Visando novos estudos com a proteína amilóide sérica A (SAA), propusemos a produção de seu recombinante humano em Escherichia coli, mais especificamente, a isoforma encontrada na fase aguda (A-SAA1) e da constitutivamente expressa (C-SAA4). Realizamos a expressão, identificação e purificação das proteínas recombinantes. Concomitantemente, também avaliamos o efeito da hipóxia na expressão e produção da proteína SAA nativa em linhagens de pré-adipócitos murinos 3T3-L1, não diferenciados e diferenciados e adipócitos humanos. Aparentemente quanto maior o grau de diferenciação celular, maior a expressão e produção da proteína. Para os adipócitos humanos, o perfil de expressão de mRNA da SAA mostra que SAA1>SAA2>SAA4 nas relações 500:150:1. Na hipóxia, há um aumento na expressão de SAA, entretanto não associamos esta expressão a um aumento da concentração da proteína. A importância do reconhecimento de que SAA pode ser umas das proteínas induzidas pela hipóxia em adipócitos é discutida em relação ao seu papel pró-inflamatório. / In order to provide more complex studies with the protein serum amyloid A (SAA), this study proposed the production of its human recombinant in bacteria (Escherichia coli), more specifically, the synthesis of the main isoform found in the acute phase (A-SAA1) and the constitutively expressed (C-SAA4). The expression, identification and purification of the recombinants proteins was performed. Concurrently, we also did a study evaluating the effect of hypoxia in the expression and protein production of native SAA in undifferentiated and differentiated murine preadipocytes 3T3-L1 and humans adipocytes. Apparently, the protein expression and production increases with the cell differentiation degree. For human adipocytes, we demonstrated the mRNA expression profile of SAA, in which SAA1 > SAA2 > SAA4 (500:150:1). In hypoxia, there is an increased expression of SAA, but we could not link it to an increase of protein concentration. The importance of recognizing that SAA may be one of the proteins induced by hypoxia in adipocytes is discussed in relation to the proinflammatory role of this protein.

A leucemia linfóide aguda (LLA) é considerada uma doença grave dos glóbulos brancos, sendo mais comum e mais agressiva em crianças e adolescentes. O tratamento para a LLA tem avançado devido aos estudos para a otimização de drogas já utilizadas em quimioterapias. Entre essas drogas estão as enzimas L- asparaginases (ASPases) que atuam reduzindo a concentração de L-asparagina (Asn) na corrente sanguínea, impedindo a proliferação das células cancerosas, visto que essas não conseguem sintetizar quantidades apropriadas desse aminoácido. No entanto, o medicamento por ser oriundo de um procarioto causa severas reações alérgicas aos usuário, afim de diminuir a imunogenicidade deste quimioterápico, é importante gerar um biofármaco oriundo de um eucarioto. Neste âmbito, obtivemos a Pichia pastoris recombinante responsável pela produção da enzima ASPase intermembranar, oriunda do gene ASP3 de Saccharomyces cerevisiae. Através do planejamento experimental, foi possível ter um aumento de 5 vezes na atividade obtida na condição inicial. O clone Mut+ alcançou sua melhor atividade de 8,6 U/g de célula nas seguintes condições: 20°C, pH inicial 6 e 1,5% de concentração de indutor. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is considered a serious disease of white blood cells, is more common and more aggressive in children and adolescents. Treatment for ALL has advanced due to studies for drug optimization already used in chemotherapy. Among these drugs are the enzymes L-asparaginases (ASPases) which act by reducing the concentration of L-asparagine (Asn) in the bloodstream, preventing the proliferation of cancer cells, since these can not synthesize appropriate amounts of this amino acid. However, the drug to be derived from a prokaryote causes severe allergic reactions to the user, in order to decrease the immunogenicity of the chemotherapy, it is important to generate a biopharmaceutical derived from a eukaryote. In this context, we obtained the recombinant Pichia pastoris responsible for producing the enzyme ASPase intermembrane, coming from the ASP3 gene of Saccharomyces cerevisiae. Through the experimental design, it was possible to have a 5-fold increase in activity obtained at the initial condition. The Mut + clone achieved their best activity of 8.6 U/g cell under the following conditions: 20 °C, initial pH 6 and 1.5% of inducer concentration.

