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Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A utilização de biomarcadores cardioespecíficos vem sendo recomendado como ferramenta útil na monitoração e identificação precoce de lesão cardíaca, em decorrência do potencial de cardiotoxicidade da terapêutica oncologica. O objetivo do presente estudo foi avaliar o nível plasmático do peptídeo natriurético do tipo B (BNP) e da expressão gênica do BNP e outros genes relacionados a sua síntese, a interleucina-6 (IL-6), fator β1 de transformação de crescimento (TGF-β1) e procolágeno tipo I, mediante a associação dos agentes antineoplásicos docetaxel e ciclofosfamida (TC) e da radiação ionizante (IR) no coração de ratas Wistar, 2 meses após o término do tratamento. Para isso, Ratas Wistar (3-4 meses, n=7) foram irradiadas no coração com dose única de 20Gy, em um campo ântero-posterior de 2x2cm2, em acelerador linear com feixe de energia nominal de 6 MeV; outras (n=7) foram tratadas (4 ciclos, com 7 dias de intervalo) com docetaxel (12,5 mg/Kg) e ciclofosfamida (50 mg/Kg) e irradiadas após 7 dias do tratamento quimioterápico. Como controle (n=7), animais não irradiados e não tratados com quimioterápicos. Após 2 meses do fim do tratamento, a eutanásia dos animais foi realizada. Amostras de plasma e tecido cardíaco, ventrículo esquerdo (VE), foram coletadas. Por ensaio ELISA foi quantificada a concentração plasmática de BNP; parte do tecido cardíaco foi fixado, incluído em parafina e cortado em micrótomo, para assinalar a presença de BNP no VE, avaliação qualitativa, pela técnica de imunohistoquímica (IHQ); e a outra parte para a técnica RT-qPCR, onde foram avaliados a expressão relativa de mRNA dos genes do BNP, IL-6, TGF-β1 e procolágeno tipo I. Na IHQ o grupo controle apresentou uma marcação pontual, enquanto que os grupos tratados apresentaram uma marcação mais difusa, sendo que o grupo TC+IR foi o que apresentou maior dispersão na marcação do BNP no tecido cardíaco. Embora não tenha sido observado no ensaio ELISA uma diferença significativa entre as concentrações plasmáticas de BNP dos grupos tratados em relação ao controle, nota-se uma tendência de aumento no grupo TC+IR. Na analise por RT-qPCR, a expressão relativa de BNP foi similar ao apresentado no ELISA. O grupo TC+IR foi o grupo que apresentou maior expressão gênica de BNP, porém a diferença não é significativa em relação ao controle. A única análise em que se obteve diferença na expressão gênica em relação ao controle foi a do gene IL-6 que apresentou expressão reduzida. Todos os demais genes analisados por RT-qPCR apresentaram uma expressão similar ao controle. Assim, os resultados obtidos sugerem que o BNP não se apresentou como um bom biomarcador cardioespecífico para identificação precoce de lesão cardíaca, no período a qual foi avaliado. As ratas Wistar, 2 meses após a submissão do tratamento, não apresentaram um resultado diferenciado em relação ao controle, nos genes TGF-β1 e procolágeno tipo I, sugerindo ausência de um quadro de remodelamento cardíaco. Entretanto, apresentou redução significativa do gene IL-6, no grupo TC+IR, propondo ação anti-inflamatória do BNP, que no mesmo grupo, apresentou uma tendência de aumento em sua expressão gênica. / The use of specific cardiac biomarkers has been recommended as a useful tool in the early identification and monitoring of cardiac injury, due to the potential cardiotoxicity of oncological therapy. The aim of this study is to investigate, analyze and evaluate the reaction of B-type natriuretic peptide (BNP), interleukin-6 (IL-6), transforming growth factor β1 (TGF-β1) and procollagen type I in its expression and release by the association of antineoplastic agents Docetaxel and Cyclophosphamide (TC) and ionizing radiation (IR) in the heart of Wistar rats, 2 months after the end of treatment. For this, Wistar rats (3-4 months, n = 7) were irradiated in the heart with a single dose of 20 Gy, in a anteroposterior field of 2x2cm2 in linear accelerator with nominal energy beam of 6 MeV, other (n = 7) were treated (four cycles with a 7-day interval) with docetaxel (12.5 mg / kg) and Cyclophosphamide (50 mg / kg) and irradiated after 7 days of chemotherapy. As a control (n = 7), non-irradiated animals not treated with chemotherapy. 2 months after the end of treatment, euthanasia was performed. Samples of plasma and heart tissue, left ventricular (LV) were collected. The plasma concentration of BNP was quantified by ELISA, part of the heart tissue was fixed, embedded in paraffin and cut in microtome, to signal the presence of BNP in the LV, qualitative evaluation by immunohistochemistry (IHC), and the other party to technique RT-qPCR were evaluated in the relative expression of mRNA of the genes of BNP, ANP, IL-6, TGF-β1 and procollagen type I. In the control group IHC showed a marking point, while the treated groups showed a more diffuse labeling, and the CT + RT group showed the greatest dispersion. Although it was not observed in the ELISA assay a significant difference between plasma concentrations of BNP treated groups compared to control, there is an increasing trend in the CT + RT group. In the analysis by RT-qPCR, the relative expression of BNP was similar to that shown in the ELISA. The CT + RT group was the group that showed higher gene expression of BNP, but the difference is not significant compared to control. The only analysis that which obtained difference in gene expression compared to control was the IL-6 gene that showed low expression. All other genes analyzed by RT-qPCR showed an expression similar to control. Therefore, the outcome is that BNP did not appear as a good specific cardiac biomarker for early identification of cardiac disease, within 2 months after treatment in Wistar rats, by effect of the action of cardiotoxic selected treatment protocols, since none of their quantitative assessments showed a differentiated result compared to control, however, there was no evidence that, in the meantime, there would be a scenario in development, or advanced of cardiac remodeling.

