Nos últimos anos, diversos protocolos e tecnologias têm sido propostos a fim de viabilizar ou otimizar a micropropagação de diversas culturas, bem como reduzir custos de produção. Dentre eles, tem ganhado destaque, o uso do meio de cultura líquido e do sistema de biorreator de imersão temporária (BIT). No entanto, observam-se diferenças de resposta entre espécies e metodologias, sendo necessários maiores estudos para um melhor conhecimento dos fatores que afetam os sistemas de micropropagação. Estudos recentes, baseados em técnicas moleculares, têm revelado que as culturas in vitro não são axênicas, como se acreditava, apresentando comunidades endofíticas onipresentes. Sabendo-se da importância desses microrganismos em plantas a campo, passou-se a questionar o papel destes no desenvolvimento e multiplicação de plantas in vitro. Diante deste cenário, este trabalho se propôs a comparar o desempenho de culturas in vitro em diferentes condições de cultivo: meio semissólido, meios líquido estático, sob agitação e, avaliando-se o crescimento/ multiplicação das plântulas e, naqueles onde houve diferença no desempenho, foram realizadas análises moleculares para a caracterização da comunidade microbiana presente na parte aérea das plantas. Foram utilizadas culturas de bromeliáceas e cana-de-açúcar, buscando sistemas que permitissem as avaliações pretendidas. Para isto foram instalados experimentos com Ananas comosus var. comosus (\'Imperial\' e \'Pérola\') e Aechmea nudicaulis, sob cultivo em meio líquido estático e sob agitação; e com Vriesea hieroglyphica E. Morren, sob cultivo em meio líquido estático, sob agitação e em BIT. Para a gramínea, cana-de-acúcar (Saccharum spp., variedade SP80-3280), foram avaliados o cultivo em meio líquido estático e em BIT. Foram também realizadas análises moleculares de plântulas de Dyckia distachya, que haviam sido cultivadas em meios de culturas semissólido, líquido sob agitação e estático. As culturas que apresentaram diferenças de desempenho entre os sistemas avaliados foram D. distachya, (sendo o melhor tratamento o meio líquido sob agitação) e cana-de-açúcar (melhor tratamento foi BIT) e estas foram consideradas como sistemas adequados para o estudo de como diferentes sistemas de cultivo in vitro podem influenciar na comunidade bacteriana das plantas. A caracterização da comunidade bacteriana de D. distachya foi realizada por T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) e mostrou que o tratamento meio líquido sob agitação, o qual teve a maior produção de brotos em relação aos demais, diferiu quanto à abundância relativa das unidades taxonômicas operacionais (UTOs) encontradas. Para cana-de-açúcar foram realizadas a construção de bibliotecas de clones do gene 16S rRNA e PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Estas análises mostraram não haver diferença significativa entre as bibliotecas dos tratamentos avaliados, no entanto, BIT apresentou 3,54 vezes mais cópias do gene 16S rRNA em relação ao tratamento meio líquido estático, nos permitindo inferir que também possui uma maior número de bactérias. Este estudo apresenta fortes indícios de que o sistema de cultivo in vitro utilizado influencia a comunidade microbiana presente nas plantas / In recent years, several protocols and technologies have been proposed for feasibility and optimization of micropropagation of different cultures as well as to reduce production costs. Among these, the use of liquid culture medium and the temporary immersion bioreactor system (TIB) have gained special attention. However, differences are observed among species and methodologies, being necessary more detailed studies for a better knowledge of the factors that affect the micropropagatiion systems. Recent studies, based on molecular techniques, have revealed that in vitro cultures are not axenic, as thought, presenting ubiquitous endophytic community. Knowing the importance of these microorganisms to field plants we would like to know more about their role in in vitro plants. In this scenario, this work proposes to compare the performance of in vitro cultures under different culture conditions: semisolid medium culture, liquid static and liquid medium under agitation, and where differences in in vitro performance were observed comparative molecular analysis of microbial community in the plantlets was performed. Bromeliads and sugarcane cultures were used seeking for model systems for these analyses. These experiments were conducted with Ananas comosus var. comosus (\'Imperial\' and \'Pérola\') and Aechmea nudicaulis cultured under liquid static medium and liquid under agitation, and with Vriesea hieroglyphica, we compared liquid static medium, liquid medium under agitation and TIB. For sugarcane (Saccharum spp. variety SP80-3280), liquid static medium and TIB was compared. Molecular analyses of Dyckia distachya plantlets, which had been grown in semisolid medium liquid static and liquid medium under agitation, were also carried out. Cultures that showed differences in performance among the systems evaluated were D. distachya, (with liquid medium under agitation as the best condition) and sugarcane (best treatment was BIT) and these were considered adequate to study the differences in the bacterial comunity of