ces anticorps, nommé rendomab-B1, a fait l’objet d’une caractérisation précise et s’est révélé être un puissant inhibiteur allostérique d’ETBR. De plus, cette propriété antagoniste a permis de bloquer l’action autocrine antiapoptotique de l’ET-1 sur des cellules endothéliales vasculaires, suggérant ainsi que le rendomab-B1 pourrait être utilisé comme agent thérapeutique afin d’inhiber les effets tumorigènes liés à la suractivation de l’axe ET1/ETBR au niveau de l’endothélium vasculaire tumoral. Par ailleurs, le rendomab-B1 a également été testé sur des lignées de mélanomes humains ; l’absence de fixation de l’anticorps malgré la présence de récepteurs ETB fonctionnels à la surface de ces cellules suggère l’existence d’une forme moléculaire atypique du récepteur, potentiellement spécifique aux mélanomes. A la lumière de ces résultats, le rendomab-B1 apparaît comme un outil prometteur, à la fois pour l’étude structurale et fonctionnelle d’ETBR, mais aussi pour une éventuelle thérapie anticancéreuse. Enfin, les 26 autres anticorps monoclonaux anti-ETBR, actuellement en cours de caractérisation, constituent également des molécules potentiellement intéressantes pour un usage fondamental ou thérapeutique impliquant ETBR. Pour conclure, ces travaux ont démontré l’intérêt de la méthode d’immunisation génique pour la production d’anticorps monoclonaux anti-RCPGs à visée thérapeutique. / For a decade, monoclonal antibodies have become increasingly important for the biotherapeutic management of cancer. However, none of the monoclonal antibodies currently on the market or in late stage clinical trial do target a G-protein coupled receptor in spite of the emerging role of these receptors in tumor progression. Among the therapeutically relevant GPCRs for oncology, the endothelin receptors (ETAR and ETBR) are particularly attractive considering their overexpression in a wide range of tumors and their involvement in various stages of tumorigenesis. In this context, my PhD project consisted in producing and characterizing monoclonal antibodies directed against endothelin receptors with a view to use them as anti-tumor agents. Using an original DNA immunization strategy, we produced a panel of 27 monoclonal antibodies which selectively recognized ETBR expressed at the surface of transfected cells. One of these antibodies, named rendomab-B1, was extensively characterized and proved to be a potent allosteric antagonist of ETBR. Moreover, rendomab-B1 was able to disrupt the autocrine ET1-mediated survival loop on vascular endothelial cells, suggesting that this antibody could be used to prevent the pro-tumorigenic effect due to ET-1 and ETBR upregulation in the tumor-surrounding endothelium. Furthermore, rendomab-B1 binding onto ETBR was also assessed on melanoma cell lines and revealed that a tumor-specific form of ETBR may exist, as illustrated by the poor fixation of rendomab-B1 on these cells in spite of the presence of functional ETB receptors. Together, these results present rendomab-B1 as promising agent, not only for the structural and functional study of ETBR, but also for its therapeutic modulation in the case of cancer for instance. Finally, the other 26 monoclonal antibodies, whose characterization is still ongoing, also constitute potential tools for fundamental or therapeutic applications involving ETBR. To conclude, this work has highlighted the relevance of the DNA immunization approach to generate monoclonal antibodies against the native form of GPCRs.

