Matrizes extracelulares descelularizadas (dMEC) têm sido utilizadas com sucesso como biomateriais biológicos para regeneração tecidual, já que apresentam vantagens como semelhança estrutural com os tecidos naturais, biocompatibilidade , biodegradabilidade, capacidade de sinalização e homeostase tecidual. O primeiro objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia de quatro protocolos para descelularização de músculo esquelético murino, objetivando a produção de matrizes extracelulares (MEC) acelulares para potenciais aplicações na engenharia de tecidos. Músculos tibiais foram coletados e congelados a -20°C ou armazenados a temperatura ambiente, seguido por descelularização em soluções contendo reagentes químicos EDTA + Tris, SDS e Triton X-100, os quais foram aplicados em diferentes sequências e analisados de acordo com modificações macroscópicas causadas nos tecidos, remoção de conteúdo celular e genético das matrizes e na capacidade de preservar a composição protéica e estrutura tridimensional da MEC. Observou-se a otimização da remoção de conteúdo celular, além da preservação da ultraestrutura e composição da MEC nos protocolos com congelação prévia a -20°C e descelularização inicial com a solução SDS, quando comparado àqueles que iniciaram com EDTA + Tris. O segundo objetivo deste trabalho foi comparar a biocompatibilidade da dMEC de músculo murino e placenta canina em modelo murino de injúria muscular. As dMEC foram produzidas a partir da placenta canina (1% SDS, 5 mM EDTA + 0,05% Tripsina, 1% Triton X-100) e do músculo esquelético tibial de ratos Wistar (Congelação a -20°C, 1% SDS, 5 mM EDTA + 50mM Tris, 1% Triton X-100). A lesão muscular foi realizada a partir de uma incisão de 1cm e divulsão na região média do músculo tibial; então, as dMEC foram implantadas. Um grupo cirúrgico, sem o implante, foi usado como um controle. Os animais foram eutanasiados depois de 3, 15 e 45 dias. Análise histológica e imunohistoquímica foram realizadas para avaliar a morfologia tecidual e a presença de infiltrado inflamatório e células em proliferação (CD163 e PCNA). No 3° dia após a implantação, uma intensa reação inflamatória (CD163+) e proliferação celular (PCNA+) foram observadas, adjacentes ao biomaterial, em ambas as matrizes. No 15° dia, o biomaterial de MEC placentária ainda preservou o infiltrado celular (CD163+ e PCNA+) e iniciou o processo de absorção do biomaterial, enquanto que a dMEC do músculo já estava completamente absorvida. Finalmente, depois dos 45 dias, ambos os biomateriais foram absorvidos e o músculo estava completamente cicatrizado, sem fibrose. Conclui-se que congelar as amostras a -20°C anteriormente ao processamento e submeter à incubação inicial em solução de 1% SDS (Protocolo 2B) favoreceu a descelularização de músculo esquelético murino. Além disso, dMEC xenogênicas e alogênicas foram reabsorvidas e apresentaram processos de integração distintos em modelo não-crítico de lesão muscular esquelética, sugerindo que eventuais alterações sistêmicas, observadas a longo prazo, sejam avaliadas, bem como, a validação da utilização destas matrizes em modelos de perda muscular volumétrica. / Decelularized extracellular matrices (dECM) have been successfully used as biological biomaterials for tissue engineering, since they present advantages such as structural similarity with natural tissues, biocompatibility, biodegradability, signaling capacity and tissue homeostasis. The first aim of this study was to evaluate the efficacy of four protocols for the decellularization of murine skeletal muscle for the production of acellular extracellular matrices (ECM) for potential applications in tissue engineering. Tibial muscle was frozen at -20°C or stored at room temperature, followed by decellularization in solutions containing EDTA + Tris, SDS and Triton X- 100 chemical reagents, which were applied in different sequences and