O papilomavirus humano (HPV) é o agente etiológico da infecção sexualmente transmissível mais comum na população mundial. A prevalência da infecção por HPV é estimada em 660 milhões de pessoas e mais de 50% das mulheres serão acometidas pela infecção ao menos uma vez na vida. O HPV é responsável por virtualmente todos os casos de câncer de colo de útero (99%), além de causar muitos outros tipos de câncer de mucosa. O câncer cervical afeta aproximadamente 1.4 milhões de mulheres e 500 mil novos casos surgem anualmente, resultando em 250 mil mortes por ano. Os maiores índices de incidência são observados na América Latina e na África. Duas vacinas contra o HPV são comercializadas desde 2006 por empresas estrangeiras. Entretanto, o custo mínimo da vacinação é superior a 600 reais. Este preço torna sua incorporação pelo sistema de saúde um processo economicamente inviável. Dessa forma, devem ser buscadas alternativas para a produção de uma vacina eficaz, de qualidade e de baixo custo no Brasil. A proteína L1, principal proteína do capsídeo do HPV, tem a propriedade de se auto agregar em partículas semelhantes às virais (VLPs), que são o principal componente das vacinas atuais e possuem muita semelhança com os vírions nativos, introduzindo inclusive, uma imunização predominantemente tipo-específica. Este projeto se propôs a construir e avaliar vetores de expressão visando à produção em larga escala da proteína L1 do HPV 16, o tipo de HPV de maior risco e incidência na população mundial. Foram construídos cinco plasmídeos para Pichia pastoris, uma das principais plataformas industriais de expressão. Eles se diferenciam pelos marcadores de seleção e pelas sequências de manutenção do vetor, mas têm exatamente o mesmo objetivo: gerar sistemas que possuam múltiplas cópias do gene da L1 e que não necessitem da utilização de antibióticos. Essa estratégia foi escolhida porque a produtividade de muitas das proteínas heterólogas tem grande dependência da dosagem gênica e porque o uso de antibióticos encarece muito o custo da produção. Na primeira etapa do projeto foi avaliado um sistema de expressão epissomal auxotrófico, mas ele não se manteve estável ao longo de 60 gerações. Na segunda parte, dois vetores de integração ao sítio do DNA ribossomal foram testados. O sistema mais estável e produtivo foi caracterizado quanto ao número de cópias integradas ao genoma da P. pastoris e ao nível de expressão. O sistema é capaz de produzir clones com mais de 30 cópias do gene da L1 e dois clones expressaram cerca de 20 a 30 miligramas/litro de L1. Adicionalmente outros dois vetores integrativos que utilizam sequências teloméricas para integração foram construídos. Ainda são necessários estudos conjuntos de fermentação em larga escala e purificação da proteína para verificar a viabilidade do sistema / The human papillomavirus (HPV) is the etiologic agent of the sexually transmitted infection most common worldwide. The prevalence of HPV infection is estimated at 660 million people and over 50% of women will be affected by the infection at least once in their lifetime. HPV is responsible for virtually all cervical cancers cases (99%), and causes many other types of mucosal cancer. Cervical cancer affects approximately 1.4 million women, and 500.000 new cases occur annually, resulting in 250.000 deaths per year. The highest incidence rates are seen in Latin America and Africa. Two HPV vaccines are marketed since 2006 by foreign companies. However, the minimum cost of vaccination is higher than 360 dollar. This price makes its incorporation by the Brazilian Health System economically unfeasible. Thus, alternatives must be found to produce an effective vaccine, with low cost and high-quality in Brazil. The L1 protein, the major capsid protein of HPV, has the ability to self aggregate into virus-like particles (VLPs) which are the main component of current vaccines. The VLPs are very similar to the native virions and can introduce an immunization predominantly type-specific. This project aimed to construct and evaluate expression vectors to produce, at large scale, the L1 protein of HPV 16, which is the HPV type at greater risk and incidence in the world. Five plasmids were constructed for Pichia pastoris, one of the major industrial expression platforms. They differ in the selection markers and the vector maintenance sequences, but they have exactly the same goal: to create systems with multiple copies of the L1 gene and that don\'t require the use of antibiotics. This strategy was chosen because the productivity of many heterologous proteins have heavy dependence on gene dosage and because the use of antibiotics is extremely expensive for its production. In the first stage of the project, it was rated an episomal auxotrophic expression system, but it was unstable after a period of 60 generations. In the second part, two vectors for integration in the ribosomal DNA locus were tested. The most stable and productive system was featured on the number of copies integrated into the P. pastoris genome and on the expression level. It was proved that the system is able to produce clones with more than 30 copies of the L1 gene and two clones expressed approximately 20-30 milligrams/liter of L1. Additionally, two other integrative vectors for integration in telomeric sequences were constructed for future testing. More studies on large-scale fermentation and protein purification will be necessary to determine the feasibility of the system.

