Orientador: João Pessoa Araújo Júnior / Banca: Camilo Bulla / Banca: Paulo Eduardo Martins Ribolla / Banca: Julio Lopes Sequeira / Banca: Alexandre Secorum Borges / Resumo: O vírus da leucemia felina (FeLV) é um retrovírus que infecta principalmente gatos jovens. Em aglomerados de animais, a infecção pelo FeLV é a que mais contribui para a mortalidade. O emprego de técnicas moleculares de detecção viral permitiu avanços no que diz respeito à caracterização da patogenia e resposta à vacinação. Baseando-se nesses novos resultados, o diagnóstico da infecção deve ser realizado, primeiramente, com um teste de triagem de detecção da proteína de capsídeo p27, e, posteriormente, a confirmação com teste de detecção de DNA proviral. O diagnóstico e separação de animais positivos constituem o mecanismo primordial para conter a disseminação do FeLV. Diante disso, é de grande importância facilitar o acesso e baratear o diagnóstico. A construção de um teste de detecção da p27 baseia-se na produção de anticorpos monoclonais. A técnica de hibridomas é menos prática e demanda mais tempo para a obtenção de resultados satisfatórios quando comparada à técnica de Phage Display. Esta está em franco desenvolvimento e tem ganhado grande aplicabilidade na medicina veterinária. Empregamos o sistema de Phage Display desenvolvido por Krebber e colaboradores (1997). Primeiramente, foi construída uma biblioteca imune em camundongos, em seguida, foram amplificadas as regiões gênicas variáveis das cadeias leve (VL) e pesada (VH) e ligadas com um Linker de (Gli4Ser)4. Esses fragmentos geneticamente construídos derivados de anticorpos são denominados de single chain variable fragment ou scFv. Os scFvs foram fusionados à pIII e apresentados na superfície de fagos filamentos. Após três ciclos de seleção e enriquecimento contra a p27 recombinante produzida no laboratório, onze scFvs foram selecionados e caracterizados com relação à constituição nucleotídica e de aminoácidos. Dentre eles, o scFv 9 e scFv 70 foram escolhidos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The feline leukemia virus (FeLV) is a retrovirus that infects primarily young cats. In animal clusters, FeLV infection is the largest contributor to mortality. The use of molecular techniques for viral detection has allowed advances with regard to the pathogenicity and response to vaccination. Based on these new findings, the diagnosis of infection should be performed first, with a screening test for detection of p27 capsid protein, and subsequently confirmed with testing for proviral DNA. The diagnosis and segregation of positive animals is the primary mechanism to contain the FeLV spread. Therefore, it is of great importance to facilitate access and lower the diagnosis. The construction of a test for p27 detection relies on monoclonal antibody development. The hybridoma technique is less practical and more time consuming to obtain satisfactory results when compared to Phage Display technology. The latter has been improved rapidly and has gained wide application in veterinary medicine. We employed the Phage Display system developed by Krebber et al. (1997). First, an immune library was built in mice and the variable region of the light and the heavy genes were amplified and connected by a linker of (Gly4Ser)4. This genetically engineered antibody fragments are called single chain variable fragments or scFv. The scFvs were fused to the pIII protein and displayed on the surface of filamentous phages. After three rounds of selection and enrichment against recombinant p27 (produced in the laboratory), eleven scFvs were selected and characterized with respect to nucleotide and aminoacid composition. Among them, scFv 9 and scFv 70 were chosen for subcloning and expression in prokaryotic system for production of heterologous proteins. The scFvs in soluble forms were evaluated for their binding capacity to p27. The scFvs will be employed to the development of an immunoassay for FeLV detect... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A esquistossomose representa um grande problema de saúde pública em regiões tropicais, negligenciado pelas empresas farmacêuticas. Três genes foram selecionados a partir do transcriptoma do S. mansoni para serem caracterizados molecularmente e testados como vacinas. O gene da Carboxipeptidase apresentou altos níveis de transcrição no estágio de cercária e uma variável expressão protéica nos estágios intra-hospedeiros. A proteína recombinante renaturada apresentou baixa atividade. O gene da Esfingomielinase apresentou alto nível transcricional em ovos, sendo expresso em todos os estágios exceto em esquistossômulos de 7 dias e fêmeas. O gene da Fosfatase Alcalina apresentou elevada transcrição em cercária, mas a expressão da proteína se eleva somente no estágio de esquistossômulo. A imunização de camundongos com cada uma das três proteínas recombinantes expressas em E. coli não levou à redução da carga parasitária após desafio. Estes resultados demonstram que diversas características de um antígeno são necessárias para que este seja um bom candidato vacinal. / Schistosomiasis is a major public health problem in tropical areas and neglected by most of the pharmaceutical companies. Three genes were selected from S. mansoni transcriptome to be molecularly characterized and tested as vaccines. The Carboxypeptidase gene showed high transcription levels in cercariae stage and a variable protein expression in intra-host stages. The refolded recombinant protein showed limited activity. The Sphingomyelinase gene showed the highest level of transcriptional activity in the egg stage and the protein is expressed in all stages but 7-day old schistosomula and females. The Alkaline Phosphatase gene showed a high transcriptional activity in cercariae stage with most of the mRNA being translated into protein as soon as it penetrates its definitive host. Immunization of mice with each of the three proteins did not show reduction in worm burden recovery after challenge. These results demonstrate that several characteristics of an antigen are important for it to be considered a good vaccine candidate.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-02-27T17:20:49Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - José Vitor Ferreira Alves - 2014.pdf: 3685107 bytes, checksum: fe9f9fed0534abe30c80c9eb985428e4 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-02-27T17:20:59Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - José Vitor Ferreira Alves - 2014.pdf: 3685107 bytes, checksum: fe9f9fed0534abe30c80c9eb985428e4 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-27T17:20:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - José Vitor Ferreira Alves - 2014.pdf: 3685107 bytes, checksum: fe9f9fed0534abe30c80c9eb985428e4 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-04-30 / Leishmaniasis is a group of diseases with distinct clinical, histopathological and immunological characteristics, caused by parasites belonging to the Leishmania genus. The serological tests used until the moment have several limitations. There are a great interest to identify immunogenic proteins of Leishmania to be tested as potential antigens for the development of techniques for the diagnosis of American cutaneous leishmaniasis (ACL). The aim of this study was to produce and purify the recombinant proteins "Leishmania activated C kinase" (rLACK); "Thiol Specific Antioxidant" (TSA), "Leishmania elongation initiation factor" (LeIF) and "Leishmania braziliensis stress inducible protein 1" (LbSTI) to evaluate the antigenicity. The recombinant proteins were produced by recombinant DNA techniques as described by Salay et al. (2007). To perform the ELISA, L.(V.) braziliensis (MHOM/BR/1975/M2903) and L.(L.) amazonensis (IFLA/BR/67/PH8) species were cultivated and the antigenic extracts and recombinant proteins were used as antigens. Sixty serum samples from patients with ATL assisted at Anuar Auad hospital, Goiânia, Goiás, were assayed, and from them, 45 were from patients with localized cutaneous leishmaniasis (LCL) and 15 were from mucosal leishmaniasis (ML). To analyze the specificity of the response of total extract and the recombinant proteins, sera from patients with other pathologies were tested. The total extract of L. (L.) amazonensis, rLACK, rTSA, rLbSTI and rLeIF showed a sensitivity of 85%, 75%, 70%, 76.7% and 56.1% respectively. The specificity of total extract of L. (L.) amazonensis, rLACK, rTSA, rLbSTI, rLeIF were 72.5%, 80%, 60%, 30% and 62.5% respectively. Thus, these results showed