O Glioblastoma Multiforme (GBM) é o tipo de tumor cerebral maligno com maior incidência na população. A perda do gene PTEN (fosfatase e tensina homóloga) é uma alteração comum associada ao GBM (até 60%) e esse gene codifica uma enzima que antagoniza a ação de PI3K, inibindo a fosforilação de AKT e, desse modo, regulando vias de sinalização relativas à sobrevivência celular e proliferação. Mutações em PTEN têm sido associadas à instabilidade genômica e ao aumento no número de quebras de fita dupla, além de serem relacionadas também à redução da expressão de RAD51, a qual é uma proteína-chave da via de reparo por recombinação homóloga (HR). Diante disso, o objetivo deste estudo foi avaliar se o status de PTEN interfere na expressão de RAD51 e proteínas parálogas (RAD51C e RAD51B) e, consequentemente, se PTEN é capaz de influenciar a eficiência de HR. Com o objetivo de induzir a formação de quebras de fita duplas (DSBs) no DNA, as células foram tratadas com a droga antitumoral etoposídeo, que produz quebras no DNA, principalmente duplas (DSBs). Duas linhagens de GBM com status diferentes de PTEN foram utilizadas: T98G (PTEN mutado) e LN18 (PTEN tipo selvagem). As células de GBM foram tratadas com etoposídeo em diferentes experimentos ou ensaios: proliferação celular, quantificação da necrose e apoptose, cinética do ciclo celular, imunofluorescência da proteína ?- H2AX, quantificação dos níveis de expressão de RAD51 e parálogas e o silenciamento de PTEN na linhagem LN18. Os resultados mostraram que a linhagem LN18 foi mais sensível à droga nos tempos iniciais (24 e 72 h) (até 61,2% de redução), em comparação com a T98G (até 12,3% de redução); no tempo mais tardio de análise (120 h), ambas as linhagens sofreram redução acentuadana proliferação. Adicionalmente, a LN18 exibiu maior porcentagem de células apoptóticas e necróticas, em comparação com a linhagem T98G, nos tempos de24, 72 e 120 horas após o tratamento. O ensaio de imunofluorescência revelou maior indução de células positivas para ?-H2AX na linhagem LN18 em relação à T98G (p =<0,001), após tratamento com etoposídeo (50 e 75 ?M). Nessas concentrações, a análise da cinética do ciclo celular mostrou um bloqueio na fase G2 em ambas as linhagens (p<0,01) nos tempos analisados (24, 48 e 72h), mas apenas a linhagem LN18 revelou bloqueio na fase S. A expressão de RAD51, RAD51B e C foi mais elevada em LN18 em comparação com a T98G e U87MG, nas células tratados (75?M) e controles. PTEN foi silenciado (siRNA-PTEN) na linhagem LN18 para verificar se a redução da expressão desse gene reduziria também a expressão de RAD51 e parálogas. Após 72 horas de silenciamento, com 69,9% de inibição de PTEN, a expressão de RAD51 e RAD51C também se mostrou reduzida em relação ao grupo controle. Em conjunto, os resultados obtidos no presente estudo indicam que o status de PTEN é crucial para as vias de sobrevivência, controle do ciclo celular e indução de apoptose nas células de GBM, indicando a relação entre PTEN e RAD51 e parálogas nas células de GBM tratadas com um indutor de quebras no DNA. Adicionalmente, outras ferramentas de estudo são requeridas para investigar as vias moleculares e possíveis interações e complexos proteicos envolvendo a participação de PTEN e RAD51 e suas proteínas parálogas / Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common malignant brain tumor. Loss of PTEN (Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10) gene is the most frequent alteration associated with GBM and encodes a phosphatase enzyme that antagonizes the PI3K, by inhibiting AKT phosphorylation thereby regulating signaling pathways related to cell survival and proliferation. PTEN deficiency has been associated with genomic instability and increased endogenous DSBs, as well as reduced expression of RAD51, which is a key gene with crucial role in HR. In this study, we aimed to evaluate whether the PTEN status in GBM cell lines can affect RAD51 expression and HR efficiency under conditions of treatment with the antineoplastic drug etoposide, which targets the DNA topoisomerase II enzyme, thus leading to the production of DNA breaks. T98G (PTEN mutated) and LN18 (PTEN wild-type) cells were treated with etoposide, and several assays were carried out: cell proliferation, detection and quantification of necrosis and apoptosis, cell cycle kinetics, immunofluorescence staining, RAD51 (and paralogs) protein expression, and PTEN silencing in LN18 cell line, by using the siRNA method. LN18 cells showed a greater reduction in cell proliferation, compared to T98G after treatments (25, 50, 75 e 100 µM) at 24, 72 and 120h. Both cell lines showed a significant increase (p=<0.001) in cell death induction, but LN18 presented a greater percentage of apoptotic and necrotic cells than T98G (24, 72 and 120h). The induction of DSB was analyzed by immunostaining (with ?-H2AX antibody), and for the concentrations (50 and 75 µM) tested, LN18 showed higher levels of ?-H2AX positive cells than that observed for T98G (p=<0.001). The analysis of cell cycle kinetics performed for cells treated with etoposide (50 and 75 µM) and collected at 24, 48 and 72h, LN18 presented a greater G2-blockage, as compared to T98G; only LN18 showed a blockage at the S-phase. The expression of RAD51, RAD51B and C was higher in LN18 compared to T98G and U87MG cells treated with etoposide (75 µM) and controls. When we silenced PTEN in LN18 linage, to check if PTEN silencing may reduce the expression of RAD51 and its paralogs, we found a 69.9% reduction in PTEN protein expressions, and the expression of RAD51 and RAD51C was also found reduced, compared to the control group. Taken together, the results obtained in this study indicate that the status of PTEN is critical for survival pathways, cell cycle control and induction of apoptosis in GBM cells, confirming the relationship between PTEN and RAD51 and its paralogs in GBM cells treated with an inducer of DNA breaks. These results contribute with relevant information for further studies on molecular pathways underlying the interaction between PTEN and RAD51 and its paralogs

