L'ovocyte se développe au sein d'un follicule, en contact étroit avec des cellules d'origine somatique, les cellules de cumulus (CC). Ces deux types cellulaires communiquent entre eux via des jonctions intercellulaires, permettant ainsi la régulation et la coordination du métabolisme pendant le développement et la maturation de l'ovocyte. Notre hypothèse est que l'expression et la régulation des gènes dans les CC joue un rôle crucial dans des fonctions essentielles pour la croissance de l'ovocyte et l'acquisition de sa compétence. Mes travaux de thèse comportent deux parties. Dans la première partie nous avons utilisé le séquençage haut débit pour examiner le répertoire des microARN (communément appelés miRNA) dans les cellules de cumulus et dans l'ovocyte. Les miRNA, séquences d'ARN non codantes dont la longueur varie entre 19 et 25 nucléotides, ont émergé récemment comme régulateurs majeurs de nombreux processus biologiques, dont le vieillissement. Nous avons identifié 32 miRNA spécifiquement dans les cellules de cumulus humains et seulement 3 dans l'ovocyte MII. Dans la seconde partie de nos travaux, nous avons analysé l'impact de l'âge maternel sur l'expression des gènes dans les cellules de cumulus. Alors qu'une baisse de la compétence de l'ovocyte avec l'avancement de l'âge maternel est bien établie, les bases moléculaires de ce phénomène demeurent peu connues. Dans une première étape pour aborder cette question, nous avons utilisé des puces à ADN pour analyser les profils d'expression des gènes des CC en fonction de l'âge maternel. De façon remarquable l'âge maternel impacte significativement l'expression de gènes qui sont critiques pour la maturation de l'ovocyte tels que les gènes impliqués dans l'angiogenèse, les voies de signalisation de TGF-ß et de l'insuline. Par l'utilisation d'outils bioinformatiques, nous avons aussi identifié des miRNA potentiels régulateurs de gènes impliqués dans des processus ou des voies impactés par l'âge ; ils pourraient constituer de nouveaux biomarqueurs pour prédire un vieillissement ovarien prématuré ainsi que la qualité et la compétence de l'ovocyte. / The oocyte develops into a follicle where it is in close contact with cumulus cells (CCs), of somatic origin. The two cell types undergo a bidirectional communication via gap junctions, which results in the regulation and coordination of the metabolism during oocyte development and maturation. We assume that gene expression and regulation in the CCs play a crucial role in functions that are essential for oocyte growth and competence acquisition. The present study may be subdivided in two parts. In the first part we used deep sequencing to investigate the repertoire of miRNAs in the cumulus cells and the oocyte. MicroRNAs that are noncoding RNA sequences whose length is approximately 19-25 nucleotides have emerged as important regulators in many biological processes including aging. Our data showed that 32 miRNAs were specifically expressed in human cumulus cells while only 3 miRNAs were identified in MII human oocyte. The impact of maternal age on gene expression in cumulus cells was addressed in a second part of my thesis work. While the correlation of oocyte competence decline with advancing maternal age is well established, little is known on its molecular basis. In a first attempt to address this issue, we used microarrays to study gene expression profiles of human cumulus cells according to maternal age. Remarkably, maternal age greatly impacted expression of genes that are critical for oocyte maturation such as genes involved in angiogenesis, TGF-β signaling, and insulin signaling pathways. Also, using bioinformatic tools, we identified miRNAs that potentially target some of the genes involved in the aging-impacted processes and pathways; this could candidate them as new biomarkers to predict premature ovarian aging and oocyte quality and competence.