Il est admis que l’axe endothéline (endothélines ET-1, -2 et -3 et leurs RCPG ETAR et ETBR), participe à la progression tumorale. Alors qu’ETAR est par exemple surexprimé dans le cancer de l’ovaire, ETBR l’est dans le mélanome. Cette surexpression, ainsi que l’implication d’ETA/BR dans la carcinogenèse, font de ces RCPG une cible tumorale pertinente. En raison de leurs forte spécificité, actions cytotoxiques variées, possibilités de couplage, les anticorps monoclonaux (AcM) sont des outils de choix en diagnostic et thérapie anti-cancéreuse. Cependant, on déplore actuellement l’absence d’AcM ciblant des RCPG sur le marché. Par une technique d’immunisation génique, 4 AcM anti-ETAR et 24 anti-ETBR ont été produits. Les résultats préliminaires obtenus avec les anti-ETAR sont prometteurs puisque ces AcM lient avec une haute affinité ETAR surexprimé dans des cellules CHO, l’un d’eux inhibant fortement la liaison du ligand. Mon travail de thèse s’est cependant concentré sur la caractérisation d’un anti-ETBR. Cet AcM reconnaît de façon spécifique et avec une forte affinité la conformation native d’ETBR surexprimé à la surface de cellules de mélanomes, suggérant l’existence d’une forme tumorale du récepteur. Suite à sa liaison aux cellules UACC-257 (lignée de mélanome), l’AcM se trouve internalisé. Dans ces cellules, malgré son incapacité à inhiber la liaison de l’ET, cet AcM inhibe l’activation de la voie PLC induite par le ligand et est également un fort inhibiteur de la migration due à l’activation de l’axe endothéline. Ces travaux soulignent l’intérêt de cet AcM comme outil diagnostique et thérapeutique dans le cas du mélanome. / It has been admitted that endothelin axis (endothelins ET-1, -2 and -3 and related GPCRs ETAR and ETBR) is involved in tumor progression. For instance, while ETAR is overexpressed in ovarian cancer, ETBR is in melanoma. This overexpression, as well as ETA/BR involvement in carcinogenesis, make these GPCRs a relevant tumor target. Because of their high specificity, various cytotoxic actions, possibilities of coupling, the monoclonal antibodies (mAbs) are useful tools in diagnosis and anti-cancer therapy. However, the absence of mAbs targeting GPCRs on the market is regrettable. Thanks to DNA immunization, 4 anti-ETAR mAbs and 24 anti-ETBR mAbs were produced. Preliminary results obtained with anti-ETAR are promising since these mAbs bind ETAR overexpressed in CHO cells with high affinity, one of them being a potent inhibitor of ligand binding. However, the aim of my PhD research works focused on the characterization of one anti-ETBR. This mAb specifically recognizes with high affinity the native conformation of ETBR overexpressed on the surface of melanoma cells, suggesting the existence of a tumor-specific receptor. Following its binding on UACC-257 cells (melanoma cell line), the mAb is internalized. In these cells, despite its inability to inhibit ET binding, this mAb is able to inhibit the ligand-induced activation of PLC pathway and display a potent inhibition of endothelin axis-induced migration. This work highlights the interest of this mAb as a tool for diagnosis and therapy in melanoma.

La mélatonine est une neuro-hormone secrétée par la glande pinéale pour réguler les rythmes circadiens, le sommeil, la physiologie de la rétine, la reproduction saisonnière et diverses fonctions neuronales. La mélatonine exerce ses fonctions en se liant à deux récepteurs membranaires appelés MT1 et MT2 qui appartiennent à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Les RCPG sont connus pour former des homo- et hétérodimères mais la pertinence physiologique de ces complexes reste à démontrer. Plusieurs études montrent que la fonction de ces complexes ne se limite pas à la régulation des protéines G hétérotrimériques, mais inclue également la régulation d'autres protéines comme les transporteurs et les canaux ioniques. Dans ce travail, nous rapportons la formation d'hétérodimères MT1/MT2 dans les photorécepteurs de la rétine de souris et nous montrons que l’augmentation de la sensibilité de ces cellules à la lumière par la mélatonine requiert l'activation de la voie Gq/PLC/PKC qui est spécifique de l’hétéromère. Cette étude confirme alors la pertinence physiologique de l’hétérodimérisation des