A levedura Saccharomyces cerevisiae é o sistema eucariótico com a genética mais conhecida, reconhecido como \"GRAS\", vem sendo proposta como hospedeira para a expressão de genes que codificam produtos de interesse biotecnológico. No Brasil, vários processos industriais empregam linhagens selvagens de S. cerevisiae, incluindo a produção de etanol combustível. A maioria dessas linhagens industriais são mais vigorosas e apresentam crescimento muito mais rápido que as linhagens de laboratório, além de já estarem adaptadas a processos industrias de larga escala. Neste trabalho, foi estabelecido um sistema de transformação genética, que permite a inserção de genes codificadores de proteínas de interesse biotecnológico no genoma de linhagens selvagens haplóides ou de ploidia maior. O sistema de transformação origina de um vetor de clonagem, denominado YlpC, formado por um fragmento do gene CAN1 (permease da L-arginina e do análogo tóxico L-canavanina), contendo um sítio de restrição interno (BstEII), onde se realiza a inserção do cassete de expressão gênica desejado. A digestão do plasmídio resultante, com HindlIlI, causa a liberação do fragmento de DNA linear, composto pelo cassete de expressão flanqueado por seqüências de CAN1. Esse fragmento resultante é destinado à transformação de leveduras. As células recombinantes sofrem interrupção do gene CAN1 selvagem pelo cassete de expressão presente no fragmento de transformação, tornando-as resistentes à Lcanavanina, permitindo assim, a seleção positiva dos clones transformantes. Para análise da eficiência desse sistema a glicoamilase de A. awamori foi utilizada como proteína repórter. O cassete de expressão contendo a sequência sinal e estrutural da glicoamilase de A. awamori sob a regulação do promotor e terminador de transcrição de PGK de S. cerevisiae foi subclonado no vetor YlpC, dando origem ao plasmídio YlpCGC e depois pUCGc. Esses vetores, digeridos com HindlIlI, liberam o fragmento CGC, empregado nas transformações de levedura deste trabalho. Obtivemos sucesso na transformação de linhagens diplóides de laboratório. Análise dos esporos e amplificação de DNA por PCR, demonstrou que o fragmento CGC encontra-se inserido em ambos alelos CAN1 cromossômicos dessas linhagens recombinantes. Das 20 linhagens de levedura industriais, submetidas à transformação com o fragmento CGC, 10 resultaram em clones transformantes, e assim como os clones recombinantes de linhagens de laboratório diplóides, mantêm a informação adicional 100% estáveis. O sistema também se mostrou adequado para a construção de linhagem de levedura diplóide heterozigota CGC+/CGC:, empregada na detecção de substâncias indutoras de recombinação mitótica, que, como é conhecido, são potencialmente carcinogênicas. / The yeast Saccharomyces cerevisiae is the eukaryotic system with the most extensively studied genetics, it is generally recognized as safe, and it has broadly been used as a host system for the expression of heterologous genes of biotechnological interest. In Brazil, the vast majority of industrial processes, which include the production of fuel ethanol, utilize wild-type strains because of their higher resistance to adverse conditions, their adaptation to industrial processes in large scale, and because they exhibit higher growth rates than laboratory strains. In the present work, a genetic transformation system was developed for the chromosomal integration of heterologous genes of commercial interest in both haploid and polyploid industrial strains. This system utilizes an integrative shuttle vector, YIpC, which contains a CAN1 gene fragment (L-arginine permease and L-canavanine toxic analogous), bearing an internar restriction site (BstEII), where the gene expression cassette can be inserted. The resultant plasmid is then digested with HindlIII, releasing a linear DNA fragment containing the expression cassette flanked by CAN1 sequences. Following the introduction of the transforming fragment into yeast cells, the wild-type CAN1 gene is interrupted by the expression cassette, thus allowing positive selection of the recombinant clones by their resistance to the toxic properties of L-canavanive. To analyze the efficiency of this system, glucoamylase of Aspergillus awamori was used as reporter. An expression cassette containing the structural and signal sequences of A. awamori glucoamylase, under the control of the S. cerevisiae PGK1 transcriptional promoter and termination sequences, was subcloned in YIpC to obtain the plasmids YIpCGC and pUCGc. Both vectors, when digested with HindlIII, released a fragment (CGC) which was subsequently used for yeast transformation. Spore analysis and DNA PCR amplification indeed confirmed that the CGC fragment was inserted in both CAN1 chromosomal alleles of transformed diploid laboratory strains. Most importantly, 10 out of 20 industrial yeast strains submitted to transformation with the CGC fragment resulted in recombinant clones and, like observed for the diploid laboratory strains, the additional information was 100% stable. In concluding, this system also seems to be suitable for the construction of diploid heterozygote CGC+/CGC yeast strains, which in turn can be used for the detection of inductor substances of mitotic recombination that, as known, are potentially carcinogenic.

