O sistema SOS controla a expressão de diversos genes, muitos envolvidos com o reparo de DNA. Caulobacter crescentus vem emergindo como um modelo alternativo interessante para o estudo de mecanismos de reparo de DNA. Temos como objetivos realizar uma análise funcional de genes de função desconhecida regulados por SOS, e investigar a indução de SOS por antibióticos beta-lactâmicos em C. crescentus. Análises funcionais dos genes CC_3424 e CC_3467 mostraram que deleções nestes genes resultam em fenótipo de sensibilidade à mitomicina C (MMC). CC_3424 possui similaridade com glioxalases e CC_3467 com endonucleases. Acreditamos que CC_3467 atue no reparo de ligações intercadeia no DNA, e que CC_3424 atue detoxificando a MMC das células. Estudos dos efeitos biológicos da indução do sistema SOS mostram que a cefalexina (CFE) induz este regulon em concentrações subinibitórias. Células tratadas com CFE apresentam mais danos oxidativos do tipo 8-oxoguanina. Estes resultados mostram que concentrações subinibitórias de CFE resultam em estresse oxidativo em C. crescentus. / The SOS response controls the expression of several genes, many of which are involved in DNA repair mechanisms. Caulobacter crescentus has emerged as an alternative bacterial model for DNA repair. As aims, we will undertake a functional analysis of some of the genes regulated by the SOS response, and will investigate the SOS induction by beta-lactam antibiotics in C. crescentus. Functional analysis of the genes CC_3424 and CC_3467 showed that deletions in these genes result in a phenotype of sensitivity to mitomycin C (MMC). CC_3424 has similarity to glyoxalase and CC_3467 to endonucleases. We believe that the CC_3467 gene plays a role in the repair of interstrand crosslinks in the DNA, while CC_3424 acts in MMC cellular detoxification. Studies of biological effects of SOS induction showed that subinibitory concentrations of cephalexin (CFE) induce the SOS regulon. Cells treated with CFE have higher concentrations of 8-oxoG oxidative damage. These results show that subinibitory concentrations of cephalexin leads to cellular oxidative stress in C. crescentus.

Pseudomonas aeruginosa é um patógeno humano que tem preocupado a comunidade científica pelo aumento da resistência antimicrobiana. Os efeitos provocados pelos antimicrobianos podem levar à ativação de respostas mutagênicas que regulam polimerases de baixa fidelidade, atuando na Síntese Translesão de DNA (TLS). Neste trabalho, avaliamos a resposta de P. aeruginosa frente à Ceftazidima e Ciprofloxacina. Foi observado que Ceftazidima não induz a resposta SOS e mutagênese, diferentemente de Ciprofloxacina. Demonstramos que as três polimerases de TLS estão envolvidas na mutagênese induzida por Ciprofloxacina e peróxido de hidrogênio. Também, observamos que a perda de qualquer uma das polimerases alterou significativamente o espectro de mutações espontâneas e induzidas por Ciprofloxacina e que possuem funções redundantes neste processo mutagênico. Assim, demonstramos que as polimerases de TLS são importantes para a mutagênese induzida por Ciprofloxacina em P. aeruginosa, e podem estar implicadas na mutagênese adaptativa e, consequentemente, na resistência bacteriana. / Pseudomonas aeruginosa is a human pathogen that has worried the scientific community by increasing antimicrobial resistance. The effects caused by the antimicrobial agents may lead to the activation of mutagenic responses that regulate low fidelity polymerases, acting in DNA Transmission Synthesis (TLS). In this work, we evaluated the response of P. aeruginosa to Ceftazidime and Ciprofloxacin. It has been observed that Ceftazidime does not induce the SOS response nor mutagenesis, unlike Ciprofloxacin. We show that the three TLS polymerases are involved in the mutagenesis induced by Ciprofloxacin and hydrogen peroxide. Also, we observed that the loss of any of the polymerases significantly altered the spectrum of spontaneous mutations induced by Ciprofloxacin and that have redundant functions in this mutagenic process. Thus, we have shown that TLS polymerases are important for Ciprofloxacin-induced mutagenesis in P. aeruginosa, and may be implicated in adaptive mutagenesis and consequently bacterial resistance.