Neuroblastoma é um tumor do sistema nervoso periférico e uma das principais causas de mortalidade infantil por câncer no Brasil e no mundo. A característica marcante desses tumores é sua heterogeneidade clínica – as apresentações variam desde formas benignas e tratáveis até variantes extremamente agressivas, que levam o paciente a óbito em poucos meses. A fim de determinar as melhores estratégias para o tratamento desse câncer, um grande número de pesquisadores tem procurado por novos biomarcadores e alvos terapêuticos. Atualmente, o melhor marcador biológico para a progressão de neuroblastoma é a amplificação do gene MYCN, que ocorre na maioria dos casos mais agressivos. Entretanto, esse marcador não é capaz de discriminar entre todos os tipos de pacientes, demonstrando a necessidade de encontrarmos outros marcadores. Neste trabalho, reconstruímos a rede de regulação gênica de neuroblastoma utilizando ferramentas de bioinformática e biologia de sistemas a fim de buscar novos biomarcadores e alvos terapêuticos para esta doença. Através dessa rede, analisamos uma assinatura de genes diferentemente expressos em metástases agressivas, buscando fatores de transcrição que pudessem estar envolvidos na progressão tumoral. Através dessa análise, observamos que MAX é um dos reguladores mestres do processo, e variações em sua expressão estavam correlacionadas com o desfecho de pacientes, sugerindo seu potencial como biomarcador. Além disso, também observamos o aumento do conteúdo de MAX em células de linhagem de neuroblastoma humano durante um protocolo de diferenciação experimental, sugerindo que essa proteína tem um papel muito mais central no controle do balanço entre proliferação e diferenciação do que previamente descrito. / Neuroblastoma is a peripheral nervous system tumor and one of the main causes of children cancer mortality in Brazil and in the rest of the world. The hallmark of these tumors is their clinical heterogeneity – presentations vary from benign and treatable to extremely aggressive variants, the latter leading the patient to death in just a few months. In order to come up with the best strategies for treatment and management of this cancer, a great number of researchers have been searching for novel biomarkers and therapeutic targets. To this date, the best neuroblastoma biomarker is the amplification of MYCN oncogene, which occurs in the majority of aggressive cases. However, this biomarker alone does not suffice to discriminate among all patients types, illustrating the need for finding other biomarkers. In this work, we reverse engineered the neuroblastoma gene regulatory network using systems biology and bioinformatics tools in order to find novel biomarkers and therapeutic targets. Using this network, we analyzed an aggressive metastasis gene signature to find transcription factors that could be involved in tumor progression. Through this analysis, we observed that MAX was a master regulator of this process, and that changes in its expression were associated with patient survival, suggesting its role as potential biomarker. Additionally, we observed that MAX content was increased in human neuroblastoma cell lines undergoing experimental differentiation. These results suggest that this protein has a much more central role in regulating the balance between proliferation and differentiation than previously described.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-11-24T03:09:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 336194.pdf: 1918264 bytes, checksum: 424f512efbedf7a1c5f9c05318cba36a (MD5) Previous issue date: 2015 / O número de pacientes acometidos por doenças neurodegenerativas crônicas vem crescendo nas últimas décadas devido ao aumento da expectativa de vida mundial. A doença de Parkinson (DP) é uma das doenças neurodegenerativas mais prevalentes na população. Além das manifestações motoras clássicas, mais de 90% dos pacientes com DP também desenvolvem complicações não motoras, entre as quais se destacam prejuízos cognitivos e depressão. Embora muitas estratégias farmacológicas tenham sido aplicadas e/ou propostas para o tratamento da DP, assim como para doenças neurodegenerativas em geral, a necessidade de abordagens terapêuticas neuroprotetoras/restauradoras permanece não atendida. Derivados de quinoxalina representam uma família de compostos de interesse terapêutico por possuir um largo espectro de atividades biológicas. O composto sintético 2-metil-3-fenil-6-aminoquinoxalina (MPAQ) é um derivado quinoxalínico recentemente estudado, o qual parece exercer atividade neuroprotetora. Ainda, a tetrahidrobiopterina (BH4) é uma pterina que atua como cofator obrigatório para a atividade das enzimas fenilalanina hidroxilase, tirosina hidroxilase e triptofano hidroxilase, as quais catalisam as etapas iniciais da degradação da fenilalanina no fígado, assim como as etapas limitantes da biossíntese dos neurotransmissores dopamina e serotonina. A BH4 também atua como cofator obrigatório para a atividade de todas as isoformas de óxido nítrico sintases (NOS), a qual sintetiza óxido nítrico (NO), uma molécula mensageira envolvida em inúmeros processos fisiológicos, além de ser um mensageiro retrógrado no sistema nervoso central (SNC). O objetivo deste trabalho foi caracterizar o possível efeito neuroprotetor do composto MPAQ, assim como melhor entender o papel da