La chromatine, dont l’unité de base est le nucléosome, est une structure nucléoprotéique dynamique qui nécessite un remodelage au cours des processus nucléaires utilisant l’ADN comme matrice tels que la réplication, la transcription ou la réparation des cassures et autres types de lésions à l’ADN. Plusieurs facteurs capables de moduler la structure de la chromatine ont été caractérisés. Ils regroupent les complexes de remodelage ATP-dépendants et les enzymes modifiant les histones de façon post-traductionnelle. Nous nous intéressons au laboratoire à la voie de méthylation de la lysine 20 située sur la queue aminoterminale de l’histone H4. Le premier niveau de méthylation est induit par la monométhyltransférase PR-Set7 tandis que la di et tri méthylation sont déposées par le couple d’enzymes SUV4-20H1/2. Pour mieux caractériser le rôle joué par PR-Set7 au cours du développement, j’ai étudié la fonction de l'orthologue de PR-Set7 chez la Drosophile (dPR-Set7). La première partie de ma thèse a consisté à caractériser le rôle de dPR-Set7 dans la transcription. De manière intéressante, nous avons montré que la régulation transcriptionnelle médiée par PR-Set7 nécessite son domaine SET enzymatique mais pas H4K20me, suggérant l'existence d’autres substrats non-histones. Nous avons mis en évidence une interaction fonctionnelle de PR-Set7 et ISWI qui est la sous unité catalytique des complexes de remodelage de la chromatine (CRC). Fait intéressant, ISWI contient un patch basique identique à la queue N-terminale de H4 suggérant qu’il pourrait être un substrat pour dPR-Set7. La deuxième partie de ma thèse a consisté à combiner l’effet des radiations à ceux induits par les inhibiteurs des méthyltransférases responsables de la méthylation H4K20 et les radiations dans les lignées de cellules cancéreuses du pancréas et de l’ovaire. Par l'utilisation de différents inhibiteurs ciblant soit PR-Set7 ou les enzymes SUV4-20H, j’ai voulu savoir si la baisse des niveaux de H4K20me pourrait contribuer à une meilleure efficacité des traitements aux rayons X. Nos résultats montrent que la diminution globale des marques H4K20me2/3 suite à l’inhibition des enzymes SUV4-20H n’impacte que faiblement sur la survie des cellules et la combinaison des deux traitements les rendraient plus radiosensibles. / Chromatin is a dynamic nucleoprotein structure that requires remodeling for all nuclear processes such as replication, transcription and DNA damage. Several factors have been characterized to modulate chromatin structure and include ATP-dependent remodeling complexes and histone-modifying enzymes. We are interested in the laboratory in the methylation pathway of lysine 20 on histone H4 tail. The first level of methylation is induced by the monomethyltransferase PR-Set7 and the di/tri methylation are deposited by the SUV4-20H enzymes. To better characterize the role of dPR-Set7 during development, I wanted to study the function of Drosophila PR-Set7 (dPR-Set7). The first part of my thesis aimed to unravel the role of dPR-Set7 in transcription. Interestingly, transcriptional regulation mediated by PR-Set7 requires its enzymatic SET domain but not H4K20me, suggesting the existence of other non-histone substrates. We demonstrated a functional interaction between PR-Set7 and ISWI, the catalytic subunit of chromatin remodeling complexes (CRC). Interestingly, ISWI contains a basic patch identical to the histone H4 tail suggesting that it could be a substrate for dPR-Set7. The second part of my thesis consisted in combining inhibitors of H4K20 methyltransferase and radiation in ovarian and pancreatic cancer cell lines. I wanted to know if the decrease of H4K20me levels by inhibiting either PR-Set7 or SUV4-20H enzymes, contribute to better X-ray treatments. Our results show that the overall decrease of H4K20me2/3 marks following the inhibition of SUV4-20H enzymes has a low impact on cell survival and the combining effects of both treatments sensitize cancer cells.