analyzed according to macroscopic modifications , removal of cellular and genetic content and the ability to preserve the ECM composition and three-dimensional structure. Thus, the optimization of cellular removal was observed, as well as the preservation of the ECM ultrastructure and composition in the protocols with freezing at -20°C and initial decellularization with the SDS solution, when compared to those starting with EDTA + Tris. The second aim of this study was to compare the biocompatibility of the dECM of murine muscle and canine placenta in murine model of muscle injury. Decellularized ECM were produced from the canine placenta (1% SDS, 5 mM EDTA + 0.05% Trypsin, 1% Triton X-100) and the tibial muscle of Wistar rats (freezing at - 20°C, 1% SDS , 5 mM EDTA + 50 mM Tris, 1% Triton X-100). The muscle injury was performed followed a 1 cm incision and divulsion in the middle region of the tibial muscle, where the dECM were implanted. A surgical group, without the implant, was used as a control. The animals were euthanized after 3, 15 and 45 days. Histological and immunohistochemistry analyses were performed to evaluate the tissue morphology and the presence of inflammatory infiltrate and cells in proliferation (CD163 and PCNA). On the 3rd day after implantation, an intense inflammatory reaction (CD163+) and cell proliferation (PCNA+) were observed, adjacent to the biomaterial, in both matrices. On 15th day, the placenta biomaterial still preserved the cellular infiltrate (CD163+ and PCNA+) and started the biomaterial absorption process, while the muscle biomaterial was already fully absorbed. Finally, after 45th day, both biomaterials were absorbed and the muscle was completely healed, without fibrosis. It was concluded that freezing samples at -20°C prior to processing and subjecting to the initial incubation in 1% SDS solution (Protocol 2B) favored the decellularization of murine skeletal muscle. In addition, xenogeneic and allogeneic dECM were resorbed and presented a distinct integration process in a non-critical model of skeletal muscle, suggesting that potential systemic changes, observed in the long term evaluation, as well as the validation of the use of these matrices in volumetric muscle loss models must be tested.

Contexto: Alguns agentes farmacológicos em estudos de modelos animais demonstraram proteção nas lesões de isquemia e reperfusão do miocárdio. Entre eles, a bradicinina desempenha papel cardioprotetor durante a reperfusão do miocárdio. Os efeitos desta substância no músculo esquelético isquêmico não são conhecidos. Objetivo: Demonstrar os efeitos da bradicinina administrada após 2 horas de isquemia total seguidas de 4 horas de reperfusão em músculo esquelético de ratos com base nos efeitos sobre enzimas musculares (aspartato aminotransferase - AST, lactato desidrogenase - LDH, e creatinino fosfoquinase - CPK), membrana celular, recrutamento de leucócitos e apoptose. Materiais e Métodos: Foram estudados 18 ratos da linhagem Wistar distribuídos em 3 grupos com 06 animais e submetidos a 2 horas de isquemia total pelo método do torniquete do membro pélvico e 4 horas de reperfusão. Durante o período de reperfusão o grupo Controle recebeu solução salina, o grupo Bradicinina recebeu solução de bradicinina na dose de 1mg/Kg e o grupo HOE recebeu solução de icatibant (HOE 140), um antagonista do receptor B2, na dose de 125g/kg. Coletou-se 1,5ml de sangue da veia cava inferior antes do início da isquemia, ao final do período de isquemia e após a reperfusão para dosagem das enzimas AST, LDH e CPK. Colheuse também, após a reperfusão, biópsia do músculo gastrocnêmio (membro pélvico esquerdo) para dosagem tissular de malondialdeído (MDA), mieloperoxidase (MPO) e para avaliação imunohistoquímica da apoptose (TUNEL). Resultados: Houve aumento significativo da AST após a reperfusão apenas no grupo Bradicinina. O valor da LDH no