O fator de crescimento transformante beta tipo 1, TGF-β1, é uma proteína extracelular homodimérica secretada por vários tipos celulares, que pode ter ação parácrina ou endócrina. Essa proteína está envolvida em processos celulares de diferenciação, proliferação, mobilidade e formação de matriz extracelular. Além disso, é parte importante dos processos de regeneração tecidual, atuando, de maneira decisiva, no reparo, atraindo macrófagos e fibroblastos para o local da injúria e estimulando a angiogênese. Assim, considerando o papel desse peptídeo no processo regenerativo, o uso de TGF-β1 como proteína terapêutica na área de Bioengenharia Tecidual é bastante promissor. Apesar disso, a venda dessa proteína, para fins terapêuticos, é inexistente no mercado e a proteína recombinante vendida, que só pode ser utilizada em pesquisas científicas, não é produzida nacionalmente e chega a custar R$200.000,00/mg. Nesse contexto, o objetivo do presente trabalho é desenvolver uma metodologia de produção do fator recombinante TGF-β1 em células de ovário de hamster chinês (CHO), visando à obtenção de níveis altos de rendimento, e, futuramente, a transferência da tecnologia de produção para a iniciativa privada, tornando possível seu uso na Medicina Regenerativa, sozinho ou em combinação com outros fatores de crescimento. O cDNA de TGF-β1 foi amplificado a partir de um banco de cDNA humano e clonado no vetor proprietário pNU1 de expressão de mamífero. A construção pNU1/TGF-β1 foi utilizada para transfectar estavelmente células CHO DG44 e uma estratégia de co-amplificação foi utilizada para selecionar células transfectantes com maior número de cópias da sequência correspondente a TGF-β1. Estas culturas foram submetidas ao processo de amplificação gênica com concentrações crescentes de metotrexato. Ensaios de Western Blot e ELISA foram realizados utilizando-se o meio condicionado pelas populações selecionadas e por clones superprodutores. Entre os 41clones obtidos, cinco apresentaram maiores níveis de produção de TGF-β1, entre 1.000 e 2.000 ng/mL. Estes clones foram selecionados para a realização de testes de atividade in vitro utilizando-se células A549, que permitem avaliar a transição epitélio-mesênquima. Um ensaio de cicatrização de feridas em peles do dorso de camundongos foi padronizado e utilizado para avaliar a atividade in vivo do clone que apresentou melhor resultado in vitro. A proteína TGF-β1 foi parcialmente purificada por HPLC em uma coluna de afinidade. Portanto, a proteína TGF-β1 humana recombinante foi produzida, apresentando atividade biológica in vitro e in vivo, sendo capaz de reparar eficientemente feridas cutâneas. Essa iniciativa pode oferecer aos pacientes uma alternativa para o tratamento de lesões teciduais, acelerando a cicatrização de feridas e o reparo de tecidos. / The transforming growth factor beta 1, TGF-β1, is a homodimeric extracellular protein secreted by several cell types, which may have paracrine or endocrine action. This protein is involved in cellular processes of differentiation, proliferation, mobility and formation of extracellular matrix. In addition, it is an important part of the tissue regeneration processes, acting decisively on repair, attracting macrophages and fibroblasts to the site of injury and stimulating angiogenesis. Therefore, considering the role of this peptide in the regenerative process and the use of TGF-β1 as a therapeutic protein in the field of Tissue Bioengineering is very promising. Despite this, the sale of this protein for therapeutic purposes is nonexistent in the market and the recombinant protein available in the market, which can only be used in scientific research, is not produced nationally and the costs are in the order of R$ 200,000.00/mg. In this context, the objective of the present work is to develop a methodology for the production of the TGF-β1 recombinant factor in Chinese hamster ovary (CHO) cells, aiming at obtaining high yields, and, in the future, transfering the production technology to the private initiative, allowing its use in Regenerative Medicine, alone or in combination with other growth factors. The TGF-β1 cDNA was amplified from a human cDNA library and cloned into the proprietary pNU1 mammalian expression vector. The pNU1/TGF-β1 construct was used to stably transfect CHO DG44 cells, and a co-amplification strategy was used to select transfectant cells with the largest number of gene copies. These cultures were subjected to the process of gene amplification with methotrexate. Western Blot and ELISA were used to assay the conditioned medium obtained from the selected cell populations and from overproducing cell clones. Among the 41 clones obtained, five presented higher levels of TGF-β1 production, between 1,000 and 2,000 ng/mL. These clones were selected for in vitro activity testing using A549 cells to evaluate the epithelial-mesenchymal transition. Awound healing assay on mouse dorsal skin was standardized and used to evaluate the in vivo activity of the cell clone which displayed the highest result in vitro. The TGF-β1 protein was partially purified by HPLC on an affinity column. Therefore, the recombinant human TGF-β1 protein was produced and shown to display biological activity both in vitro and in vivo, being able to eficiently repair cutaneous wounds. This initiative may provide patients with an alternative treatment for tissue damage, accelerating wound healing and tissue repair.