plants when grown in different in vitro conditions. The characterization of the microbial community of D. distachya was performed by T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) and showed that the liquid medium under agitation, which had the highest number of shoots compare to the other culture conditions, also differed as to the relative abundance of Operational Taxonomic Units (OTUs). For sugarcane 16S rRNA gene clone libraries, as well as real-time PCR (qPCR) were performed. These analyses showed no significant differences between the libraries of the two treatments, however, BIT showed 3.54 times more copies of the 16S rRNA gene compared to cultures from static liquid medium, allowing us to infer a higher number of bacteria. This study provides strong evidence that the in vitro system used influences the microbial community present in plants

Os microrganismos atraem considerável atenção por serem uma fonte de compostos biotecnológicos e farmacêuticos. Diversos produtos naturais peptídicos produzidos por fungos e bactérias são sintetizados por grandes enzimas, conhecidas como peptídeo sintetase não ribossômica (NRPS) e policetídeo sintase (PKS). A bioprospecção dos microrganismos isolados do solo de Terra Preta Antropogênica (TPA) da Amazônia Ocidental é de grande importância para o conhecimento deste bioma tropical. Este estudo correlacionou a presença de sideróforos e de compostos antimicrobianos produzidos pelos microrganismos isolados de TPA e dos solos adjacentes com a presença dos genes que codificam para NRPS e PKS. Linhagens bacterianas foram isoladas das amostras do solo coletadas de 10, 20 e 40 cm de profundidade. Os isolados foram cultivados em meio líquido específico por 2 dias a 28oC. Um total de 143 isolados foi testado para a atividade de sideróforo e para isso, as linhagens foram inoculadas em um meio com baixa concentração de ferro (MM9) contendo o complexo cromoazurol S-Fe3. Do total, 72 isolados apresentaram reação positiva para a produção de sideróforo. O DNA genômico dos isolados foi extraído e a amplificação por PCR foi realizada usando iniciadores específicos para NRPS e PKS. Os resultados mostraram que quinze isolados apresentaram o gene que codifica para NRPS, vinte isolados para PKS e somente dez isolados apresentaram ambos os genes. A presença de genes de NRPS e PKS em 31% dos isolados testados sugere que a produção dos sideróforos possa ocorrer pela via não ribossomal. Dois isolados foram selecionados para estudos de identificação e caracterização dos compostos. O isolado TP11 foi identificado como Pseudomonas putida através de seqüenciamento do 16S rRNA e apresentou resultado negativo para hidroxamato e catecol, sugerindo que o tipo de sideróforo não possui nenhum destes grupos funcionais. O isolado TP16 foi identificado como Pseudomonas putida e apresentou produção de sideróforo do tipo catecol e hidroxamato, sugerindo a produção de mais de um sideróforo. Além disso, esta linhagem produziu um composto antimicrobiano, com atividade de sideróforo identificado por espectrometria de massas como pseudomonina com massa molar de 330 Da. / Microorganisms have attracted considerable attention as a source for biotechnological and pharmaceutical agents. Several peptidic natural products synthesized by fungi and bacteria are assembled by large enzymes, referred as nonribosomal peptide synthetase (NRPS) and polyketide synthase (PKS). Bioprospection of microorganisms isolated from Anthropological Dark Earth soil of Brazilian Occidental Amazon is of great importance to the knowledge of this tropical biome. This study aimed to correlate the presence of siderophores and antimicrobial compounds produced by microorganisms isolated from Dark Earth and adjacent soils of Brazilian Amazon with the presence of genes encoding NRPS and PKS. Bacterial strains were isolated from soil samples collected at 10, 20 and 40 cm depth. The isolates were grown in specific liquid medium for 2 d at 28oC. A total of 143 isolates were screened for siderophore activity and for this, bacterial strains were inoculated on plates containing an iron-limited medium (MM9) amended with a chromeazurol S-Fe3 complex. From the total, seventy-two isolates showed positive reaction for siderophore production. Genomic DNA of the isolates was extracted and PCR amplification was carried out using specific primers for NRPS and PKS. The results showed that fifteen isolates presented NRPS, twenty isolates presented PKS and only ten isolates showed both genes. The presence of NRPS and PKS genes in 31% of the isolates tested suggests that production of siderophores may occur by a nonribosomal pathway. Two isolates were selected for further studies. Isolate TP11 was identified as Pseudomonas putida by 16S rDNA sequencing analysis and was negative for hydroxamate and catechol, suggesting that the siderophore type has no hydroxamate- or catechol-type functional groups. The isolate TP16 was identified as Pseudomonas putida and showed the production of catechol and hydroxamate siderophore-type, suggesting the production of more than one siderophore. In addition, this strain produced an antimicrobial compound, with siderophore activity identified through mass spectrometry as pseudomonine with a molar mass of 330 Da.