BH4 em processos cognitivos. Foram avaliados parâmetros do metabolismo mitocondrial, as concentrações de monoaminas e seus metabolitos principais, a atividade da monoamina oxidase (MAO), uma enzima importante para os processos catabólicos das principais monoaminas, bem como a ativação do sistema imune. Observou-se que MPAQ não apresentou efeito tóxico sobre o material biológico proveniente do cérebro de camundongos Swiss albino. O número de neurônios TH+ observados em culturas de células mesencefálicas tratadas in vitro com MPAQ aumentou significativamente após o tratamento com 100 µM de MPAQ. Da mesma forma, a captação de [H3]-dopamina por neurônios TH+ aumentou após o tratamento com 50 e 100 µM de MPAQ. O conteúdo de neopterina, um metabólitosecundário da via de síntese de BH4, aumentou significativamente no plasma e no estriado de camundongos C57bl/6 administrados com MPTP, demonstrando que no modelo animal agudo da DP a via de síntese de BH4 está aumentada provavelmente devido à ativação do processo inflamatório com consequente produção de NO. Considerando que na DP o processo inflamatório é crônico e não agudo, a biodisponibilidade de BH4 poderia ser deficiente e assim ser responsável pelas alterações cognitivas presentes nos indivíduos afetados pela doença. Para isso, foram investigadas medidas comportamentais que avaliam a formação da memória aversiva após a administração intracerebroventricular (i.c.v.) de BH4 em modelos in vivo de neuroinflamação e depressão, assim como em diferentes linhagens de roedores de cepas selvagens. A BH4 favoreceu a formação da memória em todos os sistemas experimentais testados, o que correlacionou com um menor limiar para a geração do LTP. No entanto, este efeito foi suprimido pela administração de L-NAME (inibidor não seletivo de NOS) e MK-801 (antagonista não competitivo de receptores NMDA). A administração do análogo de GMPc, o 8-bromo-GMPc, não reverteu a inibição gerada por L-NAME ou MK-801, sugerindo que a BH4 participa da neuromodulação da memória através de vias clássicas dependentes da sinalização glutamatérgica e do NO. Concluindo, este trabalho sugere que o composto MPAQ possivelmente exerce atividade neuroprotetora in vitro e que BH4 modula a formação da memória através de vias de sinalização clássicas que envolvem NO e receptores NMDA.<br> / Abstract : The number of patients affected by chronic neurodegenerative diseases has increased in recent decades due to increase in the life span worldwide. Parkinson's disease (PD) is one of the most prevalent neurodegenerative disease in the population. Besides the classic motor manifestations, more than 90% of patients with PD also develop non-motor complications, including cognitive losses and depression. Although many pharmacologic strategies have been applied and / or proposed for the treatment of PD, as well as neurodegenerative diseases in general, the need for neuroprotective / restorative therapeutic approaches remains unmet. Quinoxaline derivatives represent a family of compounds of therapeutic interest to possess a broad spectrum of biological activities. The synthetic compound 2-methyl-3-phenyl-6-aminoquinoxaline (MPAQ) is a quinoxaline derivative recently studied, which appears to exert neuroprotective activity. Still, tetrahydrobiopterin (BH4) is a pterin that acts as cofactor for phenylalanine hydroxylase,which catalyze the initial steps of phenylalanine degradation in the liver, as well as the limiting steps of the biosynthesis of neurotransmitters dopamine and serotonin. BH4 also acts as cofactor for the activity of all nitric oxide synthase (NOS) isoforms, essencial for nitric oxide (NO) synthesis, a messenger molecule involved in many physiological processes, besides being a retrograde messenger in the central nervous system (CNS). The objective of this study was to characterize the possible neuroprotective effect of MPAQ compound, as well as better understand the role of BH4 in cognitive processes. We evaluated parameters of mitochondrial metabolism, the concentrations of monoamines and their major metabolites, the monoamine oxidase (MAO) activity, an important enzyme for the monoamines catabolic processes, as well as activation of the immune system. It was observed that MPAQ showed no toxic effect on the biological material from Swiss Albino mice brain. The number of TH+ neurons observed in the mesencephalic cell cultures treated in vitro with MPAQ increased significantly after treatment with 100 µM of MPAQ. Likewise, the uptake of [H3]-dopamina by TH+ neurons increased after treatment with 50 and 100 µM of MPAQ. The contents of neopterin, a secondary metabolite of BH4 pathway increased significantly in plasma and striatal C57BL/6 mice administered MPTP, demonstrating that in acute animal model of PD the BH4 synthesis pathway is increased probably due to activation of the inflammatory process with consequentproduction of NO. Whereas in PD the inflammation is chronic and not acute, the bioavailability of BH4 could be deficient and thus be responsible for the cognitive changes present in individuals affected by the disease. For this, behavioral measures were investigated to assess the aversive memory formation after intracerebroventricular (i.c.v.) administration of BH4 in in vivo models of neuroinflammation and depression, as well as in different strains of rodents from wild strains. It was observed that BH4 favored memory formation in all the experimental systems tested, which correlated with a lower threshold for the LTP generation. However, this effect was suppressed by L-NAME (non-selective NOS inhibitor) and MK-801 (non-competitive NMDA receptor antagonist) administration. The administration of the cGMP analogue, 8-bromo-cGMP, did not reverse the inhibition generated by L-NAME or MK-801, suggesting that BH4 participates in memory's neuromodulation through the glutamatergic and NO classical signaling. In conclusion, this study suggests that MPAQ compound possibly has neuroprotective activity in vitro and BH4 modulates memory formation through classic pathways involving NO and NMDA receptors.