A lagarta L. obliqua tem se destacado por apresentar em sua hemolinfa proteínas com atividade biológica demonstrada em cultivos celulares. A literatura disponível não apresenta trabalhos sobre a expressão da proteína antiapoptótica de L. obliqua, então este estudo objetiva a clonagem e expressão da proteína antiapoptótica presente na hemolinfa de L. obliqua, em sistema bacteriano Escherichia coli. O RNAm extraído do tegumento de L. obliqua deu origem a um cDNA obtido por RT-PCR, o qual foi clonado em vetor pCR II-TOPO para posterior transformação de bactérias E. coli JMQC. Na expressão heteróloga, o fragmento foi subclonado em vetor pET28a e transformadas bactérias E. coli BLQC. A indução de expressão foi realizada com IPTG 1 mM. A APLOrEC purificada por cromatografia foi identificada por Western Blot. A atividade biológica da APLOrE foi analisada em células VERO e L929 após indução de morte e verificou-se que esta protegeu os cultivos induzidos com 4mM de H2O2 portanto, eficaz na manutenção estrutural do citoesqueleto destas células. / The caterpillar L. obliqua has become known for performing in their hemolymph proteins with biological activity demonstrated in cell cultures. The available literature does not provide studies on the expression of antiapoptotic protein L. oblique, so this study aims cloning and expression of anti-apoptotic protein present in the hemolymph of L. oblique, bacterial system in Escherichia coli. The extracted mRNA L. obliqua husk gave a cDNA obtained by RT-PCR, which was cloned into pCR II-TOPO vector for subsequent transformation of E. coli bacteria JMQC. The heterologous expression, the fragment was subcloned into pET28a vector and transformed E. coli bacteria BLQC. The induction of expression was performed with 1 mM IPTG. The APLOrEC purified by chromatography was identified by Western blot. The biological activity was examined in APLOrE VERO and L929 cells after death induction, and it was found that this protected crops H2O2 induced with 4mM therefore effective in the structural maintenance of the cytoskeleton of such cells.

Enquanto as células humanas sintetizam purinas pela via de novo e pela via de recuperação, protozoários parasitas as sintetizam somente pela via de recuperação. Por essa razão, as enzimas que compõem essa via são importantes alvos para o desenvolvimento de novas drogas antiparasitárias. A enzima APRT converte adenina e &#945-D-5-fosforibosil 1-pirofosfato (PRPP) a AMP na via de recuperação de purinas. Nesse trabalho, a APRT e a APRT-His recombinantes foram caracterizadas por métodos bioquímicos e espectroscópicos. As expressões do gene aprt contidos nos vetares pET29+ (Novagen) e pQE30 (Qiagen) renderam 5 e 10 mg.mL-1 de APRT e APRT-His, respectivamente, na forma solúvel. A APRT permaneceu estável e homogênea in vitro em Tris pH 7,5 contendo 5 mM de MgSO4 e 150 mM de KCl mas a APRT-His mostrou-se instável e insolúvel nesse pH e acima de 0,5 mg.mL-1. O estudo de solubilidade revelou que a APRT-His é parcialmente estabilizada em Tris pH 8,5 contendo 150 mM de KCl devendo ser purificada e mantida nesse tampão durante os ensaios espectroscópicos e a adição de 50 mM de histidina mostrou-se eficiente para a concentração da enzima até 8mg.mL-1. A caracterização bioquímica da APRT e da APRT-His revelou que elas são diméricas nos seus tampões e têm PI igual a 6,45 &#177 0,20 e 7,7 &#177 0,16, respectivamente. Os ensaios de atividade enzimática indicaram que a APRT é duas vezes mais ativa do que a APRT-His. Os espectros de CD da APRT-His foram mais intensos do que os espectros da APRT e mostraram perfil de hélice &#945 . Os resultados da desconvolução revelaram que a APRT-His tem cerca de 10% mais hélice-&#945 do que a APRT. O valor de teor de estrutura secundária da APRT equivale aos valores extraídos dos dados cristalográficos da APRT de L donovani e de L tarentolae. Os espectros de emissão de fluorescência mostraram que a APRT-His e a APRT possuem máximos de emissão em 342 e 332 nm, respectivamente. Além disso, eles indicaram que o PRRP e o AMP suprimem a fluorescência do Trp presente na APRT. A supressão foi relacionada à posição dos ligantes localizados no sítio ativo da enzima e a ausência de supressão nas amostras de APRT-His foi relacionada à presença de Mg2+. Os resultados indicam