O fibrinogênio é uma glicoproteína presente no plasma composta por duas subunidades idênticas formadas por três pares de cadeias polipeptídicas (Aα Bβ e ϒ), interligadas por pontes dissulfeto. A trombina cliva o fibrinogênio, liberando os fibrinopeptídeos A e B, formando fibrina e, conseqüentemente, o coágulo. Esse trabalho descreve a purificação e caracterização do fibrinogênio a partir do plasma da serpente Bothrops jararaca (B. jararaca). O fibrinogênio purificado foi obtido através de adsorção com cloreto de bário, precipitações com sulfato de amônio e cromatografia de gel filtração. O fibrinogênio de B. jararaca apresentou massa molecular de 370 kDa em condições não reduzidas e, em condições reduzidas, apresentou massas moleculares de 71, 60 e 55 kDa, similares às cadeias Aα Bβ e ϒ dos fibrinogênio humano e bovino (64, 56 e 47 kDa, respectivamente). Através do seqüenciamento da região amino-terminal das cadeias polipeptídicas por degradação de Edman, foram obtidos os oito primeiros aminoácidos de cada cadeia do fibrinogênio de B. jararaca. As seqüências foram: Gly-Asp-Pro-Glu-Asp-Tyr-Leu-Gly para a cadeia Aα, Gly-Ser-Asp-His-Asp-Asp-Glu para a cadeia Bβ e Glu-Ser-X-Leu-Asp-Glu-Glu-Gly para a cadeia ϒ . As seqüências foram então comparadas com a de outros animais já descritos (NCBI-National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nih.gov), mas devido ao pequeno número de aminoácidos obtidos não foi possível observar similaridades. Através de espectrometria de massa (MALDI-TOF) foram observadas algumas seqüências peptídicas, mas não foi possível obter a seqüência completa do fibrinogênio de B. jararaca. Essas seqüências não apresentaram homologia significante com outras seqüências já descritas. O fibrinogênio de B. jararaca foi coagulado pela trombina bovina enquanto que os venenos das serpentes B. jararaca, Crotalus durissus terrificus e Lachesis muta rhombeata não foram capazes de induzir a formação de coágulo. Além disso, os anticorpos anti-fibrinogênio de B. jararaca produzidos em coelho não reconheceram o fibrinogênio humano. Contudo, os anticorpos anti-fibrinogênio humano reconheceram o fibrinogênio de B. jararaca. Assim, mesmo apresentando similaridades entre os fibrinogênios de B. jararaca e de mamíferos, eles possuem comportamentos distintos, podendo sugerir que a B. jararaca apresenta uma molécula de fibrinogênio diferente do humano para evitar um possível auto-envenenamento. / Fibrinogen is a plasma glycoprotein that is composed of two sets of three nonidentical polypeptide chains (Aα Bβ and ϒ ) which are covalently linked by disulfide bonds. Thrombin cleaves fibrinogen to form fibrin and, consequently, the fibrin clot. This work describes the purification and characterization of fibrinogen from Bothrops jararaca (B. jararaca) snake plasma. Purified fibrinogen was obtained by barium chloride adsorption, ammonium sulfate precipitation and gel filtration chromatography. B. jararaca fibrinogen showed a molecular mass of 370 kDa in non-reducing conditions, similar to human and bovine fibrinogen with 340 kDa. Reduced fibrinogen showed three chains of 71, 60 and 55 kDa, which are similar to the molecular masses of human and bovine Aα Bβ and ϒ fibrinogen chains (64, 56 and 47 kDa, respectively). B. jararaca fibrinogen was clotted by bovine thrombin, however, B. jararaca, Crotalus durissus terrificus and Lachesis muta rhombeata venoms were not able to induce fibrin formation. The N-terminal sequence of B. jararaca fibrinogen chains from PVDF membranes showed only the first eight amino acids residues from each chain. The Nterminal sequence was Gly-Asp-Pro-Glu-Asp-Tyr-Leu-Gly for Aα chain, Gly-Ser-Asp- His-Asp-Asp-Glu for Bβ chain, and Glu-Ser-X-Leu-Asp-Glu-Glu-Gly for ϒ chain. The B. jararaca fibrinogen chains N-terminal sequences were compared to other animal Nterminal sequences previously described. However, due to low signal detection during Edman degradation, the sequence results were not sufficient to provide an accurate Blast search identity (NCBI-National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nih.gov). Mass spectrometry (MALDI-TOF) analysis provides some peptide sequences that did not present the complete sequences. Besides, anti-B. jararaca fibrinogen produced in rabbit did not recognize human fibrinogen while anti-human fibrinogen recognized B. jararaca fibrinogen. Thus, despite B. jararaca fibrinogen presents a molecular mass similar to human fibrinogen, the former shows distinctive features, which protect B. jararaca snakes from a fortuitous ingress of snake venom proteins into snake circulation, which could cause a self-envenomation

A finalidade desse trabalho foi a análise de aspectos estruturais e biológicos de uma lectina do veneno de B. atrox, denominada galatrox. A purificação da galatrox envolveu dois passos cromatográficos, sendo o primeiro por afinidade em coluna de agarose-lactose e o segundo referente a aplicação do material retido no gel de agarose-lactose (LacR), em coluna de Sephadex G-25. As etapas de purificação foram monitoradas por leitura de absorbância em 280nm e SDS-PAGE. Preparações de galatrox foram submetidas à digestão in situ com tripsina e a massa molecular e o sequenciamento dos peptídeos obtidos foram determinados por espectrometria de massa (MALDI-TOF-MS e ESI-CID-MS/MS). A seqüência N-terminal de aminoácidos da galatrox foi obtida pela reação automatizada de Edman (PROCISE-419®). A atividade lectínica dessa proteína foi caracterizada por meio de testes de aglutinação de eritrócitos humanos, na presença ou ausência de diferentes carboidratos como lactose (4mM) e galactose (20mM), EDTA (5mM) e aquecimento (100ºC/10min). A desgranulação mastocitária foi determinada pela liberação de -Hexosaminidase por células RBL-2H3 sensibilizadas com IgE anti-DNP(dinitrofenil) e estimuladas com galatrox, veneno bruto, fração não retida na coluna de agarose-lactose (Lac-nR), HSA-DNP (controle positivo) ou PBS (controle negativo). O nível de indução de apoptpse e/ou necrose de células RBL-2H3 tratadas com galatrox foi avaliado pela marcação com anexina V-FITC e/ou iodeto de propídeo e analisado por citometria de fluxo (FACScanto®) com o auxílio do software (CBA-DIVA®). A camptotecina foi utilizada como referência de apoptose/necrose. A atividade edematogênica foi testada em camundongos pela injeção intraplantar de galatrox; fração Lac-nR, veneno bruto e PBS. Análise por SDS-PAGE indicou que as preparações de galatrox eram homogêneas e continham bandas de 14.000 e 28.000 de massa molecular relativa em condições redutoras ou não, respectivamente. A seqüência N-terminal foi correspondente aos seguintes aminoácidos: NNXPQDWLPMNGLXYKIFD, e a seqüência de alguns aminoácidos internos corresponderam a KDFSWEWTDR e GHSEVWLGLWDK. A atividade hemaglutinante dessa lectina foi dose-dependente e inibida por EDTA (5mM), aquecimento (100ºC/10min) e lactose (32mM, 16mM, 8mM, 4mM, 2mM, 1mM, 0,5mM). Ao contrário do veneno bruto e da fração Lac-nR, esta lectina não foi edematogênica e nem promoveu apoptose e necrose de células RBL- 2H3. A galatrox induziu uma discreta desgranulação mastocitária em comparação com o veneno bruto e a fração Lac-nR. Com base nos dados obtidos sugere-se que a galatrox é uma lectina homodímérica com 28.000 de massa molecular relativa, ligante de -galactosídeos e que apresenta similaridade estrutural com outras lectinas tipo-C do veneno de Bothrops ssp. Além disso, a galatrox comportou-se como um fraco agente pró-inflamatório e não induziu efeitos apoptótico e necrótico significantes. Finalmente, esse trabalho poderá contribuir para o melhor entendimento do impacto biológico da presença de lectinas no veneno e nos envenenamentos, bem como na geração de novos produtos biotecnológicos. / The aim of this work was the analysis of structural and biological aspects of a B. atrox venom lectin, named galatrox. The galatrox purification involved two chromatographic steps, starting with an affinity column of Lactosyl-Sepharose followed by application of the retained material on a Lactosyl-Sepharose gel (LacR) in Sephadex G-25 column. The purification steps were monitored by absorbance at 280nm and SDSPAGE. Galatrox samples were submitted to digestion in situ with trypsin and the sequencing mass of the obtained peptides were determined by mass spectrometry (MALDI-TOF-MS and ESI-CID-MS/MS). The N-terminal sequence of amino acids from galatrox was obtained by automatized Edman degradation (PROCISE-491®). The lectin activity of this protein was characterized by human erytrocytes agglutination test in presence or absence of different carbohydrates as lactose (4mM) and galactose (20mM), EDTA (5mM) and heat. The mast cells degranulation was determined by -hexosaminidase release in RBL-2H3 cells sensibilized with anti-DNP IgE and challenged with galatrox, crude venom in a non retained fraction in Lactosyl-Sepharose (Lac-nR) , HAS-DNP (positive control) or PBS (negative control). The apoptosis and/or necrosi induced level in treated RBL- 2H3 cells with galatrox was evaluated using AnnexinV and/or Propidium iodide and analysed by flow citometry (FACSCanto®) with the help software (CBA-DIVA®). The camptotecin was used with apoptosi/necrosi reference. The edematogenic was tested in mice by the intraplantar injection of galatrox, Lac-nR fraction, crude venom and PBS. SDS-PAGE analyse indicated that the galatrox preparations were homogenous and contained a single band of 14,000 or 28,000 relative molecular weight showed in reducting or non-reducting conditions, respectively. N-terminal amino acid sequence was determined as following: NNXPQDWLPMNGLXYKIFD, and some internal amino acid sequence was obtained which correspond to KDFSWEWTDR and GHSEVWLGLWDK. The hemagglutination activity of this lectin was dose dependent and inhibited by EDTA (5mM), heating (100ºC/10min) and lactose (32mM, 16mM, 8mM, 4mM, 2mM, 1mM, 0,5mM). In the other hand, the crude venom and Lac-nR fraction, this lectin was not edematogenic nor promoted apoptosis and necrosi of RBL-2H3 cells. The galatrox induced a discret mast cells degranulation compared with crude venom and Lac-nR fraction. Based in obtained datas is suggested that galatrox is a homodimeric lectin with relative molecular mass of 28,000, -galactoside bindings and that shows structural similarity with other Ctype lectins from Bothrops ssp. venom. Even more the galatrox showed to be a weak proinflamatory agent and did not induced significant apoptotic and necrotic effect. Finally this work would contribute to better understanding of the biological impact that the lectin presence in venom and in poisonings as well in the generation of a new biotechnological products.

O gênero Bothrops apresenta ampla distribuição pelo território brasileiro, sendo a espécie B. jararaca seu representante de maior importância médica na região sudeste. Análises genéticas e filogeográficas descrevem a existência de um grupo monofilético, denominado grupo Jararaca, que inclui, além da espécie B. jararaca, as espécies insulares B. alcatraz e B. insularis. A proximidade evolutiva entre estas espécies, cujo desenvolvimento se iniciou no Pleistoceno, e suas diferenças quanto à dieta, levantam subsídios para o entendimento de seus venenos e suas atividades biológicas. O objetivo deste estudo foi a caracterização dos componentes do veneno de B. alcatraz por diferentes metodologias analíticas com a finalidade de aprofundar o conhecimento sobre os venenos do gênero Bothrops e sobre a evolução dos venenos das espécies do grupo Jararaca. As abordagens analíticas utilizadas foram a avaliação do proteoma dos venenos do grupo Jararaca por eletroforese e identificação de proteínas por digestão com tripsina e análise por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS), análise do N-terminoma e do peptidoma do veneno de B. alcatraz por LC-MS/MS e análise da glicosilação dos venenos do grupo Jararaca pelo tratamento com glicosidases, cromatografia de afinidade à lectinas (concanavalin A, ConA; wheat germ agglutinin, WGA; peanut agglutininin, PNA) e caracterização do N-glicoma por MSn. Os perfis eletroforéticos unidimensionais, obtidos com e sem redução das proteínas, mostraram que o veneno de B. alcatraz difere dos venenos de B. jararaca (adultos e filhotes) e do veneno de B. insularis (adultos). O perfil eletroforético bidimensional do veneno de B. alcatraz corroborou estas diferenças e revelou que a coleta do veneno na presença ou ausência de inibidores de proteinases tem influência no número de spots visualizados. Os resultados da análise dos proteomas dos venenos do grupo Jararaca mostraram que não há diferenças qualitativas significantes entre eles, e que os três apresentam um padrão similar de distribuição das classes de toxinas. A análise quantitativa label free dos proteomas revelou algumas diferenças, indicando que o veneno de B. alcatraz apresenta maior conteúdo de metaloproteinses e fosfolipases A2, que os venenos de B. jararaca e B. insularis. A identificação do peptidoma do veneno de B. alcatraz mostrou diversas formas de peptídeos potenciadores de bradicinina, além de produtos de degradação de diferentes classes de toxinas. A avaliação da glicosilação das proteínas dos três venenos revelou que após a remoção das cadeias de N-glicanos e O-glicanos os perfis eletroforéticos se mostram mais parecidos. A identificação das proteínas do veneno de B. alcatraz que mostraram afinidade pelas lectinas revelou que a ConA interagiu com um número maior de componentes, seguida por WGA e PNA. As análises qualitativa e quantitativa do N-glicoma dos venenos do grupo Jararaca mostrou que os três venenos compartilham as mesmas estruturas de N-glicanos e em abundância relativa similar. Em conjunto, os resultados deste estudo indicaram que no grupo Jararaca, os proteomas dos venenos das espécies B. jararaca e B. insularis apresentam similaridade entre si, e se diferem do veneno de B. alcatraz, principalmente com relação ao grau de glicosilação de suas proteínas. / The Brothrops genus is largely distributed on the Brazilian territory, and B. jararaca is the species of most medical importance in the Southeastern region. Genetic and phylogeographic analyses describe the existence of a monophyletic group, named Jararaca group, which is composed of B. jararaca and of the insular species B. alcatraz and B. insularis. The close evolutionary relationship between these species, which started in the Pleistocene era, and their diet-related differences, are important aspects for the understanding of their venoms and biological activities. The aim of this study was to characterize the venom of B. alcatraz by different analytical methodologies, in order to advance the knowledge on the venoms of Bothrops genus and on the evolution of the venoms of species of the Jararaca group. The analytical approaches used in this study included the charactrization of the proteomes of the venoms of the Jararaca group by electrophoresis and protein identification by trypsin digestion and analysis by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS/MS), N-terminomic and peptidomic analyses of the venom of B. alcatraz by LC-MS/MS and glycosylation analyses of the venoms of the Jararaca group by treatment with glycosidases, affinity chromatography to lectins (concanavalin A, Con A; wheat germ agglutinin, WGA; peanut agglutininin, PNA) and characterization of the N-glicomes by MSn. The one-dimensional electrophoretic profiles were evaluated under reducing and non-reducing conditions and showed that the venom of B. alcatraz differs from B. jararaca (newborn and adult) and B. insularis (adult) venoms. The two-dimensional electrophoretic profile of B. alcatraz venom corroborated these differences and revealed that the milking of the venom in the presence or in the absence of proteinase inhibitors influences the number of spots visualized on the gel. The results of the analysis of venom proteomes of the Jararaca group showed no significant qualitative differences between them; moreover, the three venoms showed a similar pattern of distribution of toxins classes. However, the label free quantitative analysis of these proteomes revealed some differences, and indicated that the venom of B. alcatraz has a higher content metaloproteinses and phospholipase A2 than B. jararaca and B. insularis venoms. The identification of B. alcatraz venom peptidome showed various forms of bradykinin-potentiating peptides, as well as products of the degradation of different toxins classes. The assessment of the glycosylation level of proteins of the three venoms showed that after removal of N-glycan and O-glycan chains their electrophoretic profiles become more similar. The identification of B. alcatraz venom proteins that showed affinity for lectins indicated that ConA interacted with a larger number of components, followed by WGA and PNA. The qualitative and quantitative analysis of the N-glicome of the venoms of the Jararaca group showed that they share the same N-glycan structures, which were also found in similar relative abundance. Taken together, the results of this study indicate that in the Jararaca group, the venom proteomes of B. jararaca and B. insularis show similarity to each other and differ from the venom of B. alcatraz, especially with respect to the degree of protein glycosylation.

Eventos de predação e a habilidade de um animal em evita-los possuem papel crucial no fitness, atuando como força seletiva determinante no surgimento de adaptações morfofisiológicas (LIMA; DILL, 1990). Em condições naturais a interação presa-predador é influenciada pelas características extrínsecas e intrínsecas dos indivíduos, como sexo, tamanho corporal e temperatura. Para tetrápodes ectotermos a temperatura talvez represente a variável mais importante, pois de forma geral, eles experienciam variações substanciais em suas temperaturas corporais ao longo de suas atividades diárias ou sazonais, e reações enzimáticas são altamente dependentes de temperatura, assim como processos fisioquímicos, e, portanto, o desempenho do animal como um todo (LILLYWHITE, 1987). A relação entre as possíveis restrições impostas pela temperatura corporal e o comportamento defensivo em serpentes foi investigada em dezenas de trabalhos ao longo das últimas seis décadas, de modo que esses estudos apresentam discrepâncias entre si oriundas diferenças teórico-metodológicas (MORI; BURGHARDT, 2004). Diante desse panorama, o presente trabalho buscará responder a seguinte questão de pesquisa: a variação individual no comportamento defensivo da falsa-coral, Oxyrhopus guibei é dependente da temperatura? Para responder essa pergunta o objetivo desse trabalho é testar a hipótese de que em um intervalo termal ótimo, comportamentos defensivos de locomoção serão expressos em maior quantidade por indivíduos da espécie Oxyrhopus guibei, enquanto em temperaturas sub-ótimas comportamentos estáticos predominarão. Portanto, foram realizados uma série de experimentos de temperatura preferencial e comportamentais em espécimes da falsa-coral oriundos do estado de São Paulo emprestados pelo Instituto Butantan entre Setembro de 2017 e Março de 2018. Os estudos com objetivo de compreender a preferência termal de O. guibei foram realizados em um gradiente termal e no decorrer do estudo observou-se que as serpentes buscavam ativamente por intervalos específicos de temperatura de forma não oportunista. Já os experimentos comportamentais realizados em uma sala climática nas temperaturas de 17,2, 24, 30,8 e 37,6°C indicaram que na presença de um estímulo predatório simulado comportamentos de função aparente de fuga foram expressos em maior quantidade em 24°C. Indivíduos maiores tenderam a expressar comportamentos \"crípticos\" em menor quantidade que indivíduos menores. Temperatura, sexo e comprimento (CRC) não produziram efeitos significativos nos outros grupos comportamentais estudados. O dardejar foi influenciado por uma interação complexa de tamanho, sexo e temperatura. O comportamento defensivo nos indivíduos de Oxyrhopus guibei é em grande parte determinado por tendências individuais e não somente por restrições impostas pela temperatura / Predatory events and the ability of an animal to avoid them play a crucial role in fitness, acting as a selective force on the emergence of morpho-phisyological adaptations (LIMA; DILL, 1990). In natural conditions the prey-predator interaction is influenced by the individual\'s extrinsic and intrinsic characteristics, such as sex, body-size and temperature. For ectoterms tetrapods, temperature probably is the mosy important variable, because in general terms, they experience substancial variation in their body temperatures through their daily or sazonal activities, and chemical reactions are highly dependable on temperature, as well as physiochemical processes, and therefore, the animal\'s performance as a whole (LILLYWHITE, 1987). The relation between the possible restrictions imposed by body temperature and the defensive behavior in snakes has been subject to dozens of studies over the last six decades, in a way that those studies show discrepancys between them from theorical-methodologycal differences (MORI; BURGHARDT, 2004). In light of this situation, the present study sought to answer the following research question: the individual variation in the defensive behavior of the false-coral snake, Oxyrhopus guibei is temperature dependent? To answer this question the main objective of this study is to test the hypothesis that in an optimal thermal range, defensive behaviors of locomotion will be expressed in greater quantity by individuals of the species Oxyrhopus guibei, while in sub-optimal temperatures static behaviors will predominate. Therefore, a series of thermal preference and behavioral experiments were carried out on false-coral specimens from the State of São Paulo borrowed from Instituto Butantan between September 2017 and March 2018. The experiments with the objective of understand the thermal preference of O. guibei were performed in a thermal gradient and during the study it was observed that the snakes actively searched for specific temperature ranges in a non-opportunistic way. The behavioral experiments performed in a climatic room at temperatures of 17.2, 24, 30.8 and 37.6 ° C indicated that in the presence of a simulated predatory stimulus behaviors of apparent \"fleeing\" function were expressed in greater quantity by 24°C. Larger individuals tended to express \"cryptic\" behaviors in lower quantity than smaller individuals. Temperature, sex and length (SVL) did not produce significant effects in the other behavioral groups studied. The defensive behavior in Oxyrhopus guibei individuals is largely determined by individual tendencies and not only by temperature constraints

Os venenos de serpentes são complexas misturas com proteínas e peptídeos que apresentam uma variedade de atividades biológicas. Devido à riqueza de seus componentes, várias moléculas encontradas no veneno vêm sendo utilizadas com fins terapêuticos, como agentes anticoagulantes ou analgésicos. Recentemente, diversos estudos têm mostrado que substâncias oriundas do veneno de serpentes são eficazes agentes antitumorais tanto in vivo quanto in vitro. Os estudos referentes ao veneno de C. vegrandis são escassos, o que o torna um interessante objeto de investigação para o isolamento de possíveis biomoléculas com potencial antitumorigênico. No presente trabalho analisamos este veneno com o intuito de isolar novas toxinas com atividade antitumoral. Observamos atividade em varias frações que apresentaram imunoreatividade frente a um anticorpo anti-jararagina, sugerindo a presença de metaloproteinases que, sabidamente, apresentam atividade contra certos tipos de tumores. Pela análise de seqüenciamento de novo foram identificadas sequencias peptídicas idênticas as encontradas na espécie C.durissus durissus. Foi identificada também uma fração ativa de baixo peso molecular que acreditamos ser um análogo à crotoxina que já foi relatada neste veneno. / Snake venoms are complex mixtures with proteins and peptides that have a variety of biological activities. Due to the high diversity of its components, several molecules found in the venom have been used for therapeutic purposes, such as anticoagulants or analgesics. Recently, several studies have shown that substances derived from snake venom are effective antitumor agents both in vivo and in vitro. The studies on the venom of C. vegrandis are scarce, turning it into an interesting object of investigation for the isolation of new biomolecules with potential antitumour potential. In this paper we analyzed this venom in order to isolate new toxins with antitumor activity. Cytotoxicity was detected in various fractions, and the most active showed immunoreactivity against an anti-jararrhagin, suggesting the presence of metalloproteases. Some toxins from this class have already been shown to be active against certain types of tumors. We also identified a low molecular weight active fraction of believed to be analogous to a crotoxin has already been in this venom.

Eventos de predação e a habilidade de um animal em evita-los possuem papel crucial no fitness, atuando como força seletiva determinante no surgimento de adaptações morfofisiológicas (LIMA; DILL, 1990). Em condições naturais a interação presa-predador é influenciada pelas características extrínsecas e intrínsecas dos indivíduos, como sexo, tamanho corporal e temperatura. Para tetrápodes ectotermos a temperatura talvez represente a variável mais importante, pois de forma geral, eles experienciam variações substanciais em suas temperaturas corporais ao longo de suas atividades diárias ou sazonais, e reações enzimáticas são altamente dependentes de temperatura, assim como processos fisioquímicos, e, portanto, o desempenho do animal como um todo (LILLYWHITE, 1987). A relação entre as possíveis restrições impostas pela temperatura corporal e o comportamento defensivo em serpentes foi investigada em dezenas de trabalhos ao longo das últimas seis décadas, de modo que esses estudos apresentam discrepâncias entre si oriundas diferenças teórico-metodológicas (MORI; BURGHARDT, 2004). Diante desse panorama, o presente trabalho buscará responder a seguinte questão de pesquisa: a variação individual no comportamento defensivo da falsa-coral, Oxyrhopus guibei é dependente da temperatura? Para responder essa pergunta o objetivo desse trabalho é testar a hipótese de que em um intervalo termal ótimo, comportamentos defensivos de locomoção serão expressos em maior quantidade por indivíduos da espécie Oxyrhopus guibei, enquanto em temperaturas sub-ótimas comportamentos estáticos predominarão. Portanto, foram realizados uma série de experimentos de temperatura preferencial e comportamentais em espécimes da falsa-coral oriundos do estado de São Paulo emprestados pelo Instituto Butantan entre Setembro de 2017 e Março de 2018. Os estudos com objetivo de compreender a preferência termal de O. guibei foram realizados em um gradiente termal e no decorrer do estudo observou-se que as serpentes buscavam ativamente por intervalos específicos de temperatura de forma não oportunista. Já os experimentos comportamentais realizados em uma sala climática nas temperaturas de 17,2, 24, 30,8 e 37,6°C indicaram que na presença de um estímulo predatório simulado comportamentos de função aparente de fuga foram expressos em maior quantidade em 24°C. Indivíduos maiores tenderam a expressar comportamentos \"crípticos\" em menor quantidade que indivíduos menores. Temperatura, sexo e comprimento (CRC) não produziram efeitos significativos nos outros grupos comportamentais estudados. O dardejar foi influenciado por uma interação complexa de tamanho, sexo e temperatura. O comportamento defensivo nos indivíduos de Oxyrhopus guibei é em grande parte determinado por tendências individuais e não somente por restrições impostas pela temperatura / Predatory events and the ability of an animal to avoid them play a crucial role in fitness, acting as a selective force on the emergence of morpho-phisyological adaptations (LIMA; DILL, 1990). In natural conditions the prey-predator interaction is influenced by the individual\'s extrinsic and intrinsic characteristics, such as sex, body-size and temperature. For ectoterms tetrapods, temperature probably is the mosy important variable, because in general terms, they experience substancial variation in their body temperatures through their daily or sazonal activities, and chemical reactions are highly dependable on temperature, as well as physiochemical processes, and therefore, the animal\'s performance as a whole (LILLYWHITE, 1987). The relation between the possible restrictions imposed by body temperature and the defensive behavior in snakes has been subject to dozens of studies over the last six decades, in a way that those studies show discrepancys between them from theorical-methodologycal differences (MORI; BURGHARDT, 2004). In light of this situation, the present study sought to answer the following research question: the individual variation in the defensive behavior of the false-coral snake, Oxyrhopus guibei is temperature dependent? To answer this question the main objective of this study is to test the hypothesis that in an optimal thermal range, defensive behaviors of locomotion will be expressed in greater quantity by individuals of the species Oxyrhopus guibei, while in sub-optimal temperatures static behaviors will predominate. Therefore, a series of thermal preference and behavioral experiments were carried out on false-coral specimens from the State of São Paulo borrowed from Instituto Butantan between September 2017 and March 2018. The experiments with the objective of understand the thermal preference of O. guibei were performed in a thermal gradient and during the study it was observed that the snakes actively searched for specific temperature ranges in a non-opportunistic way. The behavioral experiments performed in a climatic room at temperatures of 17.2, 24, 30.8 and 37.6 ° C indicated that in the presence of a simulated predatory stimulus behaviors of apparent \"fleeing\" function were expressed in greater quantity by 24°C. Larger individuals tended to express \"cryptic\" behaviors in lower quantity than smaller individuals. Temperature, sex and length (SVL) did not produce significant effects in the other behavioral groups studied. The defensive behavior in Oxyrhopus guibei individuals is largely determined by individual tendencies and not only by temperature constraints

Submitted by Gizele Lima (gizele.lima@inpa.gov.br) on 2016-08-23T19:04:31Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Erasmo FINAL 2016.pdf: 3666794 bytes, checksum: e96be7454a9ed0686ba5638ee3f76933 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-23T19:04:31Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação Erasmo FINAL 2016.pdf: 3666794 bytes, checksum: e96be7454a9ed0686ba5638ee3f76933 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-03-10 / Instituto de Amparo a Ciência, Tecnologia e Inovação de Roraima / In studies on faunal distribution it is coherent to adopt naturally delimited regions, because allow us to interpret the results with better biogeographic accuracy, and generate more secure data on biological differentiation. In all Roraima region such studies can, depending on the question, to insert their geographic units of work into the Guiana Shield, an old geologic formation comprising part of Colombia, Venezuela, French Guiana and North Amazonia – Roraima is inserted in the central area of the Shield. In this study on snakes distribution, in regional and general scale comprising various vegetal formations, the geographic unit refers to the headwaters of the rivers Samã and Miang, both located in altitudinal areas of the Guiana Shield in Roraima (04º25', 61º08'W), region that makes the transition between the Brasilian Boa Vista Basin, region of lavrado, and the Venezuelan Gran Sabana, region of the tepuyes. The operational hypothesis is that as the geographic unit of the study is inserted into Guiana Shield, its ofiofauna is endemic to this formation – most of the species, more than 50%, will have restricted occurrence to that geologic formation. It was registered in the geographic unit of the study 42 species of snakes, included in 6 families: Leptotyphlopidae 1 genera and 1 species, Boidae 2 genera and 2 species, Colubridae 8 genera and 12 species, Dipsadidae 11 genera and 20 species, Elapidae 1 genera and 3 species and Viperidae 3 genera and 4 species. In the Guiana Shield region occur 149 species of snakes, 17 are said to be endemic to the geological formation. At least 10 species registered at BV-8 in Roraima are restricted to the Amazonian domain and North of South America: Trilepida macrolepis, Chironius multiventris, Phrynonax poecilonotus, Dipsas pavonina, Dipsas variegata, Erythrolamprus breviceps, Pseudoboa neuwiedii, Xenodon severus, Micrurus hemprichii and Bothrops atrox. Two species, Dipsas copei and Erythrolamprus trebbaui have localized distribution, occurring only in some Amazon regions; 29 species have wide distribution and only Micrurus pacaraimae can be considered endemic to the study are, so far. Although the 42 registered species occur in Shield area, the distribution is wider, therefore it can be concluded that there is no such endemic Guiana Shield ofiofauna in the geographic unit of this study. With respect to the natural history, four guilds of snakes are present into the geographic unit of study, prevailing batracophagy and saurivory, followed by those that predate birds and mammals. In respect to the reproduction most species have some link to the rain season, some with more than one reproductive cycle, most of them are oviparous. The most frequent species in this study and with more specimens collected was Bothrops bilineata, which is not common in herpetological reports. Most of the species leaving in the headwaters of the rivers Samã and Miang use forested areas to survive, showing the importance of the microhabitats associated to the headwaters of these rivers. / Nos estudos sobre distribuições faunísticas é coerente adotarmos regiões naturalmente delimitadas, porque nos permite interpretar os resultados com mais acurácia biogeográfica, além de gerar dados mais seguros sobre diferenciações biológicas. Em toda a região de Roraima estudos desta natureza podem, a depender da pergunta da pesquisa, inserir as respectivas unidades geográficas do trabalho no Escudo da Guiana, uma formação geológica antiga que ocupa parte da Colômbia, Venezuela, Guiana Francesa e norte da Amazônia – Roraima está inserido na parte central do Escudo. Neste estudo sobre distribuição de serpentes, em escala regional e geral abrangendo várias formações vegetais, a unidade geográfica de trabalho refere-se às nascentes dos rios Samã e Miang, ambos situados em áreas de altitude do Escudo da Guiana em Roraima (04º25', 61º08'W), região que faz a transição entre a brasileira Bacia de Boa Vista, região do lavrado, e a Gran Sabana venezuelana, região dos tepuyes. A hipótese de trabalho é que como a unidade geográfica do estudo está inserida no Escudo da Guiana, a sua ofiofauna é endêmica a esta formação – a maioria das espécies, mais de 50%, terá ocorrência restrita a esta formação geológica. Foram registradas na unidade geográfica de trabalho 42 espécies de serpentes incluídas em 6 famílias: Leptotyphlopidae 1 gênero e 1 espécie, Boidae 2 gêneros e 2 espécies, Colubridae 8 gêneros e 12 espécies, Dipsadidae 11 gêneros e 20 espécies, Elapidae 1 gênero e 3 espécies e Viperidae 3 gêneros e 4 espécies. Na região do Escudo da Guiana ocorrem 149 espécies de serpentes, 17 são ditas endêmicas a esta formação geológica. Ao menos 10 espécies registradas no BV-8 em Roraima estão restritas ao domínio da Amazônia e norte da América do Sul: Trilepida macrolepis, Chironius multiventris, Phrynonax poecilonotus, Dipsas pavonina, Dipsas variegata, Erythrolamprus breviceps, Pseudoboa neuwiedii, Xenodon severus, Micrurus hemprichii e Bothrops atrox. Duas espécies, Dipsas copei e Erythrolamprus trebbaui têm distribuição localizada, ocorrem em apenas algumas regiões amazônicas; 29 espécies têm ampla distribuição e apenas Micrurus pacaraimae pode ser considerada endêmica na região estudada, até o momento. Embora as 42 espécies registradas ocorram na área do Escudo, a distribuição é mais ampla, portanto conclui-se que não há uma ofiofauna endêmica do Escudo da Guiana na unidade geográfica deste estudo. Com relação à história natural, quatro guildas de cobras estão presentes na unidade geográfica do estudo, com predominância de espécies batracófagas e saurívoras, seguidas pelas que predam aves e mamíferos. Com relação à reprodução a maioria das espécies tem algum vínculo com o período chuvoso, algumas com mais de um ciclo reprodutivo, a maioria ovípara. A espécie mais frequente neste estudo e com o maior número de exemplares coletados foi Bothrops bilineata, o que não é frequente nos relatos herpetológicos. A maioria das espécies que vivem nas cabeceiras dos rios Samã e Miang utilizam as áreas de mata para sobreviverem, evidenciando a importância dos microhábitats associados às cabeceiras destes rios.

As serpentes contêm em sua peçonha inúmeras substâncias que vão desde componentes inorgânicos até proteínas complexas com diferentes atividades sobre diversos sistemas fisiológicos. As serpentes do gênero Lachesis estão distribuídas na floresta tropical da América Central e do Sul, incluindo o Brasil. Entre as substâncias encontradas na peçonha dessas serpentes estão as fosfolipases A2 (PLA2), que constituem uma família de enzimas que catalisam a hidrólise da ligação éster sn-2 em glicerofosfolipídeos e exibem uma variedade de atividades fisiológicas e patológicas, incluindo neurotoxicidade pré e pós-sináptica. Elas induzem a formação de edema, afetam a agregação plaquetária, além de serem potentes promotores de inflamação. Os objetivos desse trabalho foram o isolamento, a caracterização estrutural e bioquímica de uma nova PLA2 presente na peçonha de Lachesis muta. A peçonha foi submetida a uma filtração em gel em coluna HiPrep Sephacryl S200, obtendo-se as frações LmS-A a LmS-K. As frações LmS-G, LmS-H e Lms-I apresentaram elevada atividade fosfolipásica, com destaque para a fração LmS-G, que foi então submetida a uma cromatografia de fase reversa, obtendo-se um pico majoritário denominado Lmr-PLA2. A sequência de aminoácidos da Lmr-PLA2 apresentou alta identidade com PLA2s já descritas na literatura, porém, com alguns resíduos distintos, caracterizando-a como uma nova PLA2. Além disso, a enzima possui o resíduo D49 na sua sequência de aminoácidos, sugerindo ser uma PLA2 cataliticamente ativa, confirmado pelo ensaio de atividade hemolítica indireta. A massa molar determinada por espectrometria de massas foi de 13,9 kDa. Através de eletroforese bidimensional, foi determinado o ponto isoelétrico de 5,49, indicando ser uma PLA2 ácida. Os parâmetros cinéticos obtidos foram velocidade máxima (Vmax) e a constante de Michaelis (Km) de 1,147 nmol/min/mL e 0,404 mM além de Kcat = 0,41 min-1, ou número de turnover, e a eficiência catalítica Kcat/Km= 1,02 mM-1min-1 sobre o substrato NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid). A Lmr-PLA2 inibe a agregação plaquetária, é edematogênica, mas não é miotóxica. Os níveis plasmáticos de creatina cinase, proteínas, ureia e ?-glutamiltranspeptidase de camundongos que receberam injeção de Lmr-PLA2 não foram alterados. Estes dados juntamente com as análises de miotoxicidade demonstraram que a enzima tem baixa toxicidade in vivo. A elevada atividade catalítica e baixa toxicidade da Lmr-PLA2 tornam esta molécula promissora para o desenvolvimento de fármacos. / Snakes contain numerous substances in their venom ranging from inorganic to complex proteins with different activities on various physiological systems. Snakes of the genus Lachesis are distributed in the rainforest of Central and South America, including Brazil. Among the substances found in the venom of these snakes are phospholipases A2 (PLA2), which constitute a family of enzymes that catalyze the hydrolysis of the sn-2 ester bond in glycerophospholipids and exhibit a variety of physiological and pathological activities, including neurotoxicity pre- and post-synaptic. They induce the formation of edema, affect platelet aggregation and are potent promoters of inflammation. The objectives of this work are the isolation, structural and biochemical characterization of a new PLA2 present in the venom of Lachesis muta rhombeata. The role venom was subjected to gel filtration in Sephacryl S200, obtaining fractions LMS-A to LMS-K. The fractions LMS-G, LMS-H and LMS-I exhibited phospholipase activity, particularly the fraction LMS-G, which was then subjected to reversed phase chromatography, yielding a majority peak called Lmr-PLA2. The amino acid sequence of Lmr-PLA2 showed high identity with PLA2s already described in the literature, but with some distinct residues, characterizing it as a new PLA2. Additionally, this enzyme possesses the residue D49 in its amino acid sequence, indicating that one catalytically active PLA2 confirmed by indirect hemolytic activity. The molar mass determined by mass spectrometry was 13.9 kDa and its isoelectric point 5.49, indicating that Lm-PLA2 is an acid phospholipase. The kinetic parameters were Vmax = 1.147 nmol/min/mL and Km = 0.404 mM; Kcat = 0.41 min-1, or turnover number, e a catalytic efficiency, Kcat/Km = 1.02 mM-1min-1 with NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid) substrate. Lmr-PLA2 inhibits platelet aggregation, causes edema, but it is not myotoxic. Plasma levels of creatine kinase, protein, urea and ?-glutamyltranspeptidase of mice injected with Lmr-PLA2 have not changed. These data together with myotoxicity analysis showed that the enzyme has low toxicity in vivo. The high catalytic activity and low toxicity of Lmr-PLA2 make this molecule promising for drug development.

Os venenos de serpentes são complexas misturas com proteínas e peptídeos que apresentam uma variedade de atividades biológicas. Devido à riqueza de seus componentes, várias moléculas encontradas no veneno vêm sendo utilizadas com fins terapêuticos, como agentes anticoagulantes ou analgésicos. Recentemente, diversos estudos têm mostrado que substâncias oriundas do veneno de serpentes são eficazes agentes antitumorais tanto in vivo quanto in vitro. Os estudos referentes ao veneno de C. vegrandis são escassos, o que o torna um interessante objeto de investigação para o isolamento de possíveis biomoléculas com potencial antitumorigênico. No presente trabalho analisamos este veneno com o intuito de isolar novas toxinas com atividade antitumoral. Observamos atividade em varias frações que apresentaram imunoreatividade frente a um anticorpo anti-jararagina, sugerindo a presença de metaloproteinases que, sabidamente, apresentam atividade contra certos tipos de tumores. Pela análise de seqüenciamento de novo foram identificadas sequencias peptídicas idênticas as encontradas na espécie C.durissus durissus. Foi identificada também uma fração ativa de baixo peso molecular que acreditamos ser um análogo à crotoxina que já foi relatada neste veneno. / Snake venoms are complex mixtures with proteins and peptides that have a variety of biological activities. Due to the high diversity of its components, several molecules found in the venom have been used for therapeutic purposes, such as anticoagulants or analgesics. Recently, several studies have shown that substances derived from snake venom are effective antitumor agents both in vivo and in vitro. The studies on the venom of C. vegrandis are scarce, turning it into an interesting object of investigation for the isolation of new biomolecules with potential antitumour potential. In this paper we analyzed this venom in order to isolate new toxins with antitumor activity. Cytotoxicity was detected in various fractions, and the most active showed immunoreactivity against an anti-jararrhagin, suggesting the presence of metalloproteases. Some toxins from this class have already been shown to be active against certain types of tumors. We also identified a low molecular weight active fraction of believed to be analogous to a crotoxin has already been in this venom.

Diversos estudos de serpentes têm mostrado que algumas substâncias componentes de seus venenos possuem eficiência na atividade antitumoral nos ensaios realizados em laboratório em células in vitro e in vivo. O veneno da cascavel Crotalus vegrandis possuem atividades neurotoxica, miotoxica e hemorrágica. A crotoxina simile é um importante componente desse veneno sendo formada por uma proteína que possui uma unidade ácida (Crotapotina) ligada a uma subunidade básica (PLA2). Devido ao fato de existirem poucos estudos relativos ao veneno de Crotalus vegrandis, torna-se necessário o isolamento e a caracterização de suas biomoléculas e uma maior investigação do seu potencial e sua eficácia como agente terapêutico contra células tumorais. No presente trabalho, foi realizado o isolamento e a caracterização da crotoxina simile de Crotalus vegrandis, bem como seu efeito citotóxico em células L929 e B16F10. Realizou-se o cultivo dessas células em placas com 96 poços, para, então, serem colocadas em contato direto com diferentes frações do veneno purificado de Crotalus vegrandis por um tempo total de 48 horas. Para efeitos de comparação realizou-se o mesmo ensaio com frações do veneno purificado da cascavel brasileira Crotalus durissus terrificus. Para a avaliação da viabilidade celular o tratamento com as frações do veneno purificado de Crotalus vegrandis e Crotalus durissus terrificus, realizou-se os ensaios com MTT. Os resultados mostraram uma atividade de grande toxicidade para ambos os venenos em células tumorais B16F10 e pouca toxicidade para as células normais L929. Ainda nos ensaios comparativos com os dois venenos, verificou-se que, para uma dada concentração, as frações do veneno de Crotalus vegrandis possuem uma maior eficiência que qualquer concentração do veneno de Crotalus durissus terrificus, havendo uma maior especificidade para as células B16F10. A crotoxina símile isolada do veneno de Crotalus vegrandis apresentou atividade citotóxica mais preponderante na linhagem celular tumoral B16F10, após 48 horas concentrações de 250 e 125 ug/mL. / Several studies have shown that some snake venom components have efficient antitumor activity in vitro and in vivo. The venom of the rattlesnake Crotalus vegrandis has neurotoxic, myotoxic and hemorrhagic activities. The crotoxina-like is an important component of this venom and is formed by an acidic protein (crotapotin) combined to a basic subunit (PLA2). As there are few studies on Crotalus vegrandis venom, the isolation and characterization of its components and an investigation of their potential and efficacy as a therapeutic agent against tumor cells would be of great value. In this study, we carried out the isolation and characterization of the crotoxin-like of Crotalus vegrandis and assayed its cytotoxicicity on L929 and B16F10 cells. We carried out the cultivation of these cells in 96 well plates, to then be placed in direct contact with the different purified fractions Crotalus vegrandis venom for a total time of 48 hours. For comparison, we carried out the same test with the purified fractions of Crotalus durissus terrificus venom. The MTT assay was used to assess the cell viability after treatment with fractions of Crotalus vegrandis and Crotalus durissus terrificus venoms. The results showed a high cytotoxic activity for both venoms in B16F10 tumor cells and little toxicity to normal L929 cells. Also in comparative tests with both venoms, we observed that for a given concentration, the fractions of the venom of Crotalus vegrandis had higher cytotoxic effect than the Crotalus durissus terrificus venom, with greater specificity for B16F10 cells.