Ce travail de thèse est focalisé sur la détermination, de manière non-destructive, d'interfaces profondément enterrées dans des empilements multi-couches utilisés dans les conditions de technologie réelles au travers d'une méthode innovante basée sur la photoémission avec utilisation de rayons-x de haute énergie (HAXPES) et l'analyse du fond continu inélastique. Au cours de cette thèse, une procédure numérique a été développée pour quantifier la correspondance entre la mesure du fond continu faite par HAXPES et la simulation du fond continu représentative d'une distribution en profondeur donnée. Cette méthode permet de trouver la distribution en profondeur d'un élément grâce à une procédure semi automatisée. Dans un premier temps cette méthode a été testée en étudiant une couche ultra fine de lanthane enterrée à une profondeur >50 nm dans un dispositif de grille métallique high-k. L'influence des paramètres utilisés lors de l'analyse y est étudiée et révèle l'importance principale d'un paramètre en particulier, la section efficace de diffusion inélastique. La combinaison de mesures HAXPES avec l'analyse du fond continu inélastique utilisant cette nouvelle méthode permet d'augmenter la profondeur de sonde jusqu'à un niveau sans précédent. Ainsi l'échantillon peut être sondé jusqu'à 65 nm sous la surface avec une haute sensibilité à une couche nanométrique. Dans un second temps, la méthode précédemment validée d'analyse de fond continu inélastique est combinée avec une étude haute résolution des niveaux de cœur dans un échantillon servant de source dans un transistor à haute mobilité. Les deux analyses sont complémentaires puisqu'elles permettent d'obtenir la distribution en profondeur des éléments ainsi que leur environnement chimique. Le résultat donne une description complète des diffusions élémentaires dans l'échantillon suivant les différentes conditions de recuit. / This thesis tackles the challenge of probing in a non-destructive way deeply buried interfaces in multilayer stacks used in technologically-relevant devices with an innovative photoemission method based on Hard X-ray PhotoElectron Spectroscopy (HAXPES) and inelastic background analysis. In this thesis, a numerical procedure has been implemented to quantify the matching between a HAXPES measured inelastic background and a simulated inelastic background that is representative of a given depth distribution of the chemical elements. The method allows retrieving depth distributions at large depths via a semi-automated procedure. First, this method has been tested by studying an ultra-thin layer of lanthanum buried at depth >50 nm in a high-k metal gate sample. The influence of the parameters involved in the analysis is studied unraveling the primary importance of the inelastic scattering cross section. The combination of HAXPES with inelastic background analysis using this novel method maximizes the probing depth to an unprecedented level, allowing to probe the sample up to 65 nm below the surface with a high sensitivity to a nm-thick layer. Second, the previously-checked inelastic background analysis is combined with that of high resolution core-level spectra in the case of the source part of a high electron mobility transistor. The two analyses are complementary as they allow retrieving the elemental depth distribution and the chemical state, respectively. The result gives a complete picture of the elemental intermixing within the sample when it is annealed at various temperatures. / Denne afhandling omhandler problemet med at probe dybt begravede grænseflader i multilags stacks, som bruges i teknologisk relevante devices, med en innovativ fotoemissions metode, der er baseret på Hard X-ray PhotoElectron Spectroscopy (HAXPES) og analyse af den uelastiske baggrund. I afhandlingen er en numerisk procedure blevet implementeret til at kvantificere forskellen mellem en HAXPES målt uelastisk baggrund og en modelleret baggrund, som svarer til en given dybdefordeling af atomerne. Metoden muliggør, med en halv-automatisk procedure, at bestemme dybdefordelingen i store dybder. Metoden er først blevet testet ved at studere et ultra-tyndt lag af lanthan, som er begravet i en dybde > 50 nm i en high-k-metal-gate prøve. Indflydelsen af parametrene der ingår i analysen er blevet studeret for at opklare den primære betydning af det anvendte uelastiske spredningstværsnit. Kombinationen af HAXPES med analyse af den uelastiske baggrund og brug af den nye numeriske metode giver en hidtil uset probe-dybde, som giver mulighed for at probe den atomare sammens ætning i op til 65 nm dybde under overfladen og med høj følsomhed af et kun nm tykt lag. Dernæst er den uelastiske baggrundsanalyse blevet kombineret med højopløst core-level spektroskopi for at studere de aktive dele i en høj-elektronmobilitets transistor. De to analyser er komplementære, idet de henholdsvis bestemmer den atomare fordeling og atomernes kemiske bindingstilstand. Resultatet giver et fuldstændigt billede af atomernes omfordeling i prøven når denne opvarmes til forskellige temperaturer.