que a presença dos resíduos de histidina na região N-terminal da APRT-His induziu a modificação estrutural da enzima levando a precipitação contínua. Nesse sentido, a ausência dos resíduos de histidina incorporados à enzima favoreceu a estabilidade da proteína in vitro. / Human cells synthesize purine nucleotide by again and salvage pathways, while parasitic protozoa use only salvage pathways. For this reason, the enzymes that compound the salvage pathway are important targets to development of new antiparasitic drugs. The enzyme adenine phosphoribosyltransferase (APRT) converts adenine and &#945-D-5-phosphoribosyll-pyraphosphate (PRPP) to adenosine monophosphate (AMP) at salvage pathway. In this work, the APRT and APRT-His recombinants had been characterized by biochemical and spectroscopic methods. The expression of the aprt genes from L. tarentolae inserted into pET29+ (Novagen) and pQ30 (Qiagen) vectors yielded 5 and 10 mg.mL-1 of the APRT and APRT-His, on soluble form, respectively. The APRT remained stable and homogeneous in vitro at Tris pH 7.5 containing 5 mM MgSO4 and 150 mM KCl, but APRT-His was instable and insoluble above 0.5 mg.mL-1 at the same pH. The solubility study showed that histidine increased the APRT-His solubility and it is partially stabilized at Tris pH 8.5 containing 150 mM KCl. The addition of the histidine 50 mM was efficient for concentrations up to 8 mg.mL-1.Then, the APRT-His was purified and storage in that buffer for spectroscopic assays. The biochemical characterization of the APRT and APRT-His indicated that a both are dimercs in its buffers, and they have isoelectric points at pH 6.45 &#177 0.20 and 7.7 &#177 0.16, respectively. By enzymatic activity assays, the APRT is twice activer than APRT-His. The CD spectra of the APRT-His were more intense than the APRT spectra. and showed helix &#945 profile. The fluorescence spectra marked a maximum emission fluorescence at 342 nm for the APRT-His and 332 um for the APRT. In addition, the spectra revealed that PRPP and AMP quenched the fluorescence of the tryptophan (Trp) into APRT. The quench was related to position of the ligands inside active site of the enzyme and the absent of fluorescence of the Trp, inside APRT-His, was related to absent of the Mg2+. The results has demonstrated that the presence of the histidine residues at N-terminal region of the APRT-His induced to conformational changes of the enzyme following to continuos precipitation. In the same sense, the absent of histidine residues associated to enzyme favored to stability of the protein in vitro.

O HIV-1 é o agente etiológico da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) e o HTLV-I da leucemia/linfoma de célula T no adulto (ATL) e da paraparesia espástica tropical ou mielopatia associada ao HTLV (HAM/TSP), principalmente. Ambos são retrovírus com genoma RNA e possuem o gene gag que codifica as proteínas p24 (HIV-1 e HTLV-1) e p19 (HTLV-1) que formam o capsídeo e a matriz do vírus, respectivamente, e o gene env que codifica as proteínas gp41 e gp120 (HIV-1) e gp21 e gp46 (HTLV-1) que compõem o envelope viral. Os primeiros anticorpos produzidos nas infecções por ambos os vírus são destinados a essas proteínas e os diferentes testes diagnósticos disponíveis no mercado usam uma combinação dessas proteínas virais. O diagnóstico precoce é de extrema importância para o controle da epidemia, tratamento dos indivíduos e planejamento dos gastos com saúde pública. Os kits diagnósticos usados em laboratórios clínicos, bancos de sangue e hospitais brasileiros para o diagnóstico destas viroses são na sua maioria de empresas estrangeiras e o Brasil despende milhares de reais importando esses materiais. No Brasil, há a necessidade e incentivo para a produção de sistemas de diagnóstico com tecnologia nacional. Neste trabalho, os genes das proteínas p24, gp41 e gp120 do HIV-1 e p19 do HTLV-1 foram clonados com sucesso em diferentes vetores e em diferentes linhagens de E. coli, porém essas proteínas não foram expressas. As proteínas gp21, p24 e gp46 do HTLV-1 foram produzidas em bactérias BL21(DE3) com vetor pET28a(+). Essas três proteínas foram solubilizadas dos corpos de inclusão, purificadas por IMAC e identificadas pelas técnicas de Western Blotting e por espectrometria de massas. As proteínas