Submitted by Maria Aparecida (cidazen@gmail.com) on 2017-04-26T12:29:41Z No. of bitstreams: 1 Bruno Araújo Serra Pinto.pdf: 5546725 bytes, checksum: 07839b14efcc510ac5ecfa62b980626e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-26T12:29:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bruno Araújo Serra Pinto.pdf: 5546725 bytes, checksum: 07839b14efcc510ac5ecfa62b980626e (MD5) Previous issue date: 2017-04-07 / FAPEMA / Background: The epidemiological rise of metabolic syndrome (MS) is directly related to the exponential increase of added sugar consumption. Studies describes that MSmetabolic disorders, mainly insulin resistance and obesity, are related to development of oxidative stress, cognitive declines and dementias, and neuronal senescence acceleration. Even with several evidences correlating MS to neuronal damage, the molecular mechanisms involved are still unclear, and the endoplasmic reticulum stress (ER stress), in this context, could be placed like an intermediary condition that interconnects those morbidities. Objective: To investigate the deleterious effects of hippocampal ER stress about progression of cognitive, behavioral and motor declines in rats with metabolic syndrome-induced by sucrose-rich diet in different ages. Methods: Weaned Wistar rats were divided into 4 groups: two control groups (CTR, n = 7-9), fed a standard diet and followed up to 3 and 6-months-old, respectively; and two obese groups (HSD, n = 7), fed a sucrose-rich diet (25% sucrose) followed by the same periods. Was assessed in these groups: MS development; redox profile; Cognitive, behavioral and motor functions; And the hippocampal gene/protein expression of UPR sensors (Ire1α, Perk and Atf6), chaperones (Grp78, Grp94, Pdi, Calnexin and Calreticulin), neuronal plasticity (Bdnf), antioxidant defense (Nrf2), apoptosis (Bcl2, Chop and Parp-1) and senescence (p53 and p21). For aging control, rats at 20 months of age (OLD, n = 7) fed standard chow were included as aging control for gene/protein expression and neurological assessments. Results: The sucrose-rich diet was successful in establish the SM-phenotype. At 3 months, we observed central obesity even with lower energy intake, fasting and fed dysglycemia, hypertriglyceridemia, hapatic ectopic fat deposit, decreased lipolysis rates, glucose intolerance and hepatic insulin resistance. In unpublished data, we observed mild lipid peroxidation without exepressive antioxidant enzymes activity, and absence of peripheral insulin resistance. In animals with 6 months, we observed a deepening of metabolic dysfunctions encountered in 3-months-old. In addition we observed weight gain, free fatty acids, hyperinsulinemia, peripheral insulin resistance, increased lipid peroxidation, higher SOD, CAT and GPx reduction activity in 6-months-old rats. The lipolysis rate wasn't performed. Regarding the neurofunctional assessment at 3-months-old, the animals presented motor deficit and anxiogenic behavior, however without cognitive dysfunctions. In 6-months-animals, we observed anxiogenic behavior and important motor and cognitive impairments (learning and memory), similar to OLD group. Hippocampal molecular analysis revealed a different signaling between HSD groups of 3 and 6-months. In HSD at 3 months, we observed a switch-over from UPR-adaptive to pro-apoptotic signaling, marked by increased gene expression of Perk, Atf6 and Pdi A2 (adaptive), reduction of Grp78 and Bcl2, and increases of Chop and Caspase 3 (Apoptotic). In 6-months-HSD, we observed a complete failure of UPR adaptive signaling (UPR sensors and chaperones) and increased apoptotic signaling, featured by Bcl2 reduction and increased gene/protein expression of Chop. Additionally, we observed a reduction in the Bdnf gene expression and protein cleavage of Parp-1 compatible to calpain presence (necrosis/apoptosis marker). The expressions found in the 6-month-HSD were similar to OLD group, but the cell death markers (Chop and Calpain) were found only in HSD. As expected, senescence markers (p53 and p21) were increased in the OLD group and only p21 shown increased in HSD. Conclusions: Our data set supports that prolonged exposure to sucrose-rich diet promotes SM and oxidative stress, which disrupt hippocampal ER homeostasis, leading to senescence acceleration and cell death, and subsequently leads to severe cognitive, behavioral and motor impairments. / Introdução: O crescimento epidemiológico da síndrome metabólica (SM) está diretamente relacionado ao exponencial aumento do consumo de açucares de adição. Estudos descrevem que as desordens metabólicas que compõem a SM, principalmente a resistência insulínica e obesidade, estão relacionadas ao desenvolvimento de estresse oxidativo, declínios cognitivos, demências e aceleração da senescência neuronal. Mesmo com diversas evidências correlacionando a SM a danos neuronais, os mecanismos moleculares envolvidos ainda não são totalmente conhecidos. Neste contexto, o estresse do retículo endoplasmático (ERE) pode ser apontado como uma condição intermediária que interconecta estas morbidades. Objetivo: Investigar os efeitos deletérios do ERE hipocampal sobre a instalação de declínios cognitivos, comportamentais e motores em ratos com síndrome metabólica induzida por dieta rica em sacarose em diferentes faixas etárias. Métodos: Ratos Wistar com 21 dias de vida (desmame) foram divididos em 4 grupos: dois grupos controle (CTR, n = 7-9), alimentados com uma dieta padrão e acompanhados até os 3 e 6 meses de idade, respectivamente; e dois grupos obeso (HSD, n = 7), alimentados com dieta rica em sacarose (sacarose a 25%) acompanhados pelos mesmos períodos. Foi avaliado nos grupos: desenvolvimento de SM; perfil redox; funções cognitivas, comportamentais e motoras; e expressão gênica/proteica hipocampal de sensores da UPR (Ire1α, Perk e Atf6), chaperonas (Grp78, Grp94, Pdi, Calnexina e Calreticulina), plasticidade neuronal (Bdnf), defesa antioxidante (Nrf2), apoptose (Bcl2, Chop e Parp-1) e senescência (p53 e p21). Como um controle de envelhecimento, ratos com 20 meses de idade (OLD, n = 7) alimentados com dieta padrão foram incluídos aos experimentos de expressões gênica/proteica e avaliações neurológicas. Resultados: A dieta rica em sacarose teve sucesso em estabelecer o fenótipo de SM. Com 3 meses, o grupo HSD desenvolveu obesidade central mesmo com menor ingestão energética, disglicemia em estados de jejum e alimentado, hipertrigliceridemia, acúmulo de gordura ectópica hepática, diminuição da taxa de lipólise, intolerância à glicose e resistência hepática à insulina. Em dados não publicados, observamos discreta peroxidação lipídica sem expressiva atividade de enzimas antioxidantes e sem resistência insulínica periférica. Nos animais com 6 meses, observamos um aprofundamento das disfunções metabólicas dos animais de 3 meses. Adicionalmente, observamos ganho de peso, ácidos graxos livres, hiperinsulinemia, resistência insulínica periférica, maior peroxidação lipídica, maior atividade das enzimas SOD, CAT e redução da GPx. No que se refere à avaliação neurofuncional, aos 3 meses de idade, o grupo HSD apresentou déficit motor e comportamento ansiogênico, no entanto sem disfunções cognitivas. Contudo, nos animais de 6 meses observamos comportamento ansiogênico e importantes prejuízos motores e cognitivos (aprendizado e memória), semelhantes ao grupo OLD. A análise molecular hipocampal evidenciou uma sinalização diferente entre os grupos HSD de 3 e 6 meses. No HSD com 3 meses, observamos uma transição da sinalização adaptativa da UPR para a pró-apoptótica, marcada pelo aumento das expressões gênicas de Perk, Atf6 e Pdi A2 (adaptativa), redução da Grp78 e aumento da Chop e Caspase 3 (apoptótica). No HSD de 6 meses, observamos uma falência total da sinalização adaptativa da UPR (sensores da UPR e chaperonas), e aumento da sinalização apoptótica, caracterizada pela redução do Bcl2 e aumento da expressão gênica/proteica de Chop. Adicionalmente, observamos também redução da expressão gênica do Bdnf, redução da expressão proteica de Grp94 e clivagem proteica do Parp-1 compatível com a presença de Calpaína (marcador de necrose/apoptose). As expressões encontradas no HSD de 6 meses foram semelhante as alterações observadas no grupo OLD, mas os fatores de morte celular (Chop e Calpaína) foram encontrados apenas no HSD. Como esperado, os marcadores de senescência (p53 e p21) estavam aumentados no grupo OLD e apenas o p21 se mostrou aumentado no HSD. Conclusões: Nosso conjunto de dados apoia que a exposição prolongada à dieta rica em sacarose promove SM e estresse oxidativo, que perturba a homeostase do RE hipocampal, acarretando aceleração da senescência e morte celular, e subsequentes prejuízos cognitivos, comportamentais e motores.