grupo Bradicinina foi maior em relação aos demais antes da isquemia, após a isquemia e após a reperfusão. Observou-se que nos três grupos ocorreu diminuição significativa de LDH após a reperfusão. Ocorreu aumento significativo dos valores da CPK após a reperfusão nos três grupos. Não houve diferença dos valores de CPK entre os grupos antes da isquemia. Os valores de CPK no grupo Bradicinina foram maiores quando comparados aos grupos Controle e HOE após a isquemia e após a reperfusão. O MDA elevou-se significativamente após a reperfusão no grupo Bradicinina em relação aos grupos Controle e HOE. Após a reperfusão, a MPO, elevou-se significativamente no grupo Bradicinina em relação ao grupo Controle. O número de nucleos apoptóticos foi semelhante entre os grupos. Conclusão: A bradicinina (1mg/Kg) aplicada continuamente, intra-arterial, durante 4 horas de reperfusão agrava a lesão de isquemia e reperfusão em musculatura esquelética de ratos submetidos a 2 horas de isquemia total, com base na elevação de enzima muscular (CPK), no aumento de indicador de lesão de membrana celular (MDA) e no maior recrutamento neutrofílico (MPO). / Background: Some studies of pharmacological agents in animal models have demonstrated protection in ischemia and reperfusion of the myocardium. Among them, bradykinin plays a cardioprotective effect during myocardial reperfusion. The effects of Bradykinin on ischemic skeletal muscle are unknown. Objective: To demonstrate the effects of bradykinin administered after 2 hours of total ischemia followed by 4 hours of reperfusion on rat skeletal muscle based on the effects on the muscle enzymes (aspartate aminotransferase - AST, lactate dehydrogenase - LDH and creatinine phosphokinase - CPK), on the cell membrane, on the recruitment of leukocytes and on apoptosis. Materials and Methods: Eighteen Wistar rats were studied and distributed to three groups of 06 animals each and submitted to 2 hours of total ischemia by the tourniquet method of hind limb and to 4 hours of reperfusion. During the reperfusion period the Control group received saline solution, the Bradykinin group received bradykinin solution at the dose of 1mg/Kg and the HOE group received icatibant (HOE 140) solution, a B2 receptor antagonist, at the dose of 125 g/Kg. A blood volume of 1,5 ml was collected from the inferior vena cava before the onset of ischemia, at the end of the period of ischemia and after reperfusion for the measurement of AST, LDH and CPK. A gastrocnemius muscle biopsy (left pelvic limb) was collected at the end of the reperfusion period for the determination of tissue malondialdehyde (MDA), myeloperoxidase (MPO) and immunohistochemical evaluation of apoptosis (TUNEL). Results: There was a significant increase in AST after reperfusion only in Bradykinin group. LDH was higher in the Bradykinin group compared to the others before ischemia, after ischemia and after reperfusion. All three groups showed a significant decrease in LDH after reperfusion. There was a significant increase in CPK values after reperfusion in all three groups. There was no difference in CPK values between groups before ischemia. CPK values were higher in the Bradykinin group when compared to the Control and HOE groups after ischemia and after reperfusion. MDA increased significantly after reperfusion in the Bradykinin group compared to the Control and HOE groups. After reperfusion, MPO increased significantly in the Bradykinin group compared to the control group. The number of apoptotic nuclei was similar in all groups. Conclusion: Bradykinin (1mg/Kg) continuously applied intra-arterially for 4 hours of reperfusion aggravates ischemia and reperfusion in skeletal muscle of rats submitted to 2 hours of total ischemia, based on the elevation of muscle enzyme (CPK), on the increase in the indicator of cell membrane damage (MDA) and on the greater neutrophil recruitment (MPO).