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-12-06T00:14:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 319041.pdf: 2165021 bytes, checksum: 8b0009ffb76e7e088e3c002c06bc53e3 (MD5) Previous issue date: 2013 / Existem hipóteses que o processo patológico da Doença de Parkinson inicia-se no Sistema Nervoso Entérico e no bulbo olfatório. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar se a administração oral de um pesticida, rotenona, seria capaz de mimetizar a progressão temporal do parkinsonismo em camundongos, considerando os efeitos locais no trato gastrointestinal, efeitos comportamentais e neuroquímicos. Neste estudo, camundongos machos receberam administrações orais diárias de rotenona ou o veículo (carboximetilcelulose à 0,5%) por até 28 dias. Nossos resultados demonstram que o tratamento com a rotenona diminui a motilidade gastrointestinal associada à inflitração de leucócitos no cólon. Além disso, a rotenona prejudicou a discriminação e o reconhecimento olfativo, ao mesmo tempo em que induziu aumento taxa de renovação da serotonina no bulbo olfatório, sugerindo que as alterações neuroquímicas encontradas possam estar relacionadas ao prejuízo do processamento olfatório. No presente estudo, o comprometimento intestinal e olfatório precedem os danos motores, de maneira semelhante ao observado na Doença de Parkinson. Apesar disso, não houve diferença na concentração de monoaminas estriatais. O presente estudo demonstrou a importância do modelo experimental induzido pela administração oral de rotenona rotenona para compreensão dos mecanismos envolvidos nas alterações pré-motoras da Doença de Parkinson. Além disso, nossos resultados reforçam a importância da exposição a toxinas ambientais como fator de predisposição para a Doença de Parkinson. Ainda, esses resultados ressaltam a importância da via oral como porta de entrada para toxinas ambientais e o epitélio gastrointestinal como a primeira barreira de contato entre pesticidas e o organismo <br> / Abstract: Accumulating evidence suggested that the pathological process of Parkinson´s disease starts in the enteric nervous system and in the olfactory bulb. However this hypothesis has not yet been fully investigated. Therefore, the aim of this study was to investigate the role of enteric nervous system and olfactory bulb in the onset of Parkinson?s disease induced by rotenone administration in mice. Male Swiss mice received daily oral administrations of rotenone 30 mg/kg or vehicle (0.5% carboxymetylcellulose) up to 28 days. Our results showed that rotenone was able to reduce the gastrointestinal motility, which was associated to leukocyte infiltration in the colon. Regarding the olfactory function, rotenone disrupted the discrimation and recognition abilities. At the same time, this treatment increased the serotonin turnover in the olfactory bulb, which suggests that these neurochemical alterations may be linked with the abnormal processing of odor stimulus. These alterations preceded the appearance of motor disability in our model, such as in Parkinson´s Disease clinical condition. Despite of it, no difference was found in monoaminergic concentrations in striatum. The current result indicated that rotenone model can be an important tool for studying premotor phase of parkinsonism in rodents. Moreover, our results reinforce the importance of environmental exposure to toxins and the key role of intestinal epithelium as the first point of contact with pesticides and chemical agents.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-10-19T13:01:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 339614.pdf: 2590718 bytes, checksum: 1167194006e4630cfa0a4984aba90e64 (MD5) Previous issue date: 2015 / As proteínas cinases ativadas por mitógenos (MAPKs) representam uma família de serina/treonina cinases ativadas por fosforilação em resposta a sinais extracelulares que incluem ERK 1/2, JNK p54/p46 e p38MAPK. No sistema nervoso central (SNC) estas enzimas medeiam eventos associados ao desenvolvimento e neuroplasticidade. No período inicial do desenvolvimento pós-natal ocorrem alterações significativas na estrutura do cérebro e sinalização intracelular. No hipocampo de roedores as MAPKs têm sido apontadas como proteínas fundamentais na modulação do desenvolvimento neural e plasticidade sináptica. Apesar dessas evidências a ontogenia pós-natal das MAPKs em estruturas específicas, bem como o seu papel, em determinadas fases do desenvolvimento, para o estabelecimento de funções motoras e cognitivas no adulto tem sido pouco caracterizada. A compreensão do padrão de ativação das MAPKs durante o neurodesenvolvimento