recombinantes gp21, p24 e gp46 foram reconhecidas pelos soros de indivíduos com HTLV-1 e não foram reconhecidas por soros de indivíduos com HIV-1 e saudáveis, o que confere a elas especificidade e grande potencial diagnóstico. Os resultados deste trabalho são os primeiros passos para atingir o objetivo maior de produzir todas as sete proteínas em maior escala e, por fim, chegar a produção de um kit diagnóstico sensível, específico e barato com tecnologia nacional, diminuindo os gastos com a importação destes produtos e fomentando a indústria biotecnológica nacional. / HIV-1 is the etiologic agent of acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and HTLV-I is the cause of adult T-cell leukemia/lymphoma (ATL) and HTLV-I-associated myelopathy or tropical spastic paraparesis (HAM/TSP). Both are retroviruses with RNA genome and possess the gene gag and env. The gag gene encodes for p24 protein (HTLV-1 and HIV-1) and p19 (HTLV-1) forming the viral capsid and matrix, respectively, and the env gene encodes for proteins gp120 and gp41 (HIV-1) and gp21 and gp46 (HTLV-1) making the viral envelope. The first antibodies produced in infections by both viruses are against these proteins and the various diagnostic tests on the market use a combination of those viral proteins. Early diagnosis is extremely important to control the epidemia, treatment of individuals and planning of public health expenditures. The diagnostic kits used in clinical laboratories, blood banks and in Brazilian hospitals for the diagnosis of these viruses are mostly from foreign companies. Brazil spends thousands of reais importing these materials. In Brazil, there is a need and incentive for the production of diagnostic systems with national technology. In this study, the genes of p24, gp41 and gp120 of HIV-1 and p19 of HTLV-1 have been successfully cloned in different vectors and different strains of E. coli, but these proteins were not expressed. The proteins gp21, gp46 and p24 of HTLV-1 were produced in bacteria BL21 (DE3) with vector pET28a (+). These three proteins were solubilized from inclusion bodies, purified by IMAC and identified by Western blotting techniques and mass spectrometry. The recombinant proteins gp21, p24 and gp46 were recognized by sera from patients with HTLV-1 and were not recognized by sera from individuals with HIV-1 and healthy people, which gives them great specificity and diagnostic potential. These results are the first steps to achieve the ultimate goal of producing all seven proteins on a larger scale and finally get the production of a diagnostic kit sensitive, specific and cheap with national technology, reducing spending on imports of these products and fostering the national biotechnology industry.

Submitted by Ubirajara Cruz (ubirajara.cruz@gmail.com) on 2017-06-07T14:31:32Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Ana Muñoz Vianna.pdf: 2420695 bytes, checksum: 23ce0fe8a151274827065f7b3c62e03a (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-06-08T13:00:55Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Ana Muñoz Vianna.pdf: 2420695 bytes, checksum: 23ce0fe8a151274827065f7b3c62e03a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-08T13:00:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Ana Muñoz Vianna.pdf: 2420695 bytes, checksum: 23ce0fe8a151274827065f7b3c62e03a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-02-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / A theileriose, doença endêmica no Brasil, é uma piroplasmose causada pelo protozoário intraeritrocitário, Theileria equi. Provoca perdas associadas tanto a fatores clínicos como a restrição ao trânsito de animais soropositivos. A transmissão de T. equi ocorre principalmente no repasto do carrapato, o qual inocula suas formas infectantes (esporozoítos) nos equídeos, que são os hospedeiros vertebrados. O diagnóstico e a prevenção desta enfermidade se fazem necessários em áreas endêmicas e não endêmicas devido à disseminação dos vetores e do protozoário e de sua alta prevalência. Diferentes plataformas de ELISAs têm sido desenvolvidas com a utilização de antígenos recombinantes. A proteína de superfície de merozoíto EMA-2 é liberada no citoplasma e na membrana do eritrócito, sugerindo ser um dos primeiros antígenos reconhecidos pelo