A leptospirose é uma doença sistêmica, causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira. O desenvolvimento de novas estratégias para prevenir a doença é necessário. Vacinas surgem como fortes candidatas para contornar o problema. As pesquisas atuais têm interesse em identificar antígenos conservados que estão envolvidos nas interações patógeno-hospedeiro.O presente projeto selecionou três proteínas hipotéticas de L. interrogans para serem caracterizadas quanto ao seu papel na patogênese e avaliadas quanto ao seu potencial protetor. Os genes foram amplificados por PCR e clonados no vetor de expressão PAE. As proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade e foram reconhecidas por soro de indivíduos infectados. As proteínas LIC13479 e LIC10050 foram capazes de se ligar a laminina, plasminogênio e fibronectina plasmática. Em relação à LIC10537, dois fragmentos recombinantes foram gerados. Apenas o fragmento 2 foi capaz de interagir com PLG. As proteínas que interagiram com o PLG foram capazes de gerar plasmina As proteínas foram capazes de estimular uma resposta imune e LIC13479 e LIC10050 exerceram proteção parcial no modelo de leptospirose em hamsters. / Leptospirosis is a systemic disease caused by pathogenic bacteria of genus Leptospira. The development of new strategies to prevent the disease is needed. Vaccines emerge as strong candidates to fight the problem.Currently research has focused to identify conserved antigens This project selected three hypothetical proteins of L. interrogans. Thesecoding sequences were characterized for their possible role in pathogenesis and their potential to protect animals against challenge with virulent leptospires. Genes were amplified by PCR and cloned into the expression vector pAE. The recombinant proteins were purified by metal affinity chromatography and were recognized by confirmed human leptospirosis serum samples.LIC13479 and LIC10050 proteins were able to bind with laminin, plasminogen and plasma fibronectin. The coding sequence LIC10537 was cloned in two fragments. Fragment 2was able to interact with plasminogen. All proteins were able to generate active plasmin. The recombinant proteins were able of inducing an immune response. Evaluation of immunoprotection in leptospirosis hamster model followed by challenge with virulent bacteria showed that the recombinant proteins conferred partial protection.

A glicoproteína gp120 do HIV apresenta domínios conservados, dentre os quais está o C4. Este domínio está envolvido no reconhecimento da molécula CD4 na superfície das células alvo, e anticorpos dirigidos contra ele neutralizam o vírus. Em trabalho anterior, este domínio foi introduzido dentro da região globular da proteína fibra do adenovírus. Como a fibra adenoviral é estimulante do sistema imune, decidimos testar a capacidade de indução de anticorpos anti-C4 por essa proteína modificada. Assim, foram construídos vetores plasmídicos e adenovirais portando o gene da região globular da fibra adenoviral contendo o domínio C4, que usados na imunização de camundongos induziram anticorpos capazes de reconhecer a proteína gp120. Também construímos um vetor baculoviral expressando essa proteína híbrida, que purificada por HPLC, foi utilizada para imunizar camundongos que também produziram anticorpos capazes de reconhecer a proteína gp120. Nossos dados sugerem que a região globular da fibra adenoviral é uma boa plataforma para a exposição de epítopos de imunização. / HIV glycoprotein gp120 has conserved domains, one of them being the C4 domain. This region is involved in the recognition of the CD4 marker in target cells and antibodies that recognize this domain can block HIV infection. Previously, the C4 domain was introduced in the adenovirus fiber knob. As the adenovirus fiber stimulates de immune system, we decided to test the production of anti-C4 antibodies by this hybrid protein. We constructed plasmid and adenovirus vectors carrying the fiber knob modified with the C4 domain. Immunization of mice with these vectors showed the production of specific antibodies that recognized de gp120 glycoprotein. Also, we constructed a baculovirus vector expressing the hybrid protein, which was purified by HPLC. Mice immunized with this protein also produced antibodies capable of recognizing gp120. Our data suggest that the fiber knob is a good carrier protein for epitope immunization.