La qPCR est actuellement la technique de référence en matière de quantification d'ADN. Elle peut être définie comme une amplification exponentielle, cyclique et ciblée de la séquence d'ADN cible. Le caractère exponentiel de la qPCR est à la fois à l'origine de la sensibilité de la méthode mais aussi d'une potentielle variabilité inter-échantillons. Cette variabilité est compensée par le caractère cyclique de la méthode qui entraine une synchronisation de la réaction pour tous les échantillons à chaque cycle. L'amplification ciblée de la séquence choisie traduit quand à elle la spécificité de la méthode. Néanmoins, cette dernière propriété de la PCR reste la moins vérifiée. La spécificité de la qPCR est indiscutable lorsque la cible à détecter se trouve en quantité suffisante (>100 copies environ). En revanche, pour des quantités plus faibles ou en présence d'inhibiteurs, la spécificité diminue ou disparaît (limites de détection et de quantification). Cette perte de spécificité retentit de façon significative sur la précision et la reproductibilité du dosage à réaliser. Cependant, si l'hybridation non spécifique est inéluctable dans ces conditions, l'amplification non spécifique consécutive peut être limitée, voire supprimée au moyen d'amorces de PCR soit plus spécifiques, soit moins susceptibles de générer des différences inter-échantillons. La RT-qPCR, grâce à une étape initiale de transcription inverse (conversion d'un ARN en un ADN complémentaire) permet la quantification des ARN. Cependant, la transcription inverse reste moins reproductible que la PCR, générant des différences inter-échantillons délétères en diagnostic comme en recherche. Au cours de ces travaux, je propose des méthodes originales améliorant de façon significative différentes étapes de ces techniques. Premièrement, je propose une amélioration de la standardisation de l'étape de transcription inverse capable de diminuer de façon significative la variabilité inter-échantillons ; l'utilisation d'un volume constant d'extrait d'ARN pour chaque échantillon améliore considérablement la précision de la quantification d'ARN messagers. Deuxièmement, je propose une modification des amorces par incorporation de résidus d'acides nucléiques bloqués (LNA) ; cette modification permet d'augmenter la spécificité des amorces aux limites de la détection. Enfin, je propose une méthode simple et économique permettant la mesure directe de la température de fusion (Tm) dans les conditions réelles de la PCR. Ce paramètre, considéré comme capital pour la réalisation des dosages par qPCR, est généralement obtenu par des méthodes prédictives peu précises. De plus, cette méthode doit permettre de déterminer précisément les paramètres thermodynamiques des amorces (∆G, ∆H et ∆S) et ainsi avoir accès d'une part au pourcentage réel d'amorces hybridées en fonction de la température et d'autre part d'identifier la susceptibilité des amorces aux inhibiteurs. / QPCR is currently the gold standard for DNA quantification of DNA. It can be defined as an exponential, cyclic and targeted amplification of a known DNA sequence. The exponential character of qPCR is both the cause of the sensitivity of the method but also a potential variability between samples. This variability is offset by the cyclical nature of the method that causes a synchronization of the reaction for all samples in each cycle. The targeted amplification of the selected sequence translates the specificity of the method. Nevertheless, this last property of PCR remains the least tested. The specificity of qPCR is unquestionable when the target to detect is sufficient (> 100 copies). However, for smaller quantities or in the presence of inhibitors, the specificity decreases or disappears (limits of detection and quantification). This loss of specificity will have a significant effect upon the accuracy and reproducibility of the assay to be performed. However, if non-specific hybridizations are unavoidable in these conditions, consecutive nonspecific amplification may be limited or eliminated using more specific PCR primers or less likely to produce inter-sample differences. RT-qPCR allows RNA quantification because of an initial step of reverse transcription (conversion of an RNA into a complementary DNA). However, reverse transcription is less reproducible than PCR, generating harmful inter-sample differences both in diagnosis and in the research field. In this work, I propose innovative methods improving significantly different steps of these techniques. First, I propose an improved standardization of the reverse transcription step that can significantly reduce the variability between samples; using a constant volume of RNA extract for each sample substantially improves mRNA quantification accuracy. Second, I propose a primers modification by incorporating Locked Nucleic Acid residues (LNA); this modification increases the specificity of the primers to the limits of detection. Finally, I propose a simple and economical method for direct measurement of the melting temperature (Tm) in real PCR conditions. This essential parameter in the achievement of qPCR assays is generally obtained by predictive methods with low accuracy. Furthermore, this method should determine the thermodynamic parameters of the oligonucleotide sequence (∆G, ∆H and ∆S), on the one hand allowing access to the actual percentage of annealed primers according to the temperature and on the other hand, to identify the primers susceptibility in the presence of inhibitors.