sistema imune. O objetivo desse estudo foi avaliar a proteína EMA-2 de Theileria equi, expressa em Pichia pastoris, como imunobiológico. Após expressão da glicoproteína EMA-2 foi desenvolvido um ELISA indireto. O ELISA demonstrou sensibilidade de 90,9% e especificidade de 83,3% quando comparado ao kit comercial de cELISA. A proteína também demonstrou imunogenicidade ao testarmos soros de camundongos imunizados com EMA-2 recombinante, por imunofluorescência. Sendo a proteína EMA-2 antigênica e imunogênica, poderá ser usada, além dos testes de diagnóstico, como antígeno para o desenvolvimento de vacinas de subunidade. / Theileriosis, endemic disease in Brazil, is a piroplasmosis caused by intra-erythrocytic protozoan, Theileria equi. Causes losses associated with both clinical factors and restriction on the movement of positive animals. Transmission of T. equi occurs mainly during tick feeding which inoculates their infective forms (sporozoites) in horses, which are the vertebrate hosts. The diagnosis and prevention of this disease is needed in endemic and non endemic areas due to the presence of vectors and protozoa. Different ELISAs platforms have been developed using recombinant antigens. EMA-2 is released into the cytoplasm and erythrocyte membrane, suggesting that one of the first antigens recognized by the immune system. The aim of this study was to evaluate the EMA-2 protein of Theileria equi, expressed in Pichia pastoris, as immunobiological. After expression of EMA-2 glycoprotein, an indirect ELISA was developed. The ELISA demonstrated sensitivity of 90.9% and specificity of 83.3% when compared to the commercial kit cELISA. The protein also showed immunogenicity when test the sera of immunized mice with recombinant EMA-2 by immunofluorescence. As the EMA-2 protein antigenic and immunogenic, it may be used diagnostic tests as well as a promising antigen for the development of subunit vaccines.

A leucemia linfóide aguda (LLA) é considerada uma doença grave dos glóbulos brancos, sendo mais comum e mais agressiva em crianças e adolescentes. O tratamento para a LLA tem avançado devido aos estudos para a otimização de drogas já utilizadas em quimioterapias. Entre essas drogas estão as enzimas L- asparaginases (ASPases) que atuam reduzindo a concentração de L-asparagina (Asn) na corrente sanguínea, impedindo a proliferação das células cancerosas, visto que essas não conseguem sintetizar quantidades apropriadas desse aminoácido. No entanto, o medicamento por ser oriundo de um procarioto causa severas reações alérgicas aos usuário, afim de diminuir a imunogenicidade deste quimioterápico, é importante gerar um biofármaco oriundo de um eucarioto. Neste âmbito, obtivemos a Pichia pastoris recombinante responsável pela produção da enzima ASPase intermembranar, oriunda do gene ASP3 de Saccharomyces cerevisiae. Através do planejamento experimental, foi possível ter um aumento de 5 vezes na atividade obtida na condição inicial. O clone Mut+ alcançou sua melhor atividade de 8,6 U/g de célula nas seguintes condições: 20°C, pH inicial 6 e 1,5% de concentração de indutor. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is considered a serious disease of white blood cells, is more common and more aggressive in children and adolescents. Treatment for ALL has advanced due to studies for drug optimization already used in chemotherapy. Among these drugs are the enzymes L-asparaginases (ASPases) which act by reducing the concentration of L-asparagine (Asn) in the bloodstream, preventing the proliferation of cancer cells, since these can not synthesize appropriate amounts of this amino acid. However, the drug to be derived from a prokaryote causes severe allergic reactions to the user, in order to decrease the immunogenicity of the chemotherapy, it is important to generate a biopharmaceutical derived from a eukaryote. In this context, we obtained the recombinant Pichia pastoris responsible for producing the enzyme ASPase intermembrane, coming from the ASP3 gene of Saccharomyces cerevisiae. Through the experimental design, it was possible to have a 5-fold increase in activity obtained at the initial condition. The Mut + clone achieved their best activity of 8.6 U/g cell under the following conditions: 20 °C, initial pH 6 and 1.5% of inducer concentration.