A agalaxia contagiosa é uma doença de notificação obrigatória que causa severas perdas econômicas para produção de ovinos e caprinos mundialmente. Apesar de seu impacto na produção animal, pouco se sabe sobre os fatores de virulência e patogenicidade do M. agalactiae (principal agente etiológico). Desta maneira, o presente estudo possuiu como objetivo a identificação, purificação e caracterização de proteínas antigênicas de M. agalactiae. Para tanto, quatro proteínas de superfície com potencial antigênico (WP_011949419.1, WP_011949418.1 (P40), WP_011949336.1, WP_011949770.1) foram selecionadas. Essas proteínas foram expressas em Escherichia coli e purificadas em coluna de níquel. As proteínas purificadas foram avaliadas quanto a antigenicidade em Western blotting utilizando soros de caprinos naturalmente infectados com M. agalactiae. Todas as proteínas expressas foram imunorreativas aos soros de caprinos naturalmente infectados, demonstrando que as proteínas utilizadas nesse estudo são possivelmente antigênicas e possuem epítopos acessíveis. / The Contagious agalactia is a notifiable disease that causes severe economic losses to sheep and goats worldwide. Despite its impact on animal production, little is known about the virulence factors and pathogenicity of M. agalactiae (main etiological agent). Thus, the present study identified, purified and characterized antigenic proteins of M. agalactiae. Therefore, four surface proteins with antigenic potential (WP_011949419.1, WP_011949418.1 (P40), WP_011949336.1, WP_011949770.1) were selected. These proteins were expressed in Escherichia coli and purified on nickel column. The purified proteins were assayed for antigenicity by Western blotting using goat sera naturally infected with M. agalactiae. All expressed proteins were immunoreactive with sera from naturally infected goats, demonstrating that the proteins used in this study are possibly antigenics and it have acessible epitopes.

O sequenciamento genômico da L. interrogans sorovar Copenhageni e ferramentas de bioinformática nos permitiram selecionar 15 genes que codificam proteínas hipotéticas conservadas preditas de superfície. A conservação foi confirmada por PCR em seis dos sorovares mais predominantes de L. interrogans. As proteínas recombinantes foram clonadas em vetor de expressão de E. coli em fusão com seis resíduos de histidina, que permite a purificação por cromatografia de afinidade a metal. Seis proteínas apresentaram reatividade com anticorpos presentes em soros de pacientes com leptospirose. Através de um ensaio de adesão por ELISA, identificamos uma nova adesina de leptospira, Lsa21, que interage fortemente com laminina, colágeno IV e fibronectina plasmática. Usando a metodologia de Western blotting, identificamos mais nove possíveis adesinas. Nossos ensaios de desafio demonstraram que as proteínas rLIC12730 conferiu proteção contra infecção letal de L. interrogans em hamsters. Nossos dados sugerem que seja um promissor candidato na prevenção da leptospirose. / The whole-genome sequences of L. interrogans serovar Copenhageni and the bioinformatic tools allow us to choose fifteen genes encoding for conserved hypothetical proteins predicted to be exported to the membrane. The chosen genes were amplified by PCR from six predominant pathogenic serovars, the DNA cloned in an E. coli vector, the recombinant proteins expressed in fusion with 6xHis-tag at N-terminus and purified by metal affinity chromatography. Six proteins were recognized by antibodies present in sera from human patients diagnosed with leptospirosis. By ELISA-attachment assay, we have identified a novel adhesion, named Lsa21, that binds strongly to laminin, collagen IV, and plasma fibronectin. By western blotting assay, we have further identified nine novel probable adhesions. The immunization/challenge assays showed that the recombinant protein rLIC12730 afforded protection against lethal leptospiral inoculation in hamsters. Our data suggest that it is a promising candidate for prevention of leptospirosis.