that recombinants proteins and total extract of L. (L.) amazonensis were antigenic and the total extract of L. (L.) amazonensis and rLACK were the antigen that had the best sensibility and specificity. / As leishmanioses compreendem um grupo de doenças que apresentam características clínicas, histopatológicas e imunológicas distintas, é causada por parasitos intracelulares que pertencem ao gênero Leishmania. Os testes sorológicos utilizados até o presente, para o diagnóstico, apresentam várias limitações e por isto é de grande importância identificar proteínas imunogênicas da Leishmania, para que sejam testadas como potenciais antígenos para o desenvolvimento de técnicas para o diagnóstico da leishmaniose tegumentar americana (LTA). O objetivo deste estudo foi produzir e purificar as proteínas recombinantes “Leishmania activated C kinase” (rLACK); “Thiol Specific Antioxidant” (TSA), “Leishmania elongation initiation factor” (LeIF) e “Leishmania braziliensis stress inducible protein 1” (LbSTI) e avaliar a sua antigenicidade. As proteínas recombinantes foram produzidas pela técnica de DNA recombinante segundo descrito por Salay et al. (2007). Para a realização do ELISA foram cultivadas as espécies L. (V.) braziliensis (MHOM/BR/1975/M2903) e L. (L.) amazonensis (IFLA/BR/67/PH8) e seus extratos antigênicos e as proteínas recombinantes produzidas foram utilizados como antígenos. Foram utilizadas 60 amostras de pacientes com LTA, atendidos no hospital Anuar Auad, Goiânia, Goiás, sendo que destas, 45 eram de pacientes com leishmaniose cutânea localizada (LCL) e 15 eram de leishmaniose mucosa (LM). Para a análise da especificidade foram utilizados o soro de pacientes com outras patologias. O extrato total de L. (L.) amazonensis, rLACK, rTSA, rLbSTI, rLeIF apresentarem sensibilidade de 85%, 75%, 70%, 76,7%, e 56,1% respectivamente. O extrato total de L. (L.) amazonensis, rLACK, rTSA, rLbSTI, rLeIF obtiveram especificidade de 72,5%, 80%, 60%, 30% e 62,5%, respectivamente. Os resultados do presente trabalho demonstraram que as proteínas recombinantes e o extrato total de L. (L.) amazonensis foram antigênicas e o extrato total de L. (L.) amazonensis e a rLACK foram os antígenos que tiveram as melhores sensibilidades e especificidades.

O sequenciamento genômico da L. interrogans sorovar Copenhageni e os avanços das análises bioinformáticas permitiram a identificação de seis novos candidatos vacinais. Esses genes de Leptospira foram submetidos a ensaios de conservação do DNA genômico, RNA mensageiro e proteína nativa correspondente em doze sorovares de Leptospira, nos quais o gene LIC11469 foi o mais conservado. As proteínas recombinantes rLIC11469 e rLIC11030 foram purificadas por cromatografia de afinidade a metal, e submetidas a ensaio de dicroísmo circular. Em ensaios de localização celular pudemos observar a presença das proteínas nativas correspondentes na membrana externa de Leptospira. Ensaios de adesão mostraram a ligação da proteína rLIC11469 à laminina e ao plasminogênio. Ensaios de imunização e desafio demonstraram que a proteína rLIC11030 conferiu proteção contra infecção letal de L. interrogans em hamsters. Ambas as proteínas apresentaram reatividade com anticorpos presentes em soros de pacientes com leptospirose, sugerindo sua expressão durante a infecção. / The genomic sequencing of the L. interrogans serovar Copenhageni and the advances of bioinformatics analysis allowed the identification of six new vaccine candidates. These genes were subjected to genomic DNA, mRNA and native protein conservation assays in twelve serovars from Leptospira, and the gene LIC11469 was the most conserved among these serovars. The recombinant proteins rLIC11469 and rLIC11030 were purified by metal affinity chromatography, and subjected to circular dichroism. Through cellular localization assays we could observe the presence of the corresponding native proteins on the outer membrane of Leptospira. In adhesion assays, the protein rLIC11469 showed binding to laminin and plasminogen. Immunization and challenge assays showed that the protein rLIC11030 afforded protection against lethal leptospiral inoculation in hamsters. Both proteins showed reactivity against sera of patients diagnosed with leptospirosis, suggesting that these proteins are probably expressed during infection.