Orientadora : Dra. Andréa Rodrigues Ávila / Coorientador : Prof. Dr. Alexandre Haruo Inoue / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 23/02/2017 / Inclui referências : f. 151-158 / Resumo: Trypanosoma cruzi é o protozoário causador da doença de Chagas, uma endemia da América Latina que afeta milhões de pessoas. Este parasita tem um ciclo de vida alternado entre hospedeiros vertebrados e invertebrados, e necessita se adaptar a mudanças em diferentes ambientes que encontra ao longo do ciclo de transmissão. O T. cruzi controla a expressão de genes a partir de eventos majoritariamente pós-transcricionais. Vias que controlam a estabilidade do mRNA ou a tradução de proteínas são bem conhecidas, enquanto que mecanismos moleculares de exportação de mRNA do núcleo para o citoplasma ainda não são bem compreendidos nem em tripanossomatídeos, nem em outros patógenos. Sabe-se, até o momento, que a maioria das proteínas envolvidas com o transporte de mRNA em outros eucariotos não está conservada em diversas espécies de parasitas. Exceto pela proteína Sub2 de T. cruzi (TcSub2), homóloga das proteínas de mamífero e levedura (UAP56/Sub2) e essencial para exportação de mRNA em tripanossomatídeos. Logo, para investigar os componentes desta via, nosso grupo tem investido em identificar proteínas exclusivas e essenciais para a exportação de mRNA em T. cruzi. Abordagens de proteômica, usando como alvo TcSub2, vem permitindo a identificação de fatores com função ainda desconhecida e/ou que são conservados apenas entre espécies de tripanossomatídeos, tornando-os alvos de interesse. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a interação de proteínas alvo com TcSub2 e seu papel na exportação de mRNA em T.cruzi. Duas proteínas não caracterizadas apresentaram motivos conservados e foram denominadas como TcFOP-like e TcAPI5-like. Interessantemente, estes motivos estão presentes em proteínas de outros organismos que estão envolvidas com a via de exportação de mRNA. Aqui, nós confirmamos que TcFOP-like e TcAPI5-like são proteínas nucleares e parecem interagir com TcSub2. Além disso, silenciamento e supereexpressão de TcFOP-like afeta o crescimento do parasita, e nós confirmamos sua interação com outros componentes da via de exportação de mRNA, tais como TcMex67 e TcHel45. Estas evidências suportam presença de components diveregentes na via de exportação de mRNA em Tripanossomatídeos. Palavras chaves: Trypanosoma cruzi. Exportação de mRNA. TcSub2.TcHel45 / Abstract: Trypanosoma cruzi is the protozoan causative of Chagas disease, an endemic disease in Latin America that affects millions of people. This parasite alternates between vertebrate and invertebrate hosts during his life cycle, and needs to adapt to the changes in different environments along the transmission cycle. T. cruzi controls the gene expression mostly by post-transcriptional events. Pathways that control mRNA stability or protein translation are well known, while the molecular mechanisms for mRNA export from nucleus to cytoplasm are still not well understood nether in trypanosomatids or other pathogens. So far, it's known that the most of the proteins that are involved in mRNA transport of other eukaryotes are not conserved in many species of parasites. One exception is T. cruzi Sub2 (TcSub2), a homologue of the proteins in mammalian and yeast (UAP56 / Sub2) and essential for mRNA export in tripanossomatids. Therefore, to investigate the components of this pathway, our group has invested in identifying unique and essential proteins for the export of mRNA in T. cruzi. Proteomic approaches, using TcSub2 as target, have allowed identification of factors with the unknown function and/or that are conserved only in species of trypanosomatids, turning into interesting targets. Then, the aim of this work was to evaluate the interaction of target proteins with TcSub2 and their role in the mRNA export pathway in T. cruzi. Two uncharacterized proteins presented conserved motifs and were named here as TcFOP-Like and TcAPI5-like. Interestingly, those motifs are present in proteins of other organisms which are involved in mRNA export pathway. Here, we confirmed that TcFOP-like and TcAPI5-like are nuclear proteins and seems to interact with TcSub2. Furthemore, knockdown and overexpression of TcFOP-like affect the growth of parasites and we confirmed its interaction with other components of the mRNA export pathway, such as TcMex67 and TcHel45. Those evidences supporte the presence of divergent components in the mRNA export pathway of Tripanossomatids. Keywords: Trypanosoma cruzi. Export of mRNA. TcSub2. TcHel45.