O projeto de obtenção de huAcMos (Anticorpos Monoclonais Humanizados) tinha como escopo a humanização de anticorpos murinos com potencial terapêutico, inserção das sequências em vetores de expressão e transfecção em células CHO (do inglês, Chinese Hamster Ovary). A expressão do huAcMo Anti-CD18 resultou em baixos níveis da proteína recombinante e inciamos o processo de expressão de isoformas do huAcMo Anti-CD3. As células foram transfectadas com seqüências codificadoras do fragmento FvFc Anti-CD3 e clonadas pelo equipamento ClonePix FL. O fragmento foi caracterizado e demonstrou uma menor afinidade quando comparada com a molécula murina original. Ulizamos o sistema de recombinação homóloga (CHO Flp-In, Invitrogen) para expressão da molécula inteira do huAcMo Anti-CD3. Os clones foram caracterizados e demonstrou, assim como o fragmento FvFc, uma menor afinidade pelo alvo. As diferenças nas propriedades de ligação são freqüentemente encontradas após processos de humanização; dependendo da função efetora esta diminuição de afinidade não é negativa para a molécula. / The humanized antibodies (huMab) project intent to use murine antibodies with therapeutic potencial to obtain more human sequences with maintened specificity. The sequences were inserted in expression vectors and transfected in CHO (Chinese Hamster Ovary) cells. Anti-CD18 huMab expression results in low levels of recombinant protein and lead us to try the expression of Anti-CD3 isoforms. The cells were transfected for the expression of a FvFc antibody fragment and cloned using ClonePix FL equipment. The fragment characterization demonstrate a lower affinity when compared with the murine molecule. We use the homologous recombination system (CHO Flp-In) for the expression of the whole molecule of huMab Anti-CD3; like the FvFc fragment, the whole molecule demonstrate a lower affinity for the target. The differences in the affinity properties are frequently found after humanization process and depending on the expected efector functions is not negatively characterized.

A levedura Saccharomyces cerevisiae é o sistema eucariótico com a genética mais conhecida, reconhecido como \"GRAS\", vem sendo proposta como hospedeira para a expressão de genes que codificam produtos de interesse biotecnológico. No Brasil, vários processos industriais empregam linhagens selvagens de S. cerevisiae, incluindo a produção de etanol combustível. A maioria dessas linhagens industriais são mais vigorosas e apresentam crescimento muito mais rápido que as linhagens de laboratório, além de já estarem adaptadas a processos industrias de larga escala. Neste trabalho, foi estabelecido um sistema de transformação genética, que permite a inserção de genes codificadores de proteínas de interesse biotecnológico no genoma de linhagens selvagens haplóides ou de ploidia maior. O sistema de transformação origina de um vetor de clonagem, denominado YlpC, formado por um fragmento do gene CAN1 (permease da L-arginina e do análogo tóxico L-canavanina), contendo um sítio de restrição interno (BstEII), onde se realiza a inserção do cassete de expressão gênica desejado. A digestão do plasmídio resultante, com HindlIlI, causa a liberação do fragmento de DNA linear, composto pelo cassete de expressão flanqueado por seqüências de CAN1. Esse fragmento resultante é destinado à transformação de leveduras. As células recombinantes sofrem interrupção do gene CAN1 selvagem pelo cassete de expressão presente no fragmento de transformação, tornando-as resistentes à Lcanavanina, permitindo assim, a seleção positiva dos clones transformantes. Para análise da eficiência desse sistema a glicoamilase de A. awamori foi utilizada como proteína repórter. O cassete de expressão contendo a sequência sinal e estrutural da glicoamilase de A. awamori sob a regulação do promotor e terminador de transcrição de PGK de S. cerevisiae foi subclonado no vetor YlpC, dando origem ao plasmídio YlpCGC e depois pUCGc. Esses vetores, digeridos com HindlIlI, liberam o fragmento CGC, empregado nas transformações de levedura deste trabalho. Obtivemos sucesso na transformação de linhagens diplóides de laboratório. Análise dos esporos e amplificação de DNA por PCR, demonstrou que o fragmento CGC encontra-se inserido em ambos alelos CAN1 cromossômicos dessas linhagens recombinantes. Das 20 linhagens de levedura industriais, submetidas à transformação com o fragmento CGC, 10 resultaram em clones transformantes, e assim como os clones recombinantes de linhagens de laboratório diplóides, mantêm a informação adicional 100% estáveis. O sistema também se mostrou adequado para a construção de linhagem de levedura diplóide heterozigota CGC+/CGC:, empregada na detecção de substâncias indutoras de recombinação mitótica, que, como é conhecido, são potencialmente carcinogênicas. / The yeast Saccharomyces cerevisiae is the eukaryotic system with the most extensively studied genetics, it is generally recognized as safe, and it has broadly been used as a host system for the expression of heterologous genes of biotechnological interest. In Brazil, the vast majority of industrial processes, which include the production of fuel ethanol, utilize wild-type strains because of their higher resistance to adverse conditions, their adaptation to industrial processes in large scale, and because they exhibit higher growth rates than laboratory strains. In the present work, a genetic transformation system was developed for the chromosomal integration of heterologous genes of commercial interest in both haploid and polyploid industrial strains. This system utilizes an integrative shuttle vector, YIpC, which contains a CAN1 gene fragment (L-arginine permease and L-canavanine toxic analogous), bearing an internar restriction site (BstEII), where the gene expression cassette can be inserted. The resultant plasmid is then digested with HindlIII, releasing a linear DNA fragment containing the expression cassette flanked by CAN1 sequences. Following the introduction of the transforming fragment into yeast cells, the wild-type CAN1 gene is interrupted by the expression cassette, thus allowing positive selection of the recombinant clones by their resistance to the toxic properties of L-canavanive. To analyze the efficiency of this system, glucoamylase of Aspergillus awamori was used as reporter. An expression cassette containing the structural and signal sequences of A. awamori glucoamylase, under the control of the S. cerevisiae PGK1 transcriptional promoter and termination sequences, was subcloned in YIpC to obtain the plasmids YIpCGC and pUCGc. Both vectors, when digested with HindlIII, released a fragment (CGC) which was subsequently used for yeast transformation. Spore analysis and DNA PCR amplification indeed confirmed that the CGC fragment was inserted in both CAN1 chromosomal alleles of transformed diploid laboratory strains. Most importantly, 10 out of 20 industrial yeast strains submitted to transformation with the CGC fragment resulted in recombinant clones and, like observed for the diploid laboratory strains, the additional information was 100% stable. In concluding, this system also seems to be suitable for the construction of diploid heterozygote CGC+/CGC yeast strains, which in turn can be used for the detection of inductor substances of mitotic recombination that, as known, are potentially carcinogenic.