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-09-23T13:40:05Z No. of bitstreams: 2 Sousa, Eduardo Martins.pdf: 2216793 bytes, checksum: b28a546dbb9489fa820abe22bc2b6109 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-09-23T15:17:05Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Sousa, Eduardo Martins.pdf: 2216793 bytes, checksum: b28a546dbb9489fa820abe22bc2b6109 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-09-23T15:17:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Sousa, Eduardo Martins.pdf: 2216793 bytes, checksum: b28a546dbb9489fa820abe22bc2b6109 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2013-03-27 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Tuberculosis is a re-emerging infectious disease that remains a major public health problem worldwide. Although there is the BCG vaccine that is effective against severe forms of childhood TB, in adults its efficacy is variable (0-85%). In this context there is a need to develop new vaccines to control the spread of TB. This thesis proposes the development of a new recombinant fusion M. tuberculosis protein (Ag85C-MPT51-HspX) by molecular cloning, expression in E. coli with a histidine tag and purified by ion exchange chromatography. The fusion protein was constructed successfully, expressed in E. coli BL21 and purified. Tests in mice were performed to evaluate the immunogenicity of the recombinant fusion protein Ag85C-MPT51-HspX of M. tuberculosis. Mice were immunized three times with the protein Ag85C-MPT51-HspX formulated with CpG-DNA encapsulated in liposomes, CpG-DNA encapsulated in liposomes, liposome or saline as negative control and the humoral and cellular immune response was evaluated. The immunization with the vaccine formulation induced the production of high titers of specific anti-fusion protein Ag85C-MPT51-HspX IgG1 = 3.08 ± 0.04; IgG2a = 3.10 ± 0.03) and, favored the increase of specific CD4+ IFN-γ (2.14% ± 0.17), CD4+ TNF-α (2.16 ± 0.34%). The recognizing of this protein by seric IgG and IgM discriminated patients with active TB infection from healthy individuals. We conclude that CMX protein has potential to be used for the development of vaccine against M. tuberculosis as well also for TB diagnostic kits. / A tuberculose é uma doença infecciosa re-emergente que permanece como um dos maiores problemas de saúde pública mundial. Embora exista a vacina BCG que é eficiente contra formas graves de TB na infância, em adultos a eficácia é variável (0 a 85%). Nesse contexto existe a necessidade do desenvolvimento de novas vacinas para controlar a disseminação da TB. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver uma nova proteína de fusão recombinante (Ag85C-MPT51-HspX) de M. tuberculosis a partir da clonagem molecular, expressão em E. coli com uma cauda de histidina e purificação através de cromatografia de troca iônica. A proteína de fusão foi construída com sucesso expressa em E. coli BL21 e purificada. Ensaios em camundongos foram realizados para avaliar a imunogenicidade da proteína recombinante de fusão Ag85C-MPT51-HspX de M. tuberculosis. Os camundongos foram imunizados três vezes com a proteína Ag85C-MPT51-HspX formulada com CpG-DNA encapsulada em lipossoma, CpG-DNA encapsulado em lipossoma, lipossoma ou salina como controle negativo e a resposta imune humoral e celular foi avaliada . A imunização com a formulação vacinal induziu a produção de altos títulos de anticorpos específicos anti-proteína de fusão Ag85C-MPT51-HspX (IgG1 =3,08±0,04; IgG2a=3,10±0,03), bem como, favoreceu o aumento de células T CD4+IFN-γ (2,14%±0,17), CD4+TNF-α (2,16%±0,34) específicas. A avaliação do reconhecimento desta proteína de fusão tanto por IgM quanto IgG humana sérica permitiu discriminar pacientes com tuberculose ativa de controles saudáveis, demonstrando a antigenicidade desta molécula em humanos. Conclui-se que a proteína CMX poderá ser testada tanto como vacina, assim como para o desenvolvimento de testes de diagnóstico para a tuberculose.