récepteurs de la mélatonine.Nous avons ensuite cherché à identifier de nouveaux partenaires de MT1 et MT2 en effectuant plusieurs cribles protéomiques et génétiques et un interactome de 378 protéines a pu être construit. L'analyse bioinformatique a révélé la présence de plusieurs protéines présynaptiques (canaux calciques voltage-dépendants Cav2.2, SNAP25, Synapsin et Munc-18) dans l'interactome MT1. Parmi ces partenaires, nous avons montré dans les cellules CHO que le récepteur MT1 interagit avec la protéine Cav2.2 et inhibe l’entrée du calcium d'une manière indépendante de la stimulation par l’agoniste, ce qui suggère un rôle régulateur de MT1 dans la libération des neurotransmetteurs.Un autre partenaire caractérisé est le transporteur de la dopamine DAT. L'interaction physique de DAT avec les récepteurs de la mélatonine diminue l’expression de DAT à la surface cellulaire et diminue l'absorption de la dopamine dans les cellules HEK293. La pertinence physiologique de ces observations a été appuyée par l’augmentation de la recapture de la dopamine dans les synaptosomes du striatum de souris knock-out pour les récepteurs de la mélatonine. En conclusion, ce rapport montre que la construction des interactomes des RCPG offre de nouvelles perspectives pour la découverte de nouvelles fonctions de ces récepteurs, comme les fonctions rétiniennes et neuronales des récepteurs de la mélatonine dans notre étude. La formation de complexes RCPG/RCPG, RCPG/canaux ioniques et RCPG/transporteurs peut avoir un effet fonctionnel réciproque au niveau de l’activité du récepteur et de ces partenaires, mettant ainsi en évidence de nouveaux mécanismes moléculaires de cross-talk cellulaire. / Melatonin is a neurohormone secreated by the pineal gland in a circadian manner. This hormone is involved in the regulation of circadian rhythms, sleep, retinal physiology, seasonal reproduction and various neuronal functions. Melatonin exerts its effects through two G protein-coupled receptors (GPCR) called MT1 and MT2. GPCRs are known to form homo- and heterodimers, but the physiological relevance of these complexes remains a matter of debate. An increasing number of reports show that the function of these GPCR complexes is not restricted to the regulation of heterotrimeric G proteins but include also the regulation of other proteins like transporters and ion channels. Here, we report the formation of MT1/MT2 heterodimers in mouse retinal rod photoreceptors and show that the enhancing effect of melatonin on light sensitivity in these cells requires the activation of the heteromer-specific Gq/PLC/PKC signaling pathway. This study demonstrates the physiological relevance of GPCR heterodimerization.We next searched for new MT1 and MT2 interacting proteins in an unbiased manner by performing several proteomic and genetic screens. An interactome of 378 proteins was built. Bioinformatic analysis revealed the presence of several presynaptic proteins (voltage-gated calcium channel Cav2.2, SNAP25, Synapsin and Munc-18) in the MT1 interactome. Presynaptic localization of MT1 and spatial proximity with presynaptic proteins was confirmed in mouse and rat brains. Among these potential partners, we show that MT1 physically interacts with Cav2.2 in CHO cell line and inhibits Cav2.2-promoted Ca2+ entry in an agonist-independent manner suggesting a regulatory role of MT1 in neurotransmitter release.Another proteins identified in the screens was the dopamine transporter DAT. Physical interaction of DAT with melatonin receptors decreased DAT cell surface expression and diminished dopamine uptake in HEK293 cell. Supporting this result we found using the in vivo model of melatonin receptors knockout mice a respective increase of dopamine uptake in synaptosomal preparations of the striatum of supporting the physiological relevance of these GPCR/transporter complexes. In conclusion, this report shows that GPCR interactome building provides new insights into receptor function, like retinal and neuronal functions of melatonin receptors in our case. Formation of GPCR/GPCR, GPCR/ion channel and GPCR/transporter complexes may have a reciprocal functional impact, on the activity of the receptor and interacting partners thus elucidating new molecular mechanisms cellular cross-talk.