é essencial, uma vez que pequenas alterações na atividade dessas proteínas em janelas específicas do desenvolvimento podem implicar em alterações funcionais tardias. No presente estudo foi determinado, em uma primeira etapa, o perfil ontogenético da fosforilação e conteúdo total das MAPKs no hipocampo de ratos Wistar machos durante o período pós-natal (PN) 1-60. Para isso a fosforilação e o conteúdo total das MAPKs foram avaliados por western blotting nas idades: PN1, PN4, PN7, PN10, PN14, PN21, PN30 e PN60. Os resultados foram expressos como percentual relativo à PN1 e demonstraram: (1) aumento significativo na fosforilação de p38MAPK de forma bimodal em PN4 e PN10-60; (2) aumento na fosforilação de ERK1 (PN4) e ERK2 (PN14) dependente da idade; (3) variação do conteúdo total de JNKp54 com perfil similar ao da ativação de p38MAPK; 4) ausência de variação na taxa de fosforilação de JNK p54/p46 nas idades analisadas. Em uma segunda etapa foi determinado o papel da atividade de ERK 1/2 durante o desenvolvimento em relação às alterações comportamentais, da estrutura sináptica e na proliferação celular hipocampal na vida adulta do animal. Para isso, foi utilizado um protocolo de inibição de MEK/ERK com U0126 (5 mg/kg; i.p.) durante um período crítico de sinaptogênese (PN7-14). Os resultados mostraram que o tratamento com o U0126 foi efetivo, pois foi observado inibição significativa da fosforilação de ERK 1, avaliada no hipocampo em PN7 e 6 h após a administração do inibidor. Adicionalmente, demonstraram que o tratamento com U0126 em PN7-14, quando comparado ao controle (DMSO 1%), tem consequências relevantes na vida adulta dos animais que incluem: (i) modificações na estrutura sináptica no hipocampo em PN30, com diminuição do diâmetro da densidade pós-sináptica e no número de vesículas no terminal pré-sináptico; (ii) danos permanentes na memória de curta duração; (iii) diminuição na proliferação celular analisado pela quantidade de células positivas para Ki-67 no giro denteado do hipocampo; e (iv) aumento na expressão de GFAP no hipocampo dos ratos quando comparado ao grupo controle (DMSO 1%). Em conjunto os resultados mostram a existência de um perfil específico de atividade das MAPKs durante o desenvolvimento pós-natal de ratos e sugerem que alteração da atividade dessas enzimas, por fatores ambientais diversos, podem acarretar alterações funcionais e estruturais permanentes do SNC.<br> / Abstract : The mitogen-activated protein kinases (MAPK) represent a family of serine/threonine kinases activated by phosphorylation in response to extracellular signals that includes ERK 1/2, JNK p54/p46 and p38MAPK. In the central nervous system (CNS), these enzymes mediate events associated with development and neuroplasticity. The early postnatal development is characterized by significant changes in brain structure, and intracellular signaling. In the hippocampus of rodents MAPKs have been identified as key proteins in the modulation of neural development and synaptic plasticity. Despite these evidences, studies characterizing the postnatal ontogeny of MAPKs in specific structures in the early periods of postnatal development in rodents are scarce. Thus, understanding the pattern of MAPK activation during brain development is critical, since minor changes in the activity of these proteins in specific developmental windows can result in later functional disorders. Accordingly, our study initially determined the profile of phosphorylation and total content of MAPKs in the hippocampus of male Wistar rats during the postnatal period (PN) 1-60. In order to target this aim MAPKs were evaluated by western blotting at ages: PN1, PN4, PN7, PN10, PN14, PN21, PN30 and PN60. The results were expressed as percentage related to PN1 and demonstrated: (1) significant increment in phosphorylation of p38MAPK displayed in two peaks one PN4 and a second at PN10-60; (2) age dependent increase in the phosphorylation of ERK1 (PN4) and ERK2 (PN14); (3) change in the total content JNKp54 with similar profile to that of p38MAPK activation; (4) no variation in the content of JNKp46 nether in the rate of phosphorylation of JNK p54/p46 in the ages analyzed. In a second stage we determined the role of ERK 1/2 activity during development regarding changes in synaptic structure, behavioral and cellular proliferation in the adult life. For this, rats were treated in the developmental period PN7-14 with the MEK/ERK inhibitor U0126 (5 mg/kg; ip). The results showed that the treatment with U0126 was effective, since it was detected a significant inhibition of ERK 1 phosphorylation, evaluated at PN7 and 6 h after the administration of the inhibitor. Moreover, the results demonstrated that the treatment with U0126 at PN7-14, as compared to the control (DMSO 1%), bring consequences for adulthood that include: (i) changes in hippocampal synaptic structure at PN30, decreasing the diameter of postsynaptic density and the number of vesicles in the presynaptic terminal; (ii) permanent damage in short term memory; (iii) a decrease in cell proliferation assessed by the number of cells positive for Ki-67 in the dentate gyrus of the hippocampus); and (iv) increased expression of GFAP in the hippocampus of rats compared with the control group (1% DMSO). Taken together the results show a specific profile of MAPKs activity during the postnatal development of rats and suggest that alteration of the activity of these enzymes by environmental factors may cause permanent functional changes in the CNS.