Orientador: Mário José Abdalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-20T04:12:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_KellyLimaCalistoda_D.pdf: 12319373 bytes, checksum: 35117c7c04d7b9af2c03f2af293482d1 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Na sepse o sistema imune torna-se hiperativo, levando a excessiva produção de mediadores pró-inflamatórios. Tanto componentes bacterianos, como o LPS, quanto citocinas pro-inflamatórias resultantes da resposta imune, podem ativar mecanismos intracelulares associados à resistência à insulina, como a via IKK'beta'/NF'capa'B e a via da JNK. Hiperglicemia e resistência à insulina ocorrem durante a sepse, como consequência dos efeitos metabólicos da excessiva produção de mediadores pró-inflamatórios. Sabe-se que a resistência à insulina pode agravar ainda mais o quadro da sepse, todavia a manutenção da normoglicemia com a insulinoterapia reduz os índices de morbidade e mortalidade. Por esta razão, o objetivo do presente estudo foi investigar o efeito de fármacos (atorvastatina e diacereína) sobre a sobrevivência, sinalização inflamatória e, paralelamente, a sua ação sobre a via de sinalização da insulina em ratos com sepse induzida por peritonite. Nossos dados demonstram que os tratamentos com atorvastatina e diacereína aumentam a sobrevida, com um efeito benéfico sobre a sensibilidade à insulina, melhorando a sinalização da insulina dos animais sépticos. Ademais, os tratamentos reduziram a ativação de JNK e IKK e consequente expressão de citocinas pró-inflamatórias, e em paralelo reduziram estresse do retículo endoplasmático induzido pela sepse. Com isso, podemos sugerir que a restauração da sinalização da insulina demonstrada pela reativação da via PI3K/Akt induzida pelos tratamentos, desempenhou um papel fundamental no aumento da sobrevida na sepse. Neste contexto, acreditamos que a melhora na via de sinalização da insulina, induzida pelos tratamentos com atorvastatina e diacereína, em paralelo com uma atenuação da inflamação nos tecidos, pode ajudar a predizer a eficácia destes tratamentos na sepse / Abstract: During the onset of sepsis, the inflammatory system becomes hyperactive, and the persistent activating stimuli induce cells to produce excessive amounts of cytokines and mediators that lead to tissue damage. Both bacterial components and proinflammatory cytokines can directly activate pro-inflammatory pathways as IKK'beta'/NF'kappa'B and JNK that seem to be associated to disruption on insulin signaling. Hyperglycemia and insulin resistance occur during sepsis, as a consequence of the metabolic effects of stress hormone and cytokine production. Studies indicate that insulin resistance may aggravate sepsis. Furthermore, it was demonstrated that the maintenance of normoglycemia with insulin therapy reduces morbidity and mortality rates in sepsis. The aim of the present study was to investigate the effect of drugs (atorvastatin and diacerhein) on survival, inflammatory signaling and insulin signaling pathway in rat model of CLP-induced sepsis. Our data demonstrate that atorvastatin and diacerhein treatment improves survival in septic rats and this improvement is accompanied by a marked improvement in insulin sensitivity. Sepsis induced an increase in JNK and IKK/NF-'kappa'B activation, and blunted insulin-induced insulin signaling in liver, muscle and adipose tissue; atorvastatin and diacerhein reversed all these alterations in parallel with a decrease sepsis-induced endoplasmic stress reticulum and circulating levels proinflammatory cytokines. The improvement insulin signaling pathway through PI3K/Akt induced by treatments with atorvastatin and diacerhein, in parallel with a decrease in tissue inflammation, may play a central role in regulation of insulin signaling and survival in sepsis insult / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Ciências Médicas

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:29:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3554_1.pdf: 1677039 bytes, checksum: 789ec72f40954c879ba9cd9eb28b74a7 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O diagnóstico de sepse neonatal precoce (SNP) em recém-nascidos pré-termo (RNPT) com baixo peso ao nascer (BPN) oferece grande dificuldade, porque as primeiras manifestações clínicas da doença nesses pacientes são confundidas com os da própria prematuridade. Os RNPT, com peso ao nascer entre 1000 e 2499g, admitidos no berçário e Unidade de Terapia Intensiva Neonatal do Instituto Cândida Vargas, João Pessoa Paraíba, Brasil, de abril - 2006 a maio - 2008, com risco ou suspeita de infecção, foram acompanhados prospectivamente até 72 horas de vida para detectar sepse. Esta tese consta de dois artigos. O primeiro tratou de elaborar escore clínico para o diagnóstico de SNP em RNPT com BPN. O estudo foi do tipo caso-controle, aninhado de uma coorte. Inicialmente, foi calculado o odds ratio (OR), com respectivos intervalos de confiança 95% (IC95%), de cada variável clínica presente em cada RNPT da amostra com diagnóstico de sepse definido através da concordância entre especialistas. As variáveis com OR apresentando valor p do teste exato de Fisher < 0,25 foram incluídos em modelo de regressão logística para desenvolver o escore. As variáveis com valor p < 0,05 compuseram o escore. A pontuação das variáveis do escore deu-se pelo valor mínimo do IC95% do OR. A amostra foi composta por 284 RNPT com BPN, foram excluídos 