Les travaux de ce doctorat concernent le développement d'une technique de caractérisation non destructive encore peu utilisée dans le domaine de la microélectronique : la tomographie par rayons X dans un microscope électronique à balayage. Cet instrument a été utilisé pour l'analyse haute résolution d'interconnexions métalliques, telles que les piliers de cuivre ainsi que les vias traversants, utilisées dans le cadre de l'intégration 3D pour connecter verticalement plusieurs puces entre elles. Les contributions les plus significatives de ces travaux sont : (1) l'amélioration des capacités d'analyse offertes par l'instrument. De nombreuses études – simulations et expériences – ont été menées afin de déterminer et améliorer les résolutions 2D et 3D de ce système d'imagerie. Il a été montré que la résolution 2D de ce système d'imagerie pouvait atteindre 60 nanomètres. La qualité des images acquises et reconstruites a également été améliorée à travers l'implémentation d'algorithmes de reconstruction itératifs et de nombreuses méthodes d'alignement des radiographies. (2) La réduction du temps d'analyse d'un facteur 3 à travers l'implémentation d'algorithmes de reconstruction contraints tels que la méthode de reconstruction basée sur la minimisation de la variation totale. (3) La mise en place d'algorithmes de correction efficaces pour l'élimination d'artéfacts de reconstruction liés à la polychromaticité du faisceau de rayons X utilisé. (4) La mise en application de l'ensemble de ces algorithmes sur des cas réels, rencontrés par des technologues. / In this thesis, an original non-destructive 3D characterization technique has been developed : the X-ray tomography hosted in a scanning electron microscope. This instrument is not widely used in the microelectronics field. This computed tomography (CT) system has been used for the high resolution analysis of metallic interconnections such as copper pillars and through silicon vias (TSVs). These components are widely used in the field of 3D integration to make vertical stacks of interconnected chips.The most significant contributions of this thesis are : (1) the enhancement of the analytical capabilities of the instrument. Many studies – simulations and experiments – have been performed in order to determine and improve the 2D and 3D resolutions of this imaging system. It has been shown that the 2D resolution of this instrument can reach 60 nanometers. The quality of the projections and reconstruction has also been improved through the implementation of iterative reconstruction algorithms and various projections alignment methods. (2) The reduction of the scanning time by a factor 3 through the implementation of constrained reconstruction techniques such as the reconstruction method based on the total variation minimization. (3) The application of effective correction algorithms for removing reconstruction artefacts due to the polychromaticity of the X-ray beam. (4) The application of all these reconstruction methods and algorithms on real cases encountered by materials engineers.

L’imagerie biomédicale est aujourd’hui un outil essentiel pour établir un diagnostic grâce à l’observation des tissus et des fluides biologiques. L’usage d’instruments à imagerie combinée avec des produits de contraste est la clé pour réussir à distinguer précisément un tissu ciblé via l’accumulation de produit de contraste dans le tissu. Les deux principaux appareils à imagerie utilisés sont le scanner à rayons X et l’imagerie à résonance magnétique (IRM). Ils sont fréquemment employés en complément de l’un et l’autre. Typiquement, de petites molécules iodées hydrophiles sont utilisées comme produit de contraste pour la radiographie à rayons X tandis que l’IRM implique des matériaux magnétiques tels que des nanoparticules d’oxyde de fer. Dans le cadre de ce projet doctoral, nous avons donc proposé deux nouveaux produits de contraste dont le premier visait à constituer une alternative aux produits iodés dont la rapide élimination et la toxicité rénale forment deux problèmes récurrents et un second produit, cette fois-ci bimodale, afin de faciliter les procédures d’imagerie bimodale. Pour le premier point, des nanoparticules de polymères iodés pour l’imagerie à rayons X ont été formulées et ce, par une technique de nanoprécipitation. Les paramètres de formulation ont été élucidés de telle sorte que les nanoparticules possédaient une distribution de taille adaptée pour l’administration par voie intraveineuse et une teneur en iode suffisante en iode pour contraster sous rayons X. Une étude in vivo a révélé le potentiel du produit de contraste à visualiser distinctement le foie et la rate et ce, tout en ne présentant pas les principaux problèmes des produits iodés commerciaux. La seconde étude a eu pour but de formuler des nano-véhicules lipidiques capables de générer un contraste pour l’imagerie à rayons X et l’IRM de par l’incorporation d’huile iodée et de nanoparticules d’oxyde de fer dans le coeur de nano-émulsions. Ceci avait pour objectif de fournir une plateforme nanoparticulaire bimodale pour réaliser efficacement et rapidement des procédures d’imagerie multimodale. Nous avons réussi à produire un efficace agent de contraste bimodal permettant d’observer distinctement le foie et les reins par IRM et le foie et la rate par imagerie à rayons X. La pharmacocinétique de la substance administrée a ainsi pu être mise en avant grâce à la bimodalité de l’agent. Employer l’IRM a permis de montrer qu’une fraction de la dose injectée était éliminée par voie rénale tandis que l’imagerie à rayons X a confirmé que les deux tissus, foie et rate,étaient passivement ciblés par l’agent de contraste. Ces deux études ont donc fournies de potentielles solutions pour répondre aux besoins en produits pour l’imagerie à rayons X et en formulations facilitant l’imagerie bimodale des tissus mous. / Biomedical imaging is nowadays an essential tool to establish a diagnosis by means of observation of tissues and biological fluids. Combination of imaging instrument with contrast enhancers is a key to obtain clear delineation of a desired tissue by accumulation of a contrast agent into this specific target. The two main imagers are the X-ray scanner and the magnetic resonance imaging (MRI).These imagers are frequently used in conjuncture. Typically, small hydrosoluble iodinated molecules are used as contrasting material for radiography whereas MRI involves magnetic materials like iron oxide nanoparticles. In this work, we proposed two novel contrast agents, the first one was aiming to form an alternative to iodinated contrast agents suffering from fast excretion and causing renal toxicity whereas the second one was aiming at providing bimodal contrasting ability to facilitate access to bimodal imaging procedure in clinics. In the first case, iodinated polymeric nanoparticles, serving for preclinical X-ray imaging were formulated by nanoprecipitation technique. Parameters of formulation were elucidated to provide nanoparticles with size distribution suitable for in vivo administration and high iodine content for contrast enhancement. In vivo study revealed the efficacy of our nanoparticles to clearly visualize liver and spleen and limiting current issues associated with marketed radiopaque contrast agents. The second work achieved was aiming at formulating bimodal lipids-based nanocarriers capable of yielding contrast enhancement for X-ray imaging and MRI by combining iodinated oil and iron oxide nanoparticles within a nano-emulsion core. This would provide bimodal nanoparticulate platform to carry out fast and efficient dual modal imaging procedures. In this context we succeeded to generate efficient dual modal contrast agent yielding clear visualization of liver and kidney by MRI and liver and spleen by X-ray imaging. Pharmacokinetic profile was so determined thanks to bimodal imaging. Using MRI allowed to show that kidneys eliminated a fraction of the dose whereas X-ray imaging confirmed that both tissues, liver and spleen, were passively targeted. These two studies proposed solutions limiting current issues of radiopaque contrast agents and novel formulations to facilitate bimodal imaging for soft tissues imaging.