Atualmente, a obesidade é considerada uma epidemia mundial. Está associada a um estado de inflamação crônica e ativação do estresse do retículo endoplasmático (ERE), relacionados à patogênese de diversas doenças como diabetes mellitus tipo 2, doenças cardiovasculares, câncer, hipertensão, dentre outras. Nesse contexto, são necessários estudos para encontrar alternativas que melhorem o processo inflamatório. Vários estudos em humanos e animais já demostraram as propriedades anti-inflamatórias do ácido graxo ômega-3. O objetivo do nosso trabalho foi avaliar os efeitos da suplementação do ácido alfa-linolênico (ALA) no metabolismo e no estresse do retículo endoplasmático em obesos grau III. Foi conduzido um estudo prospectivo, randomizado, placebo-controlado, duplo-cego. No total, 52 pacientes foram randomizados para a suplementação com 3g/dia de ALA ou placebo, sendo 27 indivíduos do grupo ômega-3/ALA e 25 do grupo controle. Foi avaliado perfil lipídico, glicídico e inflamatório antes e após suplementação. O tecido adiposo visceral (TAV) foi coletado durante cirurgia bariátrica após suplementação. O perfil de ácidos graxos incorporados no TAV foi avaliado por cromatografia gasosa. Os genes foram avaliados através de PCR em tempo real. Não houve alteração nos níveis séricos de IL-6 (p=0,2201), TNF-? (0.7703) e PCR (p=0,57) após suplementação com ômega-3/ALA, porém observamos diminuição nos níveis séricos de Leptina (p=0.0154) e IP-10 (p=0.0410), citocinas inflamatórias, e aumento na IL-4 (p=0,0211), citocina anti-inflamatória. Foi observado incorporação significativa do ALA (p=0,0002), EPA (p<0,0001) e DHA (p=0,0005) no TAV. Avaliação molecular evidenciou um aumento da expressão gênica do XBP1 (p=0,0013), sXBP1 (p<0,0001), EIF2-? (p=0,0063) e da chaperona CCT4 (p=0,0001) e diminuição na expressão gênica da leptina (p=0,0410). Podemos concluir que o ALA pode modular o ERE através da via da IRE1/XBP, levando ao aumento das chaperonas (CCT4), o que pode demonstrar um potencial terapêutico do ALA em pacientes obesos. / Currently, obesity is considered a worldwide epidemic. It is associated with chronic inflammation and stress activation of the endoplasmic reticulum (ERE), related to the pathogenesis of various diseases such as type 2 diabetes mellitus, cardiovascular diseases, cancer, hypertension, among others. In this context, studies are needed to find alternatives that improve the inflammatory process. Several studies in humans and animals have already demonstrated the anti-inflammatory properties of omega-3 fatty acid. The objective of our study was to evaluate the effects of alpha-linolenic acid (ALA) supplementation on the metabolism and stress of the endoplasmic reticulum in obese patients. A prospective, randomized, placebo-controlled, double-blind study was conducted. In total, 52 patients were randomized to supplementation with 3 g / day of ALA or placebo, 27 individuals from the omega-3 / ALA group and 25 from the control group. Lipid, glycidic and inflammatory profile were evaluated before and after supplementation. Visceral adipose tissue (TAV) was collected during bariatric surgery after supplementation. The fatty acid profile incorporated in the TAV was evaluated by gas chromatography. Genes were evaluated by real-time PCR. There was no change in serum levels of IL-6 (p = 0.2201), TNF-? (0.7703) and CRP (p = 0.57) after supplementation with ALA, but we observed a decrease in serum Leptin levels (P = 0.0154) and IP-10 (p = 0.0410), inflammatory cytokines, and increase in IL-4 (p = 0.0211), anti-inflammatory cytokine. Significant incorporation of ALA (p = 0.0002), EPA (p <0.0001) and DHA (p = 0.0005) into the TAV was observed. Molecular evaluation showed an increase in the gene expression of XBP1 (p = 0.0013), sXBP1 (p <0.0001), EIF2-? (p = 0.0063), GADD34 (p=0,0117) and CCT4 chaperone (p = 0.0001), decrease in the gene expression of leptin (p = 0.0410) and ATF-6 (p=0,0305) and a tendency to decrease the gene expression of CHOP. We can conclude that ALA can modulate ERE through the IRE1 / XBP, PERK and ATF-6 pathways, leading to increased chaperones (CCT4), which may demonstrate a therapeutic potential of ALA in obese patients.

O carcinoma hepatocelular (CHC) é a quarta causa mais frequente de morte por câncer em todo o mundo. Este estudo teve dois grandes objetivos, o primeiro foi estabelecer o carcinoma hpatocelular experimental por indução química e o segundo estudar os efeitos da melatonina sobre o estresse oxidativo, estresse de retículo endoplasmático e apoptose durante a hepatocarcinogênese. Foram realizados dois experimentos, ambos utilizaram dietilnitrosamina (DEN) mais acetilaminofluoreno (2-AAF) em ratos Wistar machos pesando 145-150 g. O primeiro estudo testou 3 protocolos de indução do câncer hepático. Os animais foram divididos em três grupos testes: DEN50: que recebeu DEN 50 mg duas vezes por semana até a 6ª semana e uma vez por semana nas semanas 11 a 13. DEN75: recebeu DEN 75mg uma vez por semana nas semanas até a 6ª semana e um reforço nas semanas de 11 a 13. DEN100: recebeu 5 doses de DEN 100mg uma a cada seis semanas por 28 semanas. Todos receberam 2- AAF dose única de 100 mg na 4ª semana. Após a indução foi comprovado por testes bioquímicos, macroscópico e histológico que o protocolo DEN50 desenvolve CHC avançado em 19 semanas, apresentou a fase inflamatória na 5ª semana e cirrose na 12ª semana. O protocolo DEN100 exibe padrão de lesões pré-cancerosas com cirrose em 28 semanas. O protocolo DEN75 foi o mais heterogêneo dos três, pois desenvolveu lesões pré-cancerosas, cancer inicial e CHC avançado. O segundo estudo, repetiu o protocolo DEN50 e administrou melatonina 20mg/L. Os tratamentos começaram nas semanas 5 e 12. Ao final de 19 semanas foi observado que animais do grupo que só recebeu DEN+2-AAF (DEN-CHC) desenvolveram carcinoma avançado, exibiram mais expressão de proteinas pró-inflamatórias (iNOS, COX-2 e NFkB). E animais tratados com Melatonina (DEN+MEL5 e DEN+MEL 12) apresentaram padrão histológico de cirrose e reduzida expressão destas proteinas. Quanto ao comportamento oxidativo foi observado que grupo DEN-CHC apresentou menor lipoperoxidação (LPO) por redução de ácidos graxos poliinsaturados, maior oxidação proteica, menor atividade da SOD e maior índice de danos ao DNA. O tratamento com melatonina ao longo da hepatocarcinogênese se mostrou efetivo para proteger a membrana lipidica, reduziu a oxidação proteica, aumentou a atividade da SOD e atenuou o dano ao DNA. Por fim, referente ao estresse de retículo endoplasmático e apoptose, animais com DEN-CHC não apresentaram ativação das proteinas de estresse de retículo (BiP, ATF6 e CHOP) nem acionaram as rotas apoptóticas. Entretanto, animais tratados com Melatonina tiveram aumento significativo na expressão de proteinas como BiP, ATF6 e CHOP, assim como proteinas pró-apoptóticas. Nossos resultados apontam que a melatonin, durante o processo de hepatocarcinogênese experimental, atuou como anti-inflamatório, antioxidante e pró-apoptótico. E estas ações contribuiram para evitar a progressão do carcinoma hepatocelular. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the fourth most frequent cause of cancer death worldwide. This study had two main objectives, the first was to establish the experimental hpatocelular carcinoma by chemical induction and the second study the effects of melatonin on oxidative stress, endoplasmic reticulum stress and apoptosis during hepatocarcinogenesis. Two experiments were conducted, both used Diethylnitrosamine (DEN) + acetylaminofluorene (2-AAF) in male Wistar rats weighing 145-150 g. The first study tested three induction protocols of liver cancer. The animals were divided into three test groups: DEN50: DEN that received 50 mg twice a week until 6 weeks and once a week during the weeks 11 and 13. DEN75: DEN received 75mg once a week during the weeks to 6 weeks and another reinforcement in weeks 11 to 13 DEN100: DEN received 5 doses of 100mg one every six weeks for 28 weeks. All received 2 AAF single dose of 100 mg at week 4. After induction was confirmed by biochemical, macroscopic and histological tests that DEN50 protocol develops advanced HCC in 19 weeks, presents inflammatory phase in the 5th week and cirrhosis at 12 weeks. The default display protocol DEN100 of precancerous lesions and cirrhosis in 28 weeks. DEN75 The protocol was the most heterogeneous of the three, as developed precancerous lesions, early cancer and advanced HCC. The second study, repeated the DEN50 protocol and administered melatonin 20mg / L. The treatments began on week 5 and 12. At the end of 19 weeks was observed that animals in the group that received only DEN (DEN-CHC) developed advanced carcinoma exhibited over expression of proinflammatory proteins (iNOS, COX-2 and NFkB). And animals treated with melatonin (DEN+ MEL5W and DEN+MEL 12W) showed histological pattern of cirrhosis and reduced expression of these proteins. As for the oxidative behavior was observed that DEN-HCC group had lower lipid peroxidation (LPO) by reducing polyunsaturated fatty acids, higher protein oxidation, lower activity of SOD and higher rate of DNA damage. Treatment with melatonin throughout hepatocarcinogenesis was effective to protect the lipid membrane, protein oxidation decreased, increased SOD activity and attenuated DNA damage. Finally, referring to the endoplasmic reticulum stress and apoptosis, animal DEN-CHC did not show activation of reticulum stress protein (BiP, ATF6 and CHOP) or triggered apoptotic routes. However, melatonin treated animals had a significant increase in the expression of proteins and BiP, CHOP and ATF6, as well as pro-apoptotic proteins. Our results indicate that melatonin, during the process of experimental hepatocarcinogenesis, acted as anti-inflammatory, antioxidant and pro-apoptotic. And these actions contributed to prevent progression of hepatocellular carcinoma.

O carcinoma hepatocelular (CHC) é a quarta causa mais frequente de morte por câncer em todo o mundo. Este estudo teve dois grandes objetivos, o primeiro foi estabelecer o carcinoma hpatocelular experimental por indução química e o segundo estudar os efeitos da melatonina sobre o estresse oxidativo, estresse de retículo endoplasmático e apoptose durante a hepatocarcinogênese. Foram realizados dois experimentos, ambos utilizaram dietilnitrosamina (DEN) mais acetilaminofluoreno (2-AAF) em ratos Wistar machos pesando 145-150 g. O primeiro estudo testou 3 protocolos de indução do câncer hepático. Os animais foram divididos em três grupos testes: DEN50: que recebeu DEN 50 mg duas vezes por semana até a 6ª semana e uma vez por semana nas semanas 11 a 13. DEN75: recebeu DEN 75mg uma vez por semana nas semanas até a 6ª semana e um reforço nas semanas de 11 a 13. DEN100: recebeu 5 doses de DEN 100mg uma a cada seis semanas por 28 semanas. Todos receberam 2- AAF dose única de 100 mg na 4ª semana. Após a indução foi comprovado por testes bioquímicos, macroscópico e histológico que o protocolo DEN50 desenvolve CHC avançado em 19 semanas, apresentou a fase inflamatória na 5ª semana e cirrose na 12ª semana. O protocolo DEN100 exibe padrão de lesões pré-cancerosas com cirrose em 28 semanas. O protocolo DEN75 foi o mais heterogêneo dos três, pois desenvolveu lesões pré-cancerosas, cancer inicial e CHC avançado. O segundo estudo, repetiu o protocolo DEN50 e administrou melatonina 20mg/L. Os tratamentos começaram nas semanas 5 e 12. Ao final de 19 semanas foi observado que animais do grupo que só recebeu DEN+2-AAF (DEN-CHC) desenvolveram carcinoma avançado, exibiram mais expressão de proteinas pró-inflamatórias (iNOS, COX-2 e NFkB). E animais tratados com Melatonina (DEN+MEL5 e DEN+MEL 12) apresentaram padrão histológico de cirrose e reduzida expressão destas proteinas. Quanto ao comportamento oxidativo foi observado que grupo DEN-CHC apresentou menor lipoperoxidação (LPO) por redução de ácidos graxos poliinsaturados, maior oxidação proteica, menor atividade da SOD e maior índice de danos ao DNA. O tratamento com melatonina ao longo da hepatocarcinogênese se mostrou efetivo para proteger a membrana lipidica, reduziu a oxidação proteica, aumentou a atividade da SOD e atenuou o dano ao DNA. Por fim, referente ao estresse de retículo endoplasmático e apoptose, animais com DEN-CHC não apresentaram ativação das proteinas de estresse de retículo (BiP, ATF6 e CHOP) nem acionaram as rotas apoptóticas. Entretanto, animais tratados com Melatonina tiveram aumento significativo na expressão de proteinas como BiP, ATF6 e CHOP, assim como proteinas pró-apoptóticas. Nossos resultados apontam que a melatonin, durante o processo de hepatocarcinogênese experimental, atuou como anti-inflamatório, antioxidante e pró-apoptótico. E estas ações contribuiram para evitar a progressão do carcinoma hepatocelular. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the fourth most frequent cause of cancer death worldwide. This study had two main objectives, the first was to establish the experimental hpatocelular carcinoma by chemical induction and the second study the effects of melatonin on oxidative stress, endoplasmic reticulum stress and apoptosis during hepatocarcinogenesis. Two experiments were conducted, both used Diethylnitrosamine (DEN) + acetylaminofluorene (2-AAF) in male Wistar rats weighing 145-150 g. The first study tested three induction protocols of liver cancer. The animals were divided into three test groups: DEN50: DEN that received 50 mg twice a week until 6 weeks and once a week during the weeks 11 and 13. DEN75: DEN received 75mg once a week during the weeks to 6 weeks and another reinforcement in weeks 11 to 13 DEN100: DEN received 5 doses of 100mg one every six weeks for 28 weeks. All received 2 AAF single dose of 100 mg at week 4. After induction was confirmed by biochemical, macroscopic and histological tests that DEN50 protocol develops advanced HCC in 19 weeks, presents inflammatory phase in the 5th week and cirrhosis at 12 weeks. The default display protocol DEN100 of precancerous lesions and cirrhosis in 28 weeks. DEN75 The protocol was the most heterogeneous of the three, as developed precancerous lesions, early cancer and advanced HCC. The second study, repeated the DEN50 protocol and administered melatonin 20mg / L. The treatments began on week 5 and 12. At the end of 19 weeks was observed that animals in the group that received only DEN (DEN-CHC) developed advanced carcinoma exhibited over expression of proinflammatory proteins (iNOS, COX-2 and NFkB). And animals treated with melatonin (DEN+ MEL5W and DEN+MEL 12W) showed histological pattern of cirrhosis and reduced expression of these proteins. As for the oxidative behavior was observed that DEN-HCC group had lower lipid peroxidation (LPO) by reducing polyunsaturated fatty acids, higher protein oxidation, lower activity of SOD and higher rate of DNA damage. Treatment with melatonin throughout hepatocarcinogenesis was effective to protect the lipid membrane, protein oxidation decreased, increased SOD activity and attenuated DNA damage. Finally, referring to the endoplasmic reticulum stress and apoptosis, animal DEN-CHC did not show activation of reticulum stress protein (BiP, ATF6 and CHOP) or triggered apoptotic routes. However, melatonin treated animals had a significant increase in the expression of proteins and BiP, CHOP and ATF6, as well as pro-apoptotic proteins. Our results indicate that melatonin, during the process of experimental hepatocarcinogenesis, acted as anti-inflammatory, antioxidant and pro-apoptotic. And these actions contributed to prevent progression of hepatocellular carcinoma.