15 por falta de exames laboratoriais. Sessenta e sete RNPT (23,6%) foram considerados como sepse através da concordância entre especialistas. Treze variáveis clínicas foram analisadas em modelo de regressão logística que resultou em escore composto por cinco variáveis: apnéia, alteração de perfusão, resíduo gástrico, hipotonia e instabilidade térmica. As variáveis apnéia, alteração de perfusão e resíduo gástrico, que apresentaram valor mínimo do IC95% do OR maior que quatro, receberam dois pontos no escore, e as demais, com menor valor, receberam um ponto. O segundo artigo tratou de estudo de validação de teste diagnóstico, definido como fase III. Para validação do novo escore, o padrão de referência usado para definir sepse foi a hemocultura. Os pontos de corte do novo escore foram aplicados em outra população de 367 RNPT com BPN, com risco ou suspeita de infecção, e comparados de maneira independente e mascarada, com os resultados das hemoculturas. A escolha do melhor ponto de corte deu-se pelo melhor valor da sensibilidade em relação à especificidade. Foram excluídos três RNPT, por não apresentarem clínica de sepse, apesar de não terem recebido antibióticos e com hemocultura positiva. Setenta RNPT com BPN tiveram o diagnóstico de sepse por hemocultura positiva. O ponto de corte dois do escore ao ser comparado com as hemoculturas mostrou o melhor valor de sensibilidade em relação à especificidade para o diagnóstico de SNP na população estudada. Concluiu-se que o escore possui fácil aplicabilidade na prática diária, por ser composto por variáveis clínicas comumente avaliadas. Sua validação mostrou ser dois o melhor ponto de corte e seu uso pode permitir informações adicionais, com relação a iniciar antibioticoterapia quando positivo, e não fazê-lo quando negativo, enquanto prossegue a investigação diagnóstica

Orientadores: Sergio Tadeu Martins Marba, Maria Heloisa Souza Blotta Lima / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-07T17:27:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Caldas_JamilPedrodeSiqueira_M.pdf: 1392314 bytes, checksum: dc91ad3e61797876f39fc3c051ec4b71 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O objetivo do estudo foi avaliar as propriedades diagnósticas de quatro exames laboratoriais na sepse neonatal tardia: leucograma, proteína C-reativa (PCR),interleucina-6 (IL-6) e fator de necrose tumoral-alfa (TNF-a). Analisaram-se 82 recémnascidos com idade entre três e 30 dias, em um período de 20 meses. Nos quadros suspeitos de sepse foram colhidas três amostras de sangue: à suspeita, 24 e 48 horas depois. O leucograma foi avaliado no dia da suspeita clinica e foi considerado alterado quando o índice neutrofílico e o numero total de neutrófilos estivessem alterados. Os marcadores séricos foram dosados por quimioluminescência e o limite de corte obtido pela construção da curva ROC. De acordo com a evolução clínica, os recém-nascidos foram classificados em três grupos: sepse comprovada por cultura, sepse clínica (culturas negativas e quadro clínico muito sugestivo de infecção) e não infectados. Os grupos foram comparáveis quanto ao peso ao nascer, idade gestacional, sexo, idade cronológica e índice de Apgar. Nos grupos sépticos, choque ocorreu em 36,2% e óbito em 8,6% das crianças. O leucograma alterou-se em 64,3% naqueles com sepse comprovada, 68,8% naqueles com sepse clínica e 25,0% nos não infectados. A mediana da PCR mostrou-se mais elevada nos grupos sépticos em relação ao não infectado, em todos os momentos, com diferença estatisticamente significativa. A IL-6 alterou-se nos três momentos, com diferença estatisticamente significativa entre os grupos sépticos e o de crianças não infectadas. Nos grupos sépticos, a mediana da IL-6 mostrou-se mais elevada na primeira aferição, caindo a seguir. No grupo sem infecção,a mediana da IL-6 permaneceu inalterada. A mediana do TNF-a alterou-se nos três momentos no grupo com sepse comprovada, com diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo não infectado, mas não entre este e aquele com sepse clínica. O leucograma revelou a acurácia mais baixa dos quatro exames (68,2%). A PCR mostrou a acurácia mais elevada dos testes, especialmente na segunda medida (89,4%). A Il-6 mostrou-se mais útil na primeira aferição, com acurácia de 81,0% (próxima àquela da PCR na primeira medida ¿ 81,8%) e sua acurácia caiu a seguir (71,2% e 68,2%). O TNF-a manteve uma acurácia praticamente constante (77,2 ¿ 77,0 ¿ 74,1%). Quando os marcadores foram associados, a acurácia aumentou significativamente: leucograma e segunda medida da PCR - 97,5%, segunda medida da PCR e primeira IL-6 - 92,3% e segunda medida da PCR e segunda do TNF-a - 95,1%. Para a associação leucograma e segunda medida da PCR, a sensibilidade e o valor preditivo negativo atingiram 100%. Na ocorrência de choque não houve diferença nas medianas dos exames. Quanto ao óbito, houve diferença significativa na terceira medida dos três marcadores séricos e na primeira da IL-6. Em conclusão, observou-se que a PCR mostrou a melhor acurácia dos quatro testes, com desempenho superior ao da IL-6 e TNF-a, e o leucograma mostrou a pior performance. A associação dos exames aumenta consideravelmente a precisão diagnóstica na sepse neonatal tardia. A manutenção dos níveis séricos elevados dos três marcadores alerta para a possibilidade de evolução para óbito / Abstract: This study evaluated the diagnostic properties of four laboratorial tests used in late neonatal