Leptospirose é uma zoonose altamente disseminada causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira. Nos centros urbanos, os roedores são os mais importantes reservatórios da doença. Desde que o controle dos roedores e medidas sanitárias não são facilmente implementadas, o desenvolvimento de uma vacina é necessário para o combate da leptospirose. Desta maneira, os genes LIC10258, LIC12880 e LIC12238 foram selecionados por análises de bioinformática e amplificados do DNA genômico de L. interrogans por metodologia de PCR. A avaliação da capacidade de adesão das proteínas recombinantes com componentes da matriz extracelular mostrou que rLIC10258 interage com a laminina e fibronectina plasmática. Todas as proteínas recombinantes foram capazes de ligar ao plasminogênio e gerar plasmina, mostrando atividade proteolítica específica, enquanto que apenas rLIC12238 foi capaz de ligar ao fibrinogênio. Os resultados obtidos sugerem que estas proteínas podem desempenhar algum papel na patogênese da doença. / Leptospirosis is worldwide zoonosis caused by pathogenic spirochaetes of the genus Leptospira. In the urban settings, rodents are the most important reservoirs. Since the control of the rodents and sanitation measures are not easily implemented, the development of vaccine is necessary to combat the leptospirosis. Thus, the genes sequences of LIC10258, LIC12880 and LIC12238 were selected by bioinformatics analysis and amplified by PCR methodology from genomic DNA of L. interrogans. Evaluation of the adhesion capacity of the recombinant proteins with extracellular matrix components showed that rLIC10258 interacts to laminin and plasma fibronectin. All recombinant proteins were capable to bind plasminogen and to generate plasmin, showing specific proteolytic activity, whereas that only rLIC12238 was capable to bind fibrinogen. The results obtained suggest that these proteins may play a role in leptospiral pathogenesis.

Adenocarcinomas e distroglicanopatias são doenças graves que estão associadas a quadros de hipoglicosilação de mucinas tumorais, como a MUC1 (transmembrane glycoprotein Mucin 1) e de mucinas de ?-distroglicana (?-DG). Um dos mais importantes desafios associados à terapia anti-câncer refere-se ao desenvolvimento de estratégias terapêuticas que permitam o direcionamento da ação de drogas anti-tumorais para a célula cancerosa com o objetivo de evitar o acometimento de células saudáveis. Nessa linha, é crucial a construção de sistemas de liberação de medicamentos sítio específicos por meio de marcadores tumorais. Quanto ao diagnóstico das distroglicanopatias, atualmente este se baseia principalmente na observação de manifestações clínicas, biópsias musculares e medidas enzimáticas, sendo que os anticorpos monoclonais disponíveis no mercado não são específicos para a condição do músculo distrófico. Dessa forma, mucinas tumorais e mucinas de ?-DG modificadas tem sido consideradas potenciais alvos para o desenvolvimento de novas estratégias diagnósticas e/ou terapêuticas aplicáveis a estas doenças. Para este trabalho, foram sintetizados, em fase sólida, glicopeptídeos miméticos de MUC1 e ?-DG hipoglicosilados, os quais foram utilizados como ferramenta de busca por novos anticorpos recombinantes. Estes antígenos foram imobilizados em uma placa e sobre eles foi aplicada uma biblioteca de fragmentos de anticorpos (Fabs) humanos recombinantes para o desenvolvimento do processo de seleção pela tecnologia de Phage Display. Após quatro rounds consecutivos de seleção, os genes codificadores dos Fabs da biblioteca não selecionada e selecionada foram sequenciados e analisados in silico na plataforma ATTILA. Esta análise permitiu rastrear o enriquecimento dos domínios VH e VL durante a seleção, além de possibilitar a escolha de inúmeros clones para produção. Para este trabalho, quatro fragmentos de anticorpos scFvs recombinantes inéditos para a mucina tumoral MUC1 e ?-DG hipoglicosilados foram desenhados e clonados em vetor de expressão pET29(a) contendo um marcador de identificação (peptídeo FLAG) e outro de purificação (cauda de histidina). A expressão de um scFv recombinante anti-MUC1 foi realizada em E. coli BL21-DE3 pela adição de 0,5mM de IPTG com indução a 20ºC por 16 horas. A purificação foi realizada por cromatografia de afinidade em resina de níquel, seguida de gel filtração, sendo estas etapas monitoradas por SDS-PAGE. A identificação imunoquímica da proteína recombinante foi confirmada por Western Blot, utilizando o anticorpo anti-FLAG. Entende-se que este trabalho, por meio da produção de novas ferramentas biotecnológicas, poderá cooperar para o desenvolvimento de novas formas abordagens diagnósticas e/ou terapêuticas para tumores e distroglicanopatias. / Adenocarcinomas and dystroglycanopathies are serious diseases associated with hypoglycosylation of tumoral mucins, such as MUC1 (transmembrane glycoprotein Mucin 1) and ?