O melanoma é o tipo de câncer de pele mais letal, apesar de ser o menos incidente. Em virtude de sua alta letalidade e de sua crescente incidência, estudos sobre melanoma são de fundamental importância nos dias de hoje. Assim como células tumorais em geral, células de melanoma apresentam características metabólicas diferenciadas, como, por exemplo, altos níveis de espécies reativas de oxigênio e alta taxa de síntese proteica. Essas modificações no metabolismo dispararam vias de resposta a estresse, como a \"Unfolded Protein Response\" (UPR), contudo, essas células se adaptam a esse estresse constante, que não culmina com a morte das mesmas. Além disso, o padrão de glicosilação em células tumorais também é sabidamente alterado, entre outros motivos, pela expressão diferencial de enzimas da via de glicosilação, como a N-acetilglicosaminiltransferase 5 (MGAT5). Relacionando essas duas características de células de melanoma, propusemo-nos a avaliar se a alta expressão de MGAT5A ( e/ou MGAT5B) funcionaria como uma resposta adaptativa de células de melanoma ao estresse de retículo endoplasmático, e seria, portanto, responsável por manter o equilíbrio diferenciado nessas células. Durante o desenvolvimento desse estudo, foi possível comprovar que a indução de estresse de retículo por meio de tratamento com tunicamicina, um inibidor da N-glicosilação e indutor clássico de UPR, sensibilizou as células de melanoma ao posterior tratamento com cisplatina. Contudo, o tratamento com swainsonina, um inibidor do processamento dos N-glicanos que ocorre no complexo de Golgi, não foi capaz nem de disparar \"Unfolded Protein Response\" nem de induzir morte nessas células e, talvez por esse motivo, não apresentou efeito sensibilizador frente à cisplatina. Além disso, foi observado que as linhagens tumorigênicas apresentam maior expressão de MGAT5A em comparação à linhagem não-tumorigênica melan-a. As tentativas de realização de silenciamento de MGAT5A não foram exitosas. Informações relacionando estresse de retículo e N-glicosilação aberrante em células tumorais ainda serão foco de estudo em nosso grupo. Com os resultados apresentados, é possível concluir que o equilíbrio diferencial dos níveis de estresse de retículo em que se encontram as linhagens tumorigênicas do nosso modelo é importante para a sobrevivência das mesmas. Além disso, é de nosso interesse avaliar a dependência de células tumorais das vias ativadas pela superexpressão de MGAT5A, caso ela realmente exista / Melanoma is the most lethal skin cancer, despite being the least prevalent. Due to its lethality and resistance to a variety of known chemotherapeutic drugs, studies on melanoma are paramount. Tumor cells in general, and melanoma cells particularly, commonly present a disturbed metabolic rate, e.g., altered metabolism of reactive oxygen species and increased rates of protein synthesis. Altogether these perturbations trigger the Unfolded Protein Response (UPR); however, tumor cells are adapted to these conditions and are able to survive. Besides, glycosylation of tumor cells is commonly altered, due to differentiated expression rates of N-glycosylation enzymes, like N-acetylglucosaminyltransferase 5 (MGAT5). Considering these information together, we proposed that the sustained overexpression of MGAT5A (and/or MGAT5B) observed in Tm1 and Tm5 melanoma cells is part of an adaptive response to reticulum stress, maintaining an unstable equilibrium in tumor cells. In this work, we observed that the induction of endoplasmic reticulum stress caused by tunicamycin treatment, a N-glycosylation inhibitor and UPR inducer, sensitized melanoma cells to further cisplatin treatment. In contrast, swainsonine treatment, an inhibitor of Golgi N-glycan processing pathway, did not cause cell death nor UPR signaling, and this may be the reason why this treatment did not sensitize cells to cisplatin treatment. MGAT5A silencing was not successful yet. Altogether, the results above show that the unstable equilibrium under which Tm1 and Tm5 tumor cells are seems necessary for their survival. Therefore, it seems that upon malignant transformation, melanoma cells present dependence of MGAT5A expression. Its our interest exploit this melanoma model to understand the concept of oncogenic dependence for MGAT5A expression in the case of melanomas, if it exists

de tumorigênese em melanomas, ainda não há tratamento eficaz para melanomas metastáticos. Esta ineficácia terapêutica pode estar relacionada com a adaptação e seleção de células de melanoma à indução de estresse de RE. Ultrapassar os níveis sustentados de estresse de RE, interferindo nas vias de adaptação a este estresse, foi o alvo deste estudo na tentativa de propor uma nova estratégia terapêutica para sensibilizar células de melanoma a morte induzida por cisplatina. Mostramos que GADD153, um dos componentes da via de UPR (Unfolded Protein Response) responsável por induzir apoptose em reposta ao estresse de RE, está excluída do núcleo em melanomas primários, metástases ganglionares e viscerais. Este dado sugere que a localização citoplasmática do fator de transcrição GADD153 possa estar envolvida na resposta adaptativa de melanomas ao estresse de RE, uma vez que se sabe que GADD153 se acumula no núcleo em resposta a este estresse. Investigamos se a indução de estresse de RE seria capaz de induzir a translocação de GADD153 para o núcleo e resultar na sensibilização de células de melanoma a morte induzida por cisplatina (CDDP). Realizamos o tratamento de células de melanoma (SbCl2, Mel85, SK-MEL- 29, SK-MEL-28 e SK-MEL-147) com tunicamicina (Tuni), indutor clássico de estresse de RE, previamente ao tratamento com CDDP. Demonstramos que em todas as linhagens exceto em SK-MEL-29, houve um aumento na porcentagem de células hipodiploides (>50%) no tratamento combinado (Tuni>CDDP) comparado ao tratamento com CDDP. As células SK-MEL-147 se mostraram mais sensíveis à indução de estresse de RE e as células SK-MEL-29 mais resistentes. Algumas diferenças entre estas linhagens como a expressão de GRP78 de superfície e presença de oligossacarídeos ?1-6 ligados de superfície podem estar relacionadas com esta resposta diferencial ao estresse de RE. Em todas as linhagens verificamos a acúmulo dos marcadores de UPR, GRP78 e GADD153, após o tratamento com tunicamicina. Além disso, GADD153 foi direcionada para o núcleo em reposta ao tratamento com tunicamicina. O acúmulo de vacúolos acídicos, da proteína autofágica LC3-II e de ROS após o tratamento com Tuni>CDDP, sugerem que tanto a autofagia quanto o estresse oxidativo parecem estar envolvidos na resposta de sensibilização. A inibição de autofagia com cloroquina aumentou a morte induzida por Tuni>CDDP, sugerindo que autofagia desempenha função protetora neste esquema terapêutico. Testamos um segundo agente genotóxico, temozolomida (TMZ), uma droga equivalente à dacarbazina, e a mesma capacidade de sensibilização foi observada pelo prévio tratamento com tunicamicina. A validação deste conceito in vivo foi dificultada pela acentuada toxicidade apresentada por tunicamicina. Avaliamos alguns candidatos a agentes estressores do RE que poderiam apresentar menor toxicidade celular, como swainsonina, atorvastatina, metformina e o composto de cobre [Cu2(apyhist)2(dpam)](ClO4)4. No entanto, não obtivemos resultados promissores com nenhum destes candidatos. Estes resultados mostram que as células tumorais podem ser pré-condicionadas à morte celular se expostas a um prévio estressor de RE, como Tuni, o que leva ao comprometimento da resposta adaptativa a indutores de morte celular como CDDP e TMZ. No entanto, ainda é necessário o estudo de agentes indutores de estresse de RE pouco tóxicos para que esta estratégia terapêutica possa ser utilizada em pacientes com melanoma / Melanoma is among the most aggressive malignancies with increasing worldwide incidence and there is no effective treatment for the metastatic disease. The absence of an effective therapy may be due to adaptation and selection of melanoma cells to endoplasmic reticulum (ER) stress. We showed that GADD153, one of the components of the ER stress-mediated apoptosis pathway, was mostly excluded from the nucleus of primary and metastatic melanoma cells compared to nevus cells. These data suggest that the unexpected GADD153 