sepsis. The tests were: white blood cell count (WBC), C-reactive protein (CRP), interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-a). It analyzed 82 newborns aged 3 and 30 days in 20 months. Three blood samples were obtained, at three moments: at clinical suspicion, 24 hour and 48 hour after. WBC was evaluated once a time, at the clinical suspicion. Sera markers were made by chemiluminescence¿s essay and the cut-off values were obtained by ROC curve. WBC was considered altered when neutrophilic index and total neutrophilic, both, were abnormal. In according to clinical evolution, newborns were classified in three groups: definite sepsis (comproved by culture), clinical sepsis (suggestive clinical aspect but negative cultures), and non-infected infants. Groups were comparable in relation to birth weight, gestational age, gender or Apgar score and age at clinical suspicion. Shock and infection-related death happened in 32,6% and 8,6% in septic groups, respectively. WBC was abnormal in 64,3% in proved septic group, 68,8% in clinical sepsis group, and in 25% non-infected infants. CRP medians were more elevated in both septic groups than in non-infected infants, in all the moments (statistically significant difference). CRP was abnormal since the first measurement. In the non-infected group, CRP median presented low and quite constant values. IL-6 was abnormal at the three moments, and there was statistically significant difference between septic and non-infected groups. Septic group IL-6 medians were more elevated at the first measurement and then it felt progressively. In the non-infected group, IL-6 median presented with no elevation. TNF-a was elevated at the three measurements in the definite septic group, and there was statistically difference for non-infected group medians. For the clinical septic group and the non-infected one there was no significant difference. WBC showed the lowest diagnostic accuracy of the four tests (68,2%). CRP presented the most elevated accuracy, especially for the second measurement (89,4%). IL-6 obtained its best performance at the first determination (81,0% - quite equal to first CRP accuracy ¿ 81,8%). Then, its accuracy felt to 71,2% and 68,2%. TNF-a presented accuracy constant (77,2% ¿ 77,0% ¿ 74,1%). When the four markers were associated, accuracy elevated markedly, and the best values were obtained for: WBC + second CRP (97,5%), second CRP and first IL-6 (92,3%) and second CRP and TNF-a (95,1%). For WBC and second CRP association, sensibility and negative predictive values reached 100%.In relationship to shock, there were no significant differences in the medians of no markers. To death, it was shown that it was accompanied by high medians of the third measurements of the three markers, an in the first median of IL-6. In summary, it was found that WBC showed regular accuracy, and it was overcome by CRP (measured serially), by IL-6 (when it was measured at the moment of clinical suspicion) and by TNF-a. Tests association increased diagnostic accuracy markedly in the late neonatal sepsis. Sustained high blood levels of such markers may be a prognostic indicator (death) / Mestrado / Pediatria / Mestre em Saude da Criança

Submitted by Carla Santos (biblioteca.cp2.carla@bahiana.edu.br) on 2018-10-24T17:29:20Z No. of bitstreams: 1 Josecy Peixoto.pdf: 3391908 bytes, checksum: 665f4fc00de3317e31e6416a6ec4da58 (MD5) / Approved for entry into archive by JOELMA MAIA (ebmsp-bibliotecacp2@bahiana.edu.br) on 2018-10-26T18:10:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Josecy Peixoto.pdf: 3391908 bytes, checksum: 665f4fc00de3317e31e6416a6ec4da58 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-26T18:10:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Josecy Peixoto.pdf: 3391908 bytes, checksum: 665f4fc00de3317e31e6416a6ec4da58 (MD5) Previous issue date: 2018-05-15 / O envelhecimento ?? relacionado ao aumento da morbidade e crescentes taxas de interna????o hospitalar no Centro de Terapia Intensiva (CTI), com maior tempo de perman??ncia, muitas vezes associado ?? les??o renal aguda e sepse. Objetivo: Avaliar a associa????o entre les??o renal aguda (LRA) e longa perman??ncia de idosos internados em CTI; estabelecer preditores de longa perman??ncia e verificar o efeito modificador da presen??a de sepse associada ?? LRA no tempo de internamento. M??todos: Estudo de coorte envolvendo 167 idosos internados em CTI, avaliados de janeiro de 2010 a janeiro de 2011. Os dados cl??nicos, sociodemogr??ficos e laboratoriais foram coletados no momento da admiss??o (permitindo o c??lculo do escore de APACHE II, diagn??stico de sepse e estadiamento da LRA de acordo com o RIFLE), diariamente, at?? ocorr??ncia de LRA, alta da CTI ou ??bito, tendo o tempo de perman??ncia em CTI como desfecho. Foram exclu??dos aqueles com tempo de perman??ncia inferior a 24 horas e com diagn??stico de morte encef??lica. Resultados: Do total de pacientes, 95(56,89%) permaneceram internados por tempo igual ou superior a 5 dias. Dos que tinham LRA, 67,6% tiveram tempo de internamento superior a 5 dias versus 38,7% dos pacientes sem LRA; RR = 1,74; IC a 95% (1,55-4,13). Os portadores de LRA, que desenvolveram sepse, tiveram 2,78 (IC a 95%: 1,10-7,09) vezes mais chances de permanecerem internados por cinco dias ou mais, mesmo ap??s ajuste de confundidores. Conclus??o: Idosos internados em CTI ao desenvolverem LRA, apresentaram um incremento no risco de longa perman??ncia.