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A frutalina, lectina α-D-galactose ligante, foi expressa e processada num sistema heterÃlogo para expressÃo de proteÃnas utilizando a levedura metilotrÃfica Pichia pastoris. Para atingir os objetivos esperados foram desenvolvidas trÃs estratÃgias: identificar o gene que codifica para a frutalina a partir do DNA genÃmico obtido de folhas de A. incisa; sintetizar, por uma empresa especializada, o gene que codifica para as cadeias polipeptÃdicas da frutalina, otimizando-o para a expressÃo em P. pastoris e isolar o gene que codifica para a frutalina, a partir do mRNA presente em sementes maduras e frescas, para obtenÃÃo do cDNA utilizando a tÃcnica da RT-PCR. Enquanto na primeira estratÃgia, foi obtido apenas o gen da cadeia beta, nas duas outras estratÃgias o gen completo foi obtido. No entretanto, a estratÃgia que mostrou melhor expressÃo da frutalina recombinante em P. pastoris foi a da obtenÃÃo do gene que codifica para a frutalina, a partir do mRNA. A expresÃo foi tempertura dependente e a frutalina recombinante apresentou uma massa molecular aparente de 17 kDa, sugerindo a presenÃa do peptÃdeo de ligaÃÃo e da cauda de histidina. / Frutalin, the Artocarpus incise alfa-D-galactose binding seed lectin was expressed and processed in a heterologous system for protein expression, using the metilotrophic yeast Pichia pastoris. In order to obtain the proposed objectives, three strategies were followed: identify the frutalin gene from the genomic DNA, obtained from the leaves; obtain, from the GenScript Corporation, the synthetic frutalin polypeptide chains gene, optimized for expression in Pichia system; and isolate frutalin gene, from mRNA present in fresh seeds in order to obtain the cDNA, using the RT-PCR technique. The obtained genes were inserted in the Pichia genome, in order to evaluate the lectin expression. While in the first strategy only the beta chain gene was obtained, in the other two the complete frutalin gene was obtained. The best results were obtained from the third strategy. The expression process was temperature dependent, with the optimum at 18 οC and the recombinant frutalin showed an apparent molecular mass of 17 kDa, which suggest the presence of both the linker peptide and the histidine tag.

Os IFN-&alpha;2 são atualmente utilizados em terapia de hepatite B e C, leucemia, mieloma múltiplo, leucemia de células pilosas, melanoma, sarcoma de Kaposi, linfoma folicular e carcinoma de células renais, em associação ou não com outras drogas. Este trabalho descreve um processo de produção, purificação e caracterização de interferon-&alpha;2a secretado para o espaço periplasmico de E. coli utilizando um vetor baseado no uso constitutivo do promotor lambda PL. Foi validada também uma análise em cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC) para monitoração do processo. Dessa forma, este trabalho descreve inicialmente um método de RP-HPLC para análise qualitativa e quantitativa de interferon-&alpha;2a e interferon-&alpha;2b. O método foi desenvolvido e validado quanto à recuperação, precisão, linearidade, sensibilidade e especificidade. O teste de recuperação indicou erro menor que 1 % e as determinações quantitativas intra-dia e inter-dia apresentaram desvio padrão relativo sempre menores que 4 %, enquanto a sensibilidade experimental foi de 0,3 &mu;g (RSD = 5 %). Em relação à linearidade, o coeficiente de correlação assumiu o valor de 0,998 (p<0,0001), para o intervalo de massa analisada de 0,62 a 10 &mu;g de interferon. Essa metodologia permite a aplicação de RP-HPLC como uma ferramenta poderosa para monitoração de níveis de expressão e qualidade do interferon-&alpha;2 durante ou logo após a fermentação. A temperatura ótima de expressão foi avaliada nos intervalos de 30 a 42 °C, em cultivo em erlenmeyer. As produções volumétrica e específica foram maiores para temperaturas iguais ou superiores a 35 °C. Dessa forma, considerando a potencial degradação da proteína recombinante induzida pela temperatura, a temperatura ótima para a expressão de interferon neste processo foi definida como 35 °C. Os maiores valores de produção específica e volumétrica obtidos, em produção em erlenmeyer, foram 1,04 &mu;g/mL/A600 e 3,45 mg/L, respectivamente. Foi padronizado um método de purificação laboratorial, em duas etapas: uma cromatografia de troca iônica, seguida de uma etapa de cromatografia de exclusão molecular. A pureza final e a recuperação em massa foram de, respectivamente, 95,3 % e 66 %. O produto final