cellular localization could be involved in melanoma cell adaption to ER stress, since GADD153 accumulates in the nucleus during ER stress. Unfolded protein response (UPR) signaling induced in response to ER stress, is a dual process that induces a protective response to restore ER homeostasis or cell death if ER stress is severe or persistent. We investigated if induction of ER stress was a potential strategy to chemosensitize melanoma cells to a second insult by surpassing the adaptive levels to ER stress. We first treated human melanoma cells (SbCl2, SK-MEL-28, Mel85, SK-MEL-29 and SK-MEL-147) with tunicamycin (Tuni), an ER stress inducer, before cisplatin (CDDP) treatment. CDDP is a low cost chemotherapeutic drug currently used in Brazil as a second line for melanoma treatment, especially in youngsters. All cell lines, except SK-MEL-29, demonstrated an >50% increase in the percentage of hypodiploid cells with Tuni>CDDP treatment when compared to CDDP only. The same results were obtained with temozolomide (TMZ), equivalent drug to the active form of dacarbazine, the first line of cytotoxic treatment of melanomas. UPR markers, GRP78 and nuclear translocation of GADD153 were induced by Tuni. Differences between SK-MEL-29 and SK-MEL-147 as cell surface GRP78 and ?1-6 oligossacharides can be related with the differential ER stress sensitization observed in these cells. One of the cellular mechanisms that are regulated by ER stress is autophagy. Accordingly, we observed an increase in the acidic vesicular organelles and accumulation of LC3II in response to Tuni>CDDP treatment. Autophagy inhibition with chloroquine increased Tuni>CDDP induced-cell death, suggesting that autophagy plays a protective role in this response. Oxidative stress can be involved in this scenario since we demonstrated an accumulation of reactive oxygen species in response to Tuni>CDDP. Tunicamycin was cytotoxic in vivo and we investigated alternatives to this antibiotic as swainsonine, atorvastatin, metformin and [Cu2(apyhist)2(dpam)](ClO4)4 but we did not observed ER stress induction. These results indicate that tumor cells could be preconditioned to cell death if exposed to a first ER stressor, such as Tuni, which would compromise an effective adaptive response to a cell death inducer, as CDDP and TMZ. This combined approach may be a promising strategy for melanoma therapy but further studies are necessary to find noncytotoxic alternatives to tunicamycin

Orientadores: Eliana Pereira de Araújo, Lício Augusto Velloso / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-22T10:03:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nunez_CarlaEvelynCoimbra_D.pdf: 6141570 bytes, checksum: e9e12c78d1c319b6c83160c2ebf9976b (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A obesidade e caracterizada pelo acumulo excessivo de gordura no organismo, podendo resultar em dano a saúde. Mudança socioeconômica, ocorrida nos últimos cinquenta anos tem contribuído para o aumento da prevalência da obesidade, a qual e hoje considerada um dos principais problemas de saúde publica no mundo. O acumulo progressivo de ácidos graxos no tecido adiposo, e eventualmente, em outros sítios anatômicos não especializados na estocagem de energia sob a forma de gordura como, por exemplo, o fígado e o músculo, e associado à ativação de uma resposta inflamatória subclinica que desempenha papel importante na indução da resistência a insulina. Esta, por sua vez, e considerada o mecanismo fisiopatogênico unificador de uma serie de doenças comumente associadas à obesidade, tais como o diabetes mellitus, a aterosclerose, a esteatohepatite nao-alcoolica, entre outros. A inflamação subclinica desempenha um papel central na indução da resistência a insulina em obesos. Atualmente o estresse de reticulo endoplasmático e a ativação da sinalização do TLR4 vêm sendo identificados como potenciais mecanismos ativadores da inflamação sub-clinica associada à obesidade. No ambiente intracelular a ativação dos sinais inflamatórios disparados por ambos, estresse de reticulo endoplasmático ou TLR4, podem associar-se, modulando ou sendo modulado por outros eventos. Um desses eventos e a autofagia que se caracteriza como um processo celular finamente regulado e desempenha um papel importante no controle de varias funções da célula, tais como, reciclagem de organelas, disponibilidade de nutrientes e diferenciação celular. Um estudo recente demonstrou a existência de aumento na atividade autofágica em tecido adiposo de pessoas obesas e propôs a associação causal entre autofagia e resistência a insulina. A redução da adiposidade e o mecanismo mais eficiente para reduzir à resistência a insulina em pessoas obesas. Entretanto, o impacto da redução de adiposidade sobre a regulação da autofagia no tecido adiposo não e conhecido. Neste estudo, a regulação da autofagia no tecido adiposo durante o emagrecimento foi observada em duas etapas distintas. Inicialmente, um modelo animal de obesidade induzida por dieta, submetido posteriormente, a restrição calórica de 40% durante quinze dias. Animais obesos alimentados ad libitum, apresentaram aumento dos marcadores de autofagia no tecido adiposo, o que foi revertido na restrição calórica. De forma diversa, a restrição ocasionou o aumento da autofagia nos animais magros. A reintrodução de alimentação ad libitum foi suficiente para reduzir a autofagia nos animais magros, mas não nos obesos, cuja supra-regulacao da autofagia foi mais uma vez observada. Na segunda parte do estudo, autofagia foi avaliada em fragmentos de tecido adiposo subcutâneo de pacientes obesos selecionados para cirurgia bariátrica colhidos no ato da cirurgia e apos um ano, aproximadamente. Foram incluídos no estudo nove pacientes obesos não-diabeticos e seis pacientes obesos diabéticos. Assim como no modelo animal, obesidade em humanos foi associada a um aumento dos marcadores de autofagia no tecido adiposo os quais foram reduzidos apos a perda de peso. Assim, na vigência da obesidade ocorre uma regulação anômala da autofagia, estando aumentada durante alimentação ad libitum e reduzindo-se com a restrição alimentar / Abstract: Obesity, defined as abnormal or excessive fat accumulation that may impair life quality, is one of the major public health problems in modern world. It results from an imbalance between food intake and energy expenditure leading to the progressive accumulation of fatty acids in the adipose tissue and in some tissues that are not specialized in energy storage, such as liver and muscle. Insulin resistance is one of the main outcomes of obesity and is regarded as the main mechanism connecting diseases that are commonly associated with obesity, such as, type 2 diabetes mellitus, atherosclerosis, and non-alcoholic steatohepatitis, among others. Subclinical inflammation plays a major role in the induction of insulin resistance in obesity. Recently, endoplasmic reticulum stress and the activation of TLR4 signaling have been identified as potential triggering mechanisms for obesity-associated subclinical inflammation. At the intracellular environment activation of inflammatory signaling triggered by either endoplasmic reticulum stress or TLR4 signaling can integrate and modulate or be modulated by other cellular events. One such event is autophagy which is a highly regulated process that plays an important role in the control of a wide range of cellular functions such as organelle recycling, nutrient availability and tissue differentiation. A recent study has shown an increased autophagic activity in the adipose tissue of obese subjects, and a role for autophagy in obesity associated insulin resistance was proposed. Body mass reduction is the most efficient approach to tackle insulin resistance in over-weight subjects; however, the impact of weight loss in adipose tissue autophagy is unknown. In this study we used a two-step approach to evaluate adipose tissue autophagy during body mass reduction. First, a mouse model of diet-induced obesity and diabetes was submitted to a fifteen-day, 40% caloric restriction. At base-line, markers of autophagy were increased in obese mice as compared to lean controls. Upon caloric restriction, autophagy increased in the lean mice, while decreasing in the obese mice. The reintroduction of ad libitum feeding was sufficient to rapidly reduce autophagy in the lean mice and increase autophagy in the obese mice. In the second part of the study, autophagy was evaluated in the subcutaneous adipose tissue of nine obese-non-diabetic and six obese-diabetic subjects undergoing bariatric surgery for body mass reduction. Specimens were collected during the surgery, and approximately one year later. As in the mouse model, human obesity was associated with increased autophagy and body mass reduction led to an attenuation of autophagy in the adipose tissue. Thus, while caloric restriction leads to increased autophagy in the adipose tissue in lean subjects, in obesity, autophagy is defectively regulated, being increased during ad libitum feeding and reduced upon caloric restriction / Doutorado / Clinica Medica / Doutora em Ciências