Introdução: O câncer de próstata atinge cerca de três quartos da população masculina acima de 65 anos, sendo esta neoplasia o sexto tipo de câncer mais comum no mundo, e o mais prevalente em homens. O receptor de androgênios (AR) desempenha um papel crítico no desenvolvimento normal da próstata, bem como no câncer prostático. Sua atividade transcricional é regulada através da interação com diversas proteínas. O NCoR1 (correpressor de receptores nucleares) está envolvido na diminuição da atividade do AR sobre a transcrição de genes alvo. Objetivos: Desenvolver um modelo de cultura celular de câncer prostático a partir de fragmentos tumorais; identificar o melhor gene normalizador para estudos de expressão gênica em amostras das células em cultivo; avaliar os efeitos do silenciamento do AR e seu corregulador, NCoR1, sobre a proliferação celular e expressão gênica de PSA, um gene alvo do AR, em células de cultura primária e em células de uma linhagem de câncer prostático (LNCaP – Lymph Node Carcinoma of the Prostate). Métodos: Fragmentos de tumores prostáticos coletados após prostatectomia radical ou prostatovesiculectomia foram plaqueados e mantidos em cultivo. As células que proliferaram a partir dos explants foram testadas para marcadores de epitélio (citoqueratinas) e de malignidade (racemase). Após 10 dias, as células foram silenciadas para o AR e, posteriormente, lisadas para a extração de RNA total ou de proteínas. Células LNCaP foram mantidas em cultura e silenciadas para o AR e o NCoR1, sendo avaliada também a proliferação celular nesta última condição. O cDNA obtido a partir das culturas primárias de CaP foi usado para a amplificação do mRNA de oito genes candidatos a normalizadores, além dos mRNAs do AR e PSA. O cDNA das células LNCaP foi usado para amplificação do mRNA do PSA, e o sobrenadante das células coletado para a dosagem do PSA secretado. Resultados: Apenas 47,7% do total de culturas primárias apresentaram adesão dos fragmentos e proliferação de células. Não foi observada associação entre a adesão dos fragmentos e o escore de Gleason dos tumores. As células cultivadas apresentaram positividade para os marcadores de células epiteliais e de malignidade de células prostáticas, indicando que as células em cultivo se tratavam de células tumorais prostáticas. Para análise da expressão gênica nestas células, o gene que mostrou os melhores parâmetros de estabilidade de expressão foi o gene SDHA, e a melhor combinação de dois genes sugerida neste estudo foi SDHA e ALAS1. O silenciamento do receptor de androgênios foi observado 48 horas após a transfecção com siRNAs, sendo observada uma diminuição nos níveis do mRNA já em 24 horas após a transfecção. Observou-se uma diminuição da expressão gênica do PSA em 24 horas, em resposta à diminuição dos níveis do AR, tanto em cultura primária de CaP quanto na linhagem LNCaP. Em células LNCaP, a transfecção com siRNAs específicos para o NCoR1 não depletou completamente os níveis proteicos, porém estes diminuíram em 24, 48 e 72 horas após a transfecção. Foi verificado um aumento da expressão gênica de PSA 48 horas após o silenciamento do NCoR1, em células tradadas com diidrotestosterona. Não foi observado aumento da secreção de PSA no sobrenadante das células em cultivo 48 horas após o silenciamento. A proliferação das células LNCaP foi diminuída nos grupos transfectados com siRNAs específicos para o NCoR1 e siRNAs inespecíficos, em relação com grupo controle. Conclusões: O modelo de cultura celular a partir de fragmentos tumorais prostáticos é viável, e proporciona uma boa amostragem de células para análises moleculares de câncer de próstata sob diferentes condições experimentais. No entanto, a taxa de sucesso dos cultivos é moderada. Neste modelo, em que foram testados diversos genes em relação à sua estabilidade de expressão, o gene SDHA apresentou uma boa estabilidade, ao contrário de outros genes frequentemente utilizados como genes de referência sem nenhuma análise prévia de sua expressão, como beta-actina, GAPDH e beta-2-microglobulina. Assim, o SDHA, ou ainda a combinação SDHA e ALAS1, é indicado para as estratégias de normalização neste tipo de amostra. O silenciamento do AR em células tumorais prostáticas diminuiu a expressão gênica de PSA, como esperado. O silenciamento de seu correpressor, NCoR1, aumentou os níveis de mRNA do PSA, indicando que sua ausência resulta em um aumento da atividade transcricional do AR. A menor taxa de proliferação nos grupos transfectados pode estar mais relacionada ao estresse da transfecção do que à ausência de NCoR1 nas células. Mais análises poderão confirmar os efeitos da ausência deste correpressor sobre a resposta das células tumorais prostáticas, o que abrirá caminho para um melhor entendimento da fisiopatologia dos tumores prostáticos. / Introduction: Prostate cancer (PCa) occurs in seventy-five percent of men over 65 years old, and it is the sixth most common type of cancer in the world and the most prevalent in men. Androgen receptor (AR) plays a critical role in normal prostate gland development and also in prostate cancer. Its transcriptional activity is regulated by protein interaction and NCoR1 (nuclear receptor co-repressor) decreases the AR activity on target genes transcription. Objectives: To develop a prostate cancer cell culture model from tumor fragments; to identify the best housekeeping gene for gene expression studies in that cultured cells; to evaluate the effects of AR and NCoR1 silencing on cell proliferation and PSA gene expression, a AR target gene, in cells of primary culture of PCa and in a prostate cancer cell line, LNCaP. Methods: PCa fragments obtained from radical prostatectomy or prostatovesiculectomy were plated and maintained in culture. Proliferating cells were tested for markers of epithelium (cytokeratin) and malignancy (racemase). After ten days, cells were transfected with AR siRNAs and then lysed for total RNA or protein extraction. LNCaP cells were silenced for AR and NCoR1, and proliferation rate was also measured in the last condition. cDNA obtained from primary culture was used to amplify eight candidate to housekeeping genes mRNA, and also AR and PSA mRNA. cDNA from LNCaP cells was used to amplify PSA mRNA, and the cells supernatant was collected to dose secreted PSA. Results: Only 47.7% of the total number of primary cultures had fragment adhesion and cell proliferation. There was no association between explants adhesion and tumor Gleason’s score. Cells were positive for epithelium and malignancy markers, confirming the growth of prostate cancer cells. For gene expression analysis in these cells, the gene showing the best parameters of stability of expression was SDHA, and the best combination of two genes was SDHA and ALAS1. AR silencing was observed in 48 hours after siRNA transfection, with a decrease of mRNA levels in 24 hours after transfection. There was a decrease of PSA gene expression in 24 hours, either in primary culture or in LNCaP cells. In LNCaP cells, transfection with NCoR1 siRNA did not depleted entirely the protein levels. However, the levels of NCoR1 decreased in 24, 48, and 72 hours after transfection in relation to control group. There was an increase of PSA gene expression in 48 hours after NCoR1 siRNA transfection in cells treated with dihydrotestosterone. There was no increase in PSA secretion in cells supernatant in response to NCoR1 silencing. LNCaP cell proliferation was decreased in both transfected groups, the specific siRNA to NCoR1 and the unspecific control, in relation to control group. Conclusions: the culture cell model from explants of prostate cancer is practicable, and provides a good cell sampling to molecular analysis of prostate cancer under different experimental conditions. Nevertheless, the successful rate of cultures is moderate. In this model, several genes were tested for expression stability, and SDHA had presented the best values, unlike others classical housekeeping genes, as beta-actin, GAPDH and beta-2-microglobulin. Thus, SDHA, or the combination of SDHA and ALAS1, is indicated to normalization strategies in these samples. The silencing of AR in prostate cancer cells had decreased PSA gene expression, as expected. The silencing of its co-repressor, NCoR1, had increased the PSA mRNA levels, indicating that the absence of this coregulator results in an increase of AR transcriptional activity. The smaller proliferation of transfected groups in relation to control group could be related to the transfection stress, more than to the absence of NCoR1. More analysis can confirm the effects of NCoR1 silencing on tumor cells proliferation rate, and contribute to a better understanding of prostate tumors pathophysiology.