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é um patógeno relacionado ao desenvolvimento de quadros de diarréia aguda ou persistente. A resposta inflamatória induzida por EAEC está relacionada à liberação de interleucina 8, que atua estimulando a transmigração de neutrófilos através do epitélio. Os macrófagos, de forma similar aos neutrófilos, são células fagocíticas que produzem espécies reativas de oxigênio (ERO), como o peróxido de hidrogênio (H2O2). Neste trabalho, avaliamos as consequências da interação de diferentes cepas clínicas com macrófagos humanos ativados da linhagem U-937. Todas as cepas testadas apresentaram filamentos nos testes de aderência aos macrófagos, diferentemente do que ocorre na interação com outras linhagens celulares como HEp-2, T84 e Caco-2. O ferro é um microelemento essencial para bactérias, sendo utilizado como cofator de enzimas e que também pode participar da geração de ERO através da reação de Fenton. Considerando-se a possibilidade de que o H2O2 produzido pelos macrófagos possa gerar radical hidroxil através da reação de Fenton, testes de aderência foram realizados com as amostras cultivadas na presença do captador de ferro 2,2-dipiridil. Tal fato não suprimiu a formação de filamentos, entretanto diminuiu a aderência das cepas EAEC 042 e 17-2. Com o objetivo de produzir uma resposta adaptativa ao H2O2, as culturas bacterianas foram pré-tratadas com uma dose sub-letal de H2O2 por 60 minutos antes de aderirem aos macrófagos. Nossos resultados mostraram que o pré-tratamento também não inibiu o aparecimento de filamentos em relação às culturas não tratadas. Além disto, foi observado que o pré-tratamento com o H2O2 reduziu a aderência das amostras de EAEC ao tapete celular. A filamentação é uma das respostas SOS, induzida pela presença de danos e/ou bloqueio na síntese da molécula de DNA. Com o objetivo de verificar se o H2O2 produzido pelos macrófagos estaria causando danos induzindo o sistema SOS e a filamentação bacteriana, foram realizados testes de viabilidade com mutantes derivados de E. coli K12 deficientes em enzimas do reparo por excisão de bases (BW535) e na resposta SOS (DM49). Nossos resultados mostram que os mutantes apresentaram os níveis de sobrevivência semelhantes ao observado para cepa selvagem isogênica (AB1157). Todos estes resultados em conjunto indicam que o H2O2 não é o indutor da filamentação nos testes de aderência. Macrófagos ativados apresentam ação microbicida através da ação da enzima indolamina dioxigenase (IDO), associada à redução do aminoácido L-triptofano. Desta forma, realizamos testes qualitativos de aderência de EAEC aos macrófagos suplementando o meio de interação com este aminoácido. Nossos resultados mostram que a adição de triptofano ao meio de interação reduz o número de filamentos por campo. Desta forma, aventamos a hipótese de que a depleção do triptofano seja responsável pela indução de resposta SOS, tendo como conseqüência a filamentação das bactérias. / Enteroaggregative Escherichia coli is a pathogen related to cases development of acute or persistent diarrhea. The inflammatory response induced by EAEC is linked to induction of IL-8 release, which acts stimulating neutrophils diapedesis through the epithelium. Macrophages, similarly to neutrophils, are phagocytic cells that produce reactive oxygen species (ROS), such as H2O2. Iron is an essential microelement to bacteria, been used as cofactor of enzymes in fundamental cellular processes but it is involved in ROS generation through Fenton reaction. On this report we evaluated the consequences of different EAEC strains interaction with activated human macrophages (U937 lineage). All tested strains showed filaments on the adherence tests with macrophages, unlike to what occurs in the interaction with other cellular lineages as HEp-2, T84 e Caco-2. Considering the possibility of H2O2 macrophage produced generates hydroxyl radical through Fenton reaction, the strains were grown in medium containing iron chelator 2,2-dipiridil. Iron chelation did not suppress filamentation, however decreased the adherence of 042 e 17-2 