Les virus entériques sont l'une des principales causes d'épidémies de gastroentérites chez l'Homme. Ces virus sont essentiellement excrétés dans les selles et sont donc observés en grande quantité au sein des eaux usées. L'abattement viral est très variable en fonction des types de traitements mis en place dans les stations d'épurations (STEP). Malgré ces traitements, la grande majorité des STEP rejettent d'importantes quantités de virus entériques dans l'environnement. L'objectif de ce travail a été d'apporter des éléments de réponse concernant la circulation des virus entériques humains dans un environnement hydrique urbain. Pour cela, des méthodes d'analyse ont été mises au point afin de permettre la détection d'un large panel de virus entériques dans différentes matrices hydriques susceptibles d'être étudiées dans l'environnement. Trois contrôles ont été développés afin de vérifier le bon déroulement de cette méthode et donc de valider les résultats obtenus. Une campagne d'échantillonnage a été réalisée au niveau d'un tronçon de la Seine impacté par les affluents naturels et des effluents de STEP. La prise en compte des débits au niveau des différents points de prélèvement a permis de calculer les flux viraux qui correspondent à la quantité de virus circulant en un point au cours d'une unité de temps. Cette approche a permis de démontrer la contribution majeure des effluents de STEP dans la contamination virale du milieu récepteur. Parmi l'ensemble des virus entériques recherchés, les adénovirus, les norovirus, les astrovirus et les rotavirus présentaient les charges virales les plus importantes dans les effluents de STEP et dans les eaux de surface. Leurs quantités au sein de ces matrices d'eau étaient les plus importantes durant la période hivernale ce qui était cohérent avec les données épidémiologiques. Un lien étroit entre l'état sanitaire de la population humaine reliée au réseau d'assainissement et la concentration en virus entériques des effluents de STEP et des eaux de surface a pu être établi. Sur ces mêmes prélèvements, l'étude de la diversité des astrovirus et des norovirus de génogroupes I et II a été réalisée par pyroséquençage. Cette approche a permis d'établir un profil des différents génotypes circulant dans les effluents de STEP. Au regard des données épidémiologiques recueillies sur la même période par le Centre National de Référence des virus entériques, un grand nombre de génotypes communs ont pu être observés entre ces deux jeux de données. Ce constat met en évidence le caractère informatif de l'analyse des effluents de STEP qui fournit un profil relativement pertinent des virus entériques circulant dans l'environnement mais aussi dans la population humaine. La présence de virus entériques présente dans les eaux de surface, ressources utilisées pour la potabilisation, est un réel problème de santé publique. C'est pourquoi la dernière partie de ce travail s'intéresse à évaluer leur persistance dans l'eau de surface et l'eau destinée à la consommation humaine, mais aussi face à des traitements de désinfection, fréquemment utilisés dans les usines de potabilisation et parfois en sortie de STEP. L'absence de modèle cellulaire pour la plupart de ces virus nous a conduit à développer une approche basée sur l'emploi d'agents intercalants permettant d'évaluer l'intégrité de la capside des particules virales détectées par PCR en temps réel. L'utilisation de ces agents intercalants s'est avérée pertinente à partir du moment où les conditions conduisent à une dégradation des capsides virales. Par conséquent, leur emploi sur des échantillons d'eau potabilisée a permis une meilleure estimation du risque sanitaire associé à la consommation de l'eau produite. En conclusion, ce travail propose des méthodes d'analyse qui ont permis de mettre en exergue les relations existantes entre la circulation des virus entériques dans l'environnement et l'état sanitaire de la population humaine / Enteric viruses are a major cause of gastroenteritis outbreaks in humans. These viruses are mainly excreted in the faeces and are therefore observed in large amounts in wastewater. Depending on the types of treatments, virus removal from effluent may vary from one wastewater treatment plants (WWTP) to another. Despite these treatments, most of the WWTP releases significant quantities of enteric viruses in the environment. The aim of this study was to better understand the circulation of human enteric viruses in urban rivers. For this purpose methods have been developed to enable the detection of a broad panel of enteric viruses in various water matrices that may be collected from the environment. Since there is important inhibition observed in this type of water samples, three controls were developed to verify the success of this method, from the sample concentration to the PCR quantification, and thus to validate the results. A sampling campaign was carried out at the Seine River section (Paris area) affected by its natural tributaries and WWTP effluents. The river and effluent flows at the different sampling points were used to calculate the viral flows as the amount of virus circulating at a point during a time unit. This approach has demonstrated the major implication WWTP effluents in the viral contamination of the Seine River. Among all the targeted enteric viruses, adenoviruses, norovirus, astrovirus and rotavirus showed the most significant viral loads in WWTP effluents and consequently in river waters. Their quantities in WWTP effluents and surface water were the most important during the winter period which was consistent with the epidemiological data from the French Reference Center for enteric viruses. A close connection between the health status of the Parisian population and enteric virus concentration in WWTP effluents and in the Seine River could be established. The study of the diversity of astrovirus and norovirus of genogroups I and II was carried out by pyrosequencing on WWTP effluent and Seine river samples to develop a profile of the different genotypes circulating in the environment. Many common genotypes were observed between the effluent dataset and the epidemiological data collected over the same period by the French Reference Center. These results highlight the complementarity of the two datasets, and the fact that WWTP effluents provide a relevant profile of enteric viruses circulating in the environment but also in the human population. The amount of enteric viruses present in drinking water resources such as surface waters is a real public health problem. Therefore, it is important to evaluate viral persistence in surface waters during tertiary treatment and in drinking water, but also the viral persistence after usual disinfection treatments such chlorination and ultraviolet treatment. The absence of cell model for culture of most enteric viruses, has led us to develop a method using intercalating dyes to assess the capsid integrity of the viral particles quantified by real time PCR. The use of these intercalating agents was relevant when the environmental conditions and disinfection treatments caused a degradation of the viral capsid. Consequently, their use for the analysis of water samples from drinking water plants allowed to prevent an overestimation of the risk of transmission to humans by the consumption of tap water. In conclusion, this work provides development of analysis methods highlighting the relationships between the circulation of infectious enteric viruses in the environment and the health status of the human population