A eritropoietina (EPO) é um hormônio que pertence a um grupo de fatores de crescimento hematopoiético, controlando a proliferação e a diferenciação de células da medula óssea. Ela age induzindo a elevação da produção de células vermelhas, aumentando a quantidade de hemoglobina e o oxigênio circulante. Este hormônio é principalmente secretado pelo rim, e é amplamente usado na medicina no tratamento de anemias, desordens renais e cardíacas, tumores e diversas outras doenças. A EPO recombinante tem sido produzida em células de mamíferos (COS-1 e CHO) em culturas in vitro e tem sido expressa experimentalmente em células de insetos, leveduras e bactérias. Até o momento, há somente uma descrição da expressão transgênica desta proteína em plantas sem, no entanto, sucesso na regeneração de plantas saudáveis e férteis. No presente trabalho, plantas transgênicas de arroz (Oryza sativa) e tabaco (Nicotiana tabaccum) contendo o gene da EPO foram geradas, nas quais foi avaliada a expressão gênica e detectada a presença da proteína recombinante. O gene recombinante da EPO utilizado foi sintetizado baseado na técnica de “overlapping” de nucleotídeos. Um fragmento de 582 pb correspondente ao cDNA da EPO foi clonado e submetido a seqüenciamento automático. Uma mutação no nucleotídeo 252 (G A) foi identificada, o que não modificou o aminoácido codificado pelo códon, uma glicina. O fragmento foi transferido para o vetor de expressão pWUbi.tm1, o qual contém o promotor do gene da ubiquitina e o terminador tm1'. Este cassete de expressão foi transferido para o vetor binário pWBVec4a, que foi transformado nas cepas AGL1 e LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens. Estas cepas foram utilizadas na transformação de arroz e de tabaco, respectivamente. A integração do transgene no genoma da planta foi comprovada por PCR. A expressão da EPO nas plantas de tabaco foi detectada por RT-PCR convencional e quantitiativa, e a presença da proteína foi avaliada por SDS-PAGE e Western blot, provando o sucesso da obtenção de plantas transgênicas de tabaco expressando EPO. Foi obtida por auto-fecundação a geração T1, a qual apresentou segregação mendeliana. Nenhuma das plantas avaliadas apresentou qualquer tipo de deformidade ou mal-formação. Não foi possível a obtenção de plantas de arroz transgênicas devido à deficiência das mesmas no processo de regeneração, possivelmente em conseqüência da super-expressão do transgene em função do promotor escolhido. / Erythropoietin (EPO) is a hormone that belongs to a group of growth hematopoeitic factors, which control the proliferation and differentiation of marrow bone´s cells. It acts inducing the production of blood red cells, increasing the amount of circulating hemoglobin and oxygen. This hormone, mostly secreted by kidneys, is widely used in medicine as a treatment for anaemia, kidney and heart disorders, tumors and numerous diseases. Recombinant EPO has been produced in mammalian cells (COS-1 and CHO) cultured in vitro and has been also experimentally inserted into insect, yeast and bacterial cells. Up to now, to the best of our knowledge, there is only one description of transgenic expression of this protein in plants but without success in the generation of healthy, fertile plants. In the present work we evaluated the expression of human EPO in plants such as rice (Oryza sativa) and tobacco (Nicotiana tabaccum). The recombinant EPO gene was synthesized based on the nucleotide “overlapping” technique. A fragment of 582 bp corresponding to the EPO cDNA was cloned and then submitted to automatic sequencing. At that time, a mutation on nucleotide 252 (G A) was identified. It did not modify the encoded amino acid of the codon, a glycine. This fragment was transferred to the expression vector pWUbi.tm1, armed with the promoter of the ubiquitin gene and the terminator tm1’. This expression cassette was transferred to the binary vector pWBVec4a, which was then transformed into strains ALG1 and LB4404 of Agrobacterium tumefaciens. These strains were employed in the transformation of rice and tobacco, respectively. Transgenic integration into plant genomes was evaluated by PCR. The expression of EPO in tobacco plants was detected by conventional and quantitative RTPCR and the presence of the protein was evaluated by SDS-PAGE and western blot, successfully proving the generation of transgenic tobacco plants expressing EPO. By selfcrossing it was obtained a collection of T1 plants, which presented mendelian segregation of the transgene, and none of the plants presented any kind of miss-formation or deformity. It was not possible to obtain rice transgenic plants due to their deficiency in the regeneration process, possibly due to the transgene over-expression driven by the ubiquitin promoter.