-dystroglican mucins (?-DG). One of the most important challenges associated with anti-cancer therapy is the development of therapeutic strategies that allow the targeting of anti-tumor drugs to the cancer cell in order to avoid the involvement of healthy cells. In this regard, the construction of site-specific drug delivery systems by tumor markers is crucial. The diagnosis of dystroglicanopathies are currently based on the observation of clinical manifestations, muscle biopsies and enzymatic measures, and the available monoclonal antibodies are not specific for the dystrophic muscle condition. Thus, tumoral mucins and modified ?-DG mucins have been considered potential targets for the development of new diagnostic and/or therapeutic strategies applicable to these diseases. For this work, glycoproteins MUC1 and ?-DG hypoglycosylated mimetics were synthesized by solid phase reaction, and were used as a search tool for new recombinant antibodies. These antigens were immobilized in a plate and a library of recombinant human antibody (Fabs) fragments was applied thereon for the development of the screening process by Phage Display technology. After four consecutive rounds of selection, the Fabs coding genes from the unselected and selected library were sequenced and analyzed in silico on ATTILA platform. This analysis allowed us to track the enrichment of the VH and VL domains during selection process, and also presented several option of clones to choose for production. For this work, four novel fragments of recombinant scFvs antibodies specific for tumoral mucin MUC1 and ?-DG hypoglycosylated were designed and cloned into pET29 (a) expression vector containing an identification marker (FLAG peptide) and a purification tag (histidine tail). Expression of a recombinant anti-MUC1 scFv was performed on E. coli BL21-DE3 by the addition of 0.5 mM of IPTG with induction at 20°C for 16 hours. Purification was performed by affinity chromatography on nickel resin, followed by gel filtration, these steps being monitored by SDS-PAGE. Immunochemical identification of the recombinant protein was confirmed by Western Blot, using the anti-FLAG antibody. It is understood that this work, through the production of new biotechnological tools, could cooperate for the development of new forms of diagnostic and/or therapeutic approaches for tumors and dystroglicanopathies.

O objetivo deste trabalho foi analisar a relação entre estrutura e função dos domínios não catalíticos do HF3, uma metaloproteínase da classe P-III do veneno da Bothrops jararaca com atividades hemorrágica e pró-inflamatória. Mostramos que proteínas recombinantes contendo o domínio rico em cisteínas (domínios tipo-disintegrina/rico em cisteínas, DC, e domínio rico em cisteínas, C) são capazes de aumentar o rolamento de leucócitos na microcirculação e de inibir a agregação plaquetária induzida pelo colágeno. Por outro lado, a proteína D e a proteína DC contendo a mutação Asp/Ala no motif Glu-Cys-Asp não apresentaram estas atividades. Peptídeos derivados da região hiper variável (HVR) do domínio rico em cisteínas também promoveram o rolamento de leucócitos, sendo esta atividade foi inibida por anticorpos anti-aMb2, e ainda inibiram a agregação plaquetária. Em conjunto, estes resultados sugerem que o domínio rico em cisteínas do HF3 e sua HVR desempenham um papel em sua atividade pró-inflamatória mediada pela integrina aMb2, e na inibição da agregação plaquetária. / This aim of this study was analyze the relationship between structure and function of the non-catalytic domains of HF3, a hemorrhagic and pro-inflammatory metalloproteinase of the P-III class, from Bothrops jararaca venom. Here we show that recombinant proteins of HF3 containing the cysteine-rich domain (disintegrin-like/cysteine rich and cysteine-rich proteins) but not the disintegrin-like protein and a disintegrin-like/cysteine rich protein carrying the mutation Asp/Ala in the Glu-Cys-Asp motif were able to significantly increase leukocyte rolling in the microcirculation and to inhibit collagen-induced platelet aggregation. Peptides from the hyper variable region (HVR) of the cysteine-rich domain also promoted leukocyte rolling and this activity was inhibited by anti-aMb2 antibodies. HVR peptides also inhibited platelet-aggregation. Taken together, these results suggest that the cysteine- rich domain of HF3 and its HVR play a role in triggering pro-inflammatory effects mediated by integrin aM/b2 and in the inhibition of platelet-aggregation.