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The ADAM10 gene expression in whole blood was studied in 47 AD, 32 healthy controls and 21 mild cognitive impairment (MCI) subjects by RT-qPCR techniques and analyzed by relative expression by 2- Ct. For miRNAs analyses, using MegaplexTM and MirWalk 2.0 database, were analyzed by RT-qPCR ~700 miRNAs in total blood and 21 miRNAs of them were validated in a sample of 21 AD subjects and 17 healthy controls. Statistical association tests, regression and diagnostic accuracy were performed. No significant differences in ADAM10 gene expression were observed between AD and control groups. Therefore, the decrease of ADAM10 protein in platelets of AD patients was not caused by a reduction in mRNA encoding for ADAM10. Mir-144-5p, miR-374 and miR-221 were downregulated in AD subjects, with moderate accuracy diagnosis. However, the association of selected miRNAs expression and Mini Mental State Examination (MMSE) was significantly better as a diagnostic tool compared to their expression separately. The validated miRNAs are involved in the regulation of pathways related to neurodegenerative diseases (beta-amyloid cascade, ubiquitination, transcriptional regulator, synaptic transmission, vesicle trafficking). Specifically, miR-144-5p, miR-374 and miR-221 are relevant for AD, as regulators of APP, BACE1 and ADAM10 translation. To the best of our knowledge, this is the first study to demonstrate a downregulation of these specific miRNAs in total blood of Alzheimer’s disease patients, compared to healthy cognitive controls. These findings are in agreement with AD protein outcomes and place the miRNAs evaluated as potential biomarkers that can be used to improve AD diagnosis. / ADAM10 é uma -secretase que cliva a APP através do caminho não amiloidogênico, inibindo desta forma a produção do peptídeo -amiloide (A ) na doença de Alzheimer (DA). Estudos apresentam a diminuição plaquetária da proteína ADAM10 em idosos com DA, assim como a desregulação de microRNAs (miRNAs) relacionados com moléculas envolvidas com a fisiopatologia desta doença. O objetivo geral foi verificar e comparar a expressão gênica da ADAM10 e de miRNAs entre idosos com DA e controles sem alterações cognitivas. Trata-se de um estudo de comparação, baseado nos pressupostos da pesquisa quantitativa. Amostras biológicas foram coletadas, analisadas e armazenadas em um biorrepositório. A expressão gênica da ADAM10 em sangue total foi estudada em 47 sujeitos com DA, 32 controles saudáveis e 21 sujeitos com transtorno neurocognitivo leve (TNCL), através de técnicas de RT-qPCR e analisada pela expressão relativa por 2- Ct. Para análises dos miRNAs, utilizando Megaplex e a base de dados MiRWalk 2.0, foram analisados por RTqPCR ~700 miRNAs no sangue total e 21 deles foram validados em uma amostra de 21 sujeitos com DA e 17 controles. Testes estatísticos de associação, regressão e acurácia diagnóstica foram realizados. Não foi observada diferença significante na expressão gênica da ADAM10 entre sujeitos com DA e controles. Assim, a diminuição dos níveis proteicos da ADAM10 plaquetária em pacientes com DA não foi devido a redução do mRNA codificante para ADAM10. Mir-144-5p, miR-374 e miR-221 estavam menos expressos em indivíduos com DA, com moderada acurácia diagnóstica. Entretanto, a associação da expressão dos miRNAs selecionados com o Mini Exame do Estado Mental (MEEM) foi significativamente melhor como uma ferramenta de diagnóstico em comparação com as análises individuais. Os miRNAs validados estão envolvidos na regulação de vias relacionadas a doenças neurodegenerativas (cascata beta-amiloide, ubiquitinação, reguladores de transcrição, transmissão sináptica, tráfego de vesículas). Especificamente, o miR-144-5p, miR-374 e miR- 221 são relevantes para a DA, como reguladores da tradução da APP, BACE1 e da ADAM10. Segundo nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a demonstrar a expressão reduzida desses miRNAs no sangue total de pacientes com DA, em comparação com controles cognitivamente saudáveis. Estes resultados estão de acordo com os resultados proteicos da DA e destacam os miRNAs avaliados como potenciais biomarcadores que podem ser utilizados para o aperfeiçoamento do diagnóstico da DA.

As metalotioneínas (MTs) constituem uma superfamília de proteínas de baixo peso molecular (5-10 kDa), ricas em cisteinas. As MTs de plantas são classificadas em quatro tipos de acordo com o arranjo de cisteinas na cadeia polipeptídica. A função das metalotioneínas em plantas é ainda desconhecida, mas as evidências sugerem que teriam um papel na regulação da homeostasia de metais essenciais, detoxificação de metais pesados e proteção contra espécies reativas de oxigênio. Neste trabalho foram identificados e caracterizados seis genes de metalotioneína a partir das seqüências codificantes para MTs depositadas em banco de dados de cana-de-açúcar, mediante análise filogenética e comparações por alinhamento com os membros da família gênica de metalotioneínas de arroz (Oryza sativa) e Arabidospsis. Os seis genes MTs de cana de açúcar foram classificados como sendo dois do tipo 1 (SoMT1a e SoMT1b); dois do tipo 2 (SoMT2a e SoMT2b); um do tipo 3 (SoMT3); e um tipo 4 SoMT4 (Ec). A região promotora presumível de quatro genes (SoMT1a, SoMT1b, SoMT2b e SoMT3) foi caracterizada e os motivos cis-regulatórios identificados. A distribuição de éxons e íntrons foi estabelecida, e dois éxons separados por único íntron foram identificados na estrutura dos genes SoMT1a e SoMT2b. Um segundo íntron parece estar presente na estrutura dos genes SoMT2a e SoMT3, mas os resultados não foram conclusivos. O gene SoMT1b não foi caracterizado para composição éxons/íntrons. Foi avaliada a expressão constitutiva de SoMT1a, SoMT1b, SoMT2a, SoMT2b e SoMT3 em diferentes tecidos/órgão (colmo, inflorescência, limbo foliar, meristema e raiz). SoMT1a e SoMT1b foram mais abundantemente expressos em todos os tecidos, seguidos de SoMT2b e SoMT3. SoMT2a apresentou a menor expressão. A expressão dos cinco genes SoMTs foi também avaliada em parte aérea e raízes de plântulas de cana-de-açúcar em resposta a 100 e 500 µM de cobre, crescidas in vitro. Não houve modulação da expressão dos genes SoMTs nos tecidos examinados para as doses de cobre utilizadas, as 6, 24, 48 e 