Cette étude évalue le potentiel, comme détecteur de rayons X, des capteurs à pixel CMOS conçus pour la trajectométrie des particules chargée. Nous démontrons l’intérêt de la construction d’une image par comptage de photons uniques pour la définition de celle-ci. Un dispositif exploitant une source X est développé pour mesurer la résolution spatiale sur l’impact des photons. Une simulation complète sous GEANT4 montre que le système permet d’estimer cette résolution avec une incertitude de 2 µm. L’application du protocole caractérise la détection directe des rayons X de basse énergie (< 10 keV) par un capteur CMOS avec une résolution de 52 lp/mm. Une méthode de détection indirecte, couplant un cristal de CsI(Tl) finement segmenté au capteur CMOS, est employée pour les énergies supérieures à 10 keV. La résolution spatiale dans ces conditions atteint 15 lp/mm. Une simulation détaillée explique cette performance limitée par les caractéristiques d’émission de lumière du cristal employé. / This work investigates the potential application of CMOS pixel sensors, designed for particle tracking, for the detection of X rays. We explain how the image definition can be improved exploiting the single photon counting technique. An experimental system, based on an X ray source, is developed to measure the single point resolution of photons. Thanks to a full GEANT4 simulation of the device, the evaluation uncertainty is predicted to be 2 µm. We apply our method to the direct detection of low energy (< 10 keV) X rays by a CMOS pixel to measure a spatial resolution of 52 lp/mm. For higher energies, an hybrid device, coupling a CSi(Tl) highly segmented crystal with a CMOS sensor, is used. The spatial resolution reaches in this case 15 lp/mm. A detailed simulation study demonstrated that this limited performance is related to the characteristics of the light emitted by the crystal.

Cette thèse est composée de deux parties : Le première partie rend compte de l'étude structurale de la protéine RrgA. RrgA est associée au pilus du pathogène Streptococcus pneumoniae et participe aux premières étapes de colonisation chez l'hôte en se liant à plusieurs composés de la Matrice Extra Cellulaire. Nous avons résolu la structure de cette protéine à 1.9 Å par cristallographie aux rayons-X. RrgA possède une structure allongée formée de quatre domaines alignés d'origine eucaryote et procaryote. En effet, trois domaines ayant des similarités structurales avec les IgG et le domaine Cna-B semblent servir de piédestal pour orienter et présenter le domaine fonctionnel de type Intégrine. Nous avons confirmé la formation de deux ponts isopeptidiques stabilisateurs par spectrométrie de masse. De plus, le domaine intégrine possède deux insertions particulières dont la présence pourrait être impliquée dans la reconnaissance des divers substrats par RrgA. La deuxième partie de cette thèse est axée sur l'étude structurale du complexe ATPase et de ExsB, la pilotine présumée du système de sécrétion de type III chez Pseudomonas aeruginosa, bactérie opportuniste et jouant un rôle majeur dans l'infection des patients atteints de mucoviscidose. Pour la première fois, nous avons mis au point un protocole d'expression et de purification sous forme soluble de l'ATPase PscN en complexe avec une protéine partenaire, PscL. Des cristaux de ce complexe ont été obtenus au robot du PSB. Par ailleurs, nous avons confirmé l'expression de la lipoprotéine ExsB chez P. aeruginosa que nous avons localisée au sein de la membrane externe. De plus, nous avons résolu la structure de cette protéine qui présente un nouveau repliement et qui établie les bases structurales pour l'étude des pilotines pour tous les systèmes de sécrétion de type III de la famille Ysc. / This manuscript is made up of two parts The first part describes the structural study of RrgA from Streptococcus pneumoniae. This protein is a pilus-associated adhesin that is able to bind to several components of the Extra Cellular Matrix and thus, participates in the first steps of host colonization. We solved the structure of RrgA to 1.9 Å by X-Ray crystallography. We showed that RrgA folds into an elongated 4-domain structure, and these domains display both eukaryotic and prokaryotic origins. Actually, three out of the four domains are reminiscent of IgG and Cna-B structures and act like stalks to orient and display the large Integrin-like domain. We confirmed the presence of two isopeptide bonds by mass spectrometry and hypothesised that the two inserted arms in the integrin domain could explain the wide variety of substrates RrgA can bind. The second part of this manuscript focuses on the structural studies of the ATPase complex as well as ExsB, the putative pilotin of the type III secretion system from Pseudomonas aeruginosa. This bacterium is a major threat in hospital-acquired infections and the main pathogen found in cystic-fibrosis suffering patients. For the first time we were able to express and purify the ATPase PscN in complex with its partner PscL. Crystallization trials led to a very promising condition that is being refined. Moreover, we confirmed expression of the lipoprotein ExsB in P. aeruginosa that we localised in the outer membrane. To have a better understanding of this protein, we also solved its high-resolution structure that displays a novel fold and our study paves the way for coming studies concerning pilotins.