Les genres Anisakis, Pseudoterranova, Hysterothylacium et Contracaecum, membres de la famille des Anisakidae, sont des nématodes dont les larves sont présentes chez de nombreuses espèces de poissons et céphalopodes. Ces larves peuvent induire des pathologies digestives et/ou allergiques chez l’Homme. En France, la consommation des produits de la pêche, surtout crus ou peu cuits est en augmentation. Ce travail de thèse s’intègre dans le programme ANR Fish-Parasites, financé par l’ANR (ANR-10-ALIA-004). Il a pour but d’évaluer les risques liés à la consommation des produits de la pêche et pour objectif principal d’étudier la répartition des Anisakidae dans les produits de la pêche. _x000D_Le plan d’échantillonnage a été établi suite à une analyse de type risk-ranking utilisant les données de consommation, l’origine géographique, des données de prévalence déjà existantes sur les Anisakidae. Au total, 1768 poissons appartenant à 18 espèces ont été collectés. L’ensemble des organes a été disséqué pour isoler les parasites. Ceux-ci ont été identifiés selon 2 méthodes : i) analyse individuelle par séquençage Sanger pour les organes ayant moins de 11 nématodes ii) analyse en pool par séquençage à haut débit (HTS) pour le reste. Le développement de plusieurs outils (création d’une base de séquences de référence, conception des amorces, mise au point de la préparation de matrice de séquençage et développement d’un pipeline d’analyse automatisé) a été nécessaire pour la mise en place de la méthode HTS. A partir des résultats obtenus, une acquisition et une structuration des données de prévalence des parasites potentiellement pathogènes pour l’Homme et présents dans les produits de la pêche couramment consommés a pu être réalisée.Sur 1 768 poissons échantillonnés, deux espèces n’étaient pas du tout parasitées : plies (Pleuronectes platessa) et saumon Atlantique (Salmo salar) d’élevage. 43,30 % des poissons n’étaient pas infectés par des Anisakidae. Sur la totalité des poissons, 28,62 % étaient infectés au niveau des viscères ; 22,96% dans les viscères et les filets et 5,49 % n’étaient infectés par des Anisakidae que dans les filets.Les cinq espèces de poisson dont la prévalence dans les filets était la plus élevée étaient : la lingue bleue (100 %), la cardine franche (70 %), le lieu noir (63 %), la baudroie (61 %) et le merlu (60 %).Les Anisakidae les plus identifiés étaient : Anisakis simplex, Anisakis pegreffii, Hysterothylacium aduncum, Pseudoterranova krabbeii.Anisakis a été retrouvé dans toutes les localisations et généralement de façon plus importante, Contracaecum a été retrouvé principalement dans le foie, Hysterothylacium dans la cavité corporelle et Pseudoterranova dans les filets et la cavité corporelle.Anisakis simplex était présent dans toutes les zones de pêches sauf dans le golfe du Lion. La zone des eaux féringiennes était la zone dans laquelle la diversité des Anisakidae était la plus importante sur une seule espèce de poisson échantillonnée (lingue bleue).L’étude statistique logistique multivariée a montré que la variable espèce et la variable taille du poisson influencent la prévalence d’Anisakis et Pseudoterranova dans les filets.Le HTS sur le PGM™ Ion Torrent s’est révélé être un outil puissant et innovant permettant l’analyse d’un grand nombre d‘échantillons d’Anisakidés à moindre coût, en peu de temps et avec un résultat équivalent à la méthode individuelle par séquençage Sanger. / Anisakis, Pseudoterranova, Hysterothylacium and Contracaecum genera, members of the Anisakids family, are nematodes which larvae are recovered from numerous fish and cephalopods species. These larvae may induce digestive and/or allergic pathologies in human being. In France, the consumption of fishery products, mostly raw or undercooked is increasing. This PhD work is part of the research program Fish-Parasites funded by the ANR (ANR-10-ALIA-004). It aimed to assess risks related to fishery products consumption and its main goal was to study the distribution of Anisakids in fishery products.The sampling plan was based on a risk-ranking analysis using data on fishery products consumption, fishing areas and prevalence data from previous work on Anisakids. A total of 1 768 fish from 18 species were collected. All the organs were dissected for parasites isolation. Parasites were identified using two approaches : i) single analysis by Sanger sequencing for organs containing less than 11 nematodes ii) pooled analysis by high throughput sequencing (HTS) for the remaining. The development of numerous tools (database creation with reference sequences, primers design, set up of the sequencing template preparation and development of an automatic analytical pipeline) was necessary for the HTS method set up. From the sequencing results, acquisition and structuring of the prevalence data has been carried out on parasites potentially pathogenic for human being and recovered from commonly consumed fishery products.On 1 768 sampled fish, two species were not parasitized at all: plaice (Pleuronectes platessa) and aquacultured Atlantic salmon (Salmo salar). 43.30 % of the fish were not infected by Anisakids. Concerning infected fish, 28.62% were contaminated in the visceral organs; 22.96% in both visceral organs and fillets and, finally, 5.49% of the fish were infected by Anisakids only in fillets.The five fish species with an elevated prevalence in their fillets were by decreasing values: blue ling (100 %), megrim (70 %), saithe (63 %), monkfish (61 %) and hake (60 %). The most identified Anisakids were: Anisakis simplex, Anisakis pegreffii, Hysterothylacium aduncum, Pseudoterranova krabbeii.Anisakis has been recovered in all the localisations and generally in higher quantities, Contracaecum has mainly been recovered from the liver, Hysterothylacium from the corporal cavity and Pseudoterranova from both fillets and corporal cavity. Anisakis simplex was isolated from all the fishing areas except for the Lion Gulf and it was the genus with the most important number of individuals. The zone of Feroan waters was the region with the most important diversity of Anisakids into a single sampled fish species (blue ling).The multivariate logistic statistical study showed that the fish species and size affect the prevalence of Anisakis and Pseudoterranova in fish fillets.HTS with the PGM™ Ion Torrent proved to be a powerful and innovative tool for the analysis of large numbers of Anisakids samples with low cost, in a shorter time and with a result equivalent to the individual method of Sanger sequencing.