96 h após imposição dos tratamentos. A resposta dos genes SoMTs também foi avaliada para o tratamento com 200g L-1 ha-1 de paraquat, aos 15 min, 6 e 24 h após aplicação do herbicida em folhas de plantas deSP80-3280. Houve uma tendência a repressão da expressão dos genes SoMTs, significativa as 6 e 24 h somente para SoMT1a. A expressão de SoMT1b, SoMT2a e SoMT3 foi significativamente reprimida as 24 h após a imposição do tratamento, enquanto que não houve efeito significativo sobre a expressão de SoMT2b. Em relação a expressão dos cinco genes SoMTs em resposta a inoculação com patógenos, plântulas de \'SP70-1143\' e \'RB72-454\', consideradas suscetíveis e resistentes, respectivamente ao fungo da ferrugem, foram inoculadas e não inoculadas com Puccinia melanocephala, enquanto que plântulas de \'SP78-4467\' e \'SP82-1176\', consideradas suscetíveis e resistentes, respectivamente a bactéria da escaldadura, foram inoculadas ou não com Xanthomonas albilineans. As coletas de parte aérea das plântulas foram realizadas aos 15 min, 4, 8, 24, 48, 96 e 240 h após inoculação. Foi observado aproximadamente 4 vezes mais transcritos de SoMT1a em plantas de \'SP70-1143\', suscetível a Puccinia melanocephala, em relação a cultivar resistente \'RB72-454\'. Entretanto, houve uma tendência a repressão de SoMT1a nas plantas suscetíveis inoculadas com o fungo, significativamente as 8 e 24 h após tratamento, não havendo diferenças para as plantas da cultivar resistente após inoculação. A expressão constitutiva dos genes SoMT1b, SoMT2a, SoMT2b e SoMT3 foi similar entre ambas as cultivares e manteve-se inalterada após inoculação com o fungo. Não houve diferenças significativa entre as cultivares suscetíveis e resistentes em relação a expressão basal dos genes SoMTs, nem foi observado efeito significativo sobre a expressão dos genes SoMTs após inoculação das plântulas com X. albilineans. Por fim, transcritos dos cinco genes SoMTs foram clonados em vetor de expressão para expressão heteróloga em Escherichia coli e proteína presumível pode ser observada em géis de poliacrilamida SDS-PAGE. Entretanto, não foi caracterizada uma modulação importante dos cinco genes SoMT em resposta a condições de estresse bióticos (patógenos) e abióticos (Paraquat e metais), que permitisse a associação direta desses genes com a resposta a estresse oxidativo / Metallothioneins (MTs) are part of a low molecular weight (5-10 kDa) cysteine-rich protein super-family. Plant MTs are classified into four types according to cysteine location in the protein sequence. MTs function is largely unknown, but evidences suggested their role in metal homeostasis, heavy metal detoxification, and protection against reactive oxygen species. This work identified and characterized six sugarcane MT genes from expressed sequences available in databases, by alignment and phylogenetic analyses using members from the MT gene family from rice (Oryza sativa) and Arabidopsis. The six sugarcane MT genes were classified as two of type 1 (SoMT1a and SoMT1b); two of type 2 (SoMT2a and SoMT2b); one of type 3 (SoMT3); and one SoMT4 (Ec). The gene putative promoter region of four genes (SoMT1a, SoMT1b, SoMT2b and SoMT3) were characterized, with the cis-regulatory motifs identified. Exon and intron location were established, with two exons and one intron identified for SoMT1a and SoMT2b, A second intron appeared to be present on SoMT2a and SoMT3, but results were inconclusive. SoMT1b could not be characterized for exons and introns. Gene expression analyses was conducted for SoMT1a, SoMT1b, SoMT2a, SoMT2b and SoMT3 in various tissues/organs (stem; inflorescence; leaf; meristem; and root). SoMT1a and SoMT1b were the most expressed genes in all tissues, followed by SoMT2b and SoMT3; SoMT2a was the least expressed. Expression of the five SoMTs genes were evaluated in shoots and roots from in vitro plant grown on 100 or 500 µM copper. There was no modulation of expression in the evaluated tissues at 6, 24, 48 and 96 h after treatment. Gene expression was also evaluated at 15 min, 6 and 24 h after tretament with 200g L-1 ha-1 Paraquat. There was a trend to repress expression of the SoMT genes, being significan only for SoMT1a at 6 and 24 h. Expression of SoMT1b, SoMT2a and SoMT3 were significantly repressed at 24 h after treatment, while there was no significant effect on SoMT2b expression. In relation to the expression of the five SoMTs in response to biotic stress, plants from cultivars \'SP70-1143\' and \'RB72-454\', considered susceptible or resistant respectively, to the rust fungus, were inculated or not with Puccinia melanocephala, whereas plants of \'SP78-4467\' e \'SP82-1176\', considered susceptible or resistant respectively, to the sugarcane leaf scald, were inoculated or not with Xanthomonas albilineans. Shoots were sampled at 15 min, 4, 8, 24, 48, 96 and 240 h after inoculation. Plants of the susceptible \'SP70-1143\' contained 4 times SoMT1a transcripts than the resistant \'RB72-454\'. However, there was a trend to decrease SoMT1a transcripts in susceptible plants, significantly 8 and 24 h after P. melanocephala inoculation, while no difference was observed for expression in resistant plants. The constitutive expression of the other genes (SoMT1b, SoMT2a, SoMT2b and SoMT3) were similar between cultivars, and remained unchanged after inoculation. There was no significant differences for constitutive SoMTs expression between the X. albilineans susceptible and resistant cultivars, nor an inoculation effect of gene expression. Transcripts from the five SoMTs genes were cloned into vetor for heterologous expression in Escherichia coli , and putative proteins were seen in polyacrylamide gels. Therefore, the modulation of the five SoMT genes in response to various abiotic (Paraquat or metals) or biotic (pathogen) stress condition was not characterized to allow definite conclusions about the direct role of metallothioneins in response to oxidative stress