Orientador: Maeli Dal Pai Silva / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T01:17:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pacagnelli_FrancisLopes_D.pdf: 1401463 bytes, checksum: 3ec8f4739f24048aabeda5c455e32e8f (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Introdução: A sobrecarga pressórica imposta pela estenose da valva aórtica (EAo) progride para disfunção ventricular e Insuficiência Cardíaca (IC). Na IC ocorre Remodelação Cardíaca (RC) e mudanças dos tipos de fibras do músculo esquelético. Os mecanismos moleculares que são responsáveis pelas alterações das fibras musculares na IC ainda não foram descritos. Os fatores de regulação miogênica (MRF), uma família de fatores transcricionais que controlam vários genes músculoespecíficos, podem estar relacionados com essa miopatia. Entre os MRFs, a MyoD está relacionada com aumento do TNF-? e diminuição do IGF-I e a miogenina com o metabolismo oxidativo. Estudos têm enfatizado os efeitos do Treinamento Físico (TF) sobre a RC e músculo esquelético na IC. A hipótese deste estudo é que a IC pode alterar os MRFs e que a aplicação do TF antes de se instalar a IC promoverá melhora na RC e reverterão às alterações fenotípicas do músculo esquelético, os MRFs e seus possíveis mecanismos de controle. Objetivos: Avaliar os efeitos do TF durante a transição entre disfunção ventricular e IC induzida por EAo pela avaliação da RC e do músculo estriado esquelético. Métodos: Após 18 semanas de EAo, quando os animais apresentaram disfunção ventricular estes foram submetidos a um TF durante 10 semanas em uma esteira. A IC foi avaliada por parâmetros clínicos e a RC por dados morfológicos e ecocardiograma. Foram avaliados no músculo soleus os tipos de fibras, as miosinas de cadeia pesada (MHC), a atividade da Citrato Sintase (CS), a expressão gênica e protéica do IGF-I, MyoD e miogenina e os níveis séricos de TNF- ?. Resultados: O grupo EAo28 apresentou sinais de IC (taquipnéia, ascite, trombo em átrio esquerdo, derrame pleural) e o grupo EAoTF apresentou diminuição da intensidade destes. A RC foi amenizada com o TF e ocorreu aumento da porcentagem de encurtamento do endocárdio (EAo28=40,90 ± 16,18% vs. EAoTF=52,27 ± 11,60%) e velocidade de encurtamento da parede posterior (EAo28=24,31 ± 6,05mm/s vs. EAoTF=30,96 ± 3,94mm/s). Os diâmetros sistólicos e diastólicos (EAo28=5,70 ± 1,95mm vs. EAoTF=4,03 ± 1,37mm; EAo28=9,33 ± 1,30mm vs. EAoTF=8,27 ± 1,03mm, respectivamente), as relações diâmetro do átrio esquerdo/diâmetro da aorta (EAo28=2,18±0,28mm vs. EAoTF=1,88±0,26mm) e ondas E/A mitral (EAo28=5,20 ± 3,02 vs. EAoTF=2,86 ± 2,84) diminuíram. O TF alterou o fenótipo muscular com aumento das fibras do tipo I (EAo28=8,47 ± 6,02% vs. EAoTF=13,0 ± 6,11%) e diminuição das fibras do tipo IIa no EAoTR em relação ao EAo28 (EAo28=22,08 ± 10,28% vs. EAoTF=13,95 ± 2,94%). Não houve alterações nos níveis de TNF- ?, na atividade da CS, na expressão gênica e protéica do IGF-I, MyoD e miogenina na IC e após o TF. Conclusão: O TF melhorou a RC, diminuiu os sinais clínicos da IC e reverteu às alterações fenotípicas do músculo soleus, sem alterar os MRFs, TNF-? e metabolismo oxidativo durante a transição entre disfunção ventricular e IC em ratos com estenose aórtica. Os MRFs parecem não estar relacionados à modulação do fenótipo muscular e a sua reversão pelo TF na EAo. / Abstract: Background: Pressure overload imposed by aortic valve stenosis (AS) progresses to ventricular dysfunction and heart failure (HF). In HF occurs Cardiac Remodeling (CR) and changes in fiber types of skeletal muscle. The molecular mechanisms that are responsible for changes in muscle fibers in HF has not been described. The myogenic regulatory factors (MRF), a family of transcriptional factors that control several musclespecific genes, may be associated with this myopathy. Among the MRFs, MyoD is related to increase of TNF-? and decrease of IGF-I and myogenin with oxidative metabolism. Studies have emphasized the effects of physical training (PT) on the CR and skeletal muscle in HF. Our hypothesis is that the HF can change the MRFs and the application of the PT before installing the HF will promote improvement in CR and revert the phenotypic changes of skeletal muscle, the MRFs and their possible control mechanisms. Objectives: Evaluate the effects of PT during the transition between ventricular dysfunction and HF induced by AS through assessment of CR and skeletal muscle. Methods: After 18 weeks of AS, when the animals presented ventricular dysfunction, they were submitted to a PT on a treadmill during 10 weeks. HF was evaluated by clinical parameters and, the CR, by morphological data and echocardiogram. We evaluated fiber types in soleus muscle, the myosin heavy chain (MHC), the activity of citrate synthase (CS), the gene and protein expression of IGF-I, MyoD and myogenin and the serum levels of TNF-?. Results: The AS28 group