As bactérias patogênicas do gênero Leptospira são o agente causador da leptospirose, uma doença de importância global. As leptospiras patogênicas causam infecção em um amplo espectro de animais e no homem. As leptospiras podem invadir o corpo humano através de abrasões na pele e mucosa. A invasividade bacteriana depende de várias etapas, tais como: aderência, invasão e disseminação através dos tecidos do hospedeiro. Recentemente, nosso grupo identificou proteínas de membrana externa que atuam como adesinas de leptospira e/ou receptores de componentes do plasma hospedeiro, o que poderia contribuir para a patogenicidade bacteriana. Assim, o presente projeto tem como objetivo avaliar as propriedades funcionais do gene LIC10920, identificado na sequência genômica de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni, como uma proteína hipotética, predita de membrana externa. A sequência LIC10920 foi amplificada por PCR e clonada no vetor de expressão pAE. O plasmídeo pAE contendo o inserto foi introduzido em estirpes de E. coli para a expressão da proteína. A proteína recombinante rLIC10920 foi purificada por cromatografia de afinidade a níquel e sua integridade estrutural foi avaliada pela técnica de dicroísmo circular. Camundongos foram imunizados com a LIC10920 para a avaliação da sua imunogenicidade. A presença de IgG humano contra LIC10920, foi avaliada por ELISA, em amostras de soro de pacientes com leptospirose. Assim, como a sua ligação com componentes da matriz extracelular e plasma do hospedeiro. Animais imunizados apresentaram alto título de anticorpos contra LIC10920. Além disso, a proteína foi reconhecida por anticorpos presente em amostras de soro humano infectado. A proteína foi capaz de interagir com plasminogênio e laminina de maneira dose-dependente e saturável. Em ambas as interações, a participação das regiões imunogênicas se mostrou importante. rLIC10920 foi capaz de capturar o plasminogênio direto do soro humano também de maneira dose-dependente. Por fim, foi observado que o plasminogênio ligado a rLIC10920 pode ser convertido em plasmina. A proteína em estudo é expressa durante a infecção e podemos atribuir a função de adesina, com papel na patogênese da bactéria. / Pathogenic bacteria of genus Leptospira are the causative agent of leptospirosis, a disease of global importance. Pathogenic leptospires cause infection in a broad spectrum of animals and humans. Pathogenic leptospires can efficiently invade the human body through skin and mucosa and promptly spread into blood vessels, reaching target organs. Bacterial invasiveness depends on several steps, such as adherence, invasion and throughout host tissues. Recently, our group has identified outer membrane proteins that act as leptospiral adhesins and/or receptors of host plasma components, which could contribute for bacterial pathogenesis. This project aims to evaluate the functional properties of the gene LIC10920, identified in the genome sequence of Leptospira interrogans serovar Copenhageni, as a predicted outer membrane protein of unknown function. The LIC10920 sequence was amplified by PCR, cloned into the expression vector pAE. Plasmids containing cloned DNA were introduced in E. coli strains for protein expression. The recombinant protein was purified by the metal affinity chromatography and its structural integrity was assessed by circular dichroism spectroscopy. Mice were subcutaneously immunized with LIC10920 for immunogenicity evaluation. The presence of IgG against LIC10920 in confirmed leptospirosis human serum samples was evaluated by ELISA. Binding of protein with extracellular matrix or plasma components was also assessed. Sera from immunized animals show that the rLIC10920 protein is capable to stimulate antibody immune response in mice. In addition, the protein is recognized by antibodies in leptospirosis human serum samples. The recombinant protein was capable of binding plasminogen and laminin. Dose-dependent and saturable binding was observed when increasing concentrations of the rLIC10920 were allowed adhere to a fixed concentration of plasminogen or of laminin, fulfilling the receptor-ligand interactions. In both cases, the participation of the immunogenic regions occurs, but in the case of laminin, the dependence is greater with structured epitopes. It has been shown that plasminogen linked to rLIC10920 can be converted to plasmin in the presence of activator. The recombinant protein was able to capture the plasminogen directly from normal human serum in a dose-dependent manner, suggesting the involvement of native protein in host-pathogen interactions. The protein under study is expressed during the infection and due to its capacity of interaction with host components, we may anticipate its role in leptospiral pathogenesis.