Submitted by Verena Bastos (verena@uefs.br) on 2015-09-21T13:18:11Z No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO FINAL ALINE THOMAZ.pdf: 1680438 bytes, checksum: 85bf2d7886a394df745618b6fd50d435 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-09-21T13:18:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO FINAL ALINE THOMAZ.pdf: 1680438 bytes, checksum: 85bf2d7886a394df745618b6fd50d435 (MD5) Previous issue date: 2015-09-27 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / The vitamin D receptor (VDR) is a cytoplasmic transcription factor and when activated by its ligand, translocates to the nucleus and interacts with DNA in the promoter regions with which has affinity, acting as a modulator of gene transcription and thereby producing multiple biological effects. Its main activities are the regulation and maintenance of plasma levels of calcium and phosphorus, as well as presenting immunomodulatory activities, such as the suppression of T cell activation, formation of secretion patterns of cytokines, modulation of proliferation and interference in the apoptosis. So this receptor is an important target for drugs that can help in the discovery of new immunomodulators. The present work had the objective to produce the recombinant vitamin D receptor in its soluble form for conducting future assays of drug screening of potential immunomodulators and drug-receptor interaction studies. For this, we used initially Escherichia coli expression system transformed with the plasmid HS_VDR_EC1-PQE T7, but it was only possible to obtain the protein in the insoluble fraction, even varying the temperature, time of induction and IPTG concentration. In an attempt to obtain soluble VDR, we used a eukaryotic expression system in insect cells using the baculovirus as a vector. It was built a vector, pFASTBacHT_VDR, which had the sequence of this protein cloned from pCMX.VDR. From there, it was possible to obtain recombinant bacmids used in transfection of insect cells, generating recombinant baculovirus, to then proceed with the expression of VDR. / O receptor de vitamina D (VDR) ? um fator de transcri??o g?nica citoplasm?tico e, quando ativado pelo seu ligante, transloca-se para o n?cleo e interage com regi?es promotoras no DNA com a qual apresenta afinidade, atuando como fator modulador da transcri??o g?nica e assim produzindo m?ltiplos efeitos biol?gicos. Suas principais atividades s?o a regula??o e a manuten??o dos n?veis plasm?ticos de c?lcio e f?sforo, e apresenta atividades imunomoduladoras, como a supress?o da ativa??o de c?lulas T, forma??o de padr?es de secre??o de citocinas, a modula??o da prolifera??o e interfer?ncia na apoptose. Sendo assim, esse receptor representa um importante alvo de drogas que pode contribuir na descoberta de novos f?rmacos com a??o imunomoduladora. O presente trabalho teve, como objetivo, produzir o VDR recombinante na forma sol?vel para a realiza??o de futuros ensaios de triagem de potenciais drogas com a??o imunomoduladora e estudos de intera??o droga-receptor. Para isso, foi utilizado, inicialmente, o sistema de express?o em Escherichia coli, utilizando o plasm?deo HS_VDR_EC1-PQE T7, por?m s? foi poss?vel obter a prote?na na fra??o insol?vel, mesmo variando a temperatura, o tempo de indu??o e a concentra??o de IPTG. Na tentativa de obter o VDR sol?vel, foi utilizado um sistema de express?o eucari?tico em c?lulas de inseto, utilizando como vetor o baculov?rus. Foi constru?do um vetor pFASTBacHT_VDR, o qual teve a sequ?ncia desta prote?na clonada a partir do pCMX.VDR. A partir da?, foi poss?vel obter bacm?deos recombinantes, utilizados na transfec??o de c?lulas de inseto, gerando baculov?rus recombinantes, para, ent?o, seguir com a express?o do VDR.

The wide diversity of plant secondary products results from different modifications undergone during biosynthesis, including glucosylation. These modification reactions result in production of the compounds actually found in plants and to unique chemical and biochemical properties, including some bitter compounds in grapefruit. While the presence of a PSPG box motif allows for identification of a clone as a putative glucosyltransferase (PGT), diversity of GT primary structures makes it difficult to accurately assign specific function. Our approach is to identify and isolate putative GT clones, express them heterologously, and biochemically characterize the proteins. Eleven putative GT clones have been isolated from Citrus paradise and some have been biochemically characterized. The current hypothesis being tested is that PGT3 and PGT9 clones are plant secondary product GTs. Due to issues with inclusion bodies when using E. coli, proteins were expressed in Pichia pastoris using the pPICZA vector. Recombinant protein expression was confirmed by Western blot and proteins were enriched by IMAC. Over 30 flavonoid and simple phenolic substrates, representing many compounds found in grapefruit, were screened for activity with PGT3 and PGT9 proteins. No significant activity was found and the biochemical function of the proteins encoded by these clones will be further investigated.