A obesidade caracterizada pelo excesso de tecido adiposo está associada a comorbidades como diabetes mellitus tipo 2 (DMT2), hipertensão arterial, doenças cardiovasculares e alguns tipos de câncer. Para pacientes considerados obesos mórbidos (OBM) (IMC>40Kg/m²) a melhor opção terapêutica é a cirurgia de bypass gástrico em Y de Roux (RYGB). Estudos clínicos mostram que após esse procedimento os indivíduos OBM com DMT2 melhoram seu estado. Uma explicação para esse fenômeno é a mudança anatômica que ocorre no trato gastrintestinal, alterando assim a produção das incretinas, GIP e GLP-1, que promovem a liberação de insulina. Essas incretinas são liberadas pela mucosa do intestino delgado na forma de próhormônios e necessitam da ativação feita pela enzima PC 1/3. Carboidratos e ácidos graxos estimulam sua liberação. Após exercerem sua ação são inativadas pela enzima DPP-IV. Logo o objetivo desse trabalho foi a quantificação de mRNA de pró-glucagon, GIP, PC1/3 e DPP-IV em jejuno proximal de OBM DMT2 e não diabetes mellitus tipo 2 (NDM2) , bem como avaliar o efeito, in vitro, de ácidos graxos monoinsaturados cis, trans e glicose sobre esse tecido. O jejuno foi obtido de indivíduos OBM submetidos RYGB. Para a quantificação basal do mRNA dos genes de interesse, o tecido (n=25) retirado na cirurgia foi diretamente imerso em TRIzol para a extração do RNA total. O mRNA foi quantificado pela reação em cadeia da polimerase (qRTPCR). Para avaliar o efeito dos ácidos graxos in vitro, o jejuno (n=5) foi fatiado (400 µm) e incubado em meio DMEM suplementado com 50 µM de acido oléico, elaidico, vaccênico ou 11 mM de glicose por 4 horas a 37°C em atmosfera de 5% de CO2 Entre OBM DMT2 e NDM2 não houve diferença estatística na expressão do mRNA de GIP, GLP-1 e DPP-IV, apenas observamos que indivíduos NDM2 tem tendência a uma maior expressão do mRNA de PC1/3 (p=0,065). No entanto, alguns pacientes não expressaram mRNA de PC1/3. A expressão dos genes estudados foi heterogênea, permitindo a divisão dos pacientes em alta e baixa expressão de GIP, sendo este utilizado como gene calibrador. Constatamos que a expressão de mRNA dos demais genes acompanham o perfil de expressão de GIP. Os testes in vitro revelaram que o ácido oléico diminuiu a expressão do mRNA de DPP-IV; o ácido vaccênico, aumentou significante a expressão do mRNA de próglucagon; e o ácido elaídico, não modulou a expressão dos genes estudados nesse trabalho. O tratamento com alta concentração de glicose aumentou o mRNA da enzimas PC1/3 e DPP-IV. Em conclusão, OBM NDM2 e DMT2 apresentaram expressão heterogênea desses genes não permitindo verificar diferença significativa entre os grupos. Alguns pacientes não expressaram o mRNA da PC1/3, e NDM2 transcreveram maior quantidade de mRNA desta enzima. Sugerimos que no jejuno proximal, os ácidos oleico e vaccênico da dieta, agem diretamente sobre as células e modulam os níveis das incretinas, diminuindo a expressão do mRNA da DPP-IV e aumentando o pró-glucagon, respectivamente. A glicose em altas concentrações estimula a transcrição das enzimas envolvidas na síntese e degradação das incretinas, podendo interferir na homeostase do metabolismo da glicose. Nossa pesquisa revela que a região do intestino que receberá diretamente o alimento após a cirurgia, pode ser modulada por este, principalmente se apresentar lipídeos e carboidratos na sua constituição. Maior atenção deve ser dada a estes pacientes do ponto de vista nutricional. / The obesity characterized by excess of adipose tissue is associated with comorbidities such as type 2 diabetes mellitus (T2DM), hypertension, cardiovascular disease and some types of cancer. For patients considered morbidly obese (OBM) (BMI> 40Kg/m²) the best therapeutic option is Roux- en- Y gastric bypass (RYGB). Clinical studies show that after this procedure, individuals with OBM T2DM improve this state. One explanation for this phenomenon is the anatomical change that occurs in the gastrointestinal tract, thereby altering the production of incretins, GIP and GLP-1, those promote the release of insulin. These incretins are released in the prohormones form by mucosa of small intestine and require the activation by the enzyme PC 1/3. Carbohydrates and fatty acids stimulate its release. After act they are inactivated by enzyme DPP-IV. Once the objective of this study was to quantify the mRNA of proglucagon, GIP, PC1/3 and DPP-IV in the proximal jejunum of OBM without type 2 diabetes mellitus (NDM2) and with T2DM and to evaluate the effect in vitro of fatty acids cis and trans monounsaturated and high glucose on this tissue. The jejunum was obtained from individuals OBM undergo RYGB. For the quantification of basal mRNA of these genes, the tissue removed at surgery was directly immersed in TRIzol for extraction of total RNA. The mRNA expression was quantified by polymerase chain reaction (qRT-PCR). To evaluate the effect of fatty acids in vitro, the jejunum was sliced (400 µm) and incubated in DMEM supplemented with 50 µM of oleic, elaidic, vaccênic acid or 11 mM of glucose for 4 hours at 37°C in an atmosphere of 5% CO2. Between OBM T2DM and NDM2 no statistical difference was observed in the expression of mRNA of GIP, GLP-1 and DPP-IV, only NDM2 tend to have greater expression of mRNA of PC1/3 (p=0.065). Furthermore, some patients did not express mRNA of PC1/3. The expression of genes studied was heterogeneous, allowing the division of patients into high and low expression of GIP, which was used as a calibrator gene. So, we found that the expression of mRNA of other genes accompany this profile. The in vitro tests showed that oleic acid decreased the DPP-IV mRNA expression, the vaccenic acid, significantly increased the proglucagon mRNA expression and elaidic acid not modulated the expression of genes studied in this work. Treatment with high concentration of glucose increased the mRNA of enzymes PC1/3 and DPP-IV. In conclusion, OBM NDM2 and T2DM showed heterogeneous expression of these genes consequently did not permit verifying significant differences between groups. Some patients do not express the mRNA of PC1/3 and NDM2 transcribe major amount of mRNA of this enzyme. We suggest that in the proximal jejunum, the oleic and vaccenic acid of diet, act directly on cells and modulate incretins levels, reducing the expression of DPP-IV mRNA and increasing the proglucagon, respectively. Glucose at high concentrations stimulates the transcription of enzymes involved in synthesis and degradation of incretins and may interfere with the homeostasis of glucose metabolism. Our research shows that this intestine region that directly receives the food after the surgery, can be modulated by foods that contains especially fat and carbohydrate. Greater attention should be given to these patients about nutritional view.

Células dendríticas (DCs) são células apresentadoras de antígenos usadas em estratégias imunoterapêuticas, como as que utilizam híbridos de DCs e células tumorais. Este projeto avaliou a possibilidade de utilizar, como parceiro de fusão das DCs, células de linhagem tumoral previamente transfectadas com mRNA amplificado de células tumorais contra as quais se pretende induzir resposta. Os híbridos foram capazes de induzir uma resposta antígeno-específica e foi possível enriquecer uma célula com antígenos de outra, uma vez que células transfectadas passaram a apresentar mRNAs da célula doadora, e expressar GFP quando a célula doadora era positiva para GFP. Foi possível amplificar integralmente o mRNA para GFP e amplificar os mRNAs de uma célula, gerando um material contendo mRNAs do preparado inicial mas incapaz de aumentar a expressão das moléculas avaliadas nas células transfectadas, mostrando que o protocolo ainda precisa ser aperfeiçoado. Em conjunto, os resultados mostraram que a estratégia de imunoterapia aqui explorada é promissora e merece maior investigação. / Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells widely used in immunotherapy strategies, as the ones that utilize dendritic cell tumor cell hybrids. The present project evaluated the possibility of using cells from tumor cell lines, which were previously transfected with mRNA amplified from tumor cells against which a response is aimed, to fuse with DCs. The hybrids were able to induce a specific immune response. Also, it was possible to enriched one cell with antigens from another one, since transfected cells increased the amount of mRNAs from the donator cell, and expressed GFP when the donator cells expressed this protein. It was possible to successfully amplify the GFP specific mRNA. The mRNAs amplified from RNA of different cell lines contained mRNAs that were present in the total extracted RNA, but were not able to increase the expression of the molecules we attempted to detect in the transfected cells, showing that the protocol still need to be improved. Together, these results show that this new strategy is promising and deserves further investigation.