strains. Strains pretreated with a H2O2 subletal dose (60 M) by 60 minutes, which resulted in a bacterial adaptative response, also did not decrease the filamentation associated to adherence beside H2O2 pretreatment decreased the adherence of EAEC strains tested. In order to verify if H2O2 induces filamentation through DNA lesions and SOS induction, we evaluated the survival of a triple mutant deficient in three enzymes involved in BER and a mutant deficient in SOS response induction, both E. coli K12 derived. Both mutants presented similar survival levels like wild strain. This result suggest that H2O2 is not involved in SOS induction and filamentation response. Activated macrophages show microbicidal action, which is related to enzymes such as IDO (indoleamine dioxygenase), associated to reduction of L-tryptophan available to microorganism. In this way, we performed adhrence macrophages assays supplementing the interaction medium with L-tryptophan. Our results showed that tryptophan addition reduced the filamentation of adhered EAEC strains. Thus, we suggested that L-tryptophan reduction could be responsible for SOS response induction and bacterial filamentation.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:05:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 VivianeKSM_TESE.pdf: 2717769 bytes, checksum: dc3d156a1c1b3c1791c93a0e2266556f (MD5) Previous issue date: 2011-12-13 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Chromobacterium violaceum is a free-living bacillus, Gram-negative commonly found in water and sand of tropical and subtropical regions. One of its main characteristic it's the ability to produce the purple pigment named violacein, that shows countless biological activities. In 2003, the genome of this organism was totally sequenced and revealed important informations about the physiology of this bacteria. However, few post-genomics studies had been accomplished. This work evaluated the protein profile of C. violaceum cultivated in LB medium at 28?C that allowed the identification and characterization of proteins related to a possible secretion system that wasn't identified and characterized yet in C. violaceum, to the quorum sensing system, to regulatory process of transcription and translation, stress adaptation and biotechnological potential. Moreover, the response of the bacteria to UVC radiation was evaluated. The comparison of the protein profile, analyzed through 2-D electrophoresis, of the control group versus the treatment group allowed the identification of 52 proteins that arose after stress induction. The obtained results enable the elaboration of a stress response pathway in C. violaceum generated by the UVC light. This pathway, that seems to be a general stress response, involves the expression of proteins related to cellular division, purine and pirimidine metabolism, heat chock or chaperones, energy supply, regulation of biofilm formation, transport, regulation of lytic cycle of bacteriophages, besides proteins that show undefined function. Despite the response present similarities with the classic SOS response of E. coli, we still cannot assert that C. violaceum shows a SOS-like response, mainly due to the absence of characterization of a LexA-like protein in this organism / Chromobacterium violaceum ? um bacilo de vida-livre, Gram-negativo comumente encontrado no solo e nas ?guas de regi?es tropicais e subtropicais. Uma das principais caracter?sticas deste organismo ? sua capacidade de produzir o pigmento violace?na, o qual apresenta in?meras atividades biol?gicas. Em 2003, o genoma deste organismo foi completamente sequenciado e revelou informa??es importantes sobre a fisiologia desta bact?ria. Por?m, poucos estudos p?s-gen?micos tem sido realizados. Este trabalho avaliou o perfil proteico de C. violaceum cultivada em meio LB a 28?C, o que permitiu a identifica??o de prote?nas relacionadas a um poss?vel sistema de secre??o ainda n?o identificado e caracterizado em C. violaceum, ao sistema quorum sensing, a processos regulat?rios da transcri??o e tradu??o, adapta??o ao estresse e ao potencial biotecnol?gico. Al?m disso, a resposta desta bact?ria ? radia??o UVC