Submitted by Carla Santos (biblioteca.cp2.carla@bahiana.edu.br) on 2018-10-24T18:10:53Z No. of bitstreams: 1 TES.Enviada para correc??oes em 15.7.18.pdf: 3508953 bytes, checksum: 4b396fc8324da8342ecc74dd431e5617 (MD5) / Approved for entry into archive by JOELMA MAIA (ebmsp-bibliotecacp2@bahiana.edu.br) on 2018-10-26T18:11:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TES.Enviada para correc??oes em 15.7.18.pdf: 3508953 bytes, checksum: 4b396fc8324da8342ecc74dd431e5617 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-26T18:11:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TES.Enviada para correc??oes em 15.7.18.pdf: 3508953 bytes, checksum: 4b396fc8324da8342ecc74dd431e5617 (MD5) Previous issue date: 2018-05-24 / a sepse ?? a principal causa de mortalidade em Unidade de Terapia Intensiva (UTI), estando frequentemente associada ?? les??o renal aguda (LRA). Estudos em pa??ses desenvolvidos indicam elevada mortalidade relacionada a esta associa????o, com maior susceptibilidade nas faixas et??rias mais avan??adas. Entretanto, em pa??ses em desenvolvimento, onde a epidemiologia da sepse e da LRA pode diferir substancialmente, os dados da literatura s??o escassos. Objetivo: determinar a mortalidade de idosos cr??ticos com sepse precoce; investigar vari??veis associadas com mortalidade em idosos cr??ticos e verificar se h?? efeito modificador da LRA na mortalidade de idosos com sepse precoce. M??todos: um corte transversal aninhado a uma coorte em um UTI no Brasil, incluindo 167 pacientes idosos admitidos no per??odo de Janeiro de 2010 a Janeiro de 2011. Dados cl??nicos-demogr??ficos e laboratoriais foram coletados diariamente desde admiss??o at?? ??bito ou alta da UTI, sendo exclu??dos aqueles com diagn??stico de morte encef??lica e portadores de insufici??ncia renal terminal. Sepse foi definida de acordo com as Diretrizes Internacionais de Sepse de 2012 e LRA pelo est??gio Risk do RIFLE. As an??lises estat??sticas foram realizadas no software SPSS?? vers??o 17.0, testes do qui-quadrado para compara????o de propor????es, teste t de Student para compara????o de m??dias e regress??o multivariada para identifica????o de vari??veis associadas ?? morte e ajuste para confundimento. Resultados: a mortalidade foi de 64,83% (IC95% 54,59-73,88) entre idosos s??pticos (??? 60 anos) e 69,23% (IC95% 59,33- 78,12) considerando ponto de corte de pa??ses desenvolvidos (idoso??? 65 anos). As vari??veis associadas com ??bito foram: necessidade de ventila????o mec??nica, sepse, cirurgia de emerg??ncia, proced??ncia de enfermarias e LRA. A diferen??a das raz??es de preval??ncia de mortalidade entre portadores de LRA superposta a sepse e sepse apenas foi de 37,55%. Conclus??o: preval??ncia de ??bitos em idosos s??pticos foi bastante elevada, aumentando sobremaneira quando associado ?? LRA, necessidade de ventila????o mec??nica e proced??ncia de enfermarias cl??nicas.