Um método baseado na extração de rRNA, seguido de RT-PCR rRNA 16S, clonagem e ARDRA foi otimizado e validado para a identificação das bactérias ativas em biofilmes. O método foi analisado primeiro com consórcios artificiais de três organismos. As etapas de clonagem e RT não causaram variações importantes na composição destes consórcios, do contrário da etapa de PCR, onde foi necessária a redução de 30 para 10 ciclos para limitar a distorção da proporção de templates. A análise de biofilmes reais indicou que clones dominantes podem ser identificados com o critério de ocorrência de >2% na biblioteca, mas que a reprodutibilidade de análises ainda é insatisfatória, possivelmente devido a fatores como a micro heterogeneidade espacial do biofilme, viés na reação de PCR e formação de mais de um clone de ARDRA por organismo. O armazenamento do biofilme a -20 °C por 2 meses não levou à alterações expressivas em sua composição. O perfil de clones detectado com o kit (Mo Bio) de extração de RNA foi muito diferente do perfil detectado com o método otimizado neste trabalho. / A method based on extraction of rRNA, followed by RT-PCR of 16S rRNA, cloning and ARDRA was optimized and validated for identification of bacteria active in biofilms. The method was first tested with artificial three-membered consortia. Cloning and RT did not lead to significant changes in the composition of the artificial consortia, but a reduction in cycle number in the PCR reaction from 30 to 10 was necessary for limiting the distortion in the proportion of amplicons relative to that of the templates. Analysis of real biofilms revealed that clones from active organisms occurred in frequencies >2% in the clone library, but reproducibility of analysis was unsatisfactory, probably due to factors such as the spatial heterogeneity of colonization of biofilms by microbes, PCR bias and more than one ARDRA clone per organism. Storage of biofilm samples at -20 °C for 2 months did not lead to important changes in composition. Very different clone profiles were obtained in the analysis of the same biofilm sample with the optimized method and with a kit (Mo Bio) for extraction of RNA.

Die toxische sowie kanzerogene Verbindung 1,2-Dichlorpropan (DCP) ist weit verbreitet in Industrie und Landwirtschaft. Die Verbindung zeigt eine geringe chemische Reaktivität, ist nur mäßig wasserlöslich und unter aeroben Bedingungen weitestgehend beständig gegenüber mikrobiellen Abbauprozessen in der Umwelt. Als Folge reichert sich DCP in Grundwässern, Sedimenten und Böden an und gefährdet über die Nahrungskette die Gesundheit von Mensch und Tier. Um DCP effizient und ökonomisch zu unbedenklichen Verbindungen abzubauen, wurden mikrobielle Mischkulturen aus belasteten Sedimenten angereichert und in einen Wirbelschichtreaktor überführt. Dieses Verfahren ermöglichte eine kontinuierliche anaerobe Dechlorierung von DCP zu Propen. Grundsätzlich stellen biologische Abbauverfahren, bei denen komplexe mikrobielle Mischpopulationen eingesetzt werden, einen vielversprechenden Weg zur Transformation chlororganischer Verbindungen dar. Jedoch liegen üblicherweise nur wenige Informationen über die Zusammensetzung der betreffenden Populationen vor, so daß eine Optimierung bzw. effiziente Steuerung des Prozesses erheblich erschwert wird. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Bestimmung der mikrobiellen Zusammensetzung der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation. Aufgrund der bekannten Limitierungen klassisch-mikrobiologischer Nachweisverfahren wurde eine Kombination mehrerer molekulargenetischer Methoden eingesetzt, die auf der vergleichenden Sequenzanalyse ribosomaler RNA beruhten. Die Untersuchungen zeigten, daß die Bakterienpopulation des Reaktors außerordentlich divers zusammengesetzt war und im wesentlichen aus bislang nicht-kultivierten Arten bestand. Es dominierten "Grüne nicht-schwefelhaltige Bakterien" (green nonsulfur bacteria) sowie Grampositive Bakterien mit niedrigem GC-Gehalt. Die Archaea hingegen waren fast ausschließlich durch zwei bekannte methanogene Spezies vertreten, Methanosaeta concilii sowie Methanomethylovorans hollandica. Der Vergleich der gewonnenen rDNA-Daten mit denen anderer Lebensräume ergab, daß Süßwasserhabitate, in denen chlororganische Verbindungen reduktiv umgesetzt werden, offenbar eine spezifische Populationsstruktur aufweisen. Es konnten spezifische 16S rDNA-Gruppen definiert werden (SHA-Cluster), die auch nach längerem Reaktorbetrieb noch nachgewiesen werden konnten. Darüber hinaus wurden Dehalobacter restrictus- sowie Dehalococcoides ethenogenes-ähnliche Bakterien in der DCP-dechlorierenden Bioreaktorpopulation gefunden. Beide Spezies sind in der Lage, chlororganische Verbindungen unter Verwendung von Wasserstoff als alleinigem Elektronendonor reduktiv zu dechlorieren. Es ist davon auszugehen, daß Dehalobacter und Dehalococcoides spp. aufgrund ihrer Physiologie an der reduktiven Umsetzung des DCPs beteiligt sind. Die Untersuchung der Population über einen längeren Zeitraum zeigte überdies, daß Bakterien der Gattung Dehalobacter überproportional angereichert und daraufhin zur dominierenden Spezies im Reaktor wurden. Dieser Befund läßt auf eine zentrale Rolle von Dehalobacter spp. bei der Transformation von DCP zu Propen schließen. Konsequenterweise führte die Zugabe von Wasserstoff zum Reaktor zur einer deutlichen Steigerung des DCP-Umsatzes. Dehalobacter und Dehalococcoides spp. sowie die anderen durch SHA-Cluster repräsentierten Bakterien stellen potentielle Indikatororganismen für die DCP-Transformation im Reaktor dar. Ein kontinuierliches Monitoring dieser Bakterien würde zu einer effizienteren Steuerung des Dechlorierungsprozesses und damit zu einer Optimierung des Verfahrens führen. / The toxic and carcinogenic compound 1,2-dichloropropane (DCP) is widely used in industry and agriculture. DCP shows a low chemical reactivity. It is only moderately soluble in aqueous systems and almost recalcitrant to microbial degradation under aerobic conditions. As a consequence DCP accumulates in groundwater, sediments and soil, thus endangering humans and animals via the food chain. To efficiently transform DCP to harmless organic compounds microbial mixed cultures have been enriched from sediments and were subsequently transferred into a fluidized bed bioreactor. This process allowed a continuous anaerobic