Tanto os androgênios quanto os estrogênios possuem um papel significativo na próstata e são indispensáveis para o crescimento normal prostático. A enzima aromatase catalisa a reação de conversão de androgênios para estrogênios. O papel dos estrogênios e seus receptores na etiologia e progressão do câncer de próstata (CaP) e da hiperplasia prostática benigna (HPB) é muito pouco compreendido. Objetivo: Analisar a expressão do mRNA dos receptores de estrogênio ER , ER 2, ER 5 e da enzima aromatase. Analisar a expressão protéica do ER e ER nos grupos CaP e HPB. Métodos: Tecidos prostáticos oriundos de câncer de próstata e de hiperplasia prostática benigna foram submetidos à extração de RNA total com o reagente Trizol, o RNA foi reversamente transcrito para cDNA e avaliado usando RT-PCR para a expressão dos receptores de estrogênio , 2, 5 e aromatase. A expressão protéica de ER e ER foi analisada por Western blot. Resultados: Comparações entre os tecidos hiperplásico e de carcinoma indicaram uma maior expressão do mRNA ER (P<0,001) e da proteína (P<0,038) em amostras de câncer comparada a HPB. A expressão do mRNA do ER 5 foi significativamente aumentada nos tecidos hiperplásicos comparada ao grupo câncer. A expressão do mRNA do ER 2 e da aromatase não foi diferente entre os grupos HPB e CaP. Nossos resultados também mostraram que a expressão protéica do ER não foi diferente entre os grupos HPB e CaP. Conclusões: O presente estudo indicou que a expressão protéica e gênica do ER e a expressão gênica do ER 5 são diferentes entre os grupos sugerindo que o aumento dos níveis do ER no CaP e do mRNA ER 5 na HPB pode ser importante na progressão das doenças prostáticas. / Both androgens and estrogens play a significant role in the prostate and are critical for normal prostate growth. The aromatase enzyme catalyzes the reaction to conversion of androgens to estrogens. The role of estrogen and its receptors in the etiology and progression of prostate cancer (PCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH) is poorly understood. Objective: The purpose of this study was to evaluate the estrogen receptors ER , 2, 5 and aromatase enzyme mRNA expression and to investigate also the ER and ER protein expression in groups PCa and BPH. Method: Total RNA of prostate cancer and benign prostatic hyperplasia tissues was extracted from each sample by the Trizol method and cDNA was performed. ER , ER 2, ER 5 estrogen receptors and aromatase gene expression were quantified by RT-PCR. ER and ER protein expression was evaluated by Western blot. Results: Comparisons of the hyperplastic and tumor prostate tissues indicated an overexpression of ER mRNA (P<0,001) and protein (P<0,038) in tumor specimens. The mRNA expression of ER 5 was significantly increased in hyperplastic tissues compared to tumor group. The mRNA expression of ER 2 and aromatase was not different between BPH and PCa groups. Our results also showed that the protein expression of ER was not different between BPH and PCa groups. Conclusions: The present study indicated that gene and protein expression ER and gene expression ER 5 are different between the groups suggesting that the ER increased levels in PCa and mRNA ER 5 in BPH may be important in progression of prostate diseases.

Tanto os androgênios quanto os estrogênios possuem um papel significativo na próstata e são indispensáveis para o crescimento normal prostático. A enzima aromatase catalisa a reação de conversão de androgênios para estrogênios. O papel dos estrogênios e seus receptores na etiologia e progressão do câncer de próstata (CaP) e da hiperplasia prostática benigna (HPB) é muito pouco compreendido. Objetivo: Analisar a expressão do mRNA dos receptores de estrogênio ER , ER 2, ER 5 e da enzima aromatase. Analisar a expressão protéica do ER e ER nos grupos CaP e HPB. Métodos: Tecidos prostáticos oriundos de câncer de próstata e de hiperplasia prostática benigna foram submetidos à extração de RNA total com o reagente Trizol, o RNA foi reversamente transcrito para cDNA e avaliado usando RT-PCR para a expressão dos receptores de estrogênio , 2, 5 e aromatase. A expressão protéica de ER e ER foi analisada por Western blot. Resultados: Comparações entre os tecidos hiperplásico e de carcinoma indicaram uma maior expressão do mRNA ER (P<0,001) e da proteína (P<0,038) em amostras de câncer comparada a HPB. A expressão do mRNA do ER 5 foi significativamente aumentada nos tecidos hiperplásicos comparada ao grupo câncer. A expressão do mRNA do ER 2 e da aromatase não foi diferente entre os grupos HPB e CaP. Nossos resultados também mostraram que a expressão protéica do ER não foi diferente entre os grupos HPB e CaP. Conclusões: O presente estudo indicou que a expressão protéica e gênica do ER e a expressão gênica do ER 5 são diferentes entre os grupos sugerindo que o aumento dos níveis do ER no CaP e do mRNA ER 5 na HPB pode ser importante na progressão das doenças prostáticas. / Both androgens and estrogens play a significant role in the prostate and are critical for normal prostate growth. The aromatase enzyme catalyzes the reaction to conversion of androgens to estrogens. The role of estrogen and its receptors in the etiology and progression of prostate cancer (PCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH) is poorly understood. Objective: The purpose of this study was to evaluate the estrogen receptors ER , 2, 5 and aromatase enzyme mRNA expression and to investigate also the ER and ER protein expression in groups PCa and BPH. Method: Total RNA of prostate cancer and benign prostatic hyperplasia tissues was extracted from each sample by the Trizol method and cDNA was performed. ER , ER 2, ER 5 estrogen receptors and aromatase gene expression were quantified by RT-PCR. ER and ER protein expression was evaluated by Western blot. Results: Comparisons of the hyperplastic and tumor prostate tissues indicated an overexpression of ER mRNA (P<0,001) and protein (P<0,038) in tumor specimens. The mRNA expression of ER 5 was significantly increased in hyperplastic tissues compared to tumor group. The mRNA expression of ER 2 and aromatase was not different between BPH and PCa groups. Our results also showed that the protein expression of ER was not different between BPH and PCa groups. Conclusions: The present study indicated that gene and protein expression ER and gene expression ER 5 are different between the groups suggesting that the ER increased levels in PCa and mRNA ER 5 in BPH may be important in progression of prostate diseases.