Este trabalho apresenta uma extensiva série de resultados experimentais da condutividade induzida por radiação X contínua, durante e após a irradiação, em amostras de PET e Kapton. As medidas foram realizadas variando-se uma série de parâmetros, tais como: o campo elétrico aplicado, a taxa de exposição, a espessura da amostra, o tipo de eletrodo, a energia da radiação e as condições ambientes. Foram feitas ainda medidas da corrente termo-estimulada em amostras irradiadas e não irradiadas, que permitiram verificar a presença de armadilhas nos materiais. Medidas da corrente fotônica com diferentes eletrodos e espessuras das amostras, constataram a influência do eletrodo no valor dessa corrente. Finalmente um modelo teórico foi desenvolvido, baseado na teoria de balanço dos portadores generalizada, com a inclusão do efeito do campo elétrico na taxa de geração de portadores (efeito Onsager). O ajuste teórico-experimental permitiu a determinação numérica dos principais parâmetros de condução, tais como, mobilidade dos portadores, coeficiente de recombinação e densidade de armadilhas, para os dois materiais estudados. / In this work we present extensive results of measurements of the prompt and delayed radiation-induced conductivity of samples of PET and Kapton. Experimental parameters, such as the effective energy of the radiation, the exposure rate, the total dose, the value of the applied electric field, the nature of the electrodes, and the ambienta1 conditions were changed within wide limits. We also report measurement of thermally stimulated currents for non-irradiated and for irradiated samples which allowed us to investigate the trap-structure of the materials. Measurements of photo-Compton currents with different electrode materials and sample thicknesses gave information about the relation between the nature of the electrodes and the amplitudes of the currents. Based on the generalized rate theory of radiation-induced conduction we developed a theoretical model which includes the effect of the applied electric field on the carrier generation yield (geminate recombination, Onsager effect). Comparison of experimental and theoretical curves allowed us to determine the values of the main conduction parameters, such as carrier mobility, recombination coefficient, trap densities, for the materials under investigation.

A estrutura populacional e o desequilíbrio de ligação são dois processos fundamentais para estudos evolutivos e de mapeamento associativo. Tradicionalmente, ambos têm sido investigados por meio de métodos clássicos comumente utilizados. Tais métodos certamente forneceram grandes avanços no entendimento dos processos evolutivos das espécies. No entanto, em geral, nenhum deles utiliza uma visão genealógica de forma a considerar eventos genéticos ocorridos no passado, dificultando a compreensão dos padrões de variação observados no presente. Uma abordagem que possibilita a investigação retrospectiva com base no atual polimorfismo observado é a teoria da coalescência. Assim, o objetivo deste trabalho foi analisar, com base na teoria da coalescência, a estrutura populacional e o desequilíbrio de ligação de um painel mundial de acessos de sorgo (Sorghum bicolor). Para tanto, análises de mutação, migração com fluxo gênico e recombinação foram realizadas para cinco regiões genômicas relacionadas à altura de plantas e maturidade (Dw1, Dw2, Dw4, Ma1 e Ma3) e sete populações previamente selecionadas. Em geral, elevado fluxo gênico médio (&Mu; = m/&mu; = 41,78 &minus; 52,07) foi observado entre as populações considerando cada região genômica e todas elas simultaneamente. Os padrões sugeriram intenso intercâmbio de acessos e história evolutiva específica para cada região genômica, mostrando a importância da análise individual dos locos. A quantidade média de migrantes por geração (&Mu;) não foi simétrica entre pares recíprocos de populações, de acordo com a análise individual e simultânea das regiões. Isso sugere que a forma pela qual as populações se relacionaram e continuam interagindo evolutivamente não é igual, mostrando que os métodos clássicos utilizados para investigar estrutura populacional podem ser insatisfatórios. Baixas taxas médias de recombinação (&rho;L = 2Ner = 0,030 &minus; 0,246) foram observadas utilizando o modelo de recombinação constante ao longo da região. Baixas e altas taxas médias de recombinação (&rho;r = 2Ner = 0,060 &minus; 3,395) foram estimadas utilizando o modelo de recombinação variável ao longo da região. Os métodos tradicional (r2) e via coalescência (E[r2 rhomap]) utilizados para a estimação do desequilíbrio de ligação mostraram resultados próximos para algumas regiões genômicas e populações. No entanto, o r2 sugeriu padrões descontínuos de desequilíbrio em várias ocasiões, dificultando o entendimento e a caracterização de possíveis blocos de associação. O método via coalescência (E[r2 rhomap]) forneceu resultados que pareceram ter sido mais consistentes, podendo ser uma estratégia eventualmente importante para um refinamento dos padrões não-aleatórios de associação. Os resultados aqui encontrados sugerem que o mapeamento genético a partir de um único pool gênico pode ser insuficiente para detectar associações causais importantes para características quantitativas em sorgo. / Population structure and linkage disequilibrium are two fundamental processes for evolution and association mapping studies. Traditionally, both