dechlorination of DCP to propene. Bioreactor processes using complex microbiota represent a promising technology for transformation of chlorinated compounds. However, the composition of the used population is usually unknown, hence hindering both optimization and control of the degradation process. Subject of this work was the analysis of the microbial diversity of the DCP-dechlorinating bioreactor population. Conventional culture-dependent microbiological methods are often limited if used for the analysis of complex communities. Therefore, a combination of different molecular methods based on comparative 16S rRNA analysis was applied. It was found that the bioreactor population was highly diverse and consisted mainly of as yet-uncultured bacteria. Members of the green nonsulfur bacteria and the gram-positive bacteria with low G+C content dominated the consortium. In contrast the archaea were represented by only two species, Methanosaeta concilii and Methanomethylovorans hollandica. The comparison of the rDNA data with those of other biotopes revealed that reductively dechlorinating freshwater habitats show a specific community structure. 16S rDNA-clusters were defined, which could still be detected after a longer operation time of the bioreactor. Furthermore, Dehalobacter restrictus- and Dehalococcoides ethenogenes-like bacteria were found in the DCP-dechlorinating bioreactor population. Both species are capable of reductive dechlorination using hydrogen as the sole electron source. Therefore, it could be assumed that these bacteria were also involved in the dechlorination of DCP. The investigation of the bioreactor population for a longer period of time revealed that Dehalobacter-like bacteria were significantly enriched and subsequently became the most frequently found bacterium within the bioreactor. This indicates a major role of Dehalobacter spp. within the transformation process of DCP to propene. Consequently, the addition of hydrogen to the bioreactor led to an increase of the DCP transformation rate. Dehalobacter und Dehalococcoides spp. as well as the bacteria represented by the specific SHA-clusters are possibly suitable as indicator organisms for the transformation of DCP within the bioreactor. A continuous monitoring of these bacteria would lead to a more efficient control and hence, to an optimization of the transformation process.

Submitted by Ana Damasceno (ana.damasceno@unipampa.edu.br) on 2017-06-07T18:12:48Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Baixa diversidade e sucessão microbiana anormal estão associadas à enterocolite necrosante em recém-nascidos prematuros.pdf: 1587508 bytes, checksum: c407e4cf94f25b2272a7d25213f72873 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-07T18:12:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Baixa diversidade e sucessão microbiana anormal estão associadas à enterocolite necrosante em recém-nascidos prematuros.pdf: 1587508 bytes, checksum: c407e4cf94f25b2272a7d25213f72873 (MD5) Previous issue date: 2017-04-07 / As múltiplas causas de Enterocolite Necrosante (NEC) e seus indicativos clínicos utilizados para o diagnóstico ainda se mantêm elusivos. Biomarcadores alternativos para o diagnóstico precoce de NEC em recém-nascidos prematuros e um melhor entendimento dos fatores de risco para o desenvolvimento de NEC são desafios emergentes. Em uma tentativa de contribuir para a solução deste problema, neste trabalho nós rastreamos as mudanças no microbioma dos recém-nascidos (diversidade microbiana, abundância e estrutura) com NEC, iniciando com a primeira evacuação (mecônio) e continuando até a liberação, e comparamos essas mudanças com os prematuros sem o diagnóstico de NEC. Um estudo metataxonomico foi conduzido usando 88 amostras fecais, a partir da primeira evacuação até a 5ª semana de vida, obtidas de 25 recém-nascidos prematuros (14 controles e 11 casos de NEC) selecionados de um grupo de 52 prematuros. Nossos dados revelaram que casos de NEC apresentaram baixa diversidade e uma transição anormal da comunidade microbiana até o diagnóstico de NEC. Um microrganismo pertencendo a família Enterobacteriaceae foi consistentemente mais abundante em prematuros com NEC do que nos controles, mesmo nas amostras de mecônio, e foi considerado um constituinte chave da comunidade microbiana correlacionada com a doença. Finalmente, nos também detectamos uma distorção na associação micróbio-micróbio nas amostras de mecônio dos casos de NEC. Portanto, nossos dados sugerem que a detecção precoce de elevada dominância de Enterobacteriaceae, baixa diversidade e associações micróbio-micróbio nos primeiros dias de vida poderiam ser utilizados como indicativo de risco de desenvolvimento de Enterocolite Necrosante nas UTIs neonatais brasileiras. / The multiple causes of Necrotizing Enterocolitis (NEC) as well as the clinical predictors used for diagnosis have remained elusive to date. Alternative biomarkers for early diagnosis of NEC in premature infants and a better understanding of risk factors for NEC development are emergent challenges. In attempt to contribute to solve this problem, in this work we tracked the changes in the newborn’s microbiome (microbial diversity, abundance and structure) with Necrotizing Enterocolitis beginning with the first stool (meconium) continuing until discharge and compare those changes with preterns without NEC diagnosis. A metataxonomy study was conducted using 88 fecal samples from the first stool (meconium) until the 5th week of life obtained from 25 preterm babies (14 controls and 11 NEC cases) selected from a cohort of 52 premature infants. Our data revealed low microbial diversity in NEC cases and an abnormal transition of the microbial community until NEC diagnosis. A microbial phylotype belonging to the Enterobacteriaceae family were consistently more abundant in NEC than in the controls even in meconium samples and was considered a key constituent of the microbial community that correlated with the disease. Finally, we also detected a disruption of microbial-microbial associations in the meconium samples of NEC cases. Thus, our data suggests that early detection of high dominance of Enterobacteriaceae, low diversity and altered microbial-microbial associations at the first days of life could be used as an indicative of risk of preterm development of Necrotizing Enterocolitis in Brazilian NICU’s.