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-10-19T13:08:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 339053.pdf: 5559976 bytes, checksum: 5ca8a2f44ed459e6a56c79a18280a177 (MD5) / O declínio de funções cognitivas básicas, como o aprendizado e a memória, é uma condição associada com o processo natural de envelhecimento e com diferentes patologias neurológicas e neurodegenerativas. Embora algumas estratégias farmacológicas têm sido aplicadas para prevenir e/ou atenuar os déficits observados nessa condição a descoberta de novas ferramentas nootrópicas é alvo da indústria farmacêutica. A neopterina, um metabólito secundário da via de síntese de novo da tetrahidrobiopterina, é encontrada em concentrações aumentadas em fluidos biológicos de indivíduos afetados por patologias que apresentam ativação do sistema imune, porém o seu efeito é pouco explorado. A grande maioria dos estudos disponíveis na literatura a descrevem como um composto inerte, e uma pequena parcela associa tratamentos in vitro dessa pterina com efeitos relacionados a estresse eletrofílico, porém a sua função no sistema nervoso central não é conhecida. Considerando que estresse eletrofílico pode ativar vias de proteção celular, o presente trabalho investigou o possível efeito da neopterina como um potencializador cognitivo. Para isto, o efeito da administração intracerebroventricular (i.c.v.) de neopterina foi estudado sobre parâmetros comportamentais e relacionados ao estresse oxidativo e inflamação, no cérebro de diversas cepas de roedores (camundongos Suíços de 60 dias de vida; nocautes para a citocina IL-10 (IL-10(-/-)) de17 meses de vida; camundongos VGV de 60 dias de vida, camundongos C57BL/6 de 60 dias de vida; e ratos Wistar de 60 dias de vida. Ainda, a síntese e o efeito in vitro da neopterina foram também investigados em sistemas experimentais (culturas primárias de células nervosas humanas, células gliais C6 e cultura primária de astrócitos estriatais e hipocampais de ratos) onde foi gerado estresse eletrofílico pela adição do oxidante peróxido de hidrogênio ou do inibidor da cadeia respiratória, azida sódica; ou ainda indução de inflamação por agentes pro-inflamatórios. Os resultados demonstraram que a administração i.c.v. de neopterina (0,4 ou 4 pmol) facilitou a aquisição e consolidação da memória sem modificar a atividade locomotora espontânea em camundongos Suíços, IL-10(-/-) e ratos Wistar. Por outro lado, este mesmo tratamento conseguiu prevenir as deficiências na locomoção induzidas pelo lipopolissacarídeo bacteriano (LPS; 0,33 mg/kg; intraperitoneal) em animais IL-10(-/-). Em concordância com os resultados comportamentais relacionados a memória, a administração i.c.v. de neopterina diminuiu o limiar para a potenciação de longo prazoem fatias hipocampais de ratos Wistar. Adicionalmente, a administração i.c.v. de neopterina aumentou a resistência ao estresse oxidativo tecidual, por aumentar as concentrações de glutationa, tióis livres e atividade de enzimas antioxidantes e por diminuir a peroxidação lipídica em camundongos Suíços. A neopterina também demonstrou atividade anti-inflamatória por prevenir o aumento das concentrações de IL-6 induzida pela administração de LPS em animais IL-10(-/-). In vitro, foi observado que o bloqueio da função mitocondrial em fatias hipocampais de camundongos Suíços resulta em liberação extracelular de neopterina. Em culturas primárias de células humanas neurais (astrócitos, neurônios e microglia) a produção e liberação de neopterina para o meio extracelular foi induzida por fatores inflamatórios como interferon-? e LPS. Em concordância com os resultados encontrados in vivo, o prétratamento com neopterina em sistemas in vitro preveniu o estresse oxidativo induzido por peróxido de hidrogênio e azida. Além disso, a incubação com neopterina promoveu um aumento da marcação para o fator nuclear eritróide 2 relacionado ao fator 2 (Nrf2) e o conteúdo da enzima hemeoxigenase-1. Finalmente, a captação de glutamato e cálcio foram analisadas como forma de melhor entender o efeito da neopterina sobre a LTP, onde foi observado a que neopterina aumentou a captação de glutamato tanto em fatias hipocampais quanto em células C6, além de aumentar a mobilização de cálcio intracelular em astrócitos hipocampais de ratos Wistar. Em conjunto estes resultados sugerem que a neopterina apresenta um efeito potencializador da cognição, facilitando a aquisição da memória e tem ação citoprotetora via ativação de Nrf2.