La déficience intellectuelle (DI) est définie par un QI < 70. La DI, répartie en formes non syndromiques et en formes syndromiques, est observée dans 3 % de la population. Des anomalies chromosomiques sont identifiées dans 15 % des DI syndromiques. Les translocations chromosomiques réciproques (TR) apparemment équilibrées sont observées chez 1 individu sur 1000 et seul 6 % des patients avec une TR de novo apparemment équilibrée ont une DI. Plusieurs mécanismes chromosomiques peuvent expliquer la DI syndromique associée à une TR : (i) un microremaniement déséquilibré identifié par l'utilisation de techniques plus résolutives, (ii) la formation d'un gène de fusion, (iii) un effetde position, (iv) la modification d’une région soumise à une empreinte parentale, (v) une interruption d'un gène au niveau d'un ou des deux points de cassure, (vi) une mutation génique sans rapport avec la TR, (vii) ou encore une cause acquise ou multifactorielle. Nous rapportons l'étude de 12 patients avec DI et porteurs d'une TR de novo apparemment équilibrée. L'analyse systématique par puces à ADN de ces individus a été réalisée avec une résolution de 25 kb. Un déséquilibre infracytogénétique au niveau des points de cassure ou ailleurs dans le génome a été observé chez 3/12 patients. Chez les 9 patients sans anomalies sur puces à ADN, nous avons étudié les points de cassure des remaniements de novo apparemment équilibrés. En dehors de la technique de marche sur le chromosome par FISH, deux autres approches ont été mises en oeuvre : (i) l'Array-Painting qui correspond à l'hybridation sur puces à ADN de chacun des dérivés chromosomiques préalablement séparés par Cytométrie en Flux, (ii) et le séquençage haut débit (WGS - Whole Genome Sequencing). Grâce à l'Array-Painting, nous avons identifié (i) chez 2 patients, des interruptions de gènes pouvant expliquer leur phénotype, à savoir les gènes : KIF1A, AUTS2 et EPHA6 ; (ii) et chez 1 patiente, un point de cassure entraînant une dérégulation de la transcription du gène MEF2C. L'étude par WGS a permis (i) chez 1 patiente, de diagnostiquer un déséquilibre plus complexe que celui observé par puce à ADN ; (ii) chez 2 patients, de mettre en évidence unchromothripsis, qui pourrait avoir un impact dans les pathologies constitutionnelles par interruption de gènes et/ou par effet de position ; (iii) et chez 2 autres patients, de caractériser précisément les points de cassure. Ainsi, grâce aux résultats obtenus par ces différentes techniques, plusieurs mécanismes physiopathologiques responsables de DI sont mis en évidence permettant un conseil génétique adéquat. Cependant, aucun mécanisme chromosomique commun ne peut être identifié hormis le chromothripsis observé chez patients. Finalement, ce travail nous permet principalement de comparer les techniques mises en oeuvre qui se sont avérées complémentaires. En conclusion, nous proposons une démarche diagnostique pour explorer un remaniement chromosomique apparemment équilibré chez des patients à phénotype anormal / Intellectual disability (ID) is defined by an IQ <70. ID, observed in 3% of the population, and displays heterogeneous origins, including acquired etiology (toxicologic, pathologic, traumatic) or genetic disorders with non-syndromic and syndromic forms. Numerical or structural chromosomal abnormalities are observed in 15% of patients with ID. Reciprocal balanced chromosomal translocations (RT) are observed in one individual in 1000. However, only 6% of patients carrying a de novo apparently balanced RT present ID. The relation between these balanced rearrangements and ID could be explained by different mechanisms namely (i) subtle rearrangement, (ii) gene fusion, (iii) position effect, (iv) disturbance of parental imprinting, (v) gene disruption at the breakpoints, (vi) mutation in gene unrelated to the translocation, (vii) or acquired or multifactorial cause. We report a chromosomal study of 12 patients with DI and carrying a de novo apparently balanced reciprocal translocation. A systematic analysis by microarrays was performed in all individuals (using a resolution of 25 kb). For three patients, a microdeletion was observed at the breakpoints or elsewhere in the genome. For the 9 remaining cases, we hypothesize that the phenotype is due to a disruption of gene(s) located at the breakpoint(s). In this