A mastite bovina é considerada a doença de maior impacto nos rebanhos leiteiros, exercendo efeito econômico negativo sobre a produtividade e perdas significativas à indústria de laticínios. Tendo em vista os impactos na sanidade animal e os prejuízos econômicos acarretados, o objetivo deste estudo foi caracterizar de forma mais abrangente a comunidade microbiana presente em rebanhos leiteiros com mastite subclínica utilizado o sequenciamento parcial do gene 16S ribossomal RNA (rRNA). Especificamente, foram caracterizadas as comunidades bacterianas presentes em amostras de leite vindas de três fazendas comerciais, sendo que cada fazenda contribuiu com amostras com alta contagem de células somáticas (CCS > 200.000 cel./mL) e com baixa contagem (CCS < 200.000 cel./mL) perfazendo um total de 57 animais. O DNA total foi extraído e amplificado com os oligonucleotídeos iniciadores da região V3 e V4 do gene 16S rRNA. O sequenciamento foi realizado utilizando a tecnologia de sequenciamento de nova geração através do equipamento MiSeq (Illumina - San Diego, EUA). Para efeito de comparação, alíquotas de todas as amostras foram destinadas ao cultivo microbiológico para identificação de bactérias causadoras da mastite. Os fragmentos amplicons de todas as amostras foram submetidos a uma série de análises computacionais utilizando o programa QIIME. Após a avaliação adicional das sequências em nível de espécie, verificou-se que em geral as bactérias diagnosticadas por cultura geralmente não corresponderam com as sequências mais abundantes detectadas pelo sequenciamento. A análise da composição da microbiota de amostras de leite provenientes de animais saudáveis revelou a presença de uma grande diversidade de espécies bacterianas, mesmo que nenhuma bactéria tenha sido detectada por técnica de cultura. A espécie bacteriana mais abundante em todas as amostras foi Staphylococcus chromogenes. Staphylococcus aureus também foi detectada na grande maioria das amostras As diferenças na composição microbiana foram observadas entre as amostras quando a comparação foi feita de forma individual. Estas diferenças foram notórias em composição taxonômica e foram refletidas por intermédio das estimativas de alfa e beta diversidade. Quando a comparação foi realizada por separação de grupos com alta e baixa CCS, essa diferença não foi tão evidente. Com este estudo será possível compreender a diversidade dos microrganismos presentes na glândula mamária de animais saudáveis e com mastite subclínica. Essas informações podem ser úteis podendo contribuir no planejamento de medidas terapêuticas e preventivas mais eficazes da doença. / Bovine mastitis is considered the most impact disease in dairy herds, exerting negative economic effect on productivity and significant losses to the dairy industry. In view of the impact on animal health and carted economic losses, the objective of this study was to characterize more comprehensively the microbial community present in dairy herds with subclinical mastitis using the partial sequencing of 16S ribosomal RNA gene (rRNA). Specifically, the bacterial communities present in samples of milk coming from three commercial farms were identified, and each farm contributed samples with high somatic cell count (SCC> 200,000 cel./mL) and low count (SCC <200,000 cel./ml) for a total of 57 animals. Total DNA was extracted and amplified with primers of the V3 and V4 region of the 16S rRNA gene. Sequencing was performed using the new generation of sequencing technology through MiSeq equipment (Illumina - San Diego, USA). For comparison, aliquots of all samples were intended for microbiological culture for identification of bacteria which cause mastitis. The amplicon fragments of all samples were subjected to a series of computer analyzes using the QIIME program. After further evaluation of the sequences at the species level, it was found that in general the bacteria do not generally diagnosed by culture corresponded to the most abundant sequences identified by sequencing. The analysis of milk samples from microbial composition from healthy animals revealed the presence of a diversity of bacterial species, even though no bacteria have been detected by culture technique. The most abundant bacterial species in all samples was Staphylococcus chromogenes. Staphylococcus aureus was also detected in most samples differences in microbial composition were found between the samples when a comparison was made individually. These differences were noticeable in taxonomic composition and were reflected by means of the estimates of alpha and beta diversity. When comparison was performed by separation of high and low groups with CCS, this difference was not so evident. This study will be possible to understand the diversity of microorganisms present in the mammary gland of healthy animals and with subclinical mastitis. This information can be useful and can contribute in the planning of more effective therapeutic and preventive measures of the disease.