Estresses abióticos como seca, alta salinidade e baixas temperaturas, afetam o crescimento e a produtividade em culturas de interesse comercial como o feijoeiro comum. Proteínas DREB (Dehydration Responsive Element Binding) são fatores de transcrição que regulam genes específicos envolvidos na tolerância ao estresse abiótico. Para determinar como as plantas toleram condições ambientais adversas, variedades tolerantes, biologia molecular e bioinformática podem ser aplicadas para identificar e caracterizar genes que controlam mecanismos de adaptação a estresses. Baseado nas informações disponíveis nos bancos de dados públicos, a sequência da Orf completa do gene Phvul.009G029600.1| PACid:27146455 contendo 1062 pb foi encontrada e usada para o desenho dos primers e para o sequenciamento. A nova sequência é muito similar ao AtRAP2.4 e foi nomeada como PvDREB6A, segundo a análise filogenética. Ferramentas de predição mostraram que a sequência apresenta 354 aminoácidos e possui uma cópia do domínio AP2, que se dobra em uma estrutura com três ?-folhas e uma ?-hélice apresentando resíduos importantes e motivos específicos de reconhecimento e de ligação ao DNA. Além disso, um peptídeo trânsito foi detectado na porção N-terminal com um sítio de clivagem no resíduo 52. A interação deste fator de transcrição com seu domínio de ligação ao DNA foi validada por Electro Mobility Shift Assay (EMSA). A localização subcelular da proteína foi realizada e expressão da Green Fluorescent Proteín (GFP) foi detectada no núcleo. A transformação genética para a superexpressão do gene PvDREB6A em plantas de Arabidopsis thaliana Columbia-0 e mutantes nocaute para o gene AtRAP2.4 (Salk_020767C) foi realizada. Quatro eventos com cópia única e melhor expressão do gene PvDREB6A denominados Col-0/pFEC2.1 #1, Salk_020767C/pFEC2.1 #13.1, Salk_020767C/ pFEC2.1 #19.7 e Salk_020767C/ pFEC2.1 #23.7, foram selecionados. O evento Salk_020767C/pFEC2.1 #23.7 mostrou melhor expressão do gene PvDREB6A e foi visualizado sob luz UV. A análise funcional revelou que as plantas transgênicas submetidas ao déficit hídrico, à alta salinidade e ao frio, apresentaram maior taxa de sobrevivência. Plantas transgênicas superexpressando o gene PvDREB6A apresentaram menor taxa de desidratação e de vazamento de eletrólitos quando submetidas a estresses abióticos. Uma análise da expressão de genes relacionados à tolerância foi conduzida. A quantificação revelou que a expressão de 18 genes: AtDC1.2, AtUSP, AtKIN1, AtERF69, AtGolS3, AtMT2A, AtCAP160, AtNTR1.7, AtGPR7, AtPDC2, AtLTI78, AtCOR15a, AtCOR15b, AtCOR47, AtCOR413, AtLEA6, AtLEA9 e AtLEA14, relacionados a tolerância a seca, sal e frio foram up-regulated devido à superexpressão do gene PvDREB6A de feijoeiro nas plantas transgênicas / Abiotic stresses like drought, high salinity and low temperatures affect growth and productivity in crops of economic interest such as common bean. DREB (Dehydration Responsive Element Binding) proteins are transcription factors that activate specific genes involved in tolerance to abiotic stress. To generate new information on the research for drought and other abiotic stresses, tolerant varieties, molecular biology and bioinformatics can be applied to identify and characterize genes that control plant defense and adaptation mechanisms to water deprivation, to excessive salt and to high/low temperature. Based on public databases, a common bean DREB sequence was found and an in silico study was carried out. A complete Orf sequence Phvul.009G029600.1 |PACid:27146455 containing 1062 bp was found and used for primer design and sequencing. The new sequence was very similar to AtRAP2.4 and named as PvDREB6A, according to phylogenetic analysis. Prediction tools showed that the deduced 354 aa sequence has one copy of the AP2 domain, folding in a three ?-sheets and one ?-helix structure, and presenting important residues and motifs for DNA contacting and binding specificity. In addition, a chloroplast transit peptide was detected at the N-terminal region with cleavage site in the 52 residue. Binding activity of this transcription factor was validated by Electro Mobility Shift Assay (EMSA). Subcellular localization was verified by transient expression of PvDREB6A::GFP in Nicotiana benthamiana and the expression of GFP was detected at the nucleus. Genetic transformation for overexpression of PvDREB6A gene in Arabidopsis thaliana wild type and knockout mutant for AtRAP2.4 gene was conducted. Four single copy events with better expression of the PvDREB6A named Col-0/pFEC2.1 #1, Salk_020767C/pFEC2.1 #13.1, Salk_020767C/pFEC2.1 #19.7 and Salk_020767C/pFEC2.1 #23.7 were selected. The event Salk_020767C/pFEC2.1 #23.7 showed the best expression of PvDREB6A and was visualized under UV light. Functional analysis, revealed that transgenic plants under water deficit, high salt, and cold showed higher survival rate. Transgenic plants overexpressing the PvDREB6A exhibited lower water loss rate and electrolyte leakage rate under abiotic stress. A gene expression analysis with tolerant-related genes was conduted. The quantification revealed that 18 genes, AtDC1.2, AtUSP, AtKIN1, AtERF69, AtGolS3, AtMT2A, AtCAP160, AtNTR1.7, AtGPR7, AtPDC2, AtLTI78, AtCOR15a, AtCOR15b, AtCOR47, AtCOR413, AtLEA6, AtLEA9 e AtLEA14, related to drought, salt and cold tolerance, were up-regulated due to the overexpression of PvDREB6A from common bean in the transgenic plants

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O pinhÃo manso (Jatropha curcas L) à uma planta oleaginosa com grande potencial para a produÃÃo de biocombustÃvel devido à riqueza de lipÃdios existente em suas sementes. Portanto, à uma fonte potencial de Ãleo renovÃvel que tem recebido considerÃvel atenÃÃo da comunidade cientÃfica. O objetivo deste estudo foi fazer uma anÃlise da expressÃo gÃnica de proteinases cisteÃnicas relacionadas à morte celular programada (MCP) em sementes em desenvolvimento e durante a germinaÃÃo de pinhÃo manso, no intuito de conhecer melhor o transcriptoma dos principais genes envolvidos no processo de MCP e durante a deposiÃÃo de proteÃnas de reservas durante a maturaÃÃo das sementes de pinhÃo manso. Para quantificar com acurÃcia os nÃveis de expressÃo gÃnica por RT-qPCR foi necessÃrio realizar uma seleÃÃo de genes de referÃncia (genes constitutivos). Os genes constitutivos escolhidos para esse estudo foram: GliceraldeÃdo-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), Poliubiquitina (PUB), alfa-tubulina (TA2), proteÃna fosfatase 2-A (PP2A2), fator de alongaÃÃo-alfa (EF1-α) e actina, todos eles citados e escolhidos na literatura para estudo de normalizaÃÃo de genes em