Leitão, C. C. F. Efeito do FSH, Ativina-A e GDF-9 sobre o desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais caprinos. 2011. 112 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia), Campus de Sobral, Universidade Federal do Ceará, Sobral, 2011. / Submitted by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-06-15T15:22:10Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_ccfleitao.pdf: 1217871 bytes, checksum: f33f9f636971df4fb09b48a95e60fefb (MD5) / Approved for entry into archive by Djeanne Costa (djeannecosta@gmail.com) on 2016-06-15T15:48:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_ccfleitao.pdf: 1217871 bytes, checksum: f33f9f636971df4fb09b48a95e60fefb (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-15T15:48:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_ccfleitao.pdf: 1217871 bytes, checksum: f33f9f636971df4fb09b48a95e60fefb (MD5) Previous issue date: 2011 / The aim of this study was to investigate the levels of messenger RNA (mRNA) for activin-A on goat preantral and antral follicles and the effects of follicle stimulating hormone (FSH), activin-A and growth and differentiation factor - 9 (GDF-9) on growth and mRNA expression for activin-A, GDF-9, bone morphogenetic protein (BMP) -2, -4, -6, -7, -15 and FSH receptor (FSH-R) in goat preantral follicles cultured in vitro. Initially, primordial, primary and secondary follicles, as well as cumulus-oocyte complexes (COCs) and mural granulosa/theca cells of small and large antral follicles were isolated mechanically from goat ovaries and the expression of mRNA for activin-A was evaluated by real-time PCR. For in vitro studies, goat secondary follicles were isolated and cultured for 6 days in the presence of FSH alone (50 ng/mL) or in combination with activin-A (100 ng/mL) or GDF-9 (200 ng/mL). Alone or in combination with FSH, the influence of activin-A on expression of activin-A and FSH-R, and the effect of GDF-9 on the levels of mRNA for GDF-9, FSH-R and BMP -2, -4, -6, -7 and -15 in secondary follicles after 6 days of culture were tested. For this, after extraction of total RNA and cDNA synthesis, the levels of mRNA for activin-A, GDF-9, FSH-R and BMP -2, -4, -6, -7 and -15 were quantified by real time PCR. The results showed that secondary follicles had lower levels of mRNA for activin-A, than compared to primary follicles (p<0.05). There was no difference in levels of mRNA for activin-A between primordial and primary or secondary (p>0.05). Allied to this, there was no difference between COCs of small and large antral follicles (p>0.05). Moreover, granulosa and theca cells of large antral follicles showed higher levels of mRNA for activin-A than in small antral follicles (p<0.05). When comparing mRNA expression for activin-A between COCs from small and large antral follicles and their granulosa and theca cells, no difference in expression levels was observed (p>0.05). After in vitro culture of secondary follicles, the presence of FSH either alone or associated with activin-A or GDF-9 increased survival, follicular growth and antrum formation (p<0.05). The FSH increased mRNA for activin-A, while the follicles cultured with activin-A showed increased levels of mRNA for FSH-R (p<0.05). In addition, GDF-9 decreased mRNA expression for BMP -2 and -15 (p<0.05), but had no effect on expression of BMP -4, -6, and -7 (p>0.05). In conclusion, during the transition from primary to secondary follicles there is a reduction of mRNA for activin-A, whereas there is an increased expression of this factor during the growth of antral follicles. FSH, activin-A and GDF-9 stimulate growth of goat secondary follicles after 6-day culture. After follicle culture FSH controls the expression of activin-A, and the expression of FSH-R is regulated by activin-A. Furthermore, GDF-9 reduces the mRNA expression for BMP-2 and -15 / O objetivo deste estudo foi investigar os níveis de RNA mensageiro (RNAm) para ativina-A em folículos pré-antrais e antrais caprinos e os efeitos do hormônio folículo estimulante (FSH), ativina-A e fator de crescimento e diferenciação - 9 (GDF-9) sobre o crescimento e a expressão de RNAm para ativina-A, GDF-9, proteína morfogenética óssea (BMP) -2, -4, -6, -7, -15 e receptor de FSH (R-FSH) em folículos pré-antrais caprinos cultivados in vitro. Inicialmente, folículos primordiais, primários e secundários, bem como complexos cumulus-oócito (COCs) e células da granulosa mural/teca de pequenos e grandes folículos antrais foram isoladas mecanicamente a partir de ovários de cabra e a expressão de RNAm para ativina-A foi avaliada por PCR em tempo real. Para os estudos in vitro, folículos secundários caprinos foram isolados e cultivados por 6 dias na presença de FSH sozinho (50 ng/mL) ou em combinação com ativina-A (100 ng/mL) ou GDF-9 (200 ng/mL). Isoladamente ou em combinação com FSH, a influência de ativina-A na expressão de ativina-A e R-FSH, e o efeito do GDF-9 sobre os níveis de RNAm para GDF-9, R-FSH e BMP -2, -4 , -6, -7 e -15 em folículos secundários após 6 dias de cultivo foram testados. Para isso, após a extração do RNA total e síntese do cDNA, os níveis de RNAm para ativina-A, GDF-9, R-FSH e BMP -2, -4, -6, -7 e -15 foram quantificados por PCR em tempo real. Os resultados mostraram que folículos secundários apresentavam níveis menores de RNAm para ativina-A comparado aos folículos primários (p<0,05). Não houve diferença nos níveis de RNAm para ativina-A entre folículos primordial e primário ou secundário (p>0,05). Aliado a isso, não houve diferença entre COCs de pequenos e grandes folículos antrais (p>0,05). Além disso, as células da granulosa e da teca de grandes folículos antrais apresentaram maiores níveis de RNAm para ativina-A do que de pequenos folículos antrais (p<0,05). Quando comparamos a expressão do RNAm para ativina-A entre COCs de pequenos e grandes folículos antrais e suas células da granulosa e da teca, nenhuma diferença nos níveis de expressão foi observada (p>0,05). Após o cultivo in vitro de folículos secundários, a presença de FSH sozinho ou associado com ativina-A ou GDF-9 aumentou a sobrevivência, crescimento folicular e formação de antro (p<0,05). O FSH também aumentou o RNAm para ativina-A, enquanto os folículos cultivados com ativina-A apresentaram níveis aumentados de RNAm para R-FSH (p<0,05). Além disso, o GDF-9 diminuiu a expressão de RNAm para BMP -2 e -15 (p<0,05), mas não teve efeito sobre a expressão de BMP -4, -6 e -7 (p>0,05). Em conclusão, durante a transição de folículo primário para secundário há uma diminuição do RNAm para ativina-A, enquanto ocorre um aumento da expressão deste fator durante o crescimento de folículos antrais. FSH, ativina-A e GDF-9 estimulam o crescimento de folículos secundários caprinos após 6 dias de cultivo. Após cultivo folicular, FSH controla a expressão de ativina-A e a expressão do R-FSH é regulada por ativina-A. Ainda, GDF-9 reduz a expressão do RNAm para BMP -2 e -15