Les neuropeptides tels que la vasopressine et l’ocytocine, hormis leurs actions périphériques bien connues, régulent de nombreuses fonctions cognitives et comportementales via une action centrale. Récemment, il a été démontré que la vasopressine régule, par le biais des récepteurs centraux V1A, V1B et OT de l’ocytocine, l’humeur, l’apprentissage et les désordres affectifs évoluant dans le système limbique. Néanmoins, les isoformes V1A et V1B restent les moins étudiées, souffrant d’un manque d’outils pharmacologiques sélectifs. Chez le rat, un modèle animal des plus utilisé en laboratoire, aucun agoniste de haute affinité sélectif du récepteur V1A n’a été caractérisé. De la même façon pour le récepteur V1B, nous manquons d’outils sélectifs permettant sa localisation dans le système nerveux central. D’où la nécessité de développer de nouvelles molécules sélectives pour répondre à ces besoins. Ceci nous a conduit, lors de ce travail de thèse, à privilégier deux axes de recherches ciblant : Le récepteur V1A.Cette partie concerne la caractérisation des propriétés pharmacologiques d’un nouveau composé, le FE 201874. Ce composé, dérivé du F-180 a été présenté comme un agoniste sélectif du récepteur V1A humain à courte durée de vie. Les résultats de cette étude ont confirmé que le FE 201874 est un très bon ligand sélectif V1B/V1A et V2/V1A vis à vis des expériences de liaison et peu sélectif OT/V1A, ce composé ayant une affinité non négligeable pour le récepteur OT. Son caractère, agoniste V1A et antagoniste OT lui confère une sélectivité complète V1A pour toute approche fonctionnelle. La validation des résultats s’est faite également par des approches ex vivo et in vivo qui ont confirmé le caractère agoniste sélectif du FE 201874. Notre étude a permis donc à la caractérisation du premier agoniste sélectif du récepteur V1A chez le rat. Ce peptide sélectif serait particulièrement utile pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ou pour les études pharmacologiques ayant pour but de mieux comprendre les rôles centraux de ces récepteurs dans les pathologies comportementales et les pathologies liées au stress. Le récepteur V1B Cette partie concerne la caractérisation des propriétés pharmacologiques et de marquage de ligands fluorescents dérivés de la d[Leu4,Lys8]VP, le premier agoniste sélectif du récepteur V1B, en vue d’étudier la distribution centrale des récepteurs V1B chez le rat. Les résultats obtenus ont montré que les 3 analogues testés sont des agonistes sélectifs V1A/V1B et V2/V1B et peu si ce n’est pas sélectif OT/V1B. Leur capacité à marquer les récepteurs V1B en système hétérologue de culture cellulaire et en culture cellulaire primaire a également été évaluée, démontrant que ces ligands fluorescents représentent d’excellents outils pour le marquage et l’étude de la localisation des récepteurs V1B. Ces ligands ont ensuite été utilisés sur coupes fraiches de cerveau de rat pour l’étude de la distribution des récepteurs V1B centraux dans les régions impliquées dans les différents processus comportementaux. Plusieurs sites ont été détectés parmi lesquels l’hippocampe, du cortex, de l’amygdale, de l’hypothalamus le bulbe olfactif Enfin, en tenant compte de la nature agoniste de ces ligands fluorescents, l’activation de la voie MAP kinase au niveau des tranches cérébrale a été également mise en évidence. / Neuropeptides such as vasopressin and oxytocin, apart from their well-known peripheral actions, regulate many cognitive and behavioral functions via central action. Recently, it has been demonstrated that vasopressin regulates, through the central receptors V1A, V1B and OT of oxytocin, mood, learning and affective disorders evolving in the limbic system. Nevertheless, the V1A and V1B isoforms remain the least studied, suffering from a lack of selective pharmacological tools. In the rat, an animal model most used in the laboratory, no agonist of high selective affinity of the receptor V1A was characterized. In the same way for the V1B receptor, we lack selective tools allowing its localization in the central nervous system. Hence the need to develop new selective molecules to meet these needs. This led us, in this thesis, to focus on two axes of research aimed at