have been investigated using classical methods that are commonly used. These methods certainly provided important advances for the understanding of the evolution processes of the species. However, in general, none of them uses a genealogical view to consider genetic events occurred in the past, making difficult the understanding of the variation patterns observed in the present. An approach that enables the retrospective investigation based on the actual observed polymorphism is the coalescent theory. Here, we used the coalescent theory to analyze the population structure and linkage disequilibrium of a worldwide sorghum (Sorghum bicolor) accession panel. To reach this purpose, analyses of mutation, migration with gene flow and recombination were performed to five genomic regions related to plant height and maturity (Dw1, Dw2, Dw4, Ma1 e Ma3) and seven previously selected populations. In general, high average gene flow (&Mu; = m/&mu; = 41,78 &minus; 52,07) was observed between populations considering each genomic region and all the regions simultaneously. The patterns suggested a high exchance of accessions between populations and a specific evolutionary history for each genomic region, showing that the individual analysis of each locus was important. The average number of migrants per generation (&Mu;) was not symmetric between reciprocal pairs of populations, according to the specific and simultaneous analyses of the regions. This result suggests that the historical and recent evolutionary relations between populations are not equal, showing that the classical methods to investigate population structure may be unsatisfactory. Low average recombination rates (&rho;L = 2Ner = 0,030 &minus; 0,246) were observed using a constant recombination model along the region. Low and high average recombination rates (&rho;r = 2Ner = 0,060 &minus; 3,395) were estimated using a variable recombination model along the region. Both traditional (r2) and coalescent (E[r2 rhomap]) methods for the estimation of linkage disequilibrium showed similar results for some genomic regions and populations. However, r2 suggested discontinuous patterns of linkage disequilibrium in several cases, making difficult the understanding and definition of the association blocks. The coalescent method (E[r2 rhomap]) provided results that seemed to be more consistent and could be an eventually important strategy to refine the non-random association patterns. The results detected here suggest that the genetic mapping from a unique gene pool may be insufficient to detect important causal associations for quantitative traits in sorghum.

O Torque teno vírus suíno é classificado como pertencente à família Anelloviridae gênero Iotatorquevirus que compreende as espécies: Torque teno sus virus 1a (TTSuV1a) e Torque teno sus virus 1b (TTSuV1b); e o gênero Kapatorquevirus que compreende apenas a espécie Torque teno sus virus k2 (TTSuVk2). O TTSuV foi identificado como potencial agente causador de falhas reprodutivas em porcas, como agente desencadeante nos quadros de doenças associadas ao circovírus suíno tipo 2 (PCVAD) e em associação com outros agentes como o vírus da síndrome respiratória e reprodutiva dos suínos (PRRSV), vírus da influenza suína (SIV) e Mycoplasma hyopneumoniae como co-agentes na manifestação clínica do complexo respiratório suíno (PRDC). No presente estudo foi utilizada uma PCR direcionada a região não traduzida do genoma viral (UTR), e foi investigado um total de 391 amostras divididas entre fetos abortados e mumificados, leitões natimortos, soro, fezes e pulmão de suínos de dez propriedades localizadas no Estado de São Paulo. Diferenças entre as frequências do TTSuV1 e do TTSuVk2 foram comparadas entre amostras de porcas com problemas reprodutivos (fetos abortados e mumificados e leitões natimortos), diferentes fases da criação de suínos (porcas, leitões da creche e crescimento), leitões apresentando ou não diarréia, entre animais da terminação vacinados ou não contra o PCV2 e ainda entre amostras positivas e negativas para o PCV2. Amostras positivas de pulmão de suíno e um pool de soro de Porco Monteiro do Pantanal foram submetidos a uma PCR para amplificação da ORF1 de ambos os gêneros do TTSuV, seguida pela clonagem e posterior sequenciamento para reconstrução da filogenia. Foi investigada a ocorrência de eventos de recombinação entre as amostras, pressão de seleção e propriedades da proteína relacionadas à ligação com anticorpos. O TTSuVk2 foi mais presente infectando tanto fetos abortados quanto leitões natimortos. Porcas e leitões da creche foram mais frequentemente infectados pelo TTSuV1 enquanto que leitões do crescimento pelo TTSuVk2. A coinfecção (TTSuV1 + TTSuVk2 + PCV2) foi mais frequente em amostras fecais diarreicas que nas não diarreicas. Animais da terminação apresentaram alta frequência de coinfecção (TTSuV1 + TTSuVk2), sendo ainda maior na associação com o PCV2. A filogenia construída pelo método neighborjoing baseada na sequência da ORF1 revelou existir quatro tipos do TTSuV1 (1a, 1b, 1c e 1d) e sete subtipos do TTSuVk2 (2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, 2g) circulantes nas populações de suínos domésticos e ferais do Brasil. Entre as estirpes virais circulantes foram detectados eventos de recombinação intra-hospedeiro, inter-hospedeiro, intra-genótipo e inter-genótipo. A região carboxi-terminal da proteína demonstrou agrupar características