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Orientador: Erich Vinícius de Paula / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T18:53:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Faiotto_VanessaBoury_M.pdf: 2777980 bytes, checksum: 26068f6f5813665c531b744d7a8c8f60 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A sepse representa uma condição potencialmente fatal em que a resposta do organismo a uma infecção resulta em lesão em seus próprios tecidos. A terapia gênica (TG) consiste na modificação do repertório de células somáticas com fins terapêuticos, substituindo genes defeituosos que causam doenças. Na sepse, vetores não virais podem representar uma estratégia excelente para a transferência do gene terapêutico, uma vez que não provoca resposta imune significativa e são expressos apenas transitoriamente. Além disso, a sua produção é mais simples. Métodos: O estudo foi dividido em três etapas. Em primeiro lugar, dois genes repórter (lacZ e F9) foram testados em dois modelos experimentais de sepse (endotoxemia e ligadura e punção cecal, CLP) para confirmar a viabilidade da transferência gênica no contexto da sepse. A expressão foi avaliada por métodos qualitativos (histoquímica) e quantitativos (avaliação funcional; métodos coagulométricos). Em seguida avaliou-se a eficácia terapêutica da transferência do gene de sFlt-1, um antagonista de VEGF natural, no modelo de endotoxemia. A expressão foi avaliada por ELISA, e a eficácia foi avaliada através de uma curva de sobrevida. Os camundongos foram tratados com o plasmídeo DNA (pDNA) contendo o cDNA do gene Flt1 (tratamento) lacZ (controle), 6 horas após o desafio com LPS. A propósito, sFlt-1 foi capaz de proteger da sepse experimental murina em outros estudos, devido a sua propriedade estabilizadora da barreira endotelial (BE). Na última etapa, avaliamos os níveis séricos de quatro proteínas envolvidas na modulação da integridade BE, utilizando amostras de soro de indivíduos diagnosticados com sepse grave e choque séptico (n = 53), através de um kit Multiplex comercial. Resultados: No primeiro passo, a transferência gênica por vetores não virais foi demonstrada no modelo de endotoxemia, pois tanto a expressão de ?-galactosidase quanto de F IX mostraram-se aumentadas nos animais tratados neste modelo. A expressão não foi confirmada no modelo CLP, embora o número reduzido de animais por grupo não permita uma conclusão definitiva sobre o assunto. Em relação à segunda etapa, apenas 4/14 animais tratados apresentaram níveis detectáveis de sFlt-1 por Elisa. Além disso, não houve diferença na sobrevida entre os animais tratados e controles. Juntos, estes resultados confirmam que a transferência gênica com vetores não virais é possível no contexto de uma inflamação grave, mas apresenta baixa eficiência e previsibilidade. Por fim, observamos diferenças significativas nos níveis séricos de endoglina (maior expressão) e HB-EGF (menor expressão) em pacientes com choque séptico, em comparação ao grupo controle. Os níveis de BMP-9 e FGF-2 não foram significativamente diferentes no choque séptico. Conclusões: Nosso estudo nos permite concluir que, apesar de factível, a utilização de vetores não-virais não parece representar uma estratégia terapêutica eficaz na sepse experimental. Maiores estudos são necessários para validar o uso de endoglina e HB-EGF como biomarcadores de sepse grave / Abstract: Sepsis represents a potentially fatal condition that occurs when the body's response to infection results in injury to its own tissues. Gene therapy (GT) consists in modification of the repertory of somatic cells with therapeutic purposes, replacing defective genes that cause diseases. In sepsis, non-viral vectors, could represent an excellent strategy for therapeutic gene transfer, since they do not elicit intense immune responses in the individual and are expressed only transiently. Besides, their production is easy and inexpensive. Methods: The study was divided in 3 steps. First, two reporter genes (lacZ and F9) were tested in two experimental models of sepsis (endotoxemia and cecal ligation and puncture, CLP) to confirm the feasibility of gene transfer in the context of sepsis. We assessed expression by qualitative (histochemistry) and quantitative methods (functional evaluation, through coagulometric methods). Next we evaluated the efficacy of the therapeutic gene transfer of sFlt-1, a natural VEGF antagonist, in the endotoxemia model. Expression was evaluated by ELISA, and efficacy was evaluated by a survival curve. Mice were treated with pDNA containing the Flt1 (treatment) or lacZ (control) cDNA, 6 hours after challenge with LPS. Of note, sFlt-1 has been previously shown to protect from experimental sepsis due to its endothelial barrier (EB) stabilizing properties. In the last step, we evaluated serum levels of 4 proteins involved in the modulation of EB integrity, using serum samples of subjects diagnosed with severe sepsis and septic shock (n=53), through a commercial Multiplex kit. Results: In the first step, we could confirm the expression of both reporter genes by non-viral vectors in the endotoxemia model. Of note, expression of ?-galactosidase showed a notable increase when compared with control group. Similarly, we noted increased expression of factor IX in the mice which were submitted to gene transfer with pDNA, when compared with the controls that received the lacZ pDNA (111,4 ± 16,10 vs 64,73 ± 12,34; p<0,001) in the endotoxemia model, and similar result in the group without sepsis induction by endotoxemia (163,4± 73,46 vs 79,88 ± 9,39; p=0,0006). Expression was not confirmed in the CLP model, although the limited number of animals per group does not allow a definite conclusion on this matter. In relation to the second step, only 4/14 treated animals presented detectable levels of sFlt-1 by Elisa. In addition, no difference could be observed in the survival between treated and control animals. Together, these results confirme that gene transfer with non-viral vectors is feasible in the context of severe inflammation, but with a low efficiency and predictability. Finally, we demonstrated significant differences in serum levels of endoglin (higher expression) and HB-EGF (lower expression) in patients with septic shock, compared to controls. BMP-9 and FGF-2 levels were not significantly different in septic shock. Conclusions: Our study allows us to conclude that although feasible, the use of non-viral vectors does not seem to represent an effective therapeutic strategy in experimental sepsis. Larger studies are needed to validate the use of endoglin and HB-EGF as biomarkers of severe sepsis / Mestrado / Clinica Medica / Mestra em Ciências