Ce travail de thèse porte sur la croissance par épitaxie par jets moléculaires assistée plasma et sur la caractérisation de nanofils (NF) de GaN et d'hétérostructures filaires de GaN/AlN. Dans un premier temps, la morphologie des NFs de GaN (densité, longueur moyenne, diamètre moyen, dispersion de longueurs) est étudiée en fonction des paramètres de croissance. Via la diffraction d'électrons rapides, la morphologie des NFs GaN est corrélée à la dynamique de nucléation de ces derniers. Des expériences de diffraction de rayons X en incidence rasante effectuées à l'ESRF permettent également de clarifier les processus de nucléation des NFs GaN. Nous démontrons ensuite l'utilisation de la diffraction de rayons X résonnante pour déterminer la polarité des NFs GaN. Nous montrons que ces derniers sont de polarité N lorsque fabriqués sur Si nu. Des tests complémentaires de gravure sélective au KOH révèlent que les NFs GaN fabriqués sur un substrat de Si recouvert d'un fin buffer d'AlN ainsi que ceux dont la fabrication est initiée après pré-déposition de Ga sur la surface du Si, sont aussi de polarité N. Concernant les hétérostructures filaires GaN-AlN, la croissance d'AlN autour et sur les nanofils de GaN est étudiée en fonction de divers paramètres de croissance. Le rapport d'aspect des coquilles d'AlN (longueur/épaisseur) est décrit par un modèle géométrique. En utilisant une combinaison de diffraction anomale multi-longueurs d'onde, de microscopie en transmission de haute résolution et des calculs théoriques, l'état de contrainte des coeurs de GaN est analysé en fonction de l'épaisseur de la coquille. Cette contrainte augmente avec l'épaisseur de la coquille tant que l'AlN croît de manière homogène autour des NFs de GaN. Dès lors que la coquille est asymétrique, le système relaxe plastiquement. Nous étudions enfin la possibilité de fabriquer des îlots de GaN dans des NFs AlN. Nous déterminons le rayon critique de NFs AlN au-dessus duquel le GaN déposé subit une transition de forme de 2D à 3D. L'analyse des propriétés optiques de ces nanostructures originales revèle la présence de nombreux états localisés. / This work focuses on the growth by plasma-assisted molecular beam epitaxy and on the characterization of GaN nanowires (NWs) and of GaN/AlN NW heterostructures. We first investigate GaN NW morphology (density, mean length, mean diameter, length dispersion) dependence on the growth parameters. Using reflection high energy electron diffraction, GaN NW morphology is correlated to their nucleation dynamics. In situ grazing-incidence X-ray diffraction experiments performed at the ESRF allow clarifying GaN NW nucleation processes on bare Si(111) and when usinga thin AlN buffer deposited on Si(111). The use of resonant X-ray diffraction for the determination of GaN NW polarity is then successfully demonstrated. GaN NWs grown on bare Si(111) are shown to be N-polar. Additional KOH selective etching tests reveal that both GaN NWs grown using a thin AlN buffer on Si(111) and when pre-depositing Ga on the Si(111) surface are N-polar, too. Regarding GaN-AlN NW heterostructures, the growth of an AlN shell around GaN NWs is studied as a function of various growth parameters. The AlN shell aspect ratio is described by a geometrical model. Using a combination of multiwavelength anomalous diffraction, high resolution transmission microscopy and theoretical calculations, GaN core strain state is investigated as a function of the AlN shell thickness. This strain is shown to increase with the shell thickness as long as AlN grows homogeneously around GaN NWs. When the shell is asymmetric, the system relaxes plastically. Eventually, we study the possibility to fabricate island-like GaN insertions in AlN NWs. We determine the critical AlN NW radius above which GaN undergoes a 2D to 3D shape-transition. Regarding optical properties of these novel structures, the presence of multiple localized states is identified.