Dissulfeto isomerase protéica (PDIA1 ou PDI) é uma chaperona e ditiol-dissulfeto oxido-redutase residente do reticulo endoplasmático (RE). PDI é essencial à regulação da proteostase por ter função no enovelamento oxidativo de proteínas e na via de degradação associada ao RE (ERAD). Além disso, PDI interage fisicamente e regula a atividade de NADPH oxidases, e fora da célula é um regulador redox essencial à atividade de proteínas extracelulares. Este pool epi/pericelular da PDI (pecPDI) regula função de proteínas de membrana/secretadas, como integrinas, glicoproteínas gp120 do virus HIV e outras, com múltiplas funções que incluem: trombose, ativação plaquetária, adesão celular, infecção viral e remodelamento vascular. A rota de externalização da PDI permanece obscura, e seu conhecimento pode indicar mecanismos dos efeitos (fisio)patológicos da PDI. A secreção da PDI pela rota RE-Golgi foi sugerida em células endoteliais infectadas pelo vírus da dengue, células pancreáticas e tireoideanas. No entanto, uma varredura sistemática das possíveis rotas de externalização da PDI não foi previamente realizada. Neste estudo, mostramos que células endoteliais (EC) externalizam constitutivamente, por rotas distintas, dois pools de PDI, de superfície celular e solúvel, enquanto na EC não estimulada PDI não foi detectada significativamente em micropartículas. PDI externalizada corresponde a ca.1,4% do pool total de PDI celular. Tanto a PDI de superfície celular como a solúvel foram majoritariamente secretadas pela via de secreção não-convencional do tipo IV independente de GRASP. Contudo, a via de secreção clássica também contribui para externalização basal da PDI de superfície celular, mas não da solúvel basal ou estimulada por PMA, ATP e trombina indicando que todas envolvem escape do Golgi. Além disso, a externalização constitutiva da PDI de superfície em célula muscular lisa vascular também ocorre por via independente de Golgi. Externalização da PDI não foi detectavelmente mediada pela secreção não-convencional do tipo I, II, III, lisossomos secretórios, endossoma de reciclagem e transporte ativo (dependente de ATP) em EC. Considerando que chaperonas são vias essenciais de resposta a estresses, investigamos o efeito de estresse do RE e choque térmico na pecPDI. Estresse do RE não altera a PDI de superfície celular, mas aumenta PDI solúvel. Ambos os pools de PDI não foram alterados por choque térmico, embora a recuperação desse estresse diminua a secreção de PDI. Estes dados sugerem que a liberação de PDI é um processo regulado, dependente da natureza do estresse. Bloqueio da síntese de proteínas com cicloheximida não altera pecPDI, indicando que PDI recém-sintetizada não é preferencialmente externalizada e que o tráfego da PDI independe de outras proteínas recém-sintetizadas. Um aspecto importante do estudo foi indicar uma resiliência da pecPDI à modulação individual de distintas vias secretoras, consistente com uma estrita auto-regulação e possibilidade de vias sinérgicas e complementares. Estes resultados indicam que a externalização da PDI de superfície e PDI secretada possam ser externalizadas por mecanismos independentes. Estes processos compõem um processo regulado estritamente, consistente com papel homeostático da pecPDI / Protein disulfide isomerase (PDIA1 or PDI) is dithiol-disulfide oxireductase chaperone resident in the endoplasmic reticulum (ER). PDI is essential for proteostasis, due to its support of oxidative protein folding and ER-associated protein degradation (ERAD). In addition, PDI associates with NADPH oxidase(s) and regulate its activity, while outside of the cell, PDI redox-dependently modulates extracellular proteins. This epi/pericellular PDI (pecPDI) pool is known to regulate membrane/secreted proteins such as integrins, HIV glycoprotein gp120 and others, with functions that involve thrombosis, platelet function, cell adhesion, viral infection and vascular remodeling. PDI externalization route remains enigmatic and its elucidation can help understand some (patho)physiological PDI effects. An ER-Golgi route for PDI secretion has been as described on dengue virus-infected endothelial cells pancreatic and thyroid) cells. However, none of these papers addressed PDI secretion routes in a systematic fashion. Here, we show that endothelial cells (EC) constitutively externalize, through different routes, two PDI pools, a cell-surface and a secreted one, while in nonstimulated ECs PDI was not significantly detected in microparticles. Externalized PDI corresponds to < 2% of total cellular PDI pool. Both cell-surface and soluble PDI were predominantly externalized through unconventional type IV GRASP-independent pathway(s). However, the classical secretory pathway also contributes to basal cell-surface, but not soluble, PDI externalization, as PMA, ATP or thrombin-stimulated secretion also involve Golgi bypass. Furthermore, constitutive cell-surface PDI externalization in vascular smooth muscle cells also occurs in a Golgi-independent way. PDI externalization was not detectably mediated by non-conventional type I, II and III secretion routes, secretory lysosomes, recycling endosomes and ATP dependent active transport in EC. Since chaperones are essential for cellular stress response, we assessed the effects of ER stress and heat-shock on pecPDI. ER stress did not affect cell-surface PDI but increased the soluble pool. Both PDI pools were unaltered by heat shock, while stress recovery decreased PDI secretion. These data suggest that PDI release is finely tuned and dependent on the type of stress. Blockade of protein synthesis with cycloheximide did not change pecPDI levels, suggesting that newly-synthesized PDI is not preferentially externalized and that PDI traffic does not require newly-synthesized proteins. An important aspect of the study was the evidence for pecPDI resilience to individual modulation of distinct secretion routes, consistent with strict auto-regulation and possible synergic or complementary pathways. Overall, our data suggest that cell-surface and secreted PDI pool externalization are regulated through independent mechanisms, which in both cases involve Type IV non-conventional routes, with some minor contribution of Golgi-dependent secretory pathway. These patterns compose a strictly regulated process, consistent with an important homeostatic role for pecPDI

A Síndrome de Marfan (SMF) é a enfermidade hereditária mais comum dentre as que afetam o sistema conjuntivo, causada por mutações da glicoproteína fibrilina-1, o principal componente estrutural das microfibrilas elásticas da matriz extracelular. As manifestações fenotípicas da SMF são sistêmicas e acometem tipicamente os sistemas ocular, esquelético e cardiovascular, este uma importante causa de morbi-mortalidade. Entretanto, não está claro como a mutação induz a doença. Estudos anteriores sugerem anomalias morfológicas do retículo endoplasmático (RE) ou retenção intracelular da fibrilina-1 nos estágios avançados da SMF. Entretanto, a contribuição do enovelamento da fibrilina-1 mutada e do estresse do RE na fisiopatologia celular da SMF não é conhecida. Proteínas mal-enoveladas podem levar à retenção intracelular e/ou aumento da degradação através da via de degradação associada ao RE (ERAD), além da indução da resposta a proteínas mal-enoveladas (UPR), ambas com potencial contribuição à fisiopatologia de doenças, incluindo a SMF. Assim, estudamos em fibroblastos embrionários isolados de camundongos (MEFs) com SMF se a fibrilina-1 mutada é reconhecida pelo controle de qualidade do RE pelo seu mal- enovelamento e induz estresse do RE por sua retenção intracelular. Demonstramos que a mutação na fibrilina-1 per se não promoveu chaperonas marcadoras de UPR ou geração de oxidantes. Além disso, não levou a uma maior sensibilização das células à indução exógena de estresse do RE, nem promoveu maior morte celular após inibição do proteassoma. Além disso, não foi observada retenção intracelular da fibrilina-1 nas células SMF, e mesmo após inibição da via secretora ou indução de estresse do RE, a inibição da secreção da fibrilina-1 foi similar nos MEFs SMF e wild-type (WT). A dissulfeto isomerase proteica (PDI), uma importante chaperona redox do RE, interage com fibrilina-1, e seu silenciamento levou a um aumento na secreção da fibrilina-1 pelos MEFs WT, mas não SMF. Além disso, o silenciamento da PDI promoveu a desorganização da matriz extracelular depositada de fibrilina-1 nos MEFs WT, enquanto nos MEFs SMF, a desorganização basal da matriz não foi adicionalmente alterada. Em paralelo, investigações in vivo mostraram que o estresse do RE não é induzido em camundongos SMF com 1 ou 3 meses de idade, apesar de manifestações fenotípicas evidentes. Entretanto, concomitante à progressão da doença, detectamos a ocorrência de estresse do RE nas aortas ascendentes dos camundongos aos 6 meses. Esta detecção foi exclusiva desta região da aorta e não ocorreu em outros órgãos afetados ou não afetados pela SMF. Assim, a manifestação do fenótipo clássico da SMF não requer uma perda da homeostase do RE diretamente induzida pela fibrilina-1 mutada. Ao contrário, esta é capaz de evadir mecanismos de controle de qualidade mediados pela PDI, sendo secretada normalmente. Assim, esta evasão do controle de qualidade pela PDI é uma condição permissiva essencial para o fenótipo da SMF. Por outro lado, o estresse do RE é uma característica evolutiva do aneurisma da aorta ascendente na SMF concomitante ao agravamento do fenótipo neste tecido / Marfan syndrome (MFS) is the most common connective tissue hereditary disease, caused by mutations in the glycoprotein fibrillin-1, the main structural component of extracellular matrix elastic microfibrils. MFS phenotypic manifestations are systemic and typically involve the ocular, skeletal and cardiovascular systems, the latter a major cause of morbidity/mortality. However, how gene mutation induxes disease is yet unclear. Previous studies suggest endoplasmic reticulum (ER) morphological abnormalities or fibrillin-1 intracellular retention in advanced MFS stages. However, the contribution of mutated fibrillin-1 folding and ER stress to MFS cellular pathophysiology is unknown. Un/misfolded proteins may associate with their intracellular retention and/or increased degradation through ER-associated degradation (ERAD), in addition to inducing the unfolded protein response (UPR), both sharing potential contributions to disease pathophysiology, including MFS. Thus, we studied in embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from WT and MFS mice, if mutated fibrillin-1 can be recognized by ER quality control as a misfolded protein, able to induce ER stress due to its intracellular retention. We showed that fibrillin-1 mutation by itself did not promote UPR chaperone markers or oxidant generation. Moreover, it did not sensitize cells to exogenous ER stress nor affected cell survival curves after proteasome inhibition. Furthermore, no intracellular retention of fibrillin-1 was observed in MFS cells, and even after secretory pathway inhibition or ER stress induction, fibrillin-1 secretion inhibition was similar in MFS and wild-type (WT) MEFs. Protein disulfide isomerase (PDI), an important ER redox chaperone, interacts with fibrillin-1 and its silencing induced an increased fibrillin-1 secretion in WT, but not MFS MEFs. Besides, PDI silencing promoted fibrillin-1 extracellular matrix disorganization in WT MEFs, whereas in MFS MEFs, the basal matrix disorganization was not further modified. Parallel in vivo evaluations demonstrated that ER stress is also not induced in 1 and 3 month-old mice MFS, despite evident phenotypical manifestations. However, concomitant to accelerated disease progression at 6 months, ER stress was detectable in ascendant aorta, but not in other disease-affected or unaffected organs. Thus, classic MFS phenotype manifestations do not require loss of ER homeostasis directly induced by mutated fibrillin-1. Contrarily, the latter can evade a PDI-mediated quality control mechanism to be normally secreted. Therefore, evading such PDI-mediated quality control is an essential permissive condition for enabling the MFS phenotype. On the other hand, ER stress is an evolutive feature of MFS ascendant aorta aneurysm concomitant to phenotype progression in this tissue

Tesis por compendio / [EN] Previous results obtained in the research group where this thesis has been performed shown that the MNSV uses the cellular secretory pathway, through its membrane protein DGBp2 (p7B) to reach the cell periphery. Knowledge about signals/motifs of membrane proteins that facilitate or permit such transport was then rather scarce. In this work we determined the residues involved in the transport of a viral transmembrane protein through the early secretory pathway (DGBp2, MNSV p7B). The residues involved are located in both the Nt (cytosolic) and Ct region (luminal) being one of the first examples in plants of a luminal ER export signal. With this information we have proposed a model in which after insertion and correct folding of the protein in the ER membrane, the luminal Ct of p7B interacts through the K49 residue with a transmembrane adapter associated with the actin cytoskeleton for movement and concentration in the RE-cortical. Nt cytoplasmic seems to be necessary to associate with the COPII vesicle components. Moreover, we have deepened in the study of the interactome of the carmovirus MPs and we have identified through a two-hybrid assay (Y2H), three cellular proteins capable of interacting with three DGBp1 from three different carmovirus (MNSV, TCV and CarMV). These cellular factors are the 60S ribosomal protein P3 (RPP3A), the g subunit of the translation initiation factor 3 (eIF3g) and the transcription factor WRKY36. These interactions were confirmed by BiFC. Furthermore, mutagenesis assays showed that binding domain of these DGBp1 is a FNF conserved domain at the very Ct end. The fact that these three proteins interact with the same host factors suggest a possible mechanism common to most if not all carmoviruses. The unstructured Nt region of MNSV CP, as for other RNA viruses, generally is responsible for viral RNA binding so it is usually called R domain. By using substitution and deletion mutants, we have shown that this R domain (which in MNSV comprising the first 94 residues) is not involved only in the packaging and binding of the viral genome, but is also responsible of CP multifunctionality. By EMSA assays with deletion mutants we could determine that the R domain was essential for binding of RNA. It was further noted that within the R domain there was a conserved region between aa 60 to 91 region, which appears to play a role in both the genomic RNA binding and in vitro encapsidation of subgenomic RNAs. However, in packaging assays, it was observed that the R domain is essential for full genome encapsidation and that the region between residue 31 and 91 is required for both cell to cell and systemic movement. Finally, using PVX as an expression vector, we showed that MNSV CP can act as a suppressor of silencing most likely by sequestering sRNAs. With very few exceptions, plant viruses use the phloem to move from infection sites to distal parts of the plant. In order to know the phloem proteome of infected plants and to identify in the future potential host proteins that facilitate or hinder the systemic transport of viruses, in the last chapter we conducted a comparative proteomic analysis by 2D-DIGE between phloem of MNSV-infected and healthy melon plants. From a total of 1046 spots, 25 were detected having significant abundance changes between the two conditions. After mass spectrometric analysis, 22 spots corresponding to 19 protein, were