plantas. AtravÃs do programa geNorm de foi possÃvel mostrar os genes de referÃncia mais estÃveis dentre os seis genes de referÃncia. Nossos resultados apontaram que os genes de referÃncia mais estÃveis ​​para as amostras de endosperma e integumento em desenvolvimento foram: GAPDH, PP2A2 e EF1-α e TA2. Os genes de menor estabilidade foram: a actina11; poliubiquitina (PUB). Na germinaÃÃo, os genes mais estÃveis foram GAPDH, PUB e TA2. Entretanto, os genes com menores valores de estabilidade foram a actina, EF1-α e PP2A2. Em nossos estudos, o programa geNorm tambÃm mostrou o nÃmero de genes de referÃncia necessÃrios para a normalizaÃÃo dos dados obtidos por RT-qPCR. Na anÃlise desse estudo, nos mostramos que para as sementes em desenvolvimento, a adoÃÃo de quatro genes mais estÃveis foram GAPDH, PP2A2 e EF1-α e TA2 necessÃrios para normalizaÃÃo dos dados de RT-qPCR. Nos dados de sementes em germinaÃÃo, mostrou-se a adoÃÃo de trÃs genes mais estÃveis ​​(GAPDH, PUB e TA2). Contudo, Para validar nossos resultados com genes de referÃncia, foi usado o perfil padrÃo da expressÃo do gene que expressa a oleosina, na qual mostrou que o padrÃo de expressÃo da oleosina està de acordo com os fornecidos pela literatura, revelando que os genes de referÃncia sÃo eficientes para normalizar os dados obtidos pela RT-qPCR. De posse desses resultados, realizou-se um estudo de expressÃo de genes supostamente envolvidos na morte celular programada e na maturaÃÃo de sementes de pinhÃo manso. Nossos resultados mostraram que os genes com seqÃÃncia C-terminal KDEL: JcCB0580861; JcCA0152821; JcCA0047111 e o gene γ-VPE JCCB0060111 mostraram um altos nÃveis de expressÃo nos estÃgios mais avanÃados em tecidos do integumento e endosperma em sementes de pinhÃo manso em desenvolvimento, e com base em nossas anÃlises, esses genes expressam proteinases cisteÃnicas que estÃo possivelmente envolvidos no processo de MCP. NÃo obstante, os genes que expressam as seguintes VPEs: JcCB0196871; JcCB0244081; e JcCA0012422 de acordo com nossos estudos, provavelmente estÃo envolvidas na maturaÃÃo das proteÃnas de reservas de sementes em desenvolvimento de pinhÃo manso. Esses dados forneceram importantes informaÃÃes a cerca do padrÃo de expressÃo de genes que estÃo envolvidos no transcriptoma de sementes em desenvolvimento, mais precisamente envolvidos no processo de MCP. NÃo obstante, o estudo de normalizaÃÃo e validaÃÃo de genes de referÃncia nos tecidos de integumento e endosperma do pinhÃo manso propiciaram um melhor entendimento no que diz respeito à estabilidade desses genes nas condiÃÃes estudadas. / Jatropha (Jatropha curcas L) is an oilseed plant with great potential for biofuel production because of the wealth of existing lipids in their seeds. Therefore, it is a potential source of renewable oil that has received considerable attention from the scientific community. The objective of this study was to analyze the gene expression of cysteine ​​proteinases related to programmed cell death (PCD) in developing seeds and during germination of Jatropha in order to better understand the transcriptome of the major genes involved in the MCP and during the deposition of protein reserves during maturation of seeds of Jatropha. To accurately quantify the levels of gene expression by RT-qPCR was necessary to make a selection of reference genes (genes constituting). The constituent genes chosen for this study were: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), polyubiquitin (PUB), alpha-tubulin (TA2), protein phosphatase 2 A (PP2A2), elongation factor-alpha (EF1-α) and actin, all cited in the literature and were chosen for study standardization of genes into plants. Through the program of geNorm was possible to show the more stable reference genes among the six genes of reference. Our results indicate that the most stable reference genes for samples of the developing endosperm and integument were: GAPDH, PP2A2 and EF1-α and TA2. The genes were less stable: the actina11; polyubiquitin (PUB). In germination, the most stable genes were GAPDH, PUB and TA2. However, genes with lower stability values ​​were actin, EF1-α and PP2A2. In our studies, the geNorm program also showed the number of reference genes needed for normalization of data obtained by RT-qPCR. In the analysis of this study, we show that for the developing seeds, the use of four most stable genes were GAPDH, PP2A2 and EF1-α and TA2 needed for normalization of RT-qPCR data. In the data of germinating seeds, was the adoption of more stable three genes (GAPDH, PUB and TA2). However, To validate our findings with reference genes, we used the standard profile of gene expression which expresses oleosina, which showed that the expression pattern of oleosina is provided according to the literature, genes reveals that the reference are efficient to normalize the data obtained by RT-qPCR. With these results, we carried out a study of expression of genes supposedly involved in programmed cell death and maturation of seeds of Jatropha. Our results showed that genes with sequence C-terminal KDEL: JcCB0580861; JcCA0152821; JcCA0047111 and γ-VPE gene JCCB0060111 showed high levels of expression in later stages in tissues of the integument and endosperm of seeds of Jatropha in developing and Based on our analysis, these genes express cysteine ​​proteinases that are possibly involved in the MCP. Nevertheless, genes that express the following VPEs: JcCB0196871; JcCB0244081, and JcCA0012422 according to our studies, are probably involved in the maturation of protein reserves in developing seeds of Jatropha. These data provided important information about the expression pattern of genes that are involved in the transcriptome of developing seed, more specifically involved in the process of MCP. However, the study of standardization and validation of reference genes in tissues of the integument and endosperm Jatropha provided a better understanding as regards the stability of these genes in the studied conditions