foi avaliada. A compara??o do perfil prot?ico, analisado por eletroforese 2-D, do controle versus tratado possibilitou a identifica??o de 52 prote?nas que surgiram ap?s a indu??o do estresse. Os resultados obtidos permitiram a elabora??o de uma via de resposta de C. violaceum ao estresse gerado pela luz UVC. Esta via, que parece ser de resposta geral ao estresse, envolve a express?o de prote?nas relacionada ? divis?o celular, metabolismo de purinas e pirimidinas, choque t?rmico ou chaperonas, fornecimento de energia, regula??o da forma??o de biofilme, transporte, regula??o do ciclo l?tico de bacteri?fagos, al?m de prote?nas que ainda n?o apresentam fun??o caracterizada. Apesar da reposta apresentar similaridades com a SOS cl?ssica de E. coli, ainda n?o podemos afirmar que C. violaceum apresenta uma resposta SOS-like, principalmente devido a aus?ncia da caracteriza??o de um prote?na LexA-like neste organismo

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é um patógeno relacionado ao desenvolvimento de quadros de diarréia aguda ou persistente. A resposta inflamatória induzida por EAEC está relacionada à liberação de interleucina 8, que atua estimulando a transmigração de neutrófilos através do epitélio. Os macrófagos, de forma similar aos neutrófilos, são células fagocíticas que produzem espécies reativas de oxigênio (ERO), como o peróxido de hidrogênio (H2O2). Neste trabalho, avaliamos as consequências da interação de diferentes cepas clínicas com macrófagos humanos ativados da linhagem U-937. Todas as cepas testadas apresentaram filamentos nos testes de aderência aos macrófagos, diferentemente do que ocorre na interação com outras linhagens celulares como HEp-2, T84 e Caco-2. O ferro é um microelemento essencial para bactérias, sendo utilizado como cofator de enzimas e que também pode participar da geração de ERO através da reação de Fenton. Considerando-se a possibilidade de que o H2O2 produzido pelos macrófagos possa gerar radical hidroxil através da reação de Fenton, testes de aderência foram realizados com as amostras cultivadas na presença do captador de ferro 2,2-dipiridil. Tal fato não suprimiu a formação de filamentos, entretanto diminuiu a aderência das cepas EAEC 042 e 17-2. Com o objetivo de produzir uma resposta adaptativa ao H2O2, as culturas bacterianas foram pré-tratadas com uma dose sub-letal de H2O2 por 60 minutos antes de aderirem aos macrófagos. Nossos resultados mostraram que o pré-tratamento também não inibiu o aparecimento de filamentos em relação às culturas não tratadas. Além disto, foi observado que o pré-tratamento com o H2O2 reduziu a aderência das amostras de EAEC ao tapete celular. A filamentação é uma das respostas SOS, induzida pela presença de danos e/ou bloqueio na síntese da molécula de DNA. Com o objetivo de verificar se o H2O2 produzido pelos macrófagos estaria causando danos induzindo o sistema SOS e a filamentação bacteriana, foram realizados testes de viabilidade com mutantes derivados de E. coli K12 deficientes em enzimas do reparo por excisão de bases (BW535) e na resposta SOS (DM49). Nossos resultados mostram que os mutantes apresentaram os níveis de sobrevivência semelhantes ao observado para cepa selvagem isogênica (AB1157). Todos estes resultados em conjunto indicam que o H2O2 não é o indutor da filamentação nos testes de aderência. Macrófagos ativados apresentam ação microbicida através da ação da enzima indolamina dioxigenase (IDO), associada à redução do aminoácido L-triptofano. Desta forma, realizamos testes qualitativos de aderência de EAEC aos macrófagos suplementando o meio de interação com este aminoácido. Nossos resultados mostram que a adição de triptofano ao meio de interação reduz o número de filamentos por campo. Desta forma, aventamos a hipótese de que a depleção do triptofano seja responsável pela indução de resposta SOS, tendo como conseqüência a filamentação das bactérias. / Enteroaggregative Escherichia coli is a pathogen related to cases development of acute or persistent diarrhea. The inflammatory response induced by EAEC is linked to induction of IL-8 release, which acts stimulating neutrophils diapedesis through the epithelium. Macrophages, similarly