Durante a sepse ocorre aumento da produção de mediadores inflamatórios, dentro os quais leucotrienos (LTs), além de hipotensão seguida de aumento da secreção de vasopressina (AVP) na fase inicial e diminuição na fase tardia, a despeito da progressão da hipotensão. Estudos recentes revelam que neurônios vasopressinérgicos contêm alto conteúdo da enzima LTC4 sintase, e também há relatos de que estruturas neurais que se conectam a esses neurônios possuem receptores para LTs, sugerindo que os mesmos podem ter uma tarefa na secreção de AVP. Este estudo avaliou a participação dos LTs centrais e periféricos sobre a secreção temporal de AVP durante a sepse experimental. Ratos Wistar receberam injeção i.c.v. de MK-886 (1.0g/kg) e i.p. (1.0mg/kg), um inibidor da síntese de leucotrienos, ou DMSO 5% (veículo) e foram submetidos ao estímulo séptico por ligadura e perfuração cecal (CLP) ou à operação fictícia. Em um grupo de animais, a sobrevida foi avaliada durante 5 dias. Em outro grupo, os animais foram decapitados 0, 4, 6, 18 e 24h após a cirurgia e o sangue processado para determinação do hematócrito, sódio sérico, osmolalidade, proteínas, nitrato sérico e AVP plasmática. A neurohipófise foi coletada para a determinação do conteúdo de AVP, e o hipotálamo dissecado para a quantificação (Western blot) da LTC4 sintase nos tempos 0, 4 e 6h. A CLP aumentou a concentração de AVP plasmática na fase inicial da sepse, que foi bloqueada pela administração central e reduzida pela periférica de MK-886. A diminuição do conteúdo neurohipofisário de AVP foi revertido parcialmente pelas duas vias de administração. Os aumentos temporais de NO sérico, de hematócrito e de LTC4 sintase hipotalâmica foram reduzidos, não alterados e bloqueados, respectivamente, pela administração central de MK-886. Por outro lado, a administração periférica não alterou o NO sérico e LTC4 sintase, mas aboliu o aumento do hematócrito. A CLP também reduziu temporalmente as proteínas plasmáticas e a administração central de MK-886 não alterou, enquanto a periférica reverteu esta redução. A alta mortalidade observada após CLP foi reduzida pela administração central e não modificada pela periférica. Na fase tardia da sepse, a AVP plasmática se manteve em concentrações basais e o bloqueador de LTs administrado pelas duas vias não alterou essas concentrações. Os resultados sugerem que os LTs centrais e periféricos estão envolvidos na regulação da secreção de AVP durante sepse experimental. / During sepsis occurs an increase in the production of inflammatory mediators, including leukotrienes (LTs), which is accompanied by hypotension and a consequent increase in vasopressin (AVP) secretion. This picture characterizes the initial phase of sepsis and contrasts with the late phase, when AVP secretion declines, despite the progressive hypotension. Recent studies revealed that vasopressinergic neurons have a high content of LTC4 synthase, a critical enzyme in LT synthesis, and that neural structures with input to these neurons contain receptors for LTs, suggesting that they may play a role in regulating AVP secretion. This study evaluated the role of central and peripheral LTs in the time course of AVP secretion during experimentally induced. Male wistar rats received an i.c.v. or i.p. injection of MK-886 (1.0g/kg or 1.0mg/kg), a LTs biosynthesis inhibitor, or vehicle 1h before cecal ligation and puncture (CLP) or sham operation. In one group of animals, the survival rate was monitored for 5 days. Another group, the animals was decapitated at 0, 4, 6, 18 and 24h after CLP or sham operation, and blood was collected for hematocrit, serum sodium, plasma osmolality, plasma protein, serum nitrate and plasma AVP levels measurement. The neurohypophysis was removed for AVP content measurement, and the hypothalamus dissected for quantification (Western blot) of the LTC4 synthase at 0, 4 and 6h. The CLP increased plasma AVP levels in the initial phase of sepsis, which was blocked by the central and reduced by the peripheral administration of MK-886. The decrease in the neurohypophyseal AVP content was partially reversed by the both via of administration. The time-course increase of serum NO, hematocrit and hypothalamus LTC4 synthase was reduced, not modified and blocked respectively by the central administration of MK-886. By other way, the peripheral administration of the LTs blocker did not alter the serum NO and hypothalamus LTC4 synthase, but abolished the increase of hematocrit. The CLP also reduced temporally the plasma protein and the central administration of MK-886 did not modify whereas the peripheral administration reversed this effect. The high mortality observed after CLP was reduced by central but did not modify by peripheral administration of MK-886. In the final phase of sepsis the plasma AVP remained in the basal levels and the administration of LTs blocker by both via did not alter these hormone levels. The results suggest that the central and peripheral LTs are involved in the AVP secretion regulation during experimental sepsis.