A leprose dos citros, principal doença viral que afeta a citricultura no Brasil, é causada pelo Citrus leprosis virus C (CiLV-C, gênero Cilevirus). CiLV-C possui um genoma bipartido de RNA de fita simples, polaridade positiva, que codifica para seis proteínas. O vírus é transmitido de planta a planta por ácaros Brevipalpus phoenicis e pode infectar mais de 40 espécies vegetais, produzindo lesões localizadas cloróticas ou necróticas ao redor do sítio de inoculação pelo ácaro. Invariavelmente, o patógeno não realiza movimento sistêmico em nenhuma de suas hospedeiras conhecidas. Para se revelar os mecanismos moleculares que determinam a atípica interação vírus/ácaro/planta, as atividades das principais vias de defesa foram avaliadas durante a infestação de A. thaliana com ácaros avirulíferos e virulíferos para o CiLV-C. A expressão de 19 genes marcadores associados às respostas de defesa do hospedeiro foi verificada mediante PCR quantitativo (RT-qPCR) em um experimento de time course (6, 12 e 24 horas após a infestação, e no momento do aparecimento dos sintomas de leprose). As análises demostraram que os genes envolvidos na via do ácido salicílico (SA) foram induzidos durante a interação com o ácaro e com o vírus. O perfil de expressão dos genes desta via durante a infestação com ácaros virulíferos foi similar ao observado com ácaros avirulíferos, porém a resposta da planta a ambos os estímulos foi mais intensa. Ademais, ambas as vias do ácido jasmônico e etileno foram ativadas durante a interação com o ácaro e reprimidas ao longo da infecção com o vírus, sugerindo uma interferência antagonística mediada pela via do SA. O mecanismo de silenciamento de RNA foi regulado de maneira diferencial em resposta à interação com ácaros avirulíferos e virulíferos. Diante da infecção viral, em tempos iniciais da infecção, as plantas responderam com a ativação de uma primeira linha de defesa mediada por AGO1, e depois alternaram para uma segunda linha de defesa mediada por AGO2. Os resultados indicam a ativação de um processo multifatorial em resposta ao CiLV-C e ao ácaro B. phoenicis em A. thaliana. / Citrus leprosis, the main viral disease affecting citrus orchards in Brazil, is caused by Citrus leprosis virus C (CiLV-C, genus Cilevirus). CiLV-C has a bipartite genome of singled stranded positive RNA, which encodes six proteins. CiLV-C is plant-to-plant transmitted by Brevipalpus phoenicis mites and can infect more than 40 plant species, invariably producing localized chlorotic or necrotic lesions around the site of feeding of the viruliferous mites. Viral long distance movement in its hosts is not accomplished. To unveil the mechanisms determining the unique characteristic of the virus/mite/plant interaction, activities of main plant defense pathways were evaluated during aviruliferous and CiLV-C viruliferous mite infestation in Arabidopsis thaliana. The expression of 19 marker genes involved in defense responses along a time course experiment (6, 12 and 24 hours after infestation, and after appearance of leprosis symptoms) was assessed by RT-qPCR. Analyses showed that genes involved in the salicylic acid (SA) pathway were up-regulated during plant interaction with mite and virus. The SA pathway expression profile observed at the infestation by viruliferous mites resembled those observed for the aviruliferous mites, but plant response to both stimuli was stronger. Both the jasmonic acid and ethylene pathways were activated during mite/plant interaction and were repressed at the course of infection with CiLV-C, suggesting an antagonistic effect mediated by the activated SA pathway. Gene silencing mechanism was differentially regulated in response to both aviruliferous and viruliferous mites. Upon viral infection, plants responded with the activation of an AGO1-mediated first defense line, in early times of infection; and then switched to an AGO2-mediated defense. Results indicate the activation of a multifactorial process in response to CiLV-C and B. phoenicis mites in A. thaliana.

La virulence de Plasmodium falciparum est fonction de sa capacité à séquestrer les érythrocytes infectés (iEs) dans les organes profonds de l’hôte. Elle est liée à la mise en place d’un trafic protéique conséquent au niveau membranaire et sub-membranaire de l’iE. Cet adressage protéique aboutit à l’expression d’antigènes variant de surface, dont P. falciparum Erythrocyte Membrane Protein-1, PfEMP-1. Cet adhésine présente une affinité pour divers récepteurs de l'hôte impliqués dans la physiopathologie des formes graves, telles que le paludisme associé à la grossesse (PAM) et le paludisme cérébral (CM). La diversité de liaison de PfEMP-1 est associée à la variabilité de séquence de son domaine extracellulaire. Ce domaine est constitué d’une succession de domaines DBL et CIDR en nombre variable. PfEMP-1 est codée par les gènes var classifiés en groupes Ups A, B, C, E et B/A, B/C. Des régions de PfEMP-1 constituées d’une succession établie de 2 à 4 domaines, nommées Domain Cassette, « DC » sont retrouvées dans différents isolats. L’obtention de données exhaustives par LC-MS/MS a permis d’établir un comparatif du protéome membranaire et hypothétique à partir des échantillons PAM et CM en comparaison à des accès simples de paludisme (UM). L’identification protéique des PfEMP-1 a montré la singularité de l’expression d’une PfEMP-1 particulière, VAR2CSA chez les PAM. Ces résultats corroborent les analyses des transcrits du gène var2csa comme surexprimé chez les PAM, transcrit qu’on retrouve également dans les infections de début et de fin de grossesse. Les PfEMP-1 identifiés au sein des CM étaient significativement associés aux groupes Ups A et B/A et la plupart des peptides identifiés étaient associés à la cassette DC8 dont le transcrit était également surexprimé. L’analyse de filter-based feature selection a permis d’identifier un sous ensemble de 13 et 14 protéines assignées comme protéines membranaires ou hypothétiques, prédictives des formes de paludisme PAM et CM, respectivement. Parmi ces protéines surexprimées chez les PAM, la présence de VAR2CSA valide l’approche d’analyse. PFI1785w a été identifiée et associée au PAM, quatre autres protéines apparaissent prédictives de cette forme clinique PFB0115w, PFF0325c, PFA_0410w et PF14_0018. Pour les CM, on distingue les protéines PfEMP-2 et antigen-332 comme spécifiques de cette forme clinique. Les autres protéines qui émergent de ce groupe sont des protéines de fonction inconnue, dont trois sont assignées comme des protéines exportées. L’obtention et l’analyse en LC-MS/MS d’extraits protéiques issus d’isolats de terrain