Chaque cellule vivante sur notre Terre est entourée d'une membrane lipidique. Les protéines résidant dans la membrane exécutent multitude de fonctions essentielles pour la survivance de la cellule. Parmi eux sont le transport actif et passif dans et hors de la cellule, la signalisation et la catalyse des réactions.Une des plus grandes familles de protéines membranaires sont rhodopsins microbiennes, qui utilisent l'énergie de la lumière pour leur fonction. Les membres de cette famille comptent parmi eux les pompes de protons, cations et anions, entraînée par l'illumination, les canaux ioniques activés par l'illumination et, finalement, photorécepteurs. Bien que les aspects fondamentaux de leur fonctionnement ont été connus depuis un certain temps, il ya une abondance de questions sans réponse. Dans cette thèse, plusieurs structures de rhodopsines microbiennes (y compris la première structure de protéorhodopsine et la première structure de la pompe à sodium) sont présentés et analysés. Les structures ouvrent la voie pour comprendre les similitudes et les différences entre les différents rhodopsines microbiennes et pour exploiter cette connaissance pour créer de meilleurs instruments à base de rhodopsines microbiennes pour des applications biologiques, par exemple, dans le domaine de optogenetics.Alors que la première partie de ce travail porte sur les nouvelles structures de rhodopsines microbiennes, la deuxième partie présente l'approche de simulation pour comprendre la signalisation en fonction des rhodopsines sensorielles dans phototaxie. Les domaines HAMP des protéines transductrices des signals des rhodopsines sensorielles sont étudiés au moyen de la dynamique moléculaire, et il est démontré que les simulations peuvent être utilisés pour la construction et la validation des structures atomiques des domaines de signalisation, ainsi que pour la compréhension des changements conformationnels associée à signalisation, initié par les transformations des rhodopsine sensorielles.La troisième et la dernière partie décrit le travail sur la protéine IPCT-DIPPS de Archaeoglobus fulgidus, une enzyme catalysant deux étapes consécutives de di-inositol-phosphate biosynthèse. La structure résolue peut servir de modèle pour comprendre le mécanisme catalytique de transférases CDP-alcool, une grande famille de protéines comptant des milliers de membres, parmi lesquels sont cinq protéines humaines, qui catalysent les étapes majeures de la biosynthèse des lipides. La structure a également été utilisé pour prédire les sites de liaison des ligands sur le site actif de l'enzyme et pour proposer le mécanisme d'action catalytique.Pour résumer, cette thèse présente les études structurales de diverses protéines membranaires par la cristallographie aux rayons X et la modélisation qui font progresser notre compréhension des aspects fondamentaux et pratiques de fonctionnement des protéines membranaires. / Every living cell on Earth is surrounded by a lipid membrane. Proteins residing in the membrane perform a variety of functions crucial for the cell's survival. Among them are active and passive transport in and out of the cell, signaling and reaction catalysis.One of the largest membrane protein families are microbial rhodopsins, which utilize light energy for their function. Members of this family count among them light-driven proton, cation and anion pumps, light-gated ion channels and photoreceptors. While the basic aspects of their functioning have been known for some time, there is a plenty of unanswered questions. In this dissertation, several structures of microbial rhodopsins (among them the first proteorhodopsin structure and the first light-driven sodium pump structure) are presented and analyzed. The structures open the way for understanding the similarities and differences between the various microbial rhodopsins and for exploiting this understanding to create better microbial rhodopsin-based instruments for biological applications, for example, in the field of optogenetics.While the first part of this work deals with the novel structures of microbial rhodopsins, the second part presents the simulation approach for understanding the sensory rhodopsin-based signaling in phototaxis. The HAMP domains of the sensory rhodopsin transducer protein are studied by means of molecular dynamics, and it is demonstrated that the simulations may be used for building and validating the atomic structures of signaling domains, as well as for understanding the signaling-associated conformational changes, initiated by light-driven sensory rhodopsin transformations.The third and the last part describes the work on the Archaeoglobus fulgidus IPCT-DIPPS proteins, an enzyme catalyzing two consecutive steps of di-inositol-phosphate biosynthesis. The determined structure may serve as a model for understanding the catalytic mechanism of CDP-alcohol transferases, a large family of proteins counting thousands of members, among which are five human proteins that catalyze the major steps of lipid biosynthesis. The structure was also used to predict the binding sites of the ligands at the enzyme active site and to propose the mechanism of catalytic action.To sum up, this dissertation presents the structural studies of various membrane proteins by means of X-ray crystallography and modeling that advance our understanding of fundamental and practical aspects of membrane protein functioning.