relacionadas à ligação com anticorpos. Este estudo é o primeiro a caracterizar geneticamente amostras de TTSuV circulantes em suínos domésticos e ferais do Brasil e contribui para um melhor entendimento sobre a epidemiologia do vírus. / The porcine torque teno virus is classified within the Anelloviridae family, genus Iotatorquevirus comprising the species: Torque teno sus virus 1a (TTSuV1a) and Torque teno sus virus 1b (TTSuV1b). The genus Kapatorquevirus comprises only one species, the Torque teno sus virus k2 (TTSuVk2). TTSuV was identified as a potential agent of reproductive failure causes in sows, as a trigger agent associated with porcine circovirus associated diseases (PCVAD) and in combination with other agents such as porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRSV), swine influenza virus (SIV) and Mycoplasm hyopneumoniae as a co-agent in the clinical manifestation of porcine respiratory disease complex (PRDC). In this study, PCR targeting the untranslated region (UTR) of the virus genome was used to investigate a total of 391 samples within aborted and mummified fetuses, stillborn piglets, serum, feces and lungs of pigs from ten different properties located at São Paulo State. Differences between frequencies of TTSuV1 and TTSuVk2 were compared among samples of sows with reproductive failure (aborted and mummified fetuses and stillborn piglets), different phases of pig breeding (sows, nursery and growing piglets), samples from piglets with diarrhea or not, finishing pigs vaccinated or not against PCV2 and between positive and negative samples for PCV2. Positive lung samples from pigs and a pool of sera from feral pigs were used to PCR amplification for the ORF1 of both genera of TTSuV, followed by cloning and subsequent sequencing to reconstruct the phylogeny. The occurrence of recombination events among the samples, selection pressure and protein-related antibodies binding properties was investigated. The TTSuVk2 was more frequent infecting both aborted fetuses as stillborn piglets. Sows and nursery piglets were frequently more infected by TTSuV1 while growing piglets by TTSuVk2. The coinfection (TTSuV1 + TTSuVk2 + PCV2) was more frequent in diarrheic stool samples than in the non-diarrheic. Finishing pigs showed high frequency of coinfection (TTSuV1 + TTSuVk2) and and increase of the coinfection in association with PCV2. Phylogeny constructed by neighborjoing method based on the ORF1 sequence revealed the existence of four types TTSuV1 (1a, 1b, 1c and 1d) and seven subtypes of TTSuVk2 (2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, 2g) circulating within populations of domestic and feral pigs in Brazil. Among circulating viral strains, intra-host, inter-host, intra-and inter-genotype recombination events were detected. The carboxy-terminal region of the protein showed the have characteristics related with antibodies binding activity. This study is the first to genetically characterize samples of TTSuV circulating in domestic and feral pigs from Brazil and contributes to a better understanding of the epidemiology of the virus.

Made available in DSpace on 2016-04-29T13:18:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Angela.pdf: 1006436 bytes, checksum: 89df1cb29eab2df6e427a7d5917fa15c (MD5) Previous issue date: 2007-05-09 / The goal of the present work was to test a procedure where training word reading was followed by the exposure to the word and word writing. Participants were 3 children with developmental deficits. An initial assessment of the children reading and writing repertoires was conducted by asking them to read and writer 36 dictated words (12 of them were training words and the other 24 words were formed by recombination of the syllables of the training words). Training words were assigned to 3 sets and reading each set of words was tested, trained and tested again. During training correct reading responses were followed by praise and small gifts. Two consecutive correct reading responses of a word led to the training of a new word. Wrong reading responses were followed by the experimenter reading of the word and the repetition of the same trial. When training of a set of 4 words was completed, the word exposure followed: each word was shown to the participant who was asked not to read them allowed. Finally each word was dictated and the participant was asked to write it. After training of each set of words a test was conducted: participants were asked to read and to write the 36 words .Results showed that training had an effect on word reading, bur not necessarily over writing, although the number or correct writing responses increased with word exposure. Error analysis showed that training led to an increase of correct syllable reading and writing, but not to correct reading and writing of new words, comprised of the trained syllables / Três crianças que freqüentavam uma sala especial participaram de um procedimento que teve como objetivo investigar o efeito do treino de leitura, seguido de exposição da palavra, na leitura e escrita recombinativas. Foi realizada uma avaliação inicial para verificar a leitura e escrita de 12 palavras (de treino) e de outras 24 palavras formadas da recombinação das sílabas das palavras do treino. As 12 palavras foram agrupadas em três conjuntos contendo 4 palavras cada um. As crianças, em cada um dos conjuntos de palavras, passaram por pré-teste, treino de leitura