<br> / Abstract : The impairment of basic cognitive functions, such as learning and memory, is a condition associated with both the natural process of aging and several neurological and neurodegenerative disorders. Even though some therapeutic strategies have been applied to cognitive impairments prevention or attenuation in these conditions, the discovery of new nootropic tools is a target of the pharmaceutical industry. Neopterin, a secundary metabolite of the tetrahydrobiopterin de novo biosynthetic pathway, is found at increased levels in biological fluids from patients of pathologies with immune system activation; however, its role on the central nervous system is virtually unknown. Most of the studies available on the literature have described neopterin as an inert compound, and some of them associated the in vitro exposure to the pterin with eletrophilic stress-related effects. Taking into consideration that eletrophilic stress can activate cellular protective pathways, the present work investigated the potential effect of neopterin as a cognitive potentiator. Thus, the effect of neopterin intracerebroventricular (i.c.v.) administration was investigated on behavior and parameters related to oxidative stress and inflammation in the brain from several rodent strains (60 day old Swiss and C57BL/6 mice; 17 month old IL-10 cytokine knockout (IL-10(-/-)); and 60 day old Wistar rats). In addition, neopterin synthesis and in vitro effects were investigated in experimental systems (human primary nervous cell cultures, C6 glial cell line and rat primary hippocampal and striatal astrocytes culture) in which eletrophilic stress was induced by the addition of the oxidant hydrogen peroxide or the mitochondrial respiratory chain inhibitor, sodium azide; or pro-inflammatory agents to induce inflammation. The results demonstrated that neopterin (0.4 or 4 pmol) i.c.v. adiministration improved memory acquisition and consolidation without affect spontaneous locomotor activity in Swiss and IL-10(-/-) mice and Wistar rats. Still, the same treatment prevented locomotor impairments induced by the bacterial lipopolysaccharide (LPS; 0.33 mg/kg; intraperitoneal) in IL-10(-/-) mice. In agreement with the behavioral results related to memory, neopterin i.c.v. administration reduced the long term potentiation in Wistar rats hippocampal slices. Moreover, neopterin i.c.v. administration increased the resistance to oxidative stress by increasing glutathione and free thiol levels and antioxidant enzymes activities and decreasing lipid oxidation in Swiss mice brain. Neopterin also showed anti-inflammatory activity by preventing IL-6 levels increase induced by LPS in IL-10(-/-) mice. In vitro, it was observed that the mitochondrial function blockage in Swiss mice hippocampal slices results in neopterin extracellular release. In human primary neural cell cultures (astrocytes, neurons and microglia), neopterin production and release for the extracellular medium was induced by inflammatory factors as interferon-? and LPS. In agreement with the in vivo results, the pretreatment with neopterin in in vitro systems prevented the hydrogen peroxide and azide-induced oxidative stress. Furthermore, neopterin exposure promoted an increase in nuclear factor (erythroidderived 2)-like 2 (Nrf2) staining and the heme oxygenase-1 enzyme content. Finally, glutamate and calcium uptake were analyzed in order to improve the understanding regarding neopterin effects on LTP, and it was observed that neopterin increased glutamate uptake both in hippocampal slices and C6 cell line and increased calcium influx in Wistar rats hippocampal astrocytes culture. These results suggest that neopterin exerts a cognitive potentiator role, facilitating memory acquisition and has a cytoprotective action through Nrf2 activation.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências / Made available in DSpace on 2012-10-20T03:44:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2014-09-26T02:34:32Z : No. of bitstreams: 1 182966.pdf: 29485484 bytes, checksum: b756a7a7b1df034005987c973cbbb537 (MD5) / Objetivando estudar a organização do pedúnculo óptico e do gânglio cerebral de larvas, jovens e adultos, empregou-se procedimentos histológicos gerais e imunohistoquímicos contra serotonina. O olho composto é formado por uma sequência de omatídeos, onde está presente uma zona de proliferação omatideal que perdura durante a vida larval e juvenil. O olho composto do adulto apresenta um sistema de proteção pigmentar mais estruturado. Os corpos celulares nas larvas formam um córtex contínuo envolvendo os neurópilos. Nos adultos constituem agrupamentos celulares bem delimitados, aonde são identificados 5 diferentes tipos celulares. Todos os neurópilos do gânglio cerebral são verificados desde a primeira fase larval. As larvas apresentam desde a eclosão lobos olfatórios e acessórios fundidos e glomerulares. No pedúnculo óptico, o corpo hemielipsóide somente é identificado na segunda fase. A partir desta fase larval os rudimentos da glândula do sinus são reconhecidos. O órgão de Bellonci larval constitui uma região vacuolar na face dorsal do pedúnculo óptico, enquanto no adulto localiza-se na face ventral. Um sítio de marcação serotonérgica foi verificado nos grandes corpos celulares da medula terminal do pedúnculo óptico durante as três fases larvais e a partir segunda fase larval também no gânglio cerebral. Nos jovens e adultos a marcação serotonérgica é mais difusa e amplamente distribuída. As características do sistema nervoso larval refletem as exigências encontradas no habitat bentônico desde a eclosão, e a complexidade neural atingida pelos adultos parece relacionada á ampliação do repertório comportamental.