context, we studied the breakpoints of the apparently balanced de novo rearrangements in these patients. Outside FISH walking, two approaches have been implemented namely Array-Painting, which combines flow chromosome sorting in an attempt to isolate derivative chromosomes from each other and DNA microarrays as well as Whole Genome Sequencing (WGS). Using Array-Painting, we identified (i) in 2 patients, a gene disruptions: in the KIF1A, AUTS2 and EphA6 genes; (ii) and in 1 patient, a breakpoint resulting in deregulation of transcription of the gene MEF2C. The WGS technology has permitted (i) in 1 patient, to diagnose more complex imbalance than that observed by micro-array; (ii) in 2 patients, to show a chromothripsis, (iii) and 2 other patients, to characterize precisely breakpoints. In conclusion, taking together, these results highlight different physiopathological mechanisms responsible for DI allowing adequate genetic counseling. However, no common chromosomal mechanism can be identified except for chromothripsis observed in 2 patients. In addition, this work allows us especially to compare the used techniques which seem to be complementary. Finally, we propose a pipeline to elucidate the etiology of the abnormal phenotype in patients carrying an apparently balanced rearrangement

Les mécanismes de régulation de l’expression génétique sont essentiels pour l’adaptation du comportement cellulaire face à son environnement (différenciation, développement, réponse à un stimulus). Les études moléculaires décrivent une grande diversité de facteurs impliqués dans ce phénomène (TFs, marques épigénétiques, nucléosomes) et plusieurs niveaux de régulation (initiation, élongation, épissage, maturation) qui expliquent la complexité du transcriptome cellulaire. Durant ma thèse, nous nous sommes intéressés aux processus de régulation de la transcription en nous appuyant sur le modèle de la différenciation lymphocytaire murine. Nos études décrivent le recrutement des GTFs et une activité transcriptionnelle caractéristique aux promoteurs des gènes et sur les enhancers. Nous montrons également que les ilots CpG (CGIs) sont des éléments régulateurs majeurs chez les mammifères et qu’ils contribuent de manière transcription-indépendante à la déplétion nucléosomale observée aux promoteurs de certains gènes. Nos collaborations nous ont également permis d’aborder des sujets relatifs à l’élongation de la transcription, l’épissage alternatif, ou les combinatoires de PTMs que peuvent exhiber le CTD de l’ARN Pol II et les queues d’histones. Dans un contexte de transition de l’ère pré-génomique vers des approches expérimentales pangénomiques (s’appuyant notamment sur les technologies de séquençage haut débit), une proportion importante de ma période doctorale fut consacrée au développement d’outils bioinformatiques pour le traitement et les analyses de données expérimentales, issues de ChIP-on-chip puis de HTS (ChIP-Seq, MNase-Seq, RNA-Seq). / Mechanisms underlying the regulation of genetic expression are crucial for cell maintenance and adaptation to environment (differentiation, development...). Molecular approaches reveal a great diversity of factors involved in this process (TFs, epigenetics, nucleosomes) and several layers of regulation (transcription initiation, elongation, splicing, maturation) which contribute to the observed transcriptome complexity. During my thesis, we studied the mechanisms of transcription regulation in mammals during lymphocyte differentiation. Briefly, we described the recruitment of GTFs and the transcriptional activity occurring on promoters and enhancers. We also reveal that CpG islands (CGIs) are major regulator elements in mammals, which contribute to nucleosome depletion in a transcription-independent manner on a significant amount of promoters. Together with our collaborators, we also studied the mechanisms of transcription elongation, alternative splicing, or the complex combinatorial patterns of PTMs that can be set on the CTD of RNA Polymerase II and on histone tails. In the context of transition from pre-genomic studies to genome-wide experiments, an important part of my work consisted in the development of bioinformatics tools for the processing and analysis of experimental datasets from ChIP-on-chip, and HTS technologies (ChIP-Seq, MNase-Seq, RNA-Seq).