L'objectif de cette thèse est l'élaboration de couche mince piézoélectrique sans plomb pour des applications mécatroniques. Le matériau piézoélectrique sélectionné est la langasite, La3Ga5SiO14, qui conserve ses propriétés à haute température (Tfus = 1470°C). L'élaboration par chimie douce permet une mise œuvre simple et économique. De nombreuses synthèses ont été réalisées variant précurseurs, ligands et solvants Des analyses thermogravimétriques et thermiques différentielles complétées par des caractérisations par spectroscopie infrarouge ont permis de comprendre les étapes de décompositions des précurseurs pour les différentes synthèses. Ainsi les précurseurs chlorures ne permettent pas la formation de langasite pure puisque restant dans la sphère de coordination du lanthane jusqu'à haute température. Nous avons retenu une synthèse à base de précurseurs nitrates permettant la formation d'une solution stable, nécessaire pour la réalisation de dépôts et conduisant à la formation de la langasite pure. Pour être piézoélectrique une couche mince doit être texturée dans une direction correspondant à une direction piézoélectrique du matériau. L'objectif de la thèse était au départ de déposer la langasite sur un substrat souple bitexturé de Ni95W5/LZO. Tous les essais de dépôts ont conduit à l'oxydation de ce substrat, même sous atmosphère inerte, d'autres substrats ont donc été étudiés. Les films obtenus ont essentiellement été caractérisés par diffraction des rayons X en mode tetha/2tetha, phi scan et figures de pôles. Des études par microscopie électronique à transmission ont également été menées. La morphologie des dépôts a été caractérisée par AFM. Les essais sur MgO (111) ou Si (100) ont conduit à la formation d'une couche mince de langasite polycristalline. Le dépôt de langasite sur MgO (100) possède une orientation préférentielle des plans (110) et (101). Des dispositifs SAW réalisés sur plusieurs couches n'ont pas permis de mettre en évidence des propriétés piézoélectriques. La dégradation de la langasite dans les films a ensuite été mise en évidence et peut expliquer ces résultats. Les dépôts de langasite sur spinelle MgAl2O4, présentent une texture fibrée des plans (002). Les perspectives de ces travaux concernent la mesure des coefficients piézoélectriques des dépôts sur spinelle ainsi que des essais de dépôt d'une couche métallique sur la surface des films afin de les protéger et éviter ainsi leur dégradation. / The objective of this PHD is the development of piezoelectric thin layers without lead element. The selected piezoelectric material is the langasite, La3Ga5SiO14, which keeps its piezoelectric properties at very high temperature (Tm = 1470°C). The chosen langasite synthesis is a soft chemistry way which is economical and easy to work. We have made many tests with different metal precursors, different solvents and ligands. Infrared spectroscopy, X-ray diffraction, differential thermal analysis and thermogravimetric analysis were done to study the decompositions steps. Thus, the synthesis with chlorides precursors lead to impure langasite due to chloride atoms which stay in the coordination sphere of lanthanum at high temperature. We selected a based nitrate synthesis which allows the formation of stable solution leading to pure langasite. To be piezoelectric, a thin layer must be a textured layer, and the orientation of the texture must be a piezoelectric direction. To depose langasite on flexible bitextured substrate of Ni95W5 / LZO was the first aim of this PHD. All tests led to the oxidation of this substrate. Further to these results other substrates were studied. The films were analyzed by X ray diffraction in (theta/2theta), phi scan and pole figures. The morphology of the layers was studied by AFM. Tests on MgO (111) or Si (100) led to the formation of polycrystalline langasite thin Layer. Deposition of langasite on MgO (100) led to two preferred orientation (110) and (101) . SAW electrodes were deposited on these layers but any piezoelectric properties were measured. Further degradation of films has been shown. Depositions on spinel MgAl2O4 , present a fibrous texture of the (002) planes . The prospects of this work concern the piezoelectric coefficients measurement of spinel deposit. Depositions tests of a metallic layer to protect the films langasite from degradation have to be made.