A obesidade é uma doença multifatorial fortemente associada com a síndrome metabólica e com as doenças hepáticas. A distribuição da gordura corporal é um fator relevante, e especificamente o tecido adiposo visceral parece ser o elo entre o aumento de peso, a síndrome metabólica e o acúmulo de gordura hepática. Os adipócitos estão envolvidos na regulação do balanço energético e podem ser modulados por hormônios, citocinas e nutrientes, entre eles o resveratrol. São dois os objetivos principais deste trabalho: (1) identificar os níveis basais de expressão do mRNA de SIRT1, adiponectina, FOXO1, PPARg e PPARb/d em diferentes tecidos adiposos (retroperitoneal, subcutâneo e visceral) de indivíduos obesos grau III com diferentes níveis de esteatose hepática; e (2) identificar a ação do resveratrol sobre a expressão do mRNA dos genes citados em adipócitos isolados do tecido adiposo visceral de indivíduos obesos grau III. Os tecidos adiposos foram obtidos durante cirurgia bariátrica. O RNA total foi extraído usando o reagente TRIzol e o mRNA foi quantificado por PCR em tempo real. Para a análise da expressão basal dos genes, dividimos os pacientes em dois grupos: aqueles com esteatose simples ou moderada e aqueles com esteatose severa associada ou não à fibrose e inflamação. Comparando os dois grupos estudados, os pacientes com esteatose severa apresentaram uma menor expressão do mRNA de SIRT1 (p=0,006), apenas no tecido adiposo visceral. Os níveis de adiponectina, FOXO1, PPARg1-3 e PPARb/d não diferiram estatisticamente entre os dois grupos de pacientes nos três depósitos de gordura corporal. O valor de HOMA-IR foi diferente estatisticamente entre os grupos estudados, sendo maior no grupo de pacientes com diagnóstico de esteatose severa associada ou não a fibrose e necroinflamação (p=0,006). Neste mesmo grupo de pacientes, a expressão de SIRT1 e o valor de HOMA-IR correlacionaram-se positivamente no tecido adiposo visceral (r=0,607; p=0,048). Quanto à modulação por resveratrol, houve aumento significativo nos níveis do mRNA de SIRT1 (p=0,021), adiponectina (p=0,025) e FOXO1 (p=0,001) nos adipócitos isolados do tecido adiposo visceral de obesos grau III. A expressão do mRNA de PPARg1-3 foi modulada negativamente (p=0,003) nas células estudadas. Considerando a expressão do PPARb/d, não houve modulação por resveratrol na concentração, tempo e modelo celular estudados. Analisando a literatura, verificamos que valores diminuídos de SIRT1 já foram associados à progressão da esteatose, em modelos experimentais. Neste trabalho, observamos menor transcrição de SIRT1 no tecido adiposo visceral de obesos com esteatose severa, o que poderia prejudicar a biogênese mitocondrial e a oxidação de ácidos graxos, contribuindo com o aumento de ácidos graxos livres na circulação portal, favorecendo o acúmulo hepático de lipídeos nestes pacientes. Desta forma, sugerimos que o aumento da expressão de SIRT1 no tecido adiposo visceral pode ter efeito protetor contra a evolução da esteatose em obesos grau III. Também constatamos que resveratrol ativa a expressão do mRNA de SIRT1, adiponectina e FOXO1 e diminui a expressão de PPARg1-3. Os resultados indicam que resveratrol pode modular o metabolismo dos adipócitos de obesos grau III, possivelmente favorecendo o metabolismo das células estudadas. / Obesity is a complex disease, strongly associated with metabolic syndrome and hepatic disease. The distribution of body fat is important, and specifically visceral adipose tissue seems to be the link between weight gain, metabolic syndrome and hepatic fat accumulation. Adipocytes are involved in the regulation of energy balance and can be modulated by hormones, cytokines and nutrients as resveratrol. The objectives of this study were: (1) to determine the expression pattern of SIRT1, adiponectin, FOXO1, PPARg1-3 and PPARb/d mRNA in different adipose tissues (retroperitoneal, subcutaneous and visceral) of morbidly obese with different levels of hepatic steatosis; and (2) analyze whether resveratrol could modulate the mRNA expression of the cited genes in isolated visceral adipocytes of morbidly obese. The adipose tissue was obtained by bariatric surgery. Total RNAs were extracted using TRIzol reagent and genes reverse transcripts were determined by quantitative polymerase chain reaction. For analysis of basal genes expression, we divided patients in two groups: those with slight or moderate steatosis and other comprising individuals with severe steatosis associated or not with necroinflammation and fibrosis. When comparing the two groups of patients, we found that the amount of SIRT1 mRNA in the visceral adipose tissue of morbidly obese with severe steatosis was decreased (p=0.006). The levels of adiponectin, FOXO1, PPARg1-3 and PPARb/d did not differ statistically between the two groups of patients in the fat depots studied. We found that HOMA-IR value was significantly higher in severe steatosis patients group (p=0.006). Our results also show that the mRNA expression of SIRT1 and HOMA-IR was positively correlated in the visceral adipose tissue of patients with severe steatosis (r=0.654; p=0.048). Regarding the modulation by resveratrol, there was significant increase in SIRT1 (p=0.021), adiponectina (p=0.025) and FOXO1 (p=0.001) mRNA in isolated visceral adipocytes. The mRNA expression of PPARg1-3 was negatively modulated by resveratrol (p=0.003). Considering PPARb/d, there was not a significantly modulation by resveratrol, in the studied model. Reduced quantities of SIRT1 mRNA have been described in severe steatosis using experimental models. We found lower transcription of SIRT1 expression in the visceral adipose tissue of obese patients with severe steatosis, which may impair mitochondrial biogenesis and fatty acids oxidation, contributing to the increase of free fatty acids in portal circulation, impairing liver function. Thus, we suggest that the increased SIRT1 mRNA expression may have a protective role on steatosis in visceral adipose tissue of morbidly obese individuals. Also, we observed that resveratrol activated the expression of SIRT1, FOXO1 and adiponectin and decreases PPARg1-3, which indicate that resveratrol can control adipocytes metabolism, possibly favoring the metabolism of studied cells.