Nos últimos anos, estudamos vários aspectos da resposta imune naturalmente adquirida em indivíduos de diferentes áreas endêmicas da Região Amazônica expostos à malária. Para isso, utilizamos proteínas recombinantes baseadas em antígenos de formas sanguíneas de P. vivax, os quais têm sido considerados candidatos à vacina contra a malária vivax. No presente trabalho, nossos estudos imunoepidemiológicos concentraram-se em 396 indivíduos de uma comunidade rural da Amazônia ocidental brasileira, localizada no Estado do Acre, com o objetivo de realizar um estudo transversal e longitudinal da resposta de anticorpos contra um painel de proteínas recombinantes derivadas de merozoítos de P. vivax (MSP119, AMA-1, MSP3α e MSP3β). Para isso, os soros desses indivíduos foram testados por ELISA quanto ao reconhecimento das quatro proteínas recombinantes. As proporções de indivíduos na linha de base com anticorpos IgG contra MSP119, AMA- 1, MSP3α e MSP3β foram de 59,8%, 50,0%, 23,5% e 26,5%, respectivamente. Dentre esses indivíduos, apenas 10,9% tinham infecções por P. vivax, P. falciparum ou malária mista. No grupo de infectados por P. vivax, a proporção de respondedores foi maior para as proteínas recombinantes MSP119 e AMA-1, atingindo 78,6%, em ambos os casos. A proporção de indivíduos com anticorpos para cada uma das proteínas associou-se com o maior tempo de exposição à malária, exceto para a MSP3β. Além disso, a positividade foi mais alta nas áreas de maior risco de transmissão. Não observamos associações relevantes entre o genótipo do antígeno Duffy dos indivíduos e presença de anticorpos para as proteínas estudadas. No estudo longitudinal, observamos um aumento da prevalência de respondedores durante a parasitemia patente, sendo de 81,9%, 80,9%, 31,9% e 48,9% para a MSP119, AMA-1, MSP3α e MSP3β, respectivamente. Em conclusão, nossos resultados confirmam a alta antigenicidade dessas proteínas, o que pode ser de grande importância para futuros ensaios clínicos na região. / In recent years we studied various aspects of the naturally acquired immune response in individuals from different endemic areas of the Amazon region exposed to malaria. For this purpose we used recombinant proteins based on P. vivax blood stage antigens considered candidates for a vaccine against vivax malaria. In the present study, we focused on 396 individuals from a rural community in western Brazilian Amazon located at the state of Acre. We conducted a transversal and longitudinal study of the antibody response to a panel of recombinant proteins representing P. vivax merozoites surface antigens (MSP119, AMA-1, MSP3α and MSP3β). The sera of these individuals were tested by ELISA for the recognition of the four antigens mentioned above. The proportions of individuals at the baseline with IgG antibodies to MSP119, AMA-1, MSP3α and MSP3β were 59.8%, 50.0%, 23.5% and 26.5%, respectively. Among these individuals, 10.9% had patent malaria infections with either P. vivax or P. falciparum or both. Among individuals with patent P. vivax infection, the frequency of responders was high for MSP119 and AMA-1, (78.6% in both cases). Except in the case of MSP3β, the proportion of individuals with antibodies to each protein correlated with the time of malaria exposure. Also, the positivity was higher in areas of higher transmission levels. No relevant association was found between the Duffy genotypes and presence of antibodies to the different antigen. In longitudinal study, we observed an increased prevalence of responders during patent parasitemia, 81.9% 80.9% 31.9% and 48.9% to MSP119, AMA-1, MSP3α and MSP3β, respectively. In conclusion, our results confirm the high antigenicity of these proteins, which can be of great importance for future clinical trials in the region.