presented signs of HF (tachypnea, ascites, thrombus in left atrium, pleural effusion) and ASPT group presented reduced intensity of these. CR was reduced with the PT and it increased the percentage of shortening of the endocardium (AS28=40,90 ± 16,18% vs. ASPT=52,27 ± 11,60%) and shortening velocity of the posterior wall (AS28=24,31 ± 6,05 mm/s vs. ASPT=30,96 ± 3,94 mm/s). The systolic and diastolic diameters (AS28=5,70 ± 1,95 mm vs. ASPT=4,03 ± 1,37 mm; AS28=9,33 ± 1,30 mm vs. ASPT=8,27 ± 1,03 mm, respectively) relations of left atrium diameter/aortic diameter (AS28=2,18 ± 0,28 mm vs. ASPT= 1,88 ± 0,26 mm) and E/A wave mitral (AS28=5,20 ± 3,02 vs. ASPT=2,86 ± 2,84) decreased. The PT changed the muscle phenotype increasing fiber type I (AS28= 8,47 ± 6,02% vs. ASPT=13,0 ± 6,11%) and decreasing fibers type IIa in ASPT in relation to AS28 (AS28=22,08 ± 10,28% vs. ASPT=13,95 ± 2,94%). There were no changes in levels of TNF-? in CS activity, gene expression and protein of IGF-I, MyoD and myogenin in HF and after PT. Conclusion: PT improved CR, decreased clinical signs of HF and reversed the phenotypic changes of the soleus muscle without altering the MRFs, TNF-? and oxidative metabolism during the transition between ventricular dysfunction and HF in rats with aortic stenosis. The MRFs seems not to be related to the modulation of muscle phenotype and its reversal by PT in the AS. / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T13:44:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_MichelVazde_M.pdf: 1365391 bytes, checksum: a8c1dd22f85ed3c7df93982f678f95f7 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Os mioblastos que formam o músculo esquelético são derivados de regiões do miótomo dos somitos. No processo de miogênese ocorre transição de estado proliferativo para um estado de diferenciação que se caracteriza por interrupção do ciclo celular, expressão de genes músculo-específico, reconhecimento célula-célula e formação de miotubos multinucleados. Para o estudo de diferenciação miogênica in vitro a linhagem celular C2C12 é um modelo bem estabelecido. Quando os mitógenos são retirados do meio de cultura (privação de soro fetal bovino), fatores de transcrição específicos são ativados, levando à diferenciação em miotubos. Na progressão do estado proliferativo para o de diferenciação participam diversas proteínas sinalizadoras. Em estudos anteriores demonstramos que a modulação da atividade da FAK tem papel crítico no processo de miogênese de células C2C12. Níveis relativamente elevados de atividade da FAK determinam a manutenção do estado proliferativo (indiferenciado) através de ativação de ciclinas. Também demonstramos que redução transitória da atividade da FAK é essencial para que as mioblastos C2C12 iniciem o processo de diferenciação terminal em miotubos. No presente estudo foi avaliada a hipótese de que a ação da tirosino-fosfatase SHP-2 determina a redução transitória da quinase de adesão focal (FAK) na transição do estado proliferativo para o estado de diferenciação no modelo de miogênese em células C2C12. A privação do soro fetal bovino induziu uma redução transiente (cerca de 80 % por ~2 horas) da fosforilação da FAK no resíduo de Tyr-397, detectada através de anticorpo fosfoespecífico anti-FAK-pY397. Não foi observada mudança na expressão da proteína FAK durante o período experimental. Experimentos de co-imunoprecipitação foram realizados para avaliar se a redução do nível de fosforilação da FAK é acompanhada de sua associação com SHP-2. Observou-se aumento de cerca de 2 vezes na associação entre FAK e SHP-2 no período coincidente com os nível baixos de fosforilação da FAK. Para avaliar o efeito da SHP-2 na redução transitória da pFAK padronizou-se o silenciamento de SHP-2 em células C2C12 nos estados de proliferação e diferenciação. Após a transfecção com siRNASHP2 nas células C2C12 foi feita a extração total de proteínas em diferentes tempos para avaliar o nível de expressão da SHP-2 no estado de proliferação. Foi observada menor expressão desta proteína após 12 horas ao período de transfecção. Depois da transfecção em meio de cultivo com o silenciamento de SHP-2 padronizados em 12 horas as células foram induzidas a se diferenciarem através da privação de soro fetal bovino. A depleção de SHP-2 aboliu a redução transiente da fosforilação da FAK. Observou-se que a depleção de SHP-2 também impediu a diferenciação terminal dos mioblastos privados de soro fetal bovino em miotubos. Esses dados sugerem que a SHP-2 modula o nível de fosforilação da FAK exercendo papel inibitório na ativação da FAK na transição das células C2C12 no estado de proliferação para diferenciação, influenciando a entrada destas células na diferenciação / Abstract: The myoblasts that form the skeletal muscle are derived from regions of the myotome of somites. In the process of myogenesis occurs transition of proliferative status to a state of differentiation