BEZERRA, Daniela da Silva. “Análise da viabilidade e expressão de genes de virulência de Streptococcus mutans em lesões dentinárias de crianças com cárie precoce da infância”. 2014. 74 f. Tese (Doutorado em Odontologia) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-05-26T15:07:47Z No. of bitstreams: 1 2014_tese_dsbezerra.pdf: 8252613 bytes, checksum: 8661237a83bb54c5fcb6ed84904a2523 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-05-26T15:10:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_tese_dsbezerra.pdf: 8252613 bytes, checksum: 8661237a83bb54c5fcb6ed84904a2523 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-26T15:10:58Z (GMT). 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Twenty-nine samples of active dentin caries and 16 samples of arrested dentin lesions were collected from children with ECC. The samples were submitted to extraction and purification of total RNA through a customized method, based on the use of a mechanical lysis and a commercial extraction kit and submitted to reverse transcriptase (RT) reaction to obtain complementary DNA (cDNA). Next, to demonstrate the primers specificity for the virulence genes on in vivo samples, 06 cDNA samples were submitted to Sanger’s sequencing for each primer. After verifying the specificity, RT-qPCR (quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction) were executed for all the samples. The results showed that the bacterial RNA could be extracted in appropriate quantity and quality through the customized protocol, making its use on gene expression studies on dentin affected by caries (Chapter 01). The RT-qPCR results showed that, despite the low quantification, if compared to total streptococci and total bacteria, SM was detected as metabolically active with similar quantification on active and arrested lesions (p>0.05). Despite that, a higher expression of the virulence genes pdhA and aguD was detected on arrested lesions (p≤0,05) (Chapter 02). It was concluded that after standardization of an effective RNA extraction technique, reactions of RT-qPCR were efficiently executed for SM identification, quantification, and gene expression on samples of human dentin affected by caries. This bacterium proved to be viable, however, only inactive lesions showed larger expression of the genes pdhA and aguD, probably to make its metabolic activity viable, even in unfavorable survival conditions. / A cárie precoce da infância (CPI) é caracterizada pela presença de uma ou mais lesões em superfície dentária de crianças menores de 6 anos de idade, sendo considerada um problema de saúde pública. Streptococcus mutans (SM) é considerado o principal agente etiológico da doença e possui vários atributos de virulência que permitem sua sobrevivência na cavidade oral e, portanto, sua seleção em situações de estresse nesse ambiente. Neste contexto, este trabalho teve por objetivos: (a) padronizar um método de extração e purificação de RNA total para viabilizar estudos de expressão gênica bacteriana de lesões de cárie dentinária in vivo (capítulo 1); (b) identificar e quantificar SM metabolicamente ativo e analisar a expressão dos genes de virulência atpD, fabM, nox, pdhA e aguD em lesões dentinárias ativas e inativas (capítulo 2). Foi realizada a coleta de 29 amostras de dentina cariada ativa e de 16 amostras de lesões dentinárias inativas de crianças com CPI. As amostras foram submetidas à extração e purificação do RNA total por um método padronizado, com base no uso de lise mecânica e kit de extração comercial e, em seguida, submetidas às reações de transcrição reversa (RT) para obtenção do DNA complementar (cDNA). Com o intuito de comprovação da especificidade dos primers para os genes de virulência de SM em amostras in vivo, 06 amostras de cDNA foram amplificadas e submetidas ao sequenciamento de Sanger para cada primer. Após verificação da especificidade, reações em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real da transcrição reversa (RT-qPCR) foram executadas para todas as amostras. Os resultados obtidos mostraram que o RNA bacteriano pôde ser extraído em adequada quantidade e qualidade pelo protocolo padronizado, viabilizando seu uso em estudos de expressão de genes bacterianos em dentina cariada (Capítulo 01). Os resultados da RT-qPCR mostraram que, apesar da baixa quantificação em relação aos estreptococos e bactérias totais, SM viáveis foram detectados com quantificação semelhante em lesões ativas e inativas (p>0.05). Apesar disso, maior expressão dos genes de virulência pdhA e aguD foi detectada nas lesões inativas (p≤0,05) (Capítulo 02). Concluiu-se que, após padronização de uma técnica eficaz de extração de RNA, reações de RT-qPCR foram executadas com eficiência para identificação, quantificação e expressão gênica de SM em amostras de dentina humana cariada. SM estavam viáveis nos dois grupos de lesões, porém só nas lesões dentinárias inativas mostraram maior expressão dos genes pdhA e aguD, provavelmente para viabilizar sua atividade metabólica nas condições menos favoráveis à sua sobrevivência, inerentes a este substrato.