e pós-teste. No treino, o participante foi ensinado a ler as palavras de cada um dos 3 conjuntos; cada resposta correta de leitura do participante era reforçada com elogios e brindes e, a cada duas respostas corretas de leitura consecutivas, passava-se para o treino de outra palavra. As respostas incorretas de leitura eram seguidas da leitura da palavra pela pesquisadora e não eram reforçadas qualquer tentativa de leitura que se seguia logo após a correção. Após o treino de um conjunto seguia-se a fase de exposição da palavra (estímulo visual), sem sua oralização pelo participante e/ou pela pesquisadora. Depois que todas as palavras do conjunto foram expostas ao participante, eram ditadas para que as escrevesse. Ao final, foi incluída uma fase contendo 36 palavras as 12 do treino e 24 novas palavras para verificar a possibilidade de ocorrência de leitura e escrita recombinativas. Os resultados indicaram que o treino de leitura foi importante para a melhora da leitura das palavras, mas não necessariamente da escrita, e que o número de respostas corretas de escrita aumentou com a exposição da palavra. A análise de acertos e erros de sílabas indicou que o treino de leitura seguido de exposição das palavras, produziu aumento do número de sílabas lidas e escritas corretamente, no entanto, não foi suficiente para que os participantes apresentassem leitura e escrita recombinativas

O vírus da cinomose canina (CDV) é um importante patógeno de cães domésticos e carnívoros selvagens. A infecção pelo CDV é relevante a nível mundial e está associada com alta morbidade e mortalidade. Em diversos países a cinomose é considerada controlada pelo uso de vacinas, no entanto, no Brasil ainda é endêmica, principalmente devido ao grande número de animais não domiciliados. Além disso, surtos em cães e várias espécies de animais silvestres ocorrem com frequência, dizimando populações ameaçadas. As vacinas vivas atenuadas são seguras para cães, mas seu uso não é aconselhado em espécies altamente suscetíveis à infecção pelo CDV. Também os relatos de surtos de cinomose em cães supostamente vacinados levantam a hipótese de que as vacinas disponíveis no mercado podem não ser eficientes frente a algumas cepas de campo. Com o objetivo de gerar dados acerca dos mecanismos de evolução do CDV e desenvolver e testar a eficácia de uma vacina bivalente inativada contra o vírus da raiva (RABV) e CDV a presente tese será apresentada na forma de dois artigos científicos. Ainda, um artigo de revisão sobre os modelos animais utilizados para obtenção de informações sobre o vírus do sarampo utilizando a infecção de CDV em furões e cães foi publicada e será apresentada na presente tese. No primeiro artigo, foi analisada a ocorrência de recombinação homóloga em genomas de CDV e detectou-se oito possíveis vírus recombinantes, incluindo um evento de recombinação entre uma cepa de campo e uma cepa vacinal atenuada, sugerindo que o uso de vacinação com vírus vivo atenuado pode influenciar a evolução do CDV. No segundo trabalho, uma vacina recombinante bivalente inativada baseada em RABV expressando as glicoproteínas do envelope do CDV, hemaglutinina e proteína de fusão, mostrou-se eficiente na proteção contra infecção por CDV em furões quando utilizado um protocolo prime/boost. Finalmente, foi publicada uma revisão de literatura sobre os modelos animais utilizados para obtenção de informações sobre a patogênese do vírus do sarampo utilizando a infecção com o vírus da cinomose. / Canine distemper virus (CDV) is an important pathogen of domestic dogs and wild carnivores. CDV infection is globally relevant and it is associated with high morbidity and mortality. In several countries, distemper is considered controlled by vaccination, however, in Brazil it is still endemic, mainly due to the large number of non-domiciliated animals. In addition, outbreaks in dogs and various species of wild animals occur frequently, decimating threatened populations. Live attenuated vaccines are safe for dogs, but their use is not advised in species that are highly susceptible to CDV infection. Also, reports of canine distemper in supposedly vaccinated dogs raise the hypothesis that commercially available vaccines may not be effective against some wild type strains. In order to investigate the mechanisms of CDV evolution and to develop and assess the efficacy of an inactivated bivalent vaccine against rabies virus and CDV, this thesis will be presented in the form of two scientific papers. Furthermore, a review article on the animal models used to gain information on measles virus using CDV infection in ferrets and dogs has been published and will be presented in this thesis. In the first paper, the occurrence of homologous recombination in CDV genomes was analyzed and eight possible recombinant viruses were detected, including a recombination event between a wild type strain and an attenuated vaccine strain, suggesting that the use vaccines based on attenuated live virus may influence CDV evolution. In the second study, an inactivated bivalent recombinant vaccine based on RABV expressing CDV envelope glycoproteins, hemagglutinin and fusion protein, proved to be effective in protecting against CDV infection in ferrets when using a prime/boost protocol. Finally, a literature review was published on the animal models used to obtain information on the pathogenesis of measles virus using infection with canine distemper virus.