Originaire d'Asie du Sud et de l'Est, le moustique tigre Aedes albopictus est aujourd'hui implanté sur 5 des 6 continents et les moyens de lutte mis en place pour l'éliminer peinent à freiner son expansion. Ces dernières années, l'étude des communautés microbiennes associées aux insectes a permis de démontrer leur implication dans des fonctions clefs de la biologie de leurs hôtes (nutrition, immunité, résistance aux stress biotiques et abiotiques …). Ensemble, ils constituent un super-organisme appelé holobionte. Ainsi, une meilleure connaissance de l'écologie microbienne d'Ae. albopictus pourrait nous apporter de nouvelles perspectives dans la compréhension du fonctionnement du pathosystème vectoriel. C'est dans ce contexte que s'est inscrit mon projet de thèse qui a consisté à décrire le microbiote bactérien du moustique tigre en lien avec son écologie et la génétique de ses populations. Nos travaux se sont tout d'abord portés sur des exemples précis d'interactions avec des symbiotes d'intérêts puis nous avons élargi cette étude à l'ensemble des communautés bactériennes et leurs facteurs de variation, en bénéficiant du développement des nouvelles technologies de séquençage. Les résultats obtenus ouvrent la voie vers de nouvelles hypothèses sur le fonctionnement et la dynamique de l'holobionte moustique avec la prise en compte des interactions symbiotiques comme un élément majeur du pathosystème vectoriel / Originated from South East Asia, the Asian tiger mosquito Aedes albopictus is now established on 5 of the 6 continents. Control strategies to limit its introduction and expansion remain restricted. Those last years, studies on insect microbial communities highlighted the key role of symbionts in the biology of their hosts (nutrition, immunity, resistance to biotic and abiotic stresses…). Together, they constitute a super-organism called the holobiont. Therefore, a better knowledge of microbial ecology of Ae. Albopictus should increase the understanding of vectorial pathosystem. In this context, my thesis project consisted to improve the description of bacterial microbiota associated with the Asian tiger mosquito in relation with its ecology and population genetics. We first based our attention on specific models of symbiotic interactions and then we extended our study to the whole bacterial community and its variation factors using high throughput sequencing technologies. Our results open the way to new hypotheses about the function and dynamics of mosquito holobionte taking into account the symbiotic interactions as a major component of the vectorial pathosystem

La malformation anévrysmale de la veine de Galien (MAVG) est une malformation vasculaire cérébrale congénitale qui représente près d’un tiers des anomalies vasculaires pédiatriques. Au sein d’une cohorte de 51 patients atteints d’une MAVG, nous avons identifié 5 individus porteurs de mutations hétérozygotes pathogéniques d’EPHB4. Ces mutations incluent une mutation tronquante survenue de novo ainsi que des mutations d’épissage et faux-sens hétérozygotes délétères héritées d’un parent. L’invalidation d’EPHB4 chez les embryons de Danio rerio est à l’origine d’anomalies vasculaires cérébrales spécifiques impliquant la veine dorsale longitudinale, la veine orthologue médiane du prosencéphale (précurseur embryonnaire de la veine de Galien). La co-injection de l’ARNm tronqué a permis la restauration d’un phénotype sauvage démontrant que le phénotype vasculaire observé est la conséquence d’une perte de fonction d’EPHB4. L’ensemble de ces données indique qu’EPHB4 est un gène déterminant chez un sous-groupe de patients atteints d’une MAVG, comme chez Danio rerio. Les mutations perte de fonction d’EPHB4 sont à l’origine d’anomalies spécifiques du développement vasculaire cérébral. L’identification de mutations pathogéniques d’EPHB4 chez des patients présentant des malformations capillaires implique une surveillance attentive de la grossesse. Cette surveillance échographique renforcée pourrait permettre la détection précoce d’une MAVG et une prise en charge anténatale et néonatale optimale. / Vein of Galen aneurysmal malformation (VGAM) is one of the most common fetal brain vascular malformations. We conducted whole exome sequencing in 19 unrelated VGAM patients and subsequently screened candidate gene in a cohort of 32 additional patients. We found 5 affected individuals with heterozygous mutations in EPHB4 including de novo frameshift or inherited deleterious splice or missense mutations predicted to be pathogenic by in silico tools. Knockdown of EPHB4 in zebrafish embryos leads to specific anomalies of dorsal cranial vessels including dorsal longitudinal vein, the ortholog of the median prosencephalic vein, the embryonic precursor of the vein of Galen. This model allowed todemonstrate EPHB4 loss of function mutations in VGAM by the ability to rescue the brain vascular defect in knockdown zebrafish co-injected with wild type but not truncated EPHB4 mimicking the frameshift mutation. Our data showed that in both species, loss of function mutations of EPHB4 result in specific and similar brain vascular development anomaliesThe identification of EPHB4 pathogenic mutation in patients presenting capillary malformation or VGAM should lead to careful follow up of pregnancy of carriers for early detection of VGAM in order to propose optimal neonatal care. Endovascular embolization indeed greatly improved the prognosis of VGAM patients.