Les prokinéticines sont des hormones angiogéniques qui exercent leurs fonctions biologiques par l’intermédiaire de deux récepteurs couplés aux protéines G : PKR1 et PKR2. PKR1 a été révélé comme crucial dans l’homéostasie cardiovasculaire. L’objectif de ce projet de thèse était de développer un nouvel agoniste non–peptidique à PKR1 pour la cardioprotection et la régénération cardiaque. Les premiers résultats ont permis de caractériser le premier ligand spécifique à PKR1 : IS20. L’étude in vivo a démontré qu’IS20 est capable de prévenir les lésions après induction d’un infarctus du myocarde chez la souris. Ce composé améliore les fonctions cardiaques en activant la prolifération de cellules progénitrices cardiaques et la néovascularisation (Gasser et al, PlosOne, 2015). Dans une deuxième étude, nous avons évalué le potentiel cardioprotecteur d’IS20 face à la toxicité induite par la doxorubicine (DOX), un anticancéreux de la famille des anthracyclines très efficace mais cardiotoxique. Les résultats montrent qu’IS20 atténue l’apoptose des cardiomyocytes H9c2 et des cellules progénitrices humaines de types EPDC, induite par la doxorubicine, sans affecter la cytotoxicité de la doxorubicine sur les cellules cancéreuses. In vivo, le traitement par IS20 atténue la diminution de la prolifération provoquée par la doxorubicine dans un modèle de cardiotoxicité juvénile. Dans un modèle de cardiotoxicité chronique, IS20 maintient l’intégrité cellulaire et tissulaire des vaisseaux et protège des défaillances produites par DOX. Par ses effets cytoprotecteurs des cardiomyocytes et des cellules progénitrices cardiaques, l’IS20 présente un potentiel thérapeutique prometteur pour protéger les patients cancéreux des effets cardiotoxiques des anthracyclines. / Prokineticins are angiogenic hormones that activate two G protein-coupled receptors (GPCRs): PKR1 and PKR2. PKR1 has emerged as a critical mediator of cardiovascular homeostasis and cardioprotection. The aim of this thesis project was to develop a first non-peptide PKR1 agonist stimulates cardioprotection and cardiac regeneration in mouse model of myocardial infarction (MI) or anti-cancer drug mediated cardiotoxicity. Collaboration with chemist and biomodelization team, we characterized the first selective/specific PKR1 agonist, named IS20. In vivo study demonstrated IS20 prevented cardiac lesion formation and improved cardiac function after myocardial infarction in mice, promoting proliferation of cardiac progenitor cells and neovasculogenesis (Gasser et al., 2015). Since use of a very potent anthracycline chemotherapeutic, Doxorubicin (DOX) is limited by cardiotoxicity, we hypothesized that IS20 could protect heart against DOX-mediated cardiotoxicity. Indeed, IS20 attenuated apoptosis induced by DOX in H9c2 cardiomyocytes and human epicardial progenitors in vitro. However, IS20 did not affect antineoplastic or cytostatic effect of DOX in cancer cell lines. In vivo, in the juvenile model of cardiotoxicity, IS20 significantly attenuated DOX-induced decrease in viability and proliferation cardiac progenitor cells. In the chronic cardiotoxicity model by DOX, IS20 improves heart structure and function by the activation of cardiac progenitor cells, diminishing cardiac cell death, improving vascular stability. IS20 has translational potential for cardioprotection in patients with cancer receiving anthracyclines.

Afin d’améliorer la stabilité plasmatique de peptides, nous avons développé une nouvelle stratégie basée sur l’introduction d’une chaîne fluorocarbonée dans la séquence d’un peptide natif. En appliquant le concept à l’apeline-17, un peptide présentant un intérêt potentiel pour le traitement de maladies cardiovasculaires, nous avons amélioré sa stabilité plasmatique de 4 min à plus de 24 h ainsi que son efficacité in vivo. L’étude du mécanisme de stabilisation a permis de mettre en évidence la liaison de la fluoroapeline à l’albumine, conduisant à la protection du peptide vis-à-vis de la protéolyse. Le concept a été appliqué à d’autres peptides tels que l’apeline-13, l’angiotensine II, l’ocytocine et la spexine, démontrant ainsi l’étendue et les limitations de la méthode. Enfin, nous avons également conçu des sondes fluorescentes « turn-on » originales capables de révéler leur fluorescence uniquement après liaison au récepteur ciblé. Ces sondes pourront nous servir, par la suite, pour l’étude in vivo de la biodistribution des fluoropeptides. / In order to improve the plasma stability of peptides, we have developed a new strategy based on the introduction of a fluorocarbon chain in the sequence of a native peptide. By applying this concept to apelin-17, a peptide showing a potential interest for the treatment of cardiovascular diseases, we have improved its plasma stability from 4.6 min to more than 24 h as well as its in vivo efficacy. The mechanism leading to the increase of plasma stability has been carefully investigated demonstrating the binding of the fluoroapeline to the albumin, leading to protection towards roteolysis. The concept has been applied to other peptides such as apelin-13, angiotensin II, oxytocin and spexine, showing the extension and the limitations of this method. Finally, we have designed original fluorescent fluorogenic probes which turn on their fluorescence only after binding to the targeted receptor. These probes could be used for in vivo biodistribution studies of fluoropeptides.