identified (13 of which were overrepresented and 9 had decreased abundance). Many of the identified proteins were involved in cell death and control of redox homeostasis. Two of these 19 proteins were never described in phloem proteomic assays. / [ES] Resultados previos obtenidos en el grupo de investigación donde se ha realizado la presente Tesis habían puesto de manifiesto que el MNSV utiliza la ruta de secreción celular, a través de su proteína de membrana DGBp2 (p7B), para alcanzar la periferia celular. Hasta el momento de realizar la presente Tesis los conocimientos sobre las señales/motivos de las proteínas de membrana que facilitan o permiten dicho transporte eran más bien escasos. En este trabajo hemos determinado los residuos implicados en la salida de una proteína transmembrana viral en la ruta de secreción temprana (DGBp2, p7B MNSV). Los residuos implicados se encuentran tanto en la región Nt (citosólica) como en la Ct (luminal) siendo éste uno de los primeros ejemplos descritos en plantas de señal luminal de salida de RE. Con todos estos datos se ha propuesto un modelo en el que después de la inserción y correcto plegamiento de la proteína en la membrana del RE, el Ct luminal de p7B interacciona a través del residuo K49 con un adaptador transmembrana asociado al citoesqueleto de actina para su movimiento y concentración en el RE cortical. El motivo Nt citoplasmático sería necesario para el ensamblaje de la vesícula COPII. Por otra parte se ha profundizado en el estudio del interactoma de las MPs de los carmovirus y se han identificado, mediante un ensayo de doble híbrido (Y2H), tres proteínas celulares capaces de interaccionar con tres DGBp1 procedentes de tres carmovirus diferentes (MNSV, TCV y CarMV). Estos factores celulares son la proteína P3 del ribosoma 60S (RPP3A), la subunidad g del factor de iniciación de la traducción 3 (eIF3g) y el factor de transcripción WRKY36. Estas interacciones fueron confirmadas por BiFC. Además, mediante ensayos de mutagénesis se demostró que el dominio de unión de estas DGBp1 es un dominio Ct (FNF) conservado. El hecho de que estas tres proteínas interaccionen con los mismos factores sugiere un posible mecanismo común para todos o la mayor parte de los carmovirus. Las CPs virales constituyen el paradigma de la multifuncionalidad proteica y, además de su obvio papel estructural, intervienen en un gran número de procesos del ciclo viral, incluyendo el transporte del RNA viral. La región Nt desestructurada de la CP del MNSV, al igual que para otros virus de RNA, generalmente es la encargada de unir el RNA viral por lo que se le suele llamar dominio R. Mediante mutantes de deleción y sustitución se ha demostrado que este dominio R (que en el MNSV comprende los primeros 94 residuos) no interviene solo en la encapsidación y unión del genoma viral, sino que es la responsable de la multifuncionalidad de la CP. Mediante EMSAs con mutantes de deleción se pudo determinar que la región R es esencial para la unión del RNA. Además se observó que dentro del dominio R se encuentra una región conservada entre los aa 60 al 91, que parece desempeñar un papel tanto en la unión de RNA genómico in vitro como en la encapsidación de RNAs subgenómicos. Sin embargo, en ensayos de encapsidación se observó que todo el dominio R es esencial para la encapsidación del genoma completo y que la región comprendida entre el residuo 31 y el 91 es necesaria para el movimiento tanto célula a célula como sistémico. Finalmente, utilizando PVX como vector de expresión, se demostró que la CP del MNSV puede actuar como un supresor del silenciamiento mediante la unión a los sRNAs. Con objeto de conocer el proteoma del floema de plantas infectadas y poder en el futuro identificar posibles proteínas del huésped que faciliten o dificulten el transporte sistémico de los virus, en el último capítulo se llevó a cabo un análisis proteómico comparativo, mediante 2D-DIGE, entre floemas de plantas de melón infectadas con MNSV y plantas sanas. Se detectaron 1046 spots de los cuales 2 poseían cambios significativos entre las dos condiciones Dos de estas 19 proteínas no habían sido descritas previamente en ens / [CA] Resultats previs obtinguts en el grup de recerca on s'ha realitzat la present Tesi havien posat de manifest que el MNSV utilitza la ruta de secreció cel·lular, a través de la seva proteïna de membrana DGBp2 (p7B), per arribar-hi a la perifèria cel·lular. Fins al moment de realitzar la present Tesi els coneixements sobre els senyals/motius de les proteïnes de membrana que faciliten o permeten aquest transport eren més aviat escassos. En aquest treball hem determinat els residus implicats en el transport d'una proteïna transmembrana viral a través de la ruta de secreció primerenca (DGBp2, p7B MNSV). Els residus implicats es troben tant a la regió Nt (citosòlica) com en la Ct (luminal) sent aquest un dels primers exemples descrits en plantes de senyal luminal de sortida de RE. Amb totes aquestes dades s'ha proposat un model en el qual després de la inserció i correcte plegament de la proteïna en la membrana del RE, el Ct luminal de p7B interacciona a través del residu K49 amb un adaptador transmembrana associat al citoesquelet d'actina per al seu moviment i concentració en el RE cortical. El motiu Nt citoplasmàtic caldria per a l'acoblament de la vesícula COPII. D'altra banda s'ha aprofundit en l'estudi del interactoma de les MPs dels carmovirus i s'han identificat, mitjançant un assaig de doble híbrid (Y2H), tres proteïnes cel·lulars capaces d'interaccionar amb tres DGBp1 procedents de tres Carmovirus diferents (MNSV, TCV i CarMV). Aquests factors cel·lulars són la proteïna P3 del ribosoma 60S (RPP3A), la subunitat g del factor d'iniciació de la traducció 3 (eIF3g) i el factor de transcripció WRKY36. Aquestes interaccions van ser confirmades per BiFC. A més, mitjançant assajos de mutagènesi es va demostrar que el domini d'unió d'aquestes DGBp1 és un domini Ct (FNF) conservat. El fet que aquestes tres proteïnes interaccionen amb els mateixos factors suggereix un possible mecanisme comú per a tots o la major part dels carmovirus. Les CPs virals constitueixen el paradigma de la multifuncionalitat proteica i, a més del seu obvi paper estructural, intervenen en un gran nombre de processos del cicle viral, incloent el transport de l'RNA viral. La regió Nt desestructurada de la CP del MNSV, igual que per altres virus de RNA, generalment és l'encarregada d'unir l'RNA viral pel que se li sol cridar domini R. Mitjançant mutants de deleció i substitució s'ha demostrat que aquest domini R (que en el MNSV comprèn els primers 94 residus) no intervé només a la encapsidación i unió del genoma viral, sinó que és la responsable de la multifuncionalitat de la CP. Mitjançant EMSAs amb mutants de deleció es va poder determinar que el domini R essencial per a la unió de l'RNA. A més es va observar que dins del domini R es troba una regió conservada entre els aa 60 al 91, que sembla tenir un paper tant en la unió de RNA genòmic in vitro com en l'encapsidació de RNAs subgenómicos. No obstant això, en assajos d'encapsidació es va observar que tot el domini R és essencial per a l'encapsidació del genoma complet i que la regió compresa entre el residu 31 i el 91 és essencial per al moviment tant cèl·lula a cèl·lula com sistèmic. Finalment, utilitzant PVX com a vector d'expressió, es va demostrar que la CP del MNSV pot actuar com un supressor de silenciament mitjançant la unió als sRNAs. Amb l'objecte de conèixer el proteoma del floema de plantes infectades i poder en el futur identificar possibles proteïnes de l'hoste que facilitin o dificultin el transport sistèmic dels virus, en l'últim capítol es va dur a terme una anàlisi proteòmic comparatiu, mitjançant 2D-DIGE, entre floemas de plantes de meló infectades amb MNSV i plantes sanes. Es van detectar 1046 espots dels quals 25 tenien canvis significatius entre les dues condicions. Després de sotmetre les proteïnes a una anàlisi d'espectrometria de masses , es van identificar 19 proteïnes que corresponien a 22 espots Dues / Serra Soriano, M. (2016). Relación estructura-función de las proteínas virales implicadas en el movimiento de los carmovirus y su interacción con factores celulares [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/61634 / Compendio