font l’originalité de ce travail et permettent la corrélation entre les données cliniques et biologiques. Cette étude confirme les données de transcrits sur la famille des gènes var et suggère de nouvelles intéractions protéiques dans le cadre du paludisme associé à la grossesse et cérébral. / Plasmodium falciparum is responsible for severe malaria (cerebral malaria, CM and pregnancy associated malaria, PAM). During the intra-erythrocytic maturation of P. falciparum, parasite-derived proteins are expressed, exported and presented at the surface of the infected erythrocyte (iE) membrane. These include Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein-1 (PfEMP-1). PfEMP-1 is a highly polymorphic adherence receptor, variants of which have been assigned to four groups (A-E) based on their sequence homology. Semi-conserved types, defined by tandem runs of specific domains (“domain cassettes” (DC)), are also recognized. The PfEMP-1 type expressed determines the iE adherence phenotype, and is associated with the clinical outcome of infection. Parasite isolates from Beninese children or women presenting with, respectively, CM or PAM were collected along with samples from patients with uncomplicated malaria (UM). We assessed the transcript level of var genes by RT-qPCR and the expression of membrane and hypothetical proteins of Plasmodium by LC-MS/MS. Obtaining LC-MS/MS data enabled a comparison of hypothetical and membrane proteome samples from PAM and CM for comparison with UM samples. The proteomics-based identification of PfEMP-1 showed the expression of a particular PfEMP-1, VAR2CSA, in PAM isolates. These results corroborate the analysis of gene transcripts showing that var2csa is overexpressed in PAM, with transcripts found in isolates from infections both early and late in pregnancy. The PfEMP-1 variants identified in CM samples were predominantly from the Ups groups A and B/A, and most of the peptides identified by LC-MS/MS were associated with the DC8 cassette for which the transcripts were also overexpressed. Analysis using filter-based feature selection identified subsets of 13 and 14 proteins, assigned either as hypothetical or membrane proteins that were predictive of PAM and CM syndromes respectively. The presence of VAR2CSA amongst the proteins overexpressed in PAM samples validates the analytical approach. PFI1785w has previously been identified and associated with the PAM, whilst four other proteins, PFB0115w, PFF0325c, PFA_0410w and PF14_0018, appear to be also predictive of the syndrome. PfEMP-2 protein and antigen-332 were found to be specifically expressed in CM samples. Three other proteins, assigned as ‘exported’ but with unknown function, were also associated with CM samples. Obtaining and analyzing LC-MS/MS-derived data from protein extracts of field isolates represents the originality of this work and it allowed the identification of correlations between clinical and biological data. This study confirms the transcriptional data relating to the var gene family and provides evidence of new protein interactions in the context both of malaria associated with pregnancy and of cerebral malaria.

Orientador: Maria Ines Tiraboschi Ferro / Resumo: Períodos prolongados de seca têm se tornado mais frequentes em algumas regiões do Brasil. Além disso, a expansão da cultura de cana-de-açúcar para regiões com deficiência hídrica prolongada torna a produção sucroenergética limitada nestes locais. A melhor forma de contornar esse problema é utilizar cultivares tolerantes a este estresse. Neste trabalho, o perfil de expressão gênica da cana-de-açúcar foi avaliado, a partir de duas cultivares com respostas contrastantes ao déficit hídrico: uma delas com comportamento considerado tolerante (SP81-3250), e a outra altamente exigente em água (RB855453), considerada sensível. Ambas foram submetidas a três potenciais hídricos do solo (controle (sem estresse hídrico), déficit hídrico moderado e déficit hídrico severo) a partir de 60 dias após o plantio. Essas plantas foram avaliadas molecular e fisiologicamente em três épocas distintas: 30, 60 e 90 dias após a aplicação dos tratamentos, sendo este um dos poucos estudos realizados até o momento sobre a resposta de plantas de cana-de-açúcar sob déficit hídrico prolongado, estresse esse que foi realizado no período conhecido como fase de formação da cana-de-açúcar, compreendendo o período mais crítico por demanda de água. A análise global da expressão gênica através da tecnologia de RNA-Seq mostrou alterações significativas em resposta ao déficit hídrico entre as duas cultivares. Os transcritos do genótipo tolerante apresentaram uma maior capacidade de reação das plantas frente ao déficit... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Extended periods of drought have become more frequent in some regions of Brazil. In addition, the expansion of sugarcane cultivation to regions with prolonged water deficiency makes sugarcane production limited at these locations. The best way around this problem is to use stress-tolerant cultivars. In this work, the sugarcane gene expression profile was evaluated from two cultivars with contrasting responses to water deficit: one of them with tolerant behavior (SP81-3250), and the other highly demanding in water (RB855453 ), considered sensitive. Both were submitted to three soil water potentials (control (without water stress), moderate water deficit and severe water deficit) from 60 days after planting. These plants were evaluated molecularly and physiologically at three different times: 30, 60 and 90 days after the application of the treatments. This is one of the few studies carried out so far on the response of sugarcane plants under prolonged water deficit. This stress was realized during the period known as sugarcane formation phase, comprising the most critical period by water demand. The overall analysis of gene expression through RNA-Seq technology showed significant changes in response to water deficit between the two cultivars. The transcripts of the tolerant genotype showed a higher reaction capacity of the plants to prolonged water deficit, while in the sensitive genotype, several plant survival mechanisms were repressed. The tolerant cultivar presented inducti... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre