A atividade de catalase em Candida albicans tem sido sugerida como um mecanismo de resistência ao antifúngico anfotericina B. Neste contexto, poucos são os estudos de enzimas como catalase e superóxido dismutase em leveduras do gênero Candida expostas a diferentes situações. Assim, este estudo teve por objetivo investigar o efeito da exposição de Candida a antineoplásicos, íons metálicos e antifúngicos como fluconazol e anfotericina B sobre a atividade dessas enzimas. Os resultados apontaram que o antineoplásico metotrexato aumentou a atividade da catalase em C. albicans, que íons metálicos como cobre, zinco, manganês e ferro produzem um efeito variável na atividade de superóxido dismutase, bem como, um efeito variável de um íon no acúmulo de outro. Também verificamos através de nossos resultados que a indução de resistência ao fluconazol e anfotericina B aumentam a atividade de catalase e superóxido dismutase em C. albicans e C. dubliniensis. Esses resultados sugerem que o antineoplásico metotrexato e a indução de resistência a anfotericina B e fluconazol podem gerar um estresse oxidativo em leveduras do gênero Candida que possivelmente se adaptam a esse estresse aumentando seus mecanismos de defesa antioxidante. Esse efeito pode induzir a uma maior resistência desses organismos ao ataque de células fagocíticas do hospedeiro. / Catalase is an enzyme that has been suggested to be involved in resistance mechanisms to antifungal drug such as amphotericin B. There are few studies focusing on catalase and superoxide dismutase in yeasts, such as Candida, exposed to different situations. Thereby, the aim of the present study was to investigate the effect of exposing Candida to antineoplastic drugs, metallic ions and antifungial drugs, namely fluconazole and amphotericin B, on catalase and superoxide dismutase activities. Results show that methotrexate induced catalase activity in C. albicans and that metallic ions, such as copper, zinc, manganese and iron produced a variable effect on superoxide dismutase activity of C. albicans, as well as a variable effect in the uptake of one ion on another. We also showed that fluconazole and amphotericin B resistance increased catalase and superoxide dismutase activity in C. albicans and C. dubliniensis. These results suggest that methotrexate as well as the induction of fluconazole- and amphotericin B-resistance may induce oxidative stress in yeasts such as Candida, which may adapt by increasing antioxidant defense mechanisms. This effect may induce a major resistance of this yeast to phagocytic cell attack.

A atividade de catalase em Candida albicans tem sido sugerida como um mecanismo de resistência ao antifúngico anfotericina B. Neste contexto, poucos são os estudos de enzimas como catalase e superóxido dismutase em leveduras do gênero Candida expostas a diferentes situações. Assim, este estudo teve por objetivo investigar o efeito da exposição de Candida a antineoplásicos, íons metálicos e antifúngicos como fluconazol e anfotericina B sobre a atividade dessas enzimas. Os resultados apontaram que o antineoplásico metotrexato aumentou a atividade da catalase em C. albicans, que íons metálicos como cobre, zinco, manganês e ferro produzem um efeito variável na atividade de superóxido dismutase, bem como, um efeito variável de um íon no acúmulo de outro. Também verificamos através de nossos resultados que a indução de resistência ao fluconazol e anfotericina B aumentam a atividade de catalase e superóxido dismutase em C. albicans e C. dubliniensis. Esses resultados sugerem que o antineoplásico metotrexato e a indução de resistência a anfotericina B e fluconazol podem gerar um estresse oxidativo em leveduras do gênero Candida que possivelmente se adaptam a esse estresse aumentando seus mecanismos de defesa antioxidante. Esse efeito pode induzir a uma maior resistência desses organismos ao ataque de células fagocíticas do hospedeiro. / Catalase is an enzyme that has been suggested to be involved in resistance mechanisms to antifungal drug such as amphotericin B. There are few studies focusing on catalase and superoxide dismutase in yeasts, such as Candida, exposed to different situations. Thereby, the aim of the present study was to investigate the effect of exposing Candida to antineoplastic drugs, metallic ions and antifungial drugs, namely fluconazole and amphotericin B, on catalase and superoxide dismutase activities. Results show that methotrexate induced catalase activity in C. albicans and that metallic ions, such as copper, zinc, manganese and iron produced a variable effect on superoxide dismutase activity of C. albicans, as well as a variable effect in the uptake of one ion on another. We also showed that fluconazole and amphotericin B resistance increased catalase and superoxide dismutase activity in C. albicans and C. dubliniensis. These results suggest that methotrexate as well as the induction of fluconazole- and amphotericin B-resistance may induce oxidative stress in yeasts such as Candida, which may adapt by increasing antioxidant defense mechanisms. This effect may induce a major resistance of this yeast to phagocytic cell attack.

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Alguns biomarcadores para a detecção precoce da LRA tem sido estudados, no entanto, apesar da importância no combate ao estresse oxidativo, a atividade da superóxido dismutase 1 (SOD1) ainda não foi avaliada na LRA em pacientes críticos. Nosso objetivo foi avaliar a atividade eritrocitária da SOD1 como preditora de LRA em pacientes com choque séptico. Este é um estudo prospectivo observacional que avaliou 175 pacientes consecutivos, maiores de 18 anos e com choque séptico na admissão na Unidade de Terapia Intensiva (UTI). Foram excluídos 43 pacientes. Assim, 132 pacientes foram incluídos no estudo. Nas primeiras 24 horas da admissão dos pacientes, foram coletados os dados demográficos e amostras de sangue para determinação da atividade eritrocitária da SOD1 e da concentração do malondialdeído (MDA). Todos os pacientes foram acompanhados durante a internação na UTI e o desenvolvimento da LRA foi avaliado. Além disso, também foram avaliados 17 indivíduos controle. A média de idade dos pacientes com choque séptico foi 63,2 ± 15,7 anos, 53% eram homens e a mediana do tempo de internação na UTI foi de 8 (4- 16) dias. Aproximadamente 51% dos pacientes desenvolveram LRA durante a internação na UTI. A mediana da atividade eritrocitária da SOD1 foi 2,92 (2,19- 3,92) U/mgHb. Quando comparado com os indivíduos controle, os pacientes com choque séptico tiveram uma maior concentração sérica de MDA [grupo choque: 1,4 (0,8-2,2) µmol/L vs grupo controle: 0,8 (0,5-1,1) µmol/L; p: 0,003] e menor atividade eritrocitária da SOD1 [grupo choque: 2,9 (2,2-3,9) U/mgHb vs grupo controle: 4,4 (3,3-4,7) U/mgHb; p: 0,001]. Na análise univariada, a atividade eritrocitária da SOD1 foi menor nos pacientes que desenvolveram LRA. A análise da curva ROC revelou que a menor atividade eritrocitária da SOD1 foi associada com o desenvolvimento LRA no ponto de corte < 3,32 U/mg Hb. No modelo de regressão logística, atividade da SOD1 maior que 3,32 U/mg Hb foi associada com proteção do desenvolvimento de LRA quando ajustado pela hemoglobina, fósforo e escore APACHE II (OR: 0,309; IC 95%: 0,137-0,695; p: 0,005) e quando ajustado pela idade, gênero, doença renal crônica, categoria da admissão (clínica ou cirurgica) e escore APACHE II (OR: 0,129; IC 95%: 0,033-0,508; p: 0,003). Em conclusão, a atividade eritrocitária da SOD1 é um biomarcador precoce de LRA em pacientes com choque séptico. / Oxidative stress is recognized as a fundamental characteristic of sepsis and may be a common pathway for the development of acute kidney injury (AKI). Some biomarkers for early detection of AKI have been studied, however, despite the importance in combating oxidative stress, the activity of superoxide dismutase 1 (SOD1) has not been evaluated in AKI in critically ill patients. Our objective was to evaluate erythrocyte SOD1 activity as predictor of AKI in patients with septic shock. This is a prospective observational study that evaluated 175 consecutive patients over the age of 18 years with septic shock upon Intensive Care Unit (ICU) admission. Forty-three patients were excluded. Thus, 132 patients were enrolled in the study. In the first 24 hours of the patients’ enrollment, demographic information was recorded and blood samples were taken to determine the erythrocyte SOD1 activity and the concentration of malondialdehyde (MDA). All patients were followed throughout the ICU stay, and the development of AKI was evaluated. In addition, we also evaluated 17 control subjects. The mean age of patients with septic shock was 63.2 ± 15.7 years; 53% were male, and the median ICU stay was 8 (4-16) days. Approximately 51% of patients developed AKI during the ICU stay. The median erythrocyte SOD1 activity was 2.92 (2.19-3.92) U/mg Hb. When compared to control subjects, septic shock patients had a higher serum MDA concentration [shock group: 1.4 (0.8-2.2) µmol/L vs control group: 0.8 (0.5-1.1) µmol/L; p: 0.003] and lower erythrocyte SOD1 activity [shock group: 2.9 (2.2-3.9) U/mgHb vs control group: 4.4 (3.3-4.7) U/mgHb; p: 0.001]. In univariate analysis, erythrocyte SOD1 activity was lower in patients who developed AKI. The ROC curve analysis revealed that lower erythrocyte SOD1 activity was associated with AKI development at the cutoff of < 3.32 U/mg Hb. In the logistic regression models, SOD1 activity higher than 3.32 U/mg Hb was associated with protection of AKI development when adjusted by hemoglobin, phosphorus and APACHE II score (OR: 0.309; CI95%:0.137-0.695; p=0.005) and when adjusted by age, gender, disease chronic renal, admission category (medical or surgery) and APACHE II score (OR: 0.129; CI95%:0.033-0.508; p= 0.003). In conclusion, erythrocyte SOD1 activity is an early predictor of AKI in patients with septic shock. / FAPESP: 2014/17262-0

Thesis submitted in fulfilment of the requirements for the degree Master of Technology: Biomedical Technology In the Faculty of Health and Wellness sciences at the Cape Peninsula University of Technology / Oxidative stress (OS) plays a major role in the pathogenesis of different conditions including male infertility. OS is caused by high amounts of reactive oxygen species (ROS) that exceed the antioxidant ability of a system. The sperm membrane is rich in polyunsaturated fatty acids and is prone to damage by ROS. Sperm damage decreases motility, concentration and viability. Testicular oxidative stress impairs Leydig cell function and leads to decreased hormonal control as the cells secrete testosterone. Studies have shown the role of antioxidants in the fight against OS. Recently more studies have been focused on the use of natural antioxidants derived from fruits, vegetables, nuts and oils for this purpose. The effects of Buriti oil supplementation have been investigated in the diet and it had been shown that it is rich in carotenoids and vitamin E. This study explored the antioxidant effects of Buriti oil on testicular tissue, epidymal tissue and hormonal function in male Wistar rats. Experiments were conducted for 6 weeks and male adult Wistar rats (10 weeks) were divided into two groups (n=30) for each group. The control group received standard rat chow and water while the experimental group received Buriti oil, rat chow and water daily. Both groups were exposed to natural physiological OS. The plasma, testicular and epididymal tissue samples of both groups were analysed for various parameters. Testicular weight and epididymal weight of rats fed with Buriti oil were significantly increased compared to the control group. Testicular and epididymal MDA levels were decreased in rats fed with Buriti oil compared to the control group. Superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione (GSH) activities were increased in both epididymal and testicular tissue of the Buriti oil fed group than the control group. Data were expressed in mean ± SEM. In conclusion, our findings suggest that Buriti oil supplementation could prevent OS damage in the male reproductive system.

Iron/Manganese superoxide dismutases (Fe/Mn-SODs) are metalloenzymes with highly conserved protein folds, active sites, and dimer interfaces. They protect cells against oxidative stress by catalyzing the conversion of the cytotoxic free radical superoxide to molecular oxygen and hydrogen peroxide. The majority are highly specific for the type of metal (iron or manganese) present within the active site. However, there are many key aspects of metal specificity and catalytic activity that lack a structural explanation. Computational analyses suggested that several residues are important for fine-tuning the redox potential of the metal in the active site and thereby the catalytic activity. The main objective of this thesis is to evaluate the influence of several point mutations (M27V, G73A, H75I, L80F, D150G and Q172D) and one double mutation (Q149G+G74Q)) in terms of metal specificity, catalytic activity and three-dimensional structure using the superoxide dismutase from Trichoderma reesei (TrSOD) as a model system. The corresponding genes were cloned, expressed and the resulting proteins characterized by X-ray crystallography, electron paramagnetic resonance (EPR), atomic absorption spectroscopy (AAS), dynamic light scattering (DLS) and their enzymatic activity determined. The native protein was shown to be able to use either Mn or Fe (5000 units/mg and 500 units/mg, respectively) for catalysis suggesting it to be properly classified as cambialistic. Structures for native TrSOD and the Mn-G73A, Fe-H75I, Mn-L80F, Fe-D150G and Fe-M27V, Mn-M27V mutants were solved at 2.3 &Aring;, 2.0 &Aring;, 2.03 &Aring;, 2.0 &Aring;, 1.85 &Aring;, 1.4 &Aring; and 1.6 &Aring; resolution, respectively. The H75I, L80F and M27V mutations are easily accommodated by small local structural changes to the three-dimensional structure. On the other hand, the G73A mutation destabilize one of the dimer-dimer interfaces of the tetramer making it possible for two distorted tetramers to interact forming an octamer. This enzyme also lost all catalytic activity probably due to resulting exposure of the active site consistent with the observation of a sixth ligand (solvent molecule) bound to the metal in one subunit. The D150G mutant remained tetrameric but with reduced symmetry related to the rearrangement of the last helix (H9). Our results show that a large impact on activity and oligomerization of TrSOD can be generated by a single amino acids substitution in some cases and provide some insights into our understanding of the structural details associated with the metal ion specificity and oligomerization in superoxide dismutases. / Superóxido dismutases de ferro e manganês (Fe/Mn-SODs) são metaloenzimas com enovelamentos, sítios ativos e interfaces diméricas altamente conservados. Estas enzimas protegem as células contra o estresse oxidativo pela conversão do ânion superóxido em oxigênio molecular e peróxido de hidrogênio. A maioria são altamente específicas pelo tipo de metal (ferro ou manganês) presente no sítio ativo. Entretanto, existem vários aspectos críticos sobre a especificidade pelo metal e da atividade catalítica que ainda não foram explicados em termos estruturais. Análises computacionais sugerem que vários resíduos são importantes para o ajuste do potencial redox do metal no sitio ativo e, portanto, a atividade catalítica. O objetivo principal deste trabalho é avaliar a influência de mutações simples (TrSOD) (M27V, G73A, H75I, L80F, D150G e Q172D) e dupla (Q149G + G74Q) em superóxido dismutases de Trichoderma reesei em termos de especificidade pelo metal, atividade catalítica e estrutura. Os genes correspondentes foram clonados, expressos e as proteínas resultantes caracterizadas por cristalografia de raios-X, ressonância paramagnética electrónica (EPR), espectroscopia de absorção atómica (AAS), dispersão de luz dinâmica (DLS), e a atividade enzimática foi determinada. Foi mostrado que a proteína nativa é capaz de usar tanto Mn quanto Fe (5000units/mg e 500units/mg, respectivamente) para catálise sugerindo que deveria ser a classificada como enzima cambialistica. Estruturas da enzima nativa e mutantes (Mn-G73A, Fe-H75I, Mn-L80F, Fe-D150G, Fe-M27V e Mn-M27V) foram resolvidas a resoluções de 2.3 &Aring;, 2.0 &Aring;, 2.03 &Aring;, 2.0 &Aring;, 1.85 &Aring;, 1.4 &Aring; e 1.6 &Aring; respetivamente. As mutações H75I, L80F e M27V são acomodadas facilmente por reajustes locais na estrutura tridimensional. Por outro lado, a mutação G73A desestabiliza uma das interfaces dímero-dímero do tetrâmero levando à formação de um octâmero feito por dois tetrâmeros distorcidos. Esta enzima também perde atividade provavelmente devido a um aumento na acessibilidade do sítio ativo, coerente com a observação de um sexto ligante (molécula de solvente) coordenando o metal em uma das subunidades. O mutante D150G continuou tetramérica mas com simetria reduzida relacionado com o rearranjo da última hélice (H9). Estes resultados mostram que, em alguns casos, uma mutação simples pode ter um impacto significativo no estado oligomérico e atividade catalítica da proteína TrSOD e fornece conhecimentos para a nossa compreensão dos detalhes estruturais associados com a especificidade de íons metálicos e oligomerização em superóxido dismutases.

O objetivo desse trabalho foi avaliar o estado nutricional de mulheres obesas em relação ao zinco (Zn) e a associação com marcadores do estresse oxidativo e com polimorfismos em genes das enzimas antioxidantes SOD1 e SOD3. A amostra foi composta por 60 mulheres obesas (OB) e por um grupo controle composto por 55 mulheres eutróficas (CON). Amostras de sangue e urina de 24 horas foram coletadas para análise de zinco, malondialdeído (MDA), 8-isoprostano urinário, atividade antioxidante das enzimas superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GPx). Foram avaliados dois polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) presentes nas enzimas SOD1 e SOD3, o +35A/C e Arg213Gli. Foram aplicados três recordatórios alimentares de 24 horas, incluindo um dia de final de semana. As comparações entre os grupos foram feitas pelos testes qui-quadrado, t-Student, ANOVA e Mann-Whitney. As associações entre as variáveis quantitativas foram realizadas por meio do coeficiente de correlação r de Pearson. Modelo de regressão linear multivariada backward foi feito a fim de se analisar as regressões das variáveis desfecho zinco plasmático, MDA e 8-isoprostano. O equilíbrio de Hardy-Weinberg foi calculado pelo teste do qui-quadrado. A média da ingestão de zinco foi de 6,8 mg/dia e 7,4 mg/dia no grupo CON e OB, respectivamente. As concentrações de Zn plasmático e eritrocitário e a atividade das enzimas SOD e GPx não apresentaram diferença entre os grupos. Ambos os grupos apresentaram deficiência no Zn plasmático. As concentrações de MDA e 8-isoprostano foram maiores no grupo CON, enquanto as concentrações de creatinina e Zn urinários foram maiores no grupo OB. No grupo CON, foram verificadas associações negativas entre Zn plasmático e MDA (p=0,002) e glicemia (p<0,0001). A regressão multivariada mostrou correlação negativa entre o Zn plasmático e o MDA. O 8-isoprostano sofreu influência negativa da creatinina urinária e positiva da atividade física. Já a glicemia e o consumo de energia e de lipídio apresentaram correlação positiva com o MDA. Na análise dos SNPs, foram encontradas apenas duas participantes heterozigotas para o SNP +35A/C e nenhuma participante com o alelo variante para o SNP Arg213Gli. Concluiu-se que os indivíduos obesos e eutróficos apresentaram deficiência de Zn, o que pode estar relacionado ao estresse oxidativo. O estresse oxidativo foi mais intenso para o grupo controle e não foi observada associação entre o IMC e os marcadores MDA e 8-isoprostano. Não foi possível fazer correlação dos polimorfismos com os parâmetros avaliados / The aim of this study was to assess the nutritional zinc status and its association with oxidative stress markers and with polymorphisms in genes of SOD1 and SOD3 in obese women. The sample consisted of 60 obese women (OB) and a control group of 55 normal-weight women (CON). Blood samples and 24-hour urine were collected for analysis of zinc, malondialdehyde (MDA), urinary 8-isoprostane, antioxidant activity of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GPx). Two single nucleotide polymorphisms (SNP) were evaluated in the genes of SOD1 and SOD3 enzymes, +35A/C and Arg213Gly. Three food 24-hour recalls, including one weekend day were applied. Comparisons between groups were made by chi-square test, Student\'s t - test, ANOVA and Mann-Whitney. Associations between means of quantitative variables were performed by the correlation coefficient r of Pearson. Backward multivariate linear regression was done in order to analyze the regressions of outcome variables plasma zinc, MDA and 8-isoprostane. The Hardy-Weinberg equilibrium was calculated by chi-square. The mean zinc intake was 6.8 mg/day and 7.4 mg/day in CON and OB groups, respectively. Concentrations of plasma and erythrocyte Zn and activity of SOD and GPx enzymes showed no difference between groups. Both groups showed a deficiency in plasma Zn. The concentrations of MDA and 8-isoprostane were higher in the CON group, whereas the concentrations of creatinine and urinary Zn were higher in the OB group. In the CON group, negative associations between plasma Zn and MDA (p = 0.002) and glucose (p < 0.0001) were observed. Multivariate regression analysis showed a negative correlation between plasma Zn and MDA. The 8-isoprostane suffered negative influence of urinary creatinine and positive influence of physical activity. Blood sugar and energy and lipid consumption showed a positive correlation with MDA. In the analysis of SNPs, were found only two heterozygous participants for the SNP +35A/C and no participant with the variant allele for the SNP Arg213Gly. It was concluded that obese and normal subjects showed Zn deficiency, which may be related to oxidative stress. Oxidative stress was higher in the control group and no association was observed between BMI and MDA and 8-isoprostane markers. It was not possible to correlate polymorphisms with evaluated parameters.

Estudos epidemiológicos têm indicado que a vacinação com BCG pode induzir uma resposta imune protetora que está além daquela obtida contra tuberculose. Esta vacina está associada à indução de resposta imune Th1, aumento de anticorpos a antígenos não relacionados, menos atopia, menor anergia e redução da mortalidade infantil. No entanto, os mecanismos que sustentam estes efeitos não-específicos permanecem não esclarecidos. Nós investigamos os efeitos de diferentes preparações de BCG (BCG viável e inativados - EFD BCG e HK BCG) sobre o sistema NADPH oxidase, a expressão do TLR-2 e a modulação da produção de citocinas (IL-12p40, TNF-a, IFN-g e IL-10) por leucócitos humanos in vitro. Os resultados demonstram que diferentes preparações de BCG induzem diferentes respostas, tanto em relação à atividade do sistema NADPH oxidase como à modulação da produção de citocinas por leucócitos humanos in vitro. Além disso, demonstramos que em condições inflamatórias como a asma, a modulação da produção de citocinas pelos BCG é diferente daquela observada em sujeitos saudáveis. / Epidemiological studies have indicated that the BCG vaccination may induce a protective immune response that can go beyond what is obtained against tuberculosis. This vaccine is associated to the induction of Th1 immune response, increase antibodies response to unrelated antigen, less atopy, less anergy and a reduction in childhood mortality. Nevertheless, the mechanisms that sustain these non-specific effects remain unclear. We investigated the effects of different BCG preparations (viable BCG and two inactivated BCG EFD BCG and HK BCG) over the NADPH oxidase, the TLR-2 gene expression and over the modulation of the cytokine production (IL-12p40, TNF-a, IFN-g and IL-10) by human leukocytes in vitro. The results demonstrated that different BCG preparations induce different responses, as in respect to the activity of the NADPH oxidase system as in relation to the modulation of cytokine production by human leukocytes in vitro. Beyond this we demonstrated that in inflammatory conditions as asthma, the modulation of cytokine production by the BCG is different of that observed in healthy individuals.

O estresse oxidativo reflete um desequilíbrio na manutenção do estado redox intracelular que pode resultar no acúmulo de espécies oxidantes. Nestas condições, estas espécies podem gerar danos na estrutura/função do DNA, disfunções mitocondriais, alterações no enovelamento de proteínas, peroxidação de lipídeos, dentre outros danos. Assim, o estresse oxidativo pode contribuir para diversas condições patológicas, como por exemplo, câncer, desordens neurológicas, aterosclerose, diabetes e asma. A infecção persistente por papilomavírus humano (HPV) de alto risco está etiologicamente associada ao câncer de colo uterino, uma das principais causas de morte por câncer em mulheres no mundo todo. Além disso, esses vírus estão associados a uma porcentagem relevante de cânceres de pênis, vulva, ânus e cabeça e pescoço. Em células infectadas por HPV de alto risco oncogênico, o estresse oxidativo resultante do metabolismo anormal dos queratinócitos e a resposta inflamatória crônica não efetiva, podem contribuir no processo de transformação celular. Além disso, a presença das oncoproteínas E6 e E7 interfere nos mecanismos de reparo de lesões em DNA, favorecendo o acúmulo de mutações. Ainda mais, a instabilidade genômica promovida pelo estresse oxidativo, pode favorecer a integração do HPV no genoma das células infectadas, principal causa da persistência viral e progressão de lesões ao câncer. A proteína superóxido dismutase 2 (SOD2) contribui com a homeostase celular ao catalisar a dismutação de radicais ânion superóxido em oxigênio e peróxido de hidrogênio, prevenindo a inativação direta de biomoléculas. Em estudos anteriores, observamos que o aumento do transcrito de SOD2 está associado à resistência ao efeito antiproliferativo do fator de necrose tumoral (TNF) em células imortalizadas por HPV. Além disso, mostramos que existe uma correlação direta entre o aumento dos níveis da proteína SOD2 e a severidade de lesões da cérvice uterina. Finalmente, identificamos SOD2 como um marcador preditivo independente de metástases linfonodais inguinais em pacientes com carcinoma de pênis. No entanto, o papel desta proteína na patogênese associada ao HPV não tem sido estudado em profundidade. O presente estudo visa determinar o envolvimento de SOD2 no processo de transformação celular mediado por HPV e seu valor como marcador preditivo de patologias associadas a este vírus / Oxidative stress reflects a redox imbalance in the cell in favor of oxidant species, which may result in DNA damage, mitochondrial dysfunction, protein misfolding and lipid peroxidation, among others. As a result, oxidative stress is thought to contribute to diverse pathologies such as cancer, neurological disorders, atherosclerosis, diabetes and asthma. Persistent infection with high risk human papillomavirus (HPV) types is etiologically associated with cervical cancer, one of the leading causes of cancer related female death worldwide. Moreover, HPV infection is associated with a significant percentage of penile, vulvar, anal and head and neck carcinomas. In cells infected with high-oncogenic risk HPV types the oxidative stress generated by the abnormal keratinocytes metabolism and non-efficient chronic inflammatory response may contribute to the cellular transformation process. Furthermore, expression of E6 and E7 oncoproteins interferes with several DNA repair mechanisms, favoring the accumulation of mutations. Moreover, genomic instability promoted by oxidative stress may favor HPV integration in host cell genome, the main cause of viral persistence and of precursor lesions progression to cancer. The protein superoxide dismutase 2 (SOD2) contributes to cellular homeostasis by catalyzing radical super anion dismutation in oxygen and oxygen peroxide preventing the direct inactivation of biomolecules. In previous studies we observed that SOD2 mRNA upregulation is associated with the resistance to tumor necrosis factor (TNF) antiproliferative effect in HPV-immortalized cells. Besides, we showed the existence of a direct correlation between increased SOD2 protein expression and cervical lesions severity. Finally, we identified SOD2 as an independent predictive marker of inguinal lymph node metastases in patients with penile carcinomas. However, the role of this protein in HPV-associated pathologies has not been investigated in depth. The goal of this study is to determine the involvement of SOD2 in HPV-mediated cell transformation and its value as a predictive marker in pathologies caused by this virus

Orientadores: Luiz Carlos Zeferino, Silvia Helena Rabelo dos Santos / Texto em português e inglês / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T17:34:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Burger_MarianaGenaro_M.pdf: 2615876 bytes, checksum: 488a52bb185fe37468bb4b59d9eb01b6 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O papel da proteína SOD2 na carcinogênese e progressão tumoral, particularmente no carcinoma de células escamosas do colo uterino, continua a ser o objeto de incerteza e controvérsia. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar a variabilidade na expressão da proteína SOD2 em cortes histológicos de epitélio cervical. Este estudo transversal incluiu 277 mulheres com indicação de procedimento conização ou excisão da zona de transformação devido a suspeita de NIC 2 ou lesão mais grave. A expressão SOD2 foi avaliada por ensaios de imunoistoquímicos realizados com base na porcentagem de células coradas em áreas representativas do diagnóstico histopatológico. A expressão positiva, independentemente da intensidade foi positivamente associada com o diagnóstico de NIC2/ NIC3 (OR = 2,64; 1,57-4,60) e carcinoma (OR = 14,32; 4,08-50,26). Tomando expressão SOD2 como referência para casos de NIC2/ NIC3, observou-se que a expressão positiva, independentemente da intensidade foi positivamente associada com um diagnóstico de carcinoma (OR = 5,33; 1,56-18,25). Observou-se que a expressão intensa SOD2 foi positivamente associada com o diagnóstico de NIC2/ NIC3 (OR = 7,31; 1,68-31,86) e carcinoma (OR = 36,63; 7,76-172,85). Quando a expressão de SOD2 foi tomada como referência para casos NIC2/ NIC3, observou-se que a expressão intensa foi positivamente associada com um diagnóstico de carcinoma (OR = 5,01; 2,24-11,20). Expressão SOD2 é observada com maior frequência e mais intensa em NIC2/ NIC3 e carcinoma espinocelular do que em tecido normal / NIC 1 . Além disso, a expressão SOD2 também é mais frequente e intensa em carcinomas do que em NIC2/ NIC3. Embora NIC2/ NIC3 e carcinomas invasivos iniciais são lesões contíguas na carcinogênese cervical, a expressão SOD2 pode diferenciá-los / Abstract: The role of SOD2 protein in carcinogenesis and tumor progression, particularly in squamous cell carcinoma of the uterine cervix, remains the object of uncertainty and controversy. Therefore this study aimed to evaluate the variability in SOD2 protein expression in histological specimens from cervical epithelium. This study cross-sectional study included 277 women with indication of conization procedure or transformation zone excision due to suspicion of CIN 2 or more severe lesion. The SOD2 expression was assessed by performed immunohistochemical assays based on the percentage of stained cells in representative areas of the histopathological diagnosis. Positive expression regardless of intensity was positively associated with a diagnosis of CIN2/CIN3 (OR=2.64; 1.57- 4.60) and carcinoma (OR=14.32; 4.08-50.26). Taking SOD2 expression as a reference for cases of CIN2/CIN3, it was observed that a positive expression, regardless of intensity was positively associated with a diagnosis of carcinoma (OR=5.33; 1.56-18.25). It was observed that intense SOD2 expression was positively associated with a diagnosis of CIN2/CIN3 (OR=7.31; 1.68-31.86) and carcinoma (OR=36.63; 7.76-172.85). When SOD2 expression was taken as a reference for CIN2/CIN3 cases, it was observed that intense expression was positively associated with a diagnosis of carcinoma (OR=5.01; 2.24-11.20). SOD2 expression is most frequently observed and more intense in CIN2/CIN3 and squamous carcinoma than in normal tissue/CIN 1. In addition, SOD2 expression is also more frequently observed and intense in carcinoma than in CIN2/CIN3. Although CIN 2/CIN 3 and early invasive carcinomas are contiguous lesions in cervical carcinogenesis, SOD2 expression can differentiate them / Mestrado / Oncologia Ginecológica e Mamária / Mestra em Ciências da Saúde

Le but de ce travail de thèse était de rechercher de nouvelles molécules inhibitrices de la SOD dans des extraits de substances naturelles. Cette enzyme majeure du stress oxydant étant impliquée dans de nombreux mécanismes de défense des cellules cancéreuses contre l'apoptose représente une voie thérapeutique d'avenir. Nous en avons recherché dans les champignons endophytes de plantes péruviennes, ces micro-organismes produisant de nombreux métabolites de défense des plantes hôtes. Ce travail de thèse a d'abord porté sur l'isolement, la culture, l'identification, l'extraction et la caractérisation des souches de champignons endophytes. Les analyses statistiques effectuées sur ces extraits avec les résultats obtenus en HPLC ont confirmé les problèmes de variabilités qualitative et quantitative pouvant être rencontrés au cours de la culture des endophytes et décrites dans la littérature. La seconde partie expérimentale a porté sur la recherche de furocoumarines dans les extraits obtenus, en raison de leur potentiel effet inhibiteur sur la SOD. Nous avons dérépliqué ces composés dans les extraits d'endophytes au cours de deux stratégies de spectrométrie de masse réalisées en mode d'ionisation négatif. La première approche, à l'aide d'un QTOF, a abouti à l'identification de deux furocoumarines, la 5-Methyl-4H-furo[2,3-b][1]benzopyran-4-one et la déhydropachyrrhizone. La seconde, à l'aide d'un OrbiTrap, a vu l'identification de quatre autres furocoumarines : l'Ochrocarpine A, la Moellendorffiline, l'Anisolactone et l'Anhydrorutarétine .Afin de compléter cette approche métabolomique et identifier les molécules inhibitrices de la SOD, nous avons tenté de mettre au point un test d'activité de cette enzyme, rapide, peu coûteux et réalisable en routine. Nous avons sélectionné le test au pyrogallol, mais celui-ci n'a pas démontré les qualités recherchées tant au niveau de la sensibilité que de la reproductibilité. Nous orientons à présent les recherches vers des approches différentes, la recherche directe d'adduits sur la SOD par LC-MS. / Superoxide dismutase is one of the major proteins controlling the oxidizing stress and cellular homeostasis. It is involved in numerous cancer cells proliferation processes. This protein is considered as major anti-cancer target for the development of new anti-cancer drugs. The goal of this work, was to research and identify an inhibitor of the SOD in endophytic fungi from Peruvian plants. These micro-organisms are known to produce numerous metabolites for host plants protection. During the preparation of endophytic extracts and their characterization by HPLC and statistical analyzes, we have pointed out a high quantitative and qualitative variability of the chemical content of endophytic extracts inside a same strain. Considering the literature we have focused our work on the identification of furocoumarins because of their potential inhibitory effect on the SOD. For this purpose two mass spectrometry strategies using negative ionization mode were carried out. With the QTOF mass spectrometer we have identified Methyl-4H-furo [2,3-b] [1] benzopyran-4-one and the déhydropachyrrhizone. With the OrbiTrap, the Ochrocarpine A, Moellendorffiline the Anisolactone and the Anhydrorutarétine were identified. Biological evaluation of the different extracts was performed using pyrogallol test. This investigation did not allow us to identify an inhibitor of the SOD. In the future we may consider seeking SOD inhibitors by looking at the formation SOD-chemical compound adducts using an LC-MS investigation.