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est le lymphome avec phase circulante le plus fréquent chez l’adulte dans les pays occidentaux. Elle est caractérisée par une grand hétérogénéité dans son évolution naturelle avec des formes indolentes ne nécessitant jamais de traitement spécifique et des formes agressives requérant une chimiothérapie rapidement après le diagnostic. Dans ce travail de thèse, nous avons posé la question du rôle des anomalies moléculaires et en particulier des gènes des immunoglobulines dans l’histoire naturelle de la maladie, tant au plan mécanistique que pour le pronostic. Nous avons étudié trois remaniements atypiques impliquant un gène des immunoglobulines et un partenaire inconnu dans la LLC/lymphome lymphocytique. Les points de cassure ont pu être identifiés et nous ont permis de mettre en évidence l’implication dans 2 cas d’ARN longs non codants en 17q25 et 8q24. De plus, deux cas ont des points de cassure dans une région chromosomique restreinte (espacés de 200 kb en 17q25). Il pourrait s’agir d’un locus important dans la lymphomagénèse, de même que pour la région 8q24 contenant MYC et de nombreux gènes non codants jusqu’ici peu explorés. Par ailleurs, dans l’ère du séquençage haut débit, de nombreux marqueurs pronostiques moléculaires sont décrits dans la LLC. Nous avons démontré que l’électrophorèse des protéines sériques normale (immunoglobulines polyclonales sans hypogammaglobulinémie) au diagnostic, un marqueur simple et peu couteux, reste dans l’ère du NGS, un marqueur indépendant de bon pronostic dans la LLC. Sa combinaison avec un statut IGHV muté identifie un groupe de patients qui n’auront probablement jamais besoin de traitement spécifique. Ce travail nous a conduit à mettre au point un outil performant de détection des anomalies de nombre de copies par séquençage haut débit. Celui-ci permet la mise en évidence de disomies uniparentales dont la signification pronostique n’est actuellement pas établie dans la LLC. Ces anomalies pourraient être le reflet d’une instabilité chromosomique et il serait intéressant d’étudier leur impact pronostique dans la LLC. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most frequent lymphoma with leukemic phase in the elderly in Western countries. It is characterized by a great heterogeneity in its natural history with indolent forms never requiring any specific treatment and aggressive forms needing chemotherapy rapidly after diagnosis. In this work of thesis, we asked the question of the role of molecular abnormalities, and in particular of the immunoglobulin genes in the natural history of the disease, at mechanistic level and for prognosis. We studied three atypical rearrangements implicating an immunoglobulin gene and an unknown partner in CLL/lymphocytic lymphoma. The breakpoints have been identified and the implication of long non coding RNA was highlighted in two cases in 17q25 and 8q24. Moreover, two cases harboured breakpoints in a restricted chromosomic region (200 kb spaced in 17q25). It could be an important locus in lymphomagenesis, as is 8q24 region containing MYC and numerous other non coding genes poorly characterized by now. Furthermore, in high throughput sequencing (HTS) era, many molecular prognosis markers have been described in CLL. We demonstrated that normal serum protein electrophoresis (polyclonal immunoglobulin without hypogammaglobulinemia) at diagnosis, a simple and unexpensive marker, stays in HTS era an independent good prognosis marker in CLL. Its combination with unmutated IGHV genes status identifies a group of patients who will probably never require any specific treatment. This work led us to develop an efficient tool to detect copy number variations by THS. This tool allows to highlight uniparental disomy whose prognosis signification is not established in CLL. These abnormalities could reflect chromosomal instability and it could be interesting to study their prognosis impact in CLL.

Les cancers pédiatriques représentent la première cause de décès par maladie chez les enfants puisque 20% des patients présentent des résistances et rechutent. Les traitements actuels sont à leurs limites d'efficacité mais aussi de toxicité. L'amélioration des connaissances de la biologie des tumeurs résistantes et l'identification de nouvelles cibles moléculaires sont nécessaires pour ces pathologies rares, extrêmement diverses et mal comprises. Les oncogènes de fusion sont responsables de l’oncogenèse de ~ 20% des cancers. En raison de la biologie particulière des cancers pédiatriques, nous avons émis l'hypothèse qu’ils seraient dus à des oncogènes de fusion. Leur exploration, particulièrement à la rechute où les données actuelles sont limitées, permettrait de mieux comprendre ces pathologies et d’introduire de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre premier objectif était de détecter de nouveaux transcrits de fusion parmi 48 patients pédiatriques en rechute inclus dans l'essai de médecine de précision MOSCATO-01 mené à Gustave Roussy. A partir de données de RNA-seq, nous avons détecté l’ensemble des fusions retrouvées dans ces tumeurs et classé les plus pertinentes selon leur fonction et leur potentiel thérapeutique. Un nouvel oncogène de fusion nommé LMO3-BORCS5 retrouvé chez un patient atteint de sarcome d'Ewing dans les biopsies tumorales à la rechute et au diagnostic, et dans diverses lignées cellulaires a particulièrement retenu notre attention. Nos études fonctionnelles montrent que LMO3-BORCS5 a un rôle important dans la tumorigenèse et la sensibilité au traitement et que BORCS5 fonctionnerait, in vivo, comme un gène suppresseur de tumeur. Ces résultats montrent le rôle critique des transcrits de fusion dans l'initiation et la progression tumorale ainsi que dans l’acquisition de résistance au traitement et que les fusions isolées ne doivent pas être ignorées. A l'avenir, la prise en charge des cancers réside en une médecine moléculaire de précision, les oncogènes de fusions représentant l'un des outils les plus remarquables en clinique. / Pediatric cancers represent the first cause of death by disease in children as 20% of patients harbor resistances and die from recurrence of the malignancy. Nowadays treatment are at their limits of efficacy but also toxicity. Improving the knowledge on the biology of the relapsed/resistant tumors and identifying new molecular targets are needed for these rare, extremely diverse and misunderstood pathologies. Fusion oncogenes are known to be major drivers of oncogenesis, responsible for ~20% of cancers. Due to their particular biology, we hypothesized that pediatric tumors would be more likely to harbor fusions and that their exploration, especially at relapse where very limited data are available, could help to understand the particularity of these malignancies and consequently to provide new therapeutic targets. Our first aim was to detect new fusion transcripts in a cohort of 48 pediatric patients at relapse included in the precision medicine trial MOSCATO-01, previously conducted in Gustave Roussy. From the RNA-seq data, we described the landscape of fusions in these tumors and classified the most confident candidates according to their biological function and druggability predictions. A new fusion named LMO3-BORCS5 found in biopsies of a patient with Ewing's sarcoma, at diagnosis and at relapse as well as in various cell lines particularly caught our attention. Functional studies showed that LMO3-BORCS5 has a high impact on tumorigenesis and treatment sensitivity and that BORCS5 would act, in vivo, as a tumor suppressor gene. Our results strengthened the critical role of fusion transcripts in tumor initiation, progression and resistance and reinforces the idea that a private fusion oncogene should not be ignored. Indeed, the future of cancer care lays in precision medicine, with fusion transcripts being one of the most remarkable tool for treatment decision.