A galectina-1 (Gal-1) é uma lectina que reconhece ?-galactosídeos e participa de vários processos biológicos, incluindo a modulação da resposta inflamatória. Dados da literatura mostram a participação desta lectina na indução da exposição de fosfatidilserina (FS - um marcador de apoptose), na geração de espécies reativas do oxigênio (EROs) e na modulação quimiotática de neutrófilos. Entretanto, ainda são escassos os dados relacionados ao impacto biológico da Gal-1, exógena e endógena, sobre a biologia destas células. Neste trabalho foram avaliados, in vitro, alguns aspectos funcionais da interação Gal-1/neutrófilo. Determinou-se o nível de expressão da Gal-1 (Western Blotting) e de seu mRNA (PCR real time), em leucócitos humanos obtidos do sangue periférico de doadores sadios e em células da linhagem promielocítica humana (HL-60). Leucócitos do sangue periférico e células HL-60 não expressam níveis detectáveis da proteína e também do mRNA para Gal-1. Por meio de ensaios de quimiluminescência (QL) foi possível analisar a capacidade da Gal-1 recombinante humana de induzir e modular a produção de EROs em neutrófilos humanos não ativados e ativados com fMLP (n-Formil-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine). A Gal-1 induz a produção de EROs de modo dose-dependente em neutrófilos ativados com fMLP. Entretanto, em neutrófilos não ativados esta lectina não induz o metabolismo oxidativo e, além disso, é capaz de modular negativamente a produção de EROs em resposta ao fMLP. Tanto nas células não ativadas quanto ativadas com fMLP, os efeitos da Gal-1 na produção de EROs estão parcialmente associados a sua propriedade lectínica. Na literatura ainda não há relatos sobre a interferência da Gal-1 no metabolismo oxidativo em neutrófilos ativados com repetidas doses de fMLP. Sabe-se que o tratamento sucessivo com fMLP reduz os níveis de produção de EROs por neutrófilos, no entanto, a presença de Gal-1 não interferiu neste processo. Interessantemente, neutrófilos recuperados do peritônio de camundongos Gal-1-/- liberam mais EROs em resposta ao fMLP e a Gal-1 exógena quando comparado aos neutrófilos de animais selvagens. Com base nos achados in vitro e sabendo que na sepse polimicrobiana o neutrófilo desempenha um papel importante, o próximo passo foi utilizar o modelo de M-CLP (sepse moderada) em camundongos destituídos (Gal-1-/-) ou não (Gal-1+/+) do gene da Gal-1. Animais Gal-1-/-, apresentam menor taxa de sobrevivência. O influxo de neutrófilos e a carga bacteriana no peritônio são maiores nos animais Gal-1-/- apesar da menor quantidade de bactérias detectadas no sangue, em relação aos animais selvagens. No pulmão, o influxo de neutrófilos é semelhante para ambos os grupos. No entanto, após a injeção intraperitoneal de 107 Unidades Formadoras de Colônias (UFC) de bactérias, camundongos Gal-1-/- apresentam maior atividade bactericida no lavado peritoneal e sangue, em relação aos selvagens. A participação da Gal-1 na homeostase de neutrófilos foi demonstrada in vitro, por citometria de fluxo (anexina-V-FITC), onde a indução de FS nos neutrófilos tratados com Gal-1 favoreceu a fagocitose destas células por macrófagos. Portanto, este conjunto de resultados sugere que a Gal-1, exógena ou endógena, pode modular funções imunológicas de neutrófilos e participar da regulação do processo inflamatório/infeccioso sistêmico. / Galectin-1 (Gal-1) is a lectin that recognizes ?-galactosides and participates in biological processes, including modulation of the inflammatory response. Literature data show the involvement of this lectin to induce exposure of phosphatidylserine (PS - a marker of apoptosis), in the generation of reactive oxygen species (ROS) and in modulation of neutrophil chemotaxis. However, there are few data related to the biological impact of exogenous and endogenous Gal-1 on the biology of these cells. This study evaluated, in vitro, some functional aspects of the interaction of Gal-1 and neutrophil. It was determined the expression level of Gal-1 (Western blotting) and its mRNA (real time PCR) on human leukocytes obtained from peripheral blood of healthy donors and human promyelocytic cell line (HL-60). Peripheral blood leukocytes and HL-60 cells do not express detectable levels of this protein as well as the Gal-1 mRNA. Through chemiluminescence testing (CL) it was possible to analyze the ability of recombinant human Gal-1 to induce and modulate the production of ROS in naïve and activated (n-Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine-fMLP) human neutrophils. Gal-1 induces ROS production in a dose-dependent way in fMLP activated neutrophils. However, in naive neutrophils this lectin does not induce oxidative stress and can negatively modulate ROS production in response to fMLP. The effects of Gal-1 on ROS production in both non-activated cells and activated cells are partially associated with their lectin property. In the literature there are no data about the interference of Gal-1 on ROS production in activated neutrophils with repeated doses of fMLP. It is known that the subsequent treatment with fMLP reduced levels of ROS production by neutrophils; however, the presence of Gal-1 did not affect this process. Interestingly, peritoneum neutrophils from Gal-1-/- mice release more ROS in response to fMLP and exogenous Gal-1 when compared to neutrophils from wild type animals. Based on the in vitro findings and considering that in polymicrobial sepsis, neutrophils play an important role, the next step was to use the M-CLP model (moderate sepsis) in mice lacking (Gal-1-/-) or not (Gal-1+/+) Gal-1 gene. Gal-1-/- animals present lower survival rate and fewer bacteria in the blood despite having higher bacterial load in infectious focus in relation to wild type mice. The rates of neutrophils influx into the peritoneum and lungs are similar for both groups. The participation of Gal-1 in the homeostasis of neutrophils was demonstrated in vitro by flow cytometry (annexin V-FITC), where induced PS by Gal-1 in the neutrophils enhanced the phagocytosis of these cells by macrophages. Therefore, this set of results suggests that Gal-1, exogenous or endogenous, can modulate immune functions of neutrophils and participate in the regulation of inflammatory/infectious disorders.