Archaea ainda não foi reconhecido como patógeno de doença humana. O objetivo deste estudo foi determinar a prevalência, diversidade, níveis e proporções de Archaea no biofilme subgengival de indivíduos com periodontite agressiva (PA) e saúde periodontal (SP). Sessenta indivíduos foram selecionados para este estudo (n=30/grupo). A análise de diversidade foi realizada em 10 indivíduos/grupo. Quatro sítios/indivíduo do grupo PA e 2 sítios/indivíduo do grupo SP foram analisados por qPCR. A freqüência de Archaea foi de 60% dos indivíduos/ 15,2% dos sítios em PA e de 63,3% dos indivíduos/ 15,6% dos sítios em SP (p>0,05). Um a três filotipos foi identificado por amostra. O número de cópias e a proporção de Archaea e Bacteria foram menores no grupo SP do que no grupo PA (p<0,05). Archaea são encontrados no biofilme subgengival de indivíduos com PA e SP. Methanobrevibacter oralis é o filotipo mais prevalente, podendo ser considerado residente da cavidade bucal. A alteração ecológica na microbiota de indivíduos com PA inclui o aumento dos níveis e proporções de Archaea. / Membrers of Archaea domain may be detected in the microbiota of mucous surfaces of human and animals, but their association with diesase have not been yet stablished Some studies have suggested that Archaea domain may be indirectly associated with pathogenesis of periodontitis, since they are found restrict to subgingival sites with severe periodontal destruction. The aim of this study was to determine the prevalence, diversity, levels and proportions of microorganisms of Archaea domain in subgingival biofilm of aggressive periodontitis and periodontally healthy subjects. Thirty generalized aggressive periodontitis (GAgP) and 30 periodontally healthy (PH) subjects were selected. Archaea detection was performed by PCR using domain-specific primers in 9 subgingival samples taken from each subject. Archaea diversity was determined by evaluating a single positive sample per subject, randomly selected from 10 GAgP and 10 PH subjects. Archaeal 16S rRNA gene library were constructed to each sample and the identity of phylotypes were determined for the comparison of unrecognized sequences with gene database. The levels and proportions of Archaea in relation to total microbial load were analysed by quantitative PCR (qPCR) in 4 sites per GAgP subject and 2 sites per PH subject. A total of 540 subgingival samples were analysed to Archaea presence. This domain were detected in 18 GAgP (60%) and in 19 PH (63.3%) subjects. Forty-one (15.2%) and 42 (15.6%) samples were positive for this domain in GAgP and PH subjects, respectively. There was not difference in prevalence of this domain between subjects from GAgP and PH groups, as well as there was not difference in prevalence between sites with different probing depthsin GAgP group. Thenumber of 16S rRNA clones available to identification per sample varies from 33 to 47 in GAgP group, and from 15 to 23 in PH group, with a mean of 42.8+3.9 e 20.2 +2.2, respectively. The analysis of 629 sequencies permits an identification of 1 to 3 phylotypes of Archaea domain per sample. Methanobrevibacter oralis was detected in all archaeal positive samples, being the single detected specie of this domain in 5 subjects from GAgP group, and in 3 subjects from PH group. Methanobacterium curvum/congolense was detected in 3/10 GAgP and 6/10 PH samples, whereas Methanosarcina mazeii was detected in 4/10 samples from both groups. Archaea analysis by qPCR was carried out in 103 sites and 28 GAgP subjects and in 60 sites and 30 PH individuals. Archaea has been detected in 27/28 subjects and in 68% of studied sites in GAgP group and in 26/30 subjects and 58,3% of total analysed sites in PH group. Archaeal and bacterial 16S rRNA mean levels were smaller in PH group than in GAgP group (Mann Whitney, p<0.05). There was no statistic significance of difference in the levels of Archaea in regard to probing depth categories in GAgP group (p>0.05). Moreover, the proportion of Archaea in relation to total microbial load (Archaea + Bacteria) was 0.02% and 0.08% in PH and GAgP group (p<0.05), respectively. These data suggest that Archaea is commonly found in the subgingival biofilm of humans, and that M. oralis may be considered a member of the resident microbiota of subgingival sites. The ecological shift in the microbiota of aggressive periodontitis subjects includes the increase of levels and proportions of Archaea domain.