to neutrophils, are phagocytic cells that produce reactive oxygen species (ROS), such as H2O2. Iron is an essential microelement to bacteria, been used as cofactor of enzymes in fundamental cellular processes but it is involved in ROS generation through Fenton reaction. On this report we evaluated the consequences of different EAEC strains interaction with activated human macrophages (U937 lineage). All tested strains showed filaments on the adherence tests with macrophages, unlike to what occurs in the interaction with other cellular lineages as HEp-2, T84 e Caco-2. Considering the possibility of H2O2 macrophage produced generates hydroxyl radical through Fenton reaction, the strains were grown in medium containing iron chelator 2,2-dipiridil. Iron chelation did not suppress filamentation, however decreased the adherence of 042 e 17-2 strains. Strains pretreated with a H2O2 subletal dose (60 M) by 60 minutes, which resulted in a bacterial adaptative response, also did not decrease the filamentation associated to adherence beside H2O2 pretreatment decreased the adherence of EAEC strains tested. In order to verify if H2O2 induces filamentation through DNA lesions and SOS induction, we evaluated the survival of a triple mutant deficient in three enzymes involved in BER and a mutant deficient in SOS response induction, both E. coli K12 derived. Both mutants presented similar survival levels like wild strain. This result suggest that H2O2 is not involved in SOS induction and filamentation response. Activated macrophages show microbicidal action, which is related to enzymes such as IDO (indoleamine dioxygenase), associated to reduction of L-tryptophan available to microorganism. In this way, we performed adhrence macrophages assays supplementing the interaction medium with L-tryptophan. Our results showed that tryptophan addition reduced the filamentation of adhered EAEC strains. Thus, we suggested that L-tryptophan reduction could be responsible for SOS response induction and bacterial filamentation.

O sistema SOS controla a expressão de diversos genes, muitos envolvidos com o reparo de DNA. Caulobacter crescentus vem emergindo como um modelo alternativo interessante para o estudo de mecanismos de reparo de DNA. Temos como objetivos realizar uma análise funcional de genes de função desconhecida regulados por SOS, e investigar a indução de SOS por antibióticos beta-lactâmicos em C. crescentus. Análises funcionais dos genes CC_3424 e CC_3467 mostraram que deleções nestes genes resultam em fenótipo de sensibilidade à mitomicina C (MMC). CC_3424 possui similaridade com glioxalases e CC_3467 com endonucleases. Acreditamos que CC_3467 atue no reparo de ligações intercadeia no DNA, e que CC_3424 atue detoxificando a MMC das células. Estudos dos efeitos biológicos da indução do sistema SOS mostram que a cefalexina (CFE) induz este regulon em concentrações subinibitórias. Células tratadas com CFE apresentam mais danos oxidativos do tipo 8-oxoguanina. Estes resultados mostram que concentrações subinibitórias de CFE resultam em estresse oxidativo em C. crescentus. / The SOS response controls the expression of several genes, many of which are involved in DNA repair mechanisms. Caulobacter crescentus has emerged as an alternative bacterial model for DNA repair. As aims, we will undertake a functional analysis of some of the genes regulated by the SOS response, and will investigate the SOS induction by beta-lactam antibiotics in C. crescentus. Functional analysis of the genes CC_3424 and CC_3467 showed that deletions in these genes result in a phenotype of sensitivity to mitomycin C (MMC). CC_3424 has similarity to glyoxalase and CC_3467 to endonucleases. We believe that the CC_3467 gene plays a role in the repair of interstrand crosslinks in the DNA, while CC_3424 acts in MMC cellular detoxification. Studies of biological effects of SOS induction showed that subinibitory concentrations of cephalexin (CFE) induce the SOS regulon. Cells treated with CFE have higher concentrations of 8-oxoG oxidative damage. These results show that subinibitory concentrations of cephalexin leads to cellular oxidative stress in C. crescentus.