também foi caracterizado por meio de análise em SDS-PAGE, western blotting, espectrometria de massas, HPLC de exclusão molecular e HPLC em fase reversa. / IFN-&alpha;2 is currently utilized in hepatitis B and C, leukemia, multiple myeloma, hairy cell leukemia, melanoma, Kaposi\'s sarcoma, follicular lymphoma, and renal cell carcinoma therapy, with or without other drugs. In this work, a process for E. coli periplasmic interferon-&alpha;2a production and purification utilizing a lambda PL promoter based on constitutive expression was proposed. As a tool for production monitoring, reversedphase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) analysis directly from periplasmic extract was validated. Thus, initially it was described a RP-HPLC methodology for qualitative and quantitative analysis of recombinant human interferon-&alpha;2a and interferon-&alpha;2b. The method has been set up and validated for accuracy, precision, linearity, sensitivity and specificity. A recovery test indicated a bias of less than 1% and intra-day and inter-day quantitative determinations presented relative standard deviations always < 4 %, while experimental sensitivity was 0.3 &mu;g (RSD = 5 %). Regarding to linearity, the coefficient of determination was 0.998 (p<0.0001), for a range of analyzed interferon mass from 0,62 to 10 &mu;g. This rapid methodology allows the application of the RP-HPLC as a powerful tool to monitor the production yield and quality of periplasmic Interferon &alpha;2 right after, or even during the fermentation. The optimum expression temperature was evaluated in flask cultures from 30 to 42 °C. It was observed that the volumetric and specific production were higher for culture temperatures equal or above 35 °C. Thus, considering the potential recombinant protein degradation induced by temperature, 35 °C was well-marked as the optimum temperature for interferon expression. The higher values for specific and volumetric production in culture flasks were 1.04 &mu;g/mL/A600 and 3.45 mg/L respectively. As purification method, it was utilized ionic chromatography followed by size-exclusion chromatography. The final purity and mass recovery was, respectively, 95.3 % and 66 %. The final product was also characterized utilizing SDS-PAGE, western blotting, reversed-phase HPLC, size-exclusion HPLC and mass spectrometry analysis.

O Plasmodium vivax é a espécie causadora de malária de maior distribuição mundial e maior prevalência nas Américas. A complexidade do ciclo de vida do parasito e sua extensa diversidade antigênica têm dificultado a obtenção de uma vacina eficaz e inferem que seja pouco provável que este objetivo seja alcançado utilizando um único antígeno. Neste contexto, a combinação de regiões imunodominantes de antígenos de um ou mais estágios do ciclo de vida do Plasmodium pode ser uma estratégia com melhor prognóstico na indução de resposta imune protetora e duradoura contra a atividade parasitária. Este trabalho avaliou a imunogenicidade, em camundongos, de uma formulação vacinal composta pela mistura dos antígenos CSP, pré-eritrocítico e AMA-1, o qual é expresso em ambos os estágios, préeritrocítico e eritrocítico assexuado. A proteína quimérica yPvCSAllFL, que contém epítopos para células B da região central (repeats) das 3 variantes alélicas PvCSP-VK210, PvCSP-VK247 e PvCSP-P. vivax-like fusionados, e a yPvAMA-1 foram expressas com sucesso em leveduras Pichia pastoris e purificadas por métodos cromatográficos para a imunização de camundongos BALB/c e C57BL/6, na presença do adjuvante Poly(I:C), agonista de TLR3. Por ELISA, foram determinados os títulos de anticorpos, as subclasses de IgG e a avidez destes pelas proteínas indutoras, administradas isoladamente ou em combinação. A resposta de anticorpos anti-yPvCSAllFL mostrou ser linhagem dependente, tendo sido observado altos títulos de anticorpos IgG (106) em C57BL/6, os quais se mantiveram elevados por até 6 meses após a última dose. Os anticorpos anti-yPvCSAllFL, predominantemente IgG1, foram capazes de reconhecer proteínas representando as 3 variantes alélicas. No geral, a coadministração dos antígenos yPvCSAllFL e yPvAMA-1 não comprometeu a resposta de anticorpos individual. Utilizando este protocolo de vacinação não foi possível detectar resposta