O exossomo é um complexo de exorribonucleases composto por onze proteínas envolvidas no processamento de rRNA, snRNAs, snoRNAs e na degradação de mRNAs. Todas as subunidades do complexo possuem possíveis domínios de RNase porém apenas quatro delas já tiveram a sua atividade de exorribonuclease caracterizada in vitro. Este complexo foi identificado inicialmente em levedura, sendo também encontrado em outros organismos eucarióticos e também em archaea. O estudo das interações entre suas subunidades resultou em modelos estruturais para o exossomo de H sapiens e T. brucei. A despeito do exossomo ter sido caracterizado em levedura, um estudo das possíveis interações entre as subunidades neste organismo ainda não foi realizado. Com a proposta de identificar estas interações em levedura, neste trabalho foi usado o sistema do duplo híbrido, uma poderosa ferramenta para analisar as interações proteína-proteína. Os resultados obtidos através deste sistema mostraram que a subunidade Rrp4p interagiu com as proteínas Rrp41p, Rrp44p, Mtr3p e Rrp6p. A subunidade Rrp41p mostrou uma forte interação com Rrp45p e a subunidade Rrp42p com Mtr3p. A proteína Rrp45p interagiu com Rrp41p e Rrp43p. A proteína Mtr3p interagiu com Rrp4p, Rrp42p e com Csl4p. Em nossos testes a subunidade Rrp40p não mostrou qualquer interação com as outras subunidades do complexo. Outras proteínas envolvidas no processamento RNA como Noplp, Nop58p, Nop8p e Lsm8p também foram testadas para interações com as subunidades do exossomo e mostraram que interagem com Rrp4p e Mtr3p. Estes resultados inéditos trouxeram novas informações para o futuro modelo estrutural do exossomo e novos da dos sobre a participação deste complexo no processamento de RNA. A determinação da sua estrutura pode contribuir para entender a versatilidade deste complexo em vários processos nos quais ele está envolvido na célula. / Exossome is a complex of exorribonucleases composed for eleven proteins involved in the processing of rRNA, snRNAs, snoRNAs and in the degradation of mRNAs. All the subunits of this complex possess possible RNase domains, however only four of them already had its exorribonucleases activity of characterized in vitro. This complex was identified initially in yeast, being also found in other eukaryotes organisms and also in archaea. The study of the interactions between its subunits resulted in structural models for the exossome of H. sapiens and T. bracei. The spite of exossome has been previously characterized in yeast a study of the possible interactions between the subunits in this organism was still not carried through. With the proposal of identifying these interactions in yeast, we used this work system of yeast two hybrid, a powerful tool analyze protein-protein interactions. The results obtained through this system showed that the subunit Rrp4p internet with the proteins Rrp41p, Rrp44p, Mtr3p and Rrp6p. The subunit Rrp41p showed to one strong interaction with Rrp45p and the subunit Rrp42p with Mtr3p. The Rrp45p protein interacted with Rrp41p and Rrp43p. The Mtr3p protein interacted with Rrp4p, Rrp42p and with Cs14p. In our tests the subunit Rrp40p did not show any interaction with the other subunits of the complex. Other proteins involved in processing RNA as Nop1p, Nop58p, Nop8p and Lsm8p had also been tested for interactions with the subunits of the exossome and had shown that they internet with Rrp4p and Mtr3p. These results had brought new inforrnation for a future structural model of the exossome and new data on the participation of this complex in the processing of RNA. The deterrnination of its structure can contribute to better understand the versatility of this complex in the various processes in which it is involved within the cell.

A diversidade bacteriana pode ser estudada, combinando técnicas convencionais e técnicas que empreguem tecnologias modernas para sua melhor compreensão. O objetivo do trabalho foi analisar a diversidade de bactérias cultiváveis e não cultiváveis em amostras de água do mar coletadas no Canal de São Sebastião no período de agosto/2005 a março/2007. As bactérias marinhas foram quantificadas em Agar marinho e identificadas por seqüenciamento do gene 16S rDNA. A concentração dos grupos a-, b-, g- e s-proteobacteria foi verificada através da técnica de FISH. A comunidade total foi analisada através da construção de três bibliotecas mensais (novembro/2006, fevereiro/2006, fevereiro/2007). O seqüenciamento identificou 87% das bactérias marinhas como Vibrio sp. A técnica de FISH detectou maior concentração de b-proteobacteria (10,2%), em relação ao número de células totais (DAPI) que variou de 7,0x106 a 2,3x107 céls/mL. As bibliotecas de clones foram compostas pelos filos Proteobacteria, Bacteroidetes, Cyanobacteria, Firmicutes, Fusobacteria, Verrucomicrobia e Chloroflexi. / Microbial diversity can be studied by a combination of techniques of both conventional and modern approaches for better understanding. The aim of this study was analyze marine bacteria culturable and nonculturable diversity from seawater samples collected at São Sebastião Channel during August 2005 to March 2007. Marine bacteria were quantified using Marine Agar and identified by 16S rRNA sequencing. Concentration of a-, b-, g- e s-proteobacteria group was verified through three clones library monthly (November 2006, February 2006, February 2007). The sequencing identified 87% of marine bacteria such as Vibrio sp. The FISH technique to detect higher concentration of b-proteobacteria (10.2%), compared to number total cells (DAPI) which range from 7.0 x 106 to 2.3 x 107 cells/mL. Clones library were composed of the phylum Proteobacteria, Bacteroidetes, Cyanobacteria, Firmicutes, Fusobacteria, Verrucomicrobia e Chloroflexi.