Une nouvelle méthode pour la cristallisation des protéines membranaires (MP) de bicouches amphiphiles interconnectés (IAB) a été récemment mise au point. Dans cette approche protéines cristallisées directement des membranes et il est supposé que la cristallisation est conduite principalement par les propriétés de la mésophase lipidique dans son ensemble, mais pas par des caractéristiques individuelles des détergents. Le détergent joue un rôle de modulateur de ces propriétés. L'application de ce procédé de cristallisation de la vaste gamme des protéines membranaires est très prometteuse car il facilite considérablement la cristallisation. Cependant, il faut effectuer un certain nombre d'expériences pour chaque nouvelle protéine membranaire afin de déterminer les paramètres optimaux de la mésophase lipidique pour la protéine. Pour ce faire avec des quantités limitées de protéines membranaires, en particulier des protéines humaines, qui sont généralement très difficiles à produire en quantité suffisante, l'application des systèmes robotisés de cristallisation à haut débit pour la nano volume cristallisation pourrait être la seule solution. L'objectif principal de ce travail est le transfert de l'approche actuelle pour la cristallisation des protéines membranaires de l'IAB sur les volumes nano. Pour ce faire une grande variété d'expériences cristallisations a été effectuée pour différentes protéines membranaires. Les faits, qui influent des résultats de cristallisation, ainsi que des informations structurelles obtenues ont été analysées avec soin. Il a été démontré que les gros cristaux de protéines membranaires différents adaptés pour cristallographie aux rayons X peuvent être reproductible obtenu par nano volume cristallisation. Le premier chapitre «Introduction» comprend une description générale des protéines membranaires, des approches différentes pour la cristallisation des protéines membranaires, leurs avantages et leurs limites. La vue d'ensemble des protéines membranaires, qui sont étudiés dans ce travail, les informations disponibles et les problèmes non résolus sont présentés. Le deuxième chapitre présente les matériaux et les méthodes utilisées dans l'étude. Le troisième chapitre «Résultats et discussions» est décrit les résultats obtenus et leur interprétation. Pour commencer, la nano volume cristallisation de l'IAB de la bactériorhodopsine et la comparaison avec l'approche présent de cristallisation est présenté. Nano volume cristallisations en présence d'amphiphiles fluorés et les poloxamères ont été effectuées pour la première fois et décrit en détails. L'application de l'approche du nano volume cristallisation du complexe de la rhodopsine sensorielle II de Natronomonas pharaonis avec son transducteur apparenté et les protéines du complexe avec une mutation importante dans le transducteur, ce qui élimine l'action des protéines, est présenté. Résultats de nano volume cristallisation pour un autre complexe de deux protéines membranaires - triple mutant de la bactériorhodopsine, qui fonctionne comme un transducteur de signal, avec transducteur de Natronomonas pharaonis sont décrits. Halorhopsin de Natronomonas pharaonis a également été cristallisé par la nouvelle approche et de cristallisation résultats sont présentés. La première structure de protéine membranaire - enzyme cytidine-5'-triphosphate: inositol-1-phosphate cytidylyltransférase / di-myo-inositol-1 ,3-phosphate-1-phosphate synthéase de hyperthermophiles Archaeoglobus fulgidus a été résolu en utilisant des cristaux obtenus par nano volume cristallisation. Détails de la structure, l'importance et le mécanisme proposé de l'action enzymatique sont discutées. Les conclusions finales ainsi que les perspectives de la méthodique développées sont donnés dans le dernier chapitre de la thèse. / A new method for crystallization of membrane proteins (MPs) from interconnected amphiphilic bilayers (IAB) was recently developed. In this approach proteins crystallized directly from the membranes and it is postulated that crystallization is driving mostly by the properties of the lipidic mesophase as a whole but not by individual features of the detergents. The detergent plays a role of the modulator of these properties. Application of this crystallization method to the wide range of MPs is very promising since it dramatically facilitates crystallization. However, one needs to perform a number of screening experiments for each new MP to determine the optimal parameters of the lipidic mesophase for certain protein. To do so with limited amounts of MPs, especially human proteins, which are usually very difficult to produce in sufficient amount, the application of the high throughput robotic systems for nano volume crystallization could be the only solution. The major goal of this work is the transfer of the present approach for large scale crystallization of MPs from IAB to the nano volumes. To do so a large variety of crystallizations experiments were carried out for different MPs. The facts, which influence the crystallization results, as well as structural information obtained were carefully analyzed. It was demonstrated that large crystals of different MPs suitable for X-ray crystallography can be reproducibly obtained using this nano volume crystallization method. The first chapter “Introduction” includes a general description of MPs, different approaches for crystallization of MPs, their advantages and limitations. The overview of membrane proteins, which are studied in this work, the information available and unsolved problems are presented. The second chapter presents the materials and methods used in the study. The third chapter “Results and Discussions” describes the results obtained and their interpretation. To begin with, nano volume crystallization from IAB of bacteriorhodopsin and the comparison with large scale crystallization approach is presented. Detailed nano volume crystallizations in the presence of fluorinated surfactants and poloxamers were performed for the first time and described in details. The application of nano volume approach for the crystallization of the complex of sensory rhodopsin II from Natronomonas pharaonis with its cognate transducer and the proteins complex with important mutation in the transducer, which eliminates the action of the proteins, is presented. Nano volume crystallization results for another complex of two MPs – triple mutant of BR, which operates like a signal transductor, together with transducer from Natronomonas pharaonis are described. A light-driven chloride pump halorhopsin from Natronomonas pharaonis was also crystallized by new approach and crystallization results are presented. The structure of new MP – bifunctional enzyme cytidine-5′-triphosphate:inositol-1-phosphate cytidylyltransferase/ di-myo-inositol-1,3-phosphate-1-phosphate synthase from hyperthermophiles Archaeoglobus fulgidus was solved using the crystals obtained by nano volume crystallization from IAB. Structure details, significance and proposed mechanism of the enzymatic action are discussed. The final conclusions as well as the perspectives of the developed methods are given in the last chapter of the thesis.