proliferativa de células TCD3+TCD4+ ou TCD3+TCD8+ específicas após a estimulação com yPvCSAllFL. Os índices de proliferação (8,31%) e o padrão de secreção das citocinas IFN-&#947;, IL-2, TNF-&#945; e IL-10, associados à yPvAMA-1, sofreram redução com a coadministração de antígenos (6,33%) e alteração, com elevação de IL-2 em detrimento das demais citocinas. Os dados gerados no estudo das formulações vacinais apresentadas neste trabalho podem ser úteis para o desenvolvimento de uma vacina anti-P. vivax, principalmente por explorarem estratégias de combinação e fusão de antígenos. / Plasmodium vivax is the species of malaria more widely distributed worldwide and with higher prevalence in the Americas. The complexity of the parasite life cycle and its extensive antigenic diversity have hampered the achievement of an effective vaccine and infer that it is unlikely that this goal will be achieved using a single antigen. In this context, the combination of immunodominant regions of antigens of one or more stages of the Plasmodium life cycle can be a strategy with better prognosis at inducing protective and durable immune responses against this parasite. Our study assessed the immunogenicity of vaccine formulations consisting of mixture of antigens CSP, pre-erythrocytic and AMA-1, which is expressed in the both stages, pre-erythrocytic and erythrocytic asexual, in mice. The chimeric protein yPvCSAllFL, which contains B-cell epitopes of the central region (repeats) of the 3 allelic variants PvCSP-VK210, PvCSP-VK247 and PvCSP-P. vivax-like fused, and the yPvAMA-1 were successfully expressed in the yeast Pichia pastoris and purified by chromatographic methods for immunization of BALB/c and C57BL/6 mice in the presence of the adjuvant Poly(I:C), a TLR3 agonist. By ELISA, we determined the titles, IgG subclasses and the avidity of the antibodies to these proteins, administered alone or in combination. The immune response to yPvCSAllFL proved to be dependent on mouse strain, having been observed high titers of IgG antibodies (106) in C57BL/6, which remained high for up to 6 months after the last dose. Anti-yPvCSAllFL antibodies, predominantly IgG1, were able to recognize proteins representing the 3 allelic variants. In general, the co-administration of yPvCSAllFL and yPvAMA-1 antigens did not compromise the individual antibodies response. Using this vaccination protocol, we could not detect cell specific proliferative responses of TCD3+TCD4+ or TCD3+TCD8+ after stimulation with yPvCSAllFL. The proliferation (8.31%) and the pattern of secretion of cytokines IFN-&#947;, IL-2, TNF-&#945; and IL-10, associated with the yPvAMA-1, were reduced during the co-administration (6.33%) and compensated by the elevation of IL-2. The data generated on the study of vaccine formulations presented in this thesis may be useful for the development of a vaccine anti-P. vivax, mainly by exploiting strategies of combination and fusion of antigens.

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:16:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007-Catia Marques da Costa.pdf: 899456 bytes, checksum: b8d00f84cefd48cf338e385b27121da0 (MD5) Previous issue date: 2007-02-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Anaplasma marginale (Ricktsialles: Anaplasmataceae) is a ricketsial hemoparasite responsible for causing great economic losses in cattle from tropical and subtropical regions. The objectives of this work were to produce the recombinant membrane proteins AM254, VirB9 and VirB10 and to evaluate its possible antigenicity. The genes am254, virB9 and virB10 were submitted to various experiments and were , linked to pET47 (b) plasmid. After the certification of the recombinant plasmid (pET-47-am254, pET-47-virB9 and pET-47- virB10), it was transformed into E. coli Rosetta cells for expression. The recombinant proteins produced, were analyzed by Western blot assay where the reaction of the anti-histidin monoclonal antibody against rAM254 (47kDa), rVirB9 (31kDa) and rVirB10 (60kDa) was observed. After the confirmation of the production of recombinant proteins the indirect Enzyme-Linked Immnunosorbent Assay (ELISA) was standardized with sera previously confirmed by PCR and ELISA (rMSP1 and rMSP5). The averages of the optic densities (OD) of the