O gênero Pestivirus da família Flaviviridae, compreende vírus de genoma RNA fita simples e polaridade positiva que comumente estão associados a infecções em ruminantes e suídeos. Possui quatro espécies reconhecidas: o vírus da diarreia viral bovina tipo 1 (BVDV-1), o BVDV-2, o vírus da doença da fronteira (BDV) e o vírus da peste suína clássica (CSFV). Além disso, possui possíveis espécies atípicas, sendo o vírus ‘HoBi’-like a mais reconhecida na literatura. Com o objetivo de gerar mais informações acerca da epidemiologia molecular de pestivírus no País e dos mecanismos na evolução de vírus do gênero, o presente trabalho será apresentado sob a forma de seis artigos científicos. Os trabalhos visam a caracterização de pestivírus detectados em bovinos e javalis no Rio Grande do Sul, a identificação de cepas resultantes de provável recombinação homóloga, a análise das variantes virais intrahospedeiro (quasispécies) de animais infectados pelo vírus ‘HoBi’-like, e a comparação da multiplicação in vitro de diferentes cepas de pestivírus em cultivos celulares oriundos de diferentes raças bovinas. No primeiro trabalho, amostras de soro bovino de animais do Rio Grande do Sul foram obtidas junto ao serviço veterinário oficial e submetidas a RT-PCR para detecção de pestivírus seguida de sequenciamento e análise filogenética das amostras positivas, onde 57,6% foram classificadas como BVDV-1 e 42,4% como BVDV-2, sendo constada frequência elevada de BVDV-2 quando comparada a outras regiões no mundo. No segundo trabalho, 40 amostras de javalis cativos obtidas de abatedouro foram testadas utilizando metodologia semelhante a anteriormente mencionada, e foi possível a detecção de uma amostra positiva, que foi classificada como BVDV-2, sendo a primeira evidência molecular do BVDV em javalis na literatura. No terceiro artigo científico, foi pesquisado a ocorrência de recombinação homóloga, utilizando metodologia in silico, em sequências de pestivírus presentes em banco de dados públicos, onde foram descritos novos possíveis eventos de recombinação entre BVDV-1a e BVDV-1b, BVDV-2a e BVDV-2b e CSFV-2.2 com outro genogrupo indefinido. No quarto e quinto trabalhos, animais persistentemente infectados com o vírus ‘HoBi’-like foram gerados experimentalmente e, utilizando RT-PCR seguida de clonagem, sequenciamento e análises in silico, a composição e variações intrahospedeiro das quasispécies virais em circulação foram avaliadas, onde foi possível observar que características individuais do hospedeiro são importantes na seleção de variantes virais e que a nuvem de mutantes aumenta com o passar do tempo, não havando quasispécie dominante. Por fim, no sexto artigo científico, a multiplicação de cepas de BVDV-1a e 1b, BVDV-2a e vírus ‘HoBi’-like foram avaliadas in vitro em células de cultivo primário obtidas de gado europeu, zebuíno e raça mista e comparadas utilizando modelos estatísticos, onde foi possível a observação de ausência de diferenças entre as raças (P=0,88), mas presença de diferença entre indivíduos da mesma raça (P˂0,05). Os resultados aqui apresentados somam informações acerca da epidemiologia molecular, biologia e evolução dos pestivírus, sendo importantes para embasar futuras campanhas de controle e erradicação das doenças causadas por pestivírus. / The genus Pestivirus of the family Flaviviridae, comprises single stranded RNA-viruses that are commonly associated with infections in ruminants and swine. It has four recognized species: bovine viral diarrhea virus 1 (BVDV-1), BVDV-2, border disease virus (BDV) and classical swine fever virus (CSFV). It also has putative atypical species where the ‘HoBi’-like virus is the most highlighted in the literature. In order to generate more information about molecular epidemiology of pestiviruses and important mechanisms in the evolution of the virus genus, this work will be presented in six scientific articles form. The works aimed in the characterization of pestivirus detected in cattle and wild boar in Rio Grande do Sul state, identification of strains resulting from putative homologous recombination, analysis of intrahost viral variants (quasispecies) of animals infected with ‘HoBi’-like viruses, and the comparison of in vitro growth of different pestivirus strains in cell cultures derived from different cattle breeds. In the first study, bovine serum samples of cattle from Rio Grande do Sul state were collected by the official veterinary service and submitted to RT-PCR for detection of pestivirus followed by DNA sequencing and phylogenetic analysis of the positive samples, where 57.6% were classified as BVDV-1 and 42.4% as BVDV-2, which revealed high frequency of BVDV- 2 when compared to other regions worldwide. In the second work, 40 captive wild boar lung samples obtained from slaughterhouse were tested using similar methodology described above, and one sample resulted positive and was classified as BVDV-2, which represented the first molecular evidence of BVDV in wild boars. In the third scientific article, the occurrence of homologous recombination was investigated using in silico methods applied to sequences available in public databases, which are described putative new events between BVDV-1a and BVDV-1b, BVDV-2a and 2b and CSFV-2.2 and undetermined genogroup. In the fourth and fifth studies, animals persistently infected with the ‘HoBi’-like viruses were experimentally generated and using RT-PCR followed by cloning, sequencing and in silico analysis, the composition and intrahost variations of viral quasispecies in circulation were evaluated, where it was observed that individual characteristics of the host are important in the selection of viral variants and the mutant clouds increased overtime. Finally, in the sixth scientific article, the growth of BVDV-1a and 1b, and BVDV-2b, ‘HoBi’-like virus strains were evaluated in vitro using primary cell cultures obtained by taurine, indicine and mixed breed cattle using statistical models, it was possible to observe the absence of differences between cattle breeds (P=0.88), but presence of difference between individuals within the breed (P˂0.05). The results presented herein add information about the molecular epidemiology, biology and evolution of pestiviruses, being important to support future control and eradication programs of diseases caused by pestiviruses.