which is characterised by disruption of the cell cycle, expression of muscle-specific genes, cell-cell recognition and training of myotubes multinucleate. For the study of the in vitro differentiation myogenic cell line C2C12 is a model well established. Where mitogens are moved from the culture medium (deprivation of fetal bovine serum), specific transcription factors are activated, leading to the differentiation in myotubes. The progression to the proliferative status of differentiation are involves several signaling proteins. In previous studies we showed that the modulation of the activity of FAK plays a critical role in the process of myogenesis of C2C12 cells. Relatively high levels of activity of FAK determine the maintenance of the state proliferative (indistinct) through activation of cyclin. It also demonstrated that transient reduction of the activity of FAK is essential for the myoblasts C2C12 begin the process of terminal differentiation in myotubes. In the present study was evaluated the hypothesis that the action of tirosino-phosphatase SHP-2 determines the reduction of transient focal membership of kinase (FAK) in the transition of proliferative state to the state of differentiation in the model of miogênese in C2C12 cells. The deprivation of fetal bovine serum produces a transient reduction (about 80% by ~ 2 hours) of the phosphorylation of FAK in the residue of Tyr-397, detected by antibody phsphoespecific anti-FAK-pY397. No change was observed in the expression of FAK protein during the trial period. Coimmunoprecitation experiments were performed to evaluate whether the reduction in the level of phosphorylation of FAK is accompanied by its association with SHP-2. There was an increase of about 2 times in the association between FAK and SHP-2 in the period coinciding with the low level of phosphorylation of FAK. To evaluate the effect of SHP-2 on the reduction of transient pFAK standardized up the silencing of SHP-2 in C2C12 cells in the states of proliferation and differentiation. It was observed lower expression of this protein after 12 hours the period of transfection. After Transfection in the midst of cultivation with the silencing of SHP-2 standard in 12 hours the cells were induced to differentiate by deprivation of fetal bovine serum. The depletion of SHP-2 abolished the reduction of transient phosphorylation of FAK. It was observed that the depletion of SHP-2 also prevented the terminal differentiation of myoblasts deprived of fetal bovine serum in myotubes. These data suggest that SHP-2 modulates the level of phosphorylation of FAK acting inhibitory role in the activation of FAK in the transition of C2C12 cells in the state of proliferation to differentiation, influencing the entry of these cells in the differentiation / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

As proteínas de choque térmico exercem um papel regulatório chave na defesa celular. Com o intuito de investigar o papel da proteína de choque térmico 70 kDa induzível (HSP70) na atrofia muscular e subsequente recuperação, os músculos extensor longo dos dedos e sóleo de camundongos transgênicos hiperexpressantes de HSP70 foram imobilizados durante 7 dias e subsequentemente liberados da imobilização e avaliados após 7 dias. Houve redução da área de secção transversal (AST) das fibras musculares após imobilização nos animais selvagens e HSP70 porém, apenas os animais HSP70 recuperaram a AST. O número de células satélites bem com a contração tetânica máxima permaneceram inalterados somente nos animais HSP70. O aumento da expressão dos genes atrogin-1 e MuRF-1 induzido pela imobilização foi atenuado nos animais HSP70. Nosso trabalho sugere que a HSP70 é importante para a melhor recuperação estrutural e funcional do músculo após imobilização, e este resultado pode estar relacionado à preservação da quantidade de células satélites e regulação de atrogenes. / Heat shock proteins play a key regulatory role in cellular defense. In order to investigate the role of the inducible 70-kDa heat shock protein (HSP70) in skeletal muscle atrophy and subsequent recovery, extensor digitorum longus and soleus muscles from overexpressing HSP70 transgenic mice were immobilized during 7 days and subsequently released from immobilization and evaluated after 7 days. There was a decrease in myofiber cross-sectional area after immobilization in both wild type and HSP70 mice, but only myofibers from HSP70 mice recovered their size. The number of satellite cells and the muscle tetanic contraction were unchanged only in the muscles from HSP70 mice. In addition, the increase of atrogin-1 and MuRF-1 gene expression was attenuated in HSP70 mice. Therefore, our study suggests that the HSP70 is important for structural and functional recovery of muscles after immobilization and this effect might be associated with preservation of satellite cell amount and regulation of atrogenes.