positive sera were of 1.339; 1.288 and 1.240 and of the negative sera of 0.470, 0.324 and 0.414 for AM254, VirB9 and VirB10 respectively with significant difference to the level of 5% between positives and negatives for each recombinant protein. The study demonstrated that the proteins rAM 254, rVirB9 and rVirB10 of A. marginale are recognized by sera of bovines immunized by different Brazilian isolates of the ricketsia (homologous and heterologous), showing the antigenicity potential of these proteins. / Anaplasma marginale (Ricktsialles: Anaplasmataceae) ? uma riquetsia intraeritroc?tica, respons?vel por ocasionar grandes perdas econ?micas na pecu?ria bovina das regi?es tropical e sub-tropical. O objetivo desse trabalho foi produzir as prote?nas de membrana recombinantes AM254, VirB9 e VirB10 e avaliar sua poss?vel antigenicidade. Os genes am254, virB9 e virB10 foram submetidos a v?rios procedimentos experimentais at? serem ligados ao plasm?deo pET-47b(+). Ap?s a certifica??o do plasm?deo recombinante (pET-47bam254, pET-47b-virB9 e pET-47bvirB10) este foi transformado em E. coli Rosetta para express?o. As prote?nas recombinantes produzidas foram analisadas pelo ensaio Western blot onde foi observada a rea??o do anticorpo monoclonal anti-histidina contra rVirB9 (31kDa), rVirB10 (60kDa) e rAM254 (47kDa). Ap?s a confirma??o da produ??o das prote?nas recombinantes realizou-se a padroniza??o do ensaio de imunoadsor??o enzim?tica (ELISA) indireto com soros oriundos de sangue total previamente confirmados por PCR; os mesmos soros tamb?m foram testados por ELISA (rMSP1 e rMSP5). As m?dias das densidades ?pticas (DO) dos soros positivos foram de 1,339; 1,288 e 1,240 e dos soros negativos de 0,470, 0,324 e 0,414 para AM254, VirB9 e VirB10 respectivamente com diferen?a significativa ao n?vel de 5% entre positivos e negativos para cada prote?na recombinante. O estudo demonstrou que as prote?nas rAM 254, rVirB9 e rVirB10 de A. marginale s?o reconhecidas por soros de bovinos imunizados com diferentes isolados brasileiros da riqu?tsia (hom?logo e heter?logos), revelando o potencial antig?nico dessas prote?nas.

Streptococcus pneumoniae é um importante agente causador de pneumonia, meningite e septicemia. O alto custo e a cobertura limitada da vacina conjugada atual reforçam a necessidade de se desenvolver uma vacina mais abrangente e acessível. A proteína de superfície de pneumococo A (PspA) é imunogênica e protetora em modelos animais; porém, devido à sua diversidade - há 6 clados e 3 famílias de PspA - uma vacina baseada em PspA deverá incluir fragmentos das duas famílias prevalentes (1 e 2). Neste estudo, foram produzidos fragmentos contendo a região N-terminal de PspA das famílias 1 e 2, e proteínas híbridas - contendo fusões destes fragmentos. Os anticorpos gerados contra os híbridos reconheceram PspAs nativas das duas famílias, foram capazes de se ligar a bactérias íntegras, e de aumentar a deposição de complemento em sua superfície. Finalmente, a imunização de camundongos com os híbridos foi capaz de proteger contra desafio com pneumococos contendo PspAs diversas, mostrando que estes seriam candidatos promissores na composição de uma vacina anti-pneumocócica. / Streptococcus pneumoniae is an important cause of pneumonia, meningitis and septicaemia. The high cost and limited coverage of the available conjugate vaccine reinforce the need for cost effective strategies, with broader coverage. Pneumococcal Surface Protein A (PspA) is immunogenic and protective in animal models; however, due to its diversity - there are six clades and threee families of PspA - a PspA based vaccine should include fragments of each major family (1 and 2). In the present study, we have produced fragments of the N-terminal region of PspAs families 1 and 2, and hybrid proteins - containing fusions of these fragments. Sera made against the hybrids induced antibodies that recognized PspAs from both families; these sera were also able to bind pneumococcal strains bearing diverse PspAs, and to increase complement deposition on their surface. Finally, immunization of mice with PspA hybrids was protective against challenge with pneumococci bearing diverse PspAs, showing that these hybrids should constitute promising candidates in an anti-pneumococcal vaccine.