Os bastonetes Gram positivos irregulares (BGPIs) compõem um grupo de espécies bacterianas com ampla diversidade fenotípica e que podem estar presente no meio ambiente, na microbiota humana e de animais. A identificação acurada de BGPIs em nível de gênero e espécie empregando métodos bioquímicos convencionais é bastante limitada, sendo recomendado, portanto, o uso de técnicas moleculares. No presente estudo, foram identificadas amostras de BGPIs oriundas de espécimes clínicos de humanos, de produtos farmacêuticos e de áreas limpas através da análise de sequencias do gene 16S rRNA e de outros genes conservados (housekeeping genes). Os resultados obtidos pelo sequenciamento dos genes 16S rRNA e rpoB demonstraram C. striatum multi-resistente (MDR) como responsável por surto epidêmico em ambiente hospitalar da cidade do Rio de Janeiro. Quinze cepas de C. striatum foram isoladas em cultura pura a partir de secreção traqueal de pacientes adultos submetidos a procedimentos de entubação endotraqueal. A análise por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) indicou a presença de quatro perfis moleculares, incluindo dois clones relacionados com cepas MDR (PFGE I e II). Os dados demonstram a predominância de PFGE I entre cepas MDR isoladas de unidades de terapia intensiva e enfermarias cirúrgicas. Uma potencial ligação causal entre a morte e a infecção por C. striatum MDR (PFGE tipos I e II) foi observada em cinco casos. Adicionalmente, acreditamos que este seja o primeiro estudo de identificação de espécies de Nocardia relacionadas com infecções humanas pela análise da sequencia multilocus (MLSA) no Brasil. Diferente dos dados observados na literatura (1970 a 2013) e obtidos pelos testes fenotípicos convencionais, a caracterização molecular de quatro lócus (gyrB-16S-secA1-hsp65) permitiu a identificação das espécies N. nova, N. cyriacigeorgica, N. asiatica e N. exalbida/gamkensis relacionadas com quadros de nocardiose em humanos. Cepas de N. nova isoladas de diferentes materiais clínicos de um único paciente apresentaram padrões de susceptibilidade antimicrobianos idênticos e dois perfis PFGE, indicando a possibilidade de quadros de co-infecção por N. nova em humanos. Em outra etapa da investigação, amostras de BGPIs obtidos de ambientes de salas limpas que não puderam ser identificadas por critérios convencionais foram submetidas a análise da sequência do gene 16S rRNA e caracterizadas 95,83% em nível de gênero e 35,42% em espécies. Para gêneros mais encontrados no estudo, foram analisados os genes rpoB e recA de dezessete cepas de Microbacterium e utilizado o MLSA para a identificação de sete cepas identificadas como Streptomyces. Os ensaios permitiram a identificação de três cepas de Microbacterium e de uma única amostra de Streptomyces ao nível de espécie. A análise da sequencia do gene rpoB também se mostrou eficaz na identificação de espécies de cepas de Corynebacterium. Finalmente, para as cepas ambientais pertencentes à classe Actinobacteria os dados morfológicos, bioquímicos e genotípicos permitiram documentar a cepa 3117BRRJ como representante de uma nova espécie do gênero Nocardioides, para o qual o nome Nocardioides brasiliensis sp. nov. e as cepas 3712BRRJ e 3371BRRJ como representante de um novo gênero e espécie para o qual o nome Guaraldella brasiliensis nov. foi proposto. / Irregular Gram positive rods (coryneform bacteria; IGPRs) comprise a group of species that has a wide phenotypic diversity and makes the conventional identification limited and that may be present in the environment, humans and animals hosts. In order to provide further accurate identification of these microorganisms in a genus and species terms it is recommended the use of molecular methods. In this study, we analyzed the 16S rRNA gene sequences and other conserved genes (housekeeping) in order to elucidate the identification of clinical isolates, pharmaceutical and clean room areas. We have documented a nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant (MDR) C. striatum in Rio de Janeiro. C. striatum identification was confirmed by 16S rRNA and rpoB gene sequencing. C. striatum was mostly isolated in pure culture from tracheal aspirates of adults undergoing endotracheal intubation procedures. The analysis by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) indicated the presence of four PFGE profiles, including two related clones of MDR strains (PFGE I and II). The data demonstrated the predominance of PFGE I, mostly isolated from patients of intensive care units and surgical wards. A potential causal link between death and MDR C. striatum (PFGE I and II) infection was observed in five cases. We also performed the identification of Nocardia species of human infections by multilocus sequence analysis (MLSA) and characterized their antimicrobial and phenotypic profiles. An overview from 1970 to 2013 of the case reports on Nocardia species related to human infections, except mycetomas, in Brazil, was also accomplished. Molecular characterization by four-locus (gyrB-16S-secA1-hsp65) has provided the species identification N. nova, N. cyriacigeorgica, N. asiatica and N. exalbida/gamkensis. N. nova strains isolated from different clinical specimens of one patient showed identical antimicrobial susceptibility patterns. PFGE analysis performed to determine the genetic relatedness of these N. nova strains two distinct profiles, which were designated A and B. This is the first report on identification of Nocardia species by MLSA in Brazil. The IGPRs obtained in clean room environments that could not be identified by conventional criteria were studied by 16S rRNA gene sequence analysis that allowed the identification of 95.83% at genus level and of 35.42% at the species level. The most common genus found in the clean room environments were Microbacterium and Streptomyces. The analysis of rpoB and recA genes sequence of seventeen Microbacterium strains contributed to the identification of three strains at species level. MLSA of seven Streptomyces strains identified a single sample at the species level. Moreover, the rpoB gene sequence analysis was effective in identifying Corynebacterium strains at species level. A new genus and species were found among clean room environmental strains belonging to the Actinobacteria class. Based on the morphological, genotypic and biochemical data presented in this study the 3117BRRJ strain represent a novel specie of the genus Nocardioides, for which the name Nocardioides brasiliensis sp. nov. was proposed and the 3712BRRJ and 3371BRRJ represent a new genus and species for which the name Guaraldella brasiliensis nov. were proposed.