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2013. / Submitted by Luiza Silva Almeida (luizaalmeida@bce.unb.br) on 2013-07-25T16:38:54Z No. of bitstreams: 1 2013_AndreaAmaroQuesada.pdf: 1285043 bytes, checksum: 7e45a9a6310d3ac77926791e77db533e (MD5) / Approved for entry into archive by Leandro Silva Borges(leandroborges@bce.unb.br) on 2013-07-25T18:24:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_AndreaAmaroQuesada.pdf: 1285043 bytes, checksum: 7e45a9a6310d3ac77926791e77db533e (MD5) / Made available in DSpace on 2013-07-25T18:24:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_AndreaAmaroQuesada.pdf: 1285043 bytes, checksum: 7e45a9a6310d3ac77926791e77db533e (MD5) / Introdução: Cerca de 15 milhões de bebês prematuros nascem por ano no mundo. O nascimento prematuro envolve uma série de fatores de risco ao desenvolvimento como a exposição precoce ao estresse. Apesar disso, pouco se sabe sobre os possíveis prejuízos ocasionados pelo cenário prematuridade na infância. Objetivo: Investigar os efeitos da prematuridade na infância sobre o funcionamento do eixo Hipotálamo-Hipófise-Adrenal (HHA) e Sistema Nervoso Simpático (SNS), memória e, desenvolvimento comportamental e emocional. Delineamento de pesquisa: Para alcançar tal objetivo, realizou-se um estudo quase experimental, no qual participaram 30 crianças brasileiras pré-termo (grupo experimental) e 31 crianças brasileiras a termo. Métodos: Cortisol e alfa-amilase (sAA) dos participantes foram avaliados durante dois dias consecutivos em quatro momentos diferentes: ao acordar, 30 min pós-acordar, às 16:00h e às 21:00h. Além disso, as crianças foram submetidas a bateria Wide Range Assessment of Memory and Learning (WRAML2) de avaliação de memória. Problemas de comportamento e sintomas emocionais foram rastreados por meio do Questionário de Dificuldades e Capacidades (do inglês, Strengths and Difficulties Questionnaire (SDQ)). Após uma semana, as crianças foram expostas a um conhecido estressor, o Trier Social Stress Test for Children (TSST-C). Cortisol e sAA foram mensurados novamente em quatro momentos diferentes: antes do TSST-C, 1min, 10min, e 25 min após o estressor. Resultados: Crianças pré-termo apresentaram déficits de memória, elevado índice de sintomas emocionais e hiper-funcionamento do eixo Hipotálamo-Hipófise-Adrenal (HHA) em resposta ao TSST-C. A indução de cortisol pelo TSST-C foi mais significativa em meninas pré-termo. Entretanto, crianças pré-termo e a termo não diferiram nas concentrações de sAA. Conclusão: O presente estudo demonstra as consequências do cenário prematuridade na infância. Crianças pré-termo são um fenótipo mais vulnerável, suscetíveis a alterações do funcionamento do eixo HHA, deficits de memória e problemas emocionais. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Context: Every year, around 15 million babies are born prematurely worldwide. Being born prematurely involves the exposure to several risk factors to development, such as early-life stress. Nonetheless, little is known about the effects of preterm birth later on in childhood. Objective: Our objective was to investigate the consequences of preterm birth on hypothalamus-pituitary-adrenal axis functioning, sympathetic nervous system functioning, memory performance and, behavioral and emotional profile in childhood. Design and Setting: We conducted a quasi-experimental study, on which participated 30 Brazilian preterm children (experimental group) and 31 sex and age-matched full-term children (control group). Methods: The basal cortisol and sAA of participants were measured on two consecutive days upon awakening, 30 minutes after awakening, at 1600h, and at 2100h. Further, we assessed memory functions by administration of the Wide Range Assessment of Memory and Learning (WRAML2) instrument. Behavior and emotion were evaluated by using the Strengths and Difficulties Questionnaire (SDQ). One week later, these children were exposed to a standardized laboratory stressor named Trier Social Stress Test for Children (TSST-C). Cortisol and alpha-amylase (sAA) were measured at four different time points: baseline, 1 min, 10 min and 25 min after the stressor. Results: Preterm children had more memory impairments, emotional problems and an exaggerated cortisol response to TSST-C compared to full-term children. The cortisol increase in response to TSST-C was more pronounced in preterm girls. However, no differences were observed in the sAA response to TSST-C. Conclusions: Our findings indicate the long-term effects of preterm birth and related factors on the HHA axis, internalizing behavior and memory, thereby creating a more vulnerable phenotype.

A HSP27 é um membro da família das proteínas de choque térmico que protege as células contra diversos tipo de estresse, sendo expressa principalmente em astrócitos depois da isquemia. Neste trabalho, nós estudamos o papel da HSP27 na tolerância à isquemia cerebral, usando um modelo in vivo e culturas organotípicas. Foram estudados diferentes tempos de reperfusão in vivo (1, 4, 7, 14, 21, 30 dias) usando 2 min, 10 min ou 2+10 min de isquemia global transitória pela oclusão dos 4 vasos (4VO). Foi observado um aumento no imunoconteúdo no DG depois de todos os tratamentos, com uma diminuição na porcentagem de HSP27 fosforilada. Em CA1, região vulnerável, observou-se um aumento no imunoconteúdo depois de 10 ou 2+10 min de isquemia; em 10 min o aumento de fosforilação foi paralelo ao imunoconteúdo, enquanto com 2+10min de isquemia, quando a região CA1 se tornou resistente, houve uma diminuição na porcentagem de HSP27 fosforilada. Os resultados sugerem que a HSP27 pode estar atuando como chaperona, protegendo outras proteínas da desnaturação nos astrócitos, os quais podem auxiliar os neurônios a sobreviverem por manter a homeostase do tecido. Em culturas organotípicas, foram usados 5 ou 10 min de privação de glicose e oxigênio (OGD) ou 1µM de NMDA para induzir tolerância ao tempo letal, 40 min, de privação de glicose e oxigênio (OGD). Nesse caso, foi observado um aumento no imunoconteúdo de HSP27 depois de todos os tratamentos, mas a porcentagem de HSP27 fosforilada se manteve constante ou aumentou quando o pré-condicionamento ocorreu. A HSP27 pode estar modulando os filamentos de actina ou bloqueando o processo apoptótico, facilitando a sobrevivência das células. Em conjunto, os resultados sugerem que o mecanismo que leva à morte de células pode ser diferente nos dois modelos, exigindo atuações distintas da proteína.