Músculos esqueléticos de ratos idosos apresentam uma reduzida capacidade de se regenerar após lesão. No presente estudo, nós lançamos a hipótese de que a estimulação farmacológica de adrenoceptores b2 em músculos de ratos idosos lesados poderia melhorar a regeneração destes. Ratos jovens e idosos foram tratados com injeção subcutânea do agonista b2-adrenérgico formoterol (2 mg/kg/dia) durante 10 e 21 dias após lesão do músculo sóleo. Os músculos de ratos idosos lesados e tratados com formoterol por 10 e 21 dias apresentaram menor processo inflamatório e fibras musculares em regeneração com maior calibre quando comparados aos músculos apenas lesados. O tratamento com formoterol preveniu a queda da força tetânica e aumentou a síntese de proteínas e a fosforilação de mTOR em músculos de ratos idosos lesados e avaliados após 10 dias. Nossos resultados sugerem que o formoterol melhora a capacidade regenerativa estrutural e funcional dos músculos esqueléticos de ratos idosos, e que esse efeito é mediado pelo aumento da síntese protéica através da ativação de mTOR. / Skeletal muscles from old rats fail to completely regenerate following injury. In the present work, we hypothesized that pharmacological stimulation of b2-adrenoceptors in aged muscles following injury could improve their regenerative capacity. Young and aged rats were treated with a subcutaneous injection of b2-adrenergic agonist formoterol (2 mg/kg/day) up to 10 and 21 days after soleus muscle injury. Formoterol-treated muscles from old rats evaluated at 10 and 21 days post-injury showed reduced inflammation and regenerating myofibers of greater caliber when compared to their injured controls. Formoterol minimized the decrease in tetanic force and increased protein synthesis and mTOR phosphorylation in old muscles at 10 days post-injury. Our results suggest that formoterol improves structural and functional regenerative capacity of regenerating skeletal muscles from aged rats by increasing protein synthesis via mTOR activation.

A suplementação com leucina pode ser uma forma de terapia importante para a regeneração do tecido muscular lesado, pois modula vias intracelulares reguladoras da massa muscular. Neste estudo, ratos Wistar tiveram os músculos soleus e TA da pata esquerda submetidos à criolesão. Os animais foram divididos em controle e suplementados com leucina (1,35 g/kg por dia), a qual teve início três dias antes da criolesão e prosseguiu por um, três, 10 e 21 dias. A leucina aumentou a AST das fibras no soleus e reduziu o processo inflamatório e a fibrose em ambos, além de reduzir a ativação de elementos da via TGF-β/Smad. A leucina também aumentou o número de células satélites em proliferação no soleus e acelerou a conversão das isoformas de MyHC em ambos, tendo aumentado a taxa de síntese proteica no TA. Entretanto, não houve elevação na expressão de elementos da via PI3K/Akt/mTOR. Observou-se redução da ativação de FoXO3a e do acúmulo de proteínas ubiquitinadas no soleus, além de maior atividade do proteassomo 26S. A leucina também atenuou o prejuízo funcional em ambos. / Leucine supplementation can be an important therapy for the regeneration of injured skeletal muscle tissue, for modulating intracellular pathways regulating muscle mass. In this study, rats had their soleus and TA muscles of the left hind limb damaged. The animals were divided into control and supplemented with leucine groups (1.35 g / kg per day), which started three days before damage and continued for 1, 3, 10 and 21 days. Leucine increased myofiber CSA in soleus and reduced inflammation and fibrosis on both, and reduced the activation of TGF-β/Smad signaling pathways. Leucine also increased the number of proliferating satellite cells in the soleus, accelerated the conversion between MyHC isoforms, and in rate of protein synthesis in the TA. However, no elevation on PI3K/Akt/mTOR signalling pathway was observed. There was a reduction on FoXO3a activation and ubiquitinated proteins accumulation in the soleus and an increase in the 26S proteasome activity. Leucine also attenuated the functional impairment on both muscles.