A fisiopatologia da sepse se caracteriza por hipotensão acompanhada de aumento da secreção de vasopressina (AVP) na fase inicial e diminuição numa fase mais tardia. Essa hipotensão é em parte devido ao aumento da quantidade de óxido nítrico, que juntamente com outros mediadores tem sua produção aumentada durante a sepse. A óxido nítrico sintase (NOS) é responsável pela síntese deste mediador, e sua isoforma neuronal (nNOS) está presente no músculo esquelético, pulmões, testículos, próstata, pele e também nos neurônios vasopressinérgicos do hipotálamo. O presente trabalho avaliou a participação do óxido nítrico produzido pela isoforma neuronal de NOS sobre a secreção temporal de AVP durante a sepse experimental. Ratos Wistar receberam injeção i.p. de 7-nitroindazol (50mg/kg ou 80mg/kg), inibidor específico da NOS neuronal, ou DMSO 10% + óleo de gergelim na proporção 1:9 (veículo) e após 30 minutos foram submetidos ao estímulo séptico por ligadura e perfuração cecal (CLP) ou à operação fictícia (OF). Em um grupo de animais, a sobrevida foi avaliada durante 5 dias. Em outro grupo, os animais foram decapitados 0, 4, 6, 18 e 24 horas após a cirurgia e o sangue processado para determinação do hematócrito, sódio sérico, osmolalidade, proteínas, glicose, creatinina, nitrato sérico e AVP plasmática. A neurohipófise foi removida para a determinação do conteúdo de AVP, e o hipotálamo dissecado para a determinação da atividade da NOS total. A mortalidade observada após CLP não foi modificada com o pré-tratamento com 7-NI (50mg/kg), assim como os aumentos temporais de hematócrito, glicose e nitrato sérico observados. As proteínas plasmáticas e o sódio sérico apresentaram diminuição após CLP e o pré-tratamento com 7-NI antecipou a perda proteica e postergou a diminuição do sódio sérico. Os animais após CLP não apresentaram alterações de creatinina e osmolalidade, entretanto quando prétratados com 7-NI, apresentaram aumento em 6 e 18 horas e diminuição a partir de 4hs, respectivamente. A atividade da NOS total no hipotálamo aumentou nos tempos determinados de 4 e 24 horas após CLP e este aumento foi reduzido com o prétratamento com o 7-NI nas doses de 50 e 80mg/kg, respectivamente. O conteúdo neurohipofisário de AVP diminuiu em 4, 6 e 18 horas após CLP e o pré-tratamento com 7-NI reduziu os estoques apenas em 0 e 6 horas. As concentrações plasmáticas de vasopressina apresentaram-se aumentadas sómente 6 horas após CLP e o pré-tratamento não alterou essas concentrações. Esses resultados permitem concluir que o NO produzido pela NOS neuronal não teria uma tarefa substancial na secreção de vasopressina durante sepse experimental. / The pathophysiology of sepsis is caracterized by hypotension accompanied by increase of vasopressin secretion (AVP) in early phase and decrease during late phase. This hypotension is due, in part, to the increase of nitric oxide (NO) production, that, like other mediators, shows high production during sepsis. Nitric oxide synthase (NOS) is responsible by synthesis of NO. The neuronal isoform of NOS is present in skeletic muscle, testicles, prostate, skin and vasopressinergics neurons of hypothalamus. The present work evaluated the participation of nitric oxide produced by neuronal NOS in temporal vasopressin secretion during experimental sepsis. Rats Wistar received intraperitoneal injection of 7-nitroindazole (50 or 80 mg/kg), an inhibitor of neuronal nitric oxide synthase activity, or DMSO 10% + sesame oil in the proportion 1:9 (vehicle) and after 30 minutes, they were submited to septic stimulus by cecal ligation and puncture (CLP) or to sham operation. In one of the groups, the survival rate was evaluated during 5 days. In other group, the animals were decapited 0, 4, 6, 18 and 24 hours after CLP and the blood was processed to determinate haematocrit, serum sodium, osmolality, proteins, glucose, creatinine, serum nitrate, and plasma AVP. Neurohypophysis was removed to determination of vasopressin content, and hypotalamus was dissected to determinate total NOS activity. Mortality observed after CLP was not affected by periferal injection of 7-nitroindazole (50 mg/kg) as well as haematocrit, glucose and nitrate increase. Serum sodium and plasma protein decreased after CLP and the treatment antecipated the loss protein, and delayed serum sodium decrease. CLP animals didn\'t show creatinine and osmolality alterations, but when treated with 7-nitroindazole, showed increase 6 and 18 hours, and decrease 4 hours, respectively. NOS activity in hypothalamus increased 4 and 24 hours after CLP, and was reduced with 7-NI pretreatment (50 and 80 mg/kg respectively). AVP neurohypophysis content diminished 4, 6 and 18 hours after CLP and 7-NI reduced the content just at 0 and 6 hours. Vasopressin plasma concentration increased just 6 hours after CLP and 7-NI pretreatment didn\'t alter this parameter. We concluded that NO produced by neuronal NOS doesn\'t have a substantial role in vasopressin secretion during experimental sepsis.