Os receptores canabinóides do tipo CB1 estão presentes em grandes quantidades no sistema nervoso central, especialmente no hipocampo, estrutura encefálica essencial para a formação de memórias e local onde o fenômeno eletrofisiológico da potenciação de longa duração (LTP) tem sido mais extensamente estudado. Neste trabalho, estudamos os efeitos da administração intrahipocampal de AM152, um antagonista seletivo para os receptores canabinóides CB1, ou da Anandamida, um agonista canabinóide endógeno, (a) sobre as etapas de aquisição, consolidação e evocação da memória, e (b) sobre a indução da LTP. Nossos resultados mostram que o antagonista CB1 prejudicou a consolidação, porém facilitou a evocação da memória; foi, também, capaz de inibir a indução da LTP. Já o endocanabinóide anandamida facilitou a consolidação da memória. As evidências sustentam um claro envolvimento do sistema CB1 endógeno na modulação dos processos plásticos subjacentes ao processamento do aprendizado e da memória. / CB1 cannabinoid receptors are abundantly present in the brain, with large concentration in the hippocampus, an essential structure for the memory processes and extensively studied in LTP experiments. Here, we have studied the effect of the dorsal hippocampus infusion of the selective CB1 receptor antagonist AM251, or the endogenous cannabinoid anandamide, (a) upon the memory acquisition, consolidation and retrieval of the step-down inhibitory avoidance task in rats, and (b) upon LTP induction. Our results show that AM251 has caused a memory consolidation deficit, but a retrieval facilitation; it has also blocked the LTP induction. The endocannabinoid anandamide, otherwise, has caused a facilitation of the consolidation. Our evidence support a clear role for the CB1 endogenous cannabinoid system in the modulation of plastic events underlying the learning and memory processes.

O receptor da capsaicina TRPV1 (transient receptor potential channel – vanilloid 1) é um canal de cátions não-seletivo que promove o influxo de cálcio em neurônios, quando ativado por estímulos nocivos. O caracol terrestre Megalobulimus abbreviatus apresenta comportamento aversivo, elevando seu complexo cabeça-pé quando colocado sobre substratos nocivos, e serve como um modelo simples e útil em experimentos de nocicepção. O objetivo deste estudo foi medir a resposta nociceptiva (latência aversiva) do M. abbreviatus após exposição à capsaicina tópica (soluções aquosas a 0,1% e 0,5%), e compará-la àquelas obtidas em um modelo prévio de estímulo térmico nocivo (50oC). Foi também testado se o vermelho de rutênio (doses de 3 mg/kg e 6 mg/kg, 5 min antes da exposição) e a capsazepina (doses de 1 mg/kg e 3 mg/kg, 5 min antes da exposição), respectivamente antagonistas inespecífico e específico do receptor vanilóide 1, poderiam modificar tanto as respostas evocadas pela capsaicina quanto aquelas obtidas com estímulo térmico aversivo.Finalmente, os animais foram injetados com salina, morfina (20 mg/kg), naloxone (5 mg/kg) ou morfina mais naloxone, 15 min antes da exposição à capsaicina 0.5%. As latências foram medidas quando o animal elevava seu complexo cabeça-pé a 1 cm do substrato. Os dados foram comparados por análise de variância de uma via (ANOVA) e teste post hoc de mínima diferença significativa (LSD), e por teste T de Student (p<0,05), em software SPSS 7.0. Resultados (média +/- EMP): a capsaicina tópica provocou comportamento de retirada intenso de forma dose-dependente (25.4 +/- 7 2.0 s, 15.3 +/- 1.9 s e 9.1 +/- 1.0 s para veículo, capsaicina a 0.1% e a 0.5%, respectivamente). A capsazepina inibiu significativamente a resposta à capsaicina (19.2 +/- 1.8 s para concentração de 1 mg/kg; 5.3 +/- 0.4 s para o veículo), e a resposta ao calor nocivo (28.1 +/- 1.8 s, 48.8 +/- 3.6 s, 20.4 +/- 1.2 s para concentrações de 1 mg/kg, 3 mg/kg e veículo, respectivamente). O vermelho de rutênio (6 mg/kg and 3 mg/kg, respectivamente) atenuou tanto as respostas de retirada à capsaicina (23.1 +/- 1.9 s) e ao calor (55.4 +/- 6.5 s) , quando comparadas ao veículo (16.8 +/- 2.6 s e 33.9 +/- 6.4 s, respectivamente). A morfina aumentou as latências induzidas pela capsaicina (26.5 +/- 3.4 s). O naloxone, tanto sozinho (8.1 +/- 1.1 s) quanto em combinação com a morfina (8.7 +/- 1.3 s), diminuiu marcadamente as latências provocadas pela capsaicina quando comparado à morfina apenas, ou à salina (18.2 +/- 2.6 s). Estes resultados indicam que o receptor TRPV1 desempenha um papel no comportamento aversivo do M. abbreviatus e evidencia um mecanismo regulado por opióides nas respostas induzidas pela capsaicina.