L'utilisation de variétés présentant des résistances quantitatives polygéniques est une pratique respectueuse de l'environnement et potentiellement durable pour lutter contre les bioagresseurs. Les résistances quantitatives sont cependant mal connues et encore peu exploitées. Via l'étude de l'interaction Capsicum spp. / Phytophthora capsici, les objectifs sont de (i) caractériser la diversité naturelle de l'hôte pour le phénotype quantitatif de résistance, (ii) décrire la diversité au QTL Pc5.1, déterminant majeur de la résistance, conservé chez les géniteurs et efficace à large spectre, et (iii) déterminer le profil d'évolution moléculaire aux gènes candidats de Pc5.1. L'évaluation du niveau de résistance de ressources génétiques de Capsicum spp. et du spectre de résistance d'un panel d'accessions a permis d'identifier de nouveaux géniteurs de forte résistance au spectre large et a fourni un set d'isolats différenciant les accessions selon leur spectre. Le polymorphisme à Pc5.1 a été révélé par séquençage haut débit. Globalement, Pc5.1 présente un polymorphisme nucléotidique plus élevé que le reste du génome. Les accessions résistantes sont très peu divergentes au QTL, signe d'une forte conservation intra- et inter-génique, alors que les accessions sensibles sont plus polymorphes. Aux gènes candidats, deux haplotypes majeurs ont été identifiés, l'un présent quasi exclusivement chez des accessions résistantes et l'autre chez des accessions sensibles, ce qui confirme la forte conservation du locus et la divergence entre résistants et sensibles. Le déséquilibre de liaison mesuré aux gènes candidats étant fort, surtout chez les C. annuum, 65% des polymorphismes sont significativement associés à la résistance. Cette étude a mis en évidence le caractère contraint de l'allèle de résistance à Pc5.1 et interroge sur l'origine et l'histoire évolutive du QTL, en relation avec sonefficacité à large spectre. Il semble qu'une localisation proche du centromère limite les recombinaisons au locus et que la divergence entre les sensibles et les résistants soit un événement ancien. La détermination de la nature moléculaire et de l'histoire évolutive de Pc5.1 sera poursuivie en approfondissant les analyses de divergence des séquences et en se focalisant sur la validation fonctionnelle des gènes candidats déjà en cours. / An environmentally friendly and potentially durable strategy to control diseases is the breeding for varieties displaying quantitative polygenic resistances. However a few is known about quantitative resistances, which are thus underexploited. Through the investigation of the Capsicum spp. / Phytophthora capsici interaction, this study aimed to (i) phenotype natural host diversity for the quantitative resistance, (ii) describe the nucleotide diversity at the QTL Pc5.1, a major determinant of resistance that is retrieved among genitors and is broad-spectrum, and (iii) explore the pattern of molecular evolution at Pc5.1 candidate genes. Through the phenotyping for level of resistance in Capsicum spp. genetic resources and spectrum of resistance in a sample of accessions, novel genitors displaying strong and broadspectrum resistance have been identified, and a set of isolates that differentiate accessions according to their resistance spectrum has been established. High-throughput sequencing has been exploited to identify polymorphisms at Pc5.1. Nucleotide diversity at Pc5.1 is higher than over the genome. Resistant accessions displayed low divergence thatindicates high intra- and inter-genic conservation, while susceptible accessions are more polymorphic than resistant ones. At the candidate genes, two major haplotypes have been identified, one being almost exclusively exhibited by resistant accessions and the other by susceptible ones, which reinforces the assessments that the QTL is highly conserved and that resistant and susceptible accessions are divergent. Linkage disequilibrium at candidate genes being high, particularly for C. annuum, 65% of polymorphisms are in significant association with resistance. By highlightingthe constraint pattern of selection at Pc5.1, this study wonders about the origin and the evolution history of the QTL, in relation to its broad-spectrum efficiency. A close proximity with the centromere region seems to restrict recombinations at the QTL, and divergence between resistant and susceptible may be an ancient event. The investigation of the molecular function and the pattern of evolution of Pc5.1 will be continued through in depth study of the acquired sequences and functional validation of candidate genes already ongoing.