Submitted by Rosangela Silva (rosangela.silva3@unioeste.br) on 2018-05-23T14:17:21Z No. of bitstreams: 2 Ana Luiza Peretti.pdf: 1017733 bytes, checksum: 2601a64ef7067e3a163ffd4705983cac (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-23T14:17:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Ana Luiza Peretti.pdf: 1017733 bytes, checksum: 2601a64ef7067e3a163ffd4705983cac (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-02-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / During menopause, there is a decrease in the production and secretion of the estrogen hormone, which may act on the pathophysiology of inflammatory and chronic-degenerative diseases, many of which can cause changes in muscle tissue. Seeking to prevent disturbances in these tissues, the use of mechanical vibrations has been increasing, aiming to promote the gain of muscle strength. In this way, the objective was to analyze and compare the effects of the wholy body vibration treatment at different periods in the muscle tissue of oophorectomized Wistar rats, a model that simulates hormonal deprivation. For this, 72 animals were randomized into the Pseudoophorectomy (GP) and Oophorectomy (GO) groups. After 60 postoperative days, the animals were submitted to therapeutic interventions and divided into eight subgroups: animals that did not undergo any treatment and euthanized after four (GP4 and GO4) and eight (GP8 and GO8) weeks and animals treated during the same periods (GPT4, GOT4, GPT8 and GOT8). The treatment consisted of the use of vibratory platform, using 60Hz frequency and duration of 10 minutes, three times a week for four or eight weeks. At the end of the treatments, the animals were euthanized and the soleus muscles were collected and processed. The data were analyzed for normality and analysis of the three-way variance, adopting a significance level of 5%. In the morphological analysis, the oophorectomized groups, especially GO8, presented muscular hypotrophy and the groups that performed the treatment demonstrated larger fibers than those that did not, as well as GOT4 and GOT8 resembled the animals of the pseudo-oophorectomy groups. Regarding the cross-sectional area, GPT4 had values higher than GP4 and GPT8 whereas GO8 was lower than GO4, GP8 and GOT8; for larger and smaller diameters of muscle fibers, animals that did not undergo oophorectomy had higher values than those who underwent the procedure, as well as those who performed the treatment in relation to those who did not. For the number of nuclei/fiber, GP4 and GO4 had higher mean values in relation to GPT4 and GOT4 and, when compared to time, the number was higher in four weeks than in eight. There was no statistical difference between the number of capillary/fiber and the percentage of connective tissue. In relation to oxidative stress, there was an increase in lipoperoxidation in the GO8 and GOT8 groups, with the treatment not being effective in reversing this damage; for the other SOD, CAT and ChE variables there was no significant difference. For groups of only four weeks, GO4 presented a neuromuscular junction area smaller than GP4, but GOT4 matched GPT4. For the larger diameter of the junctions, GO4 also presented different ones than the others, however, the GOT4 animals were larger than GPT4. There was predominance of oxidative fibers in the soleus muscle. To sum up, this work can be attributed to the hormonal deprivation muscular hypotrophy in the oophorectomized groups, mainly in GO8, and the reversion of this process and muscular hypertrophy in the groups that performed the treatment with whole body vibration. / Durante a menopausa, há um decréscimo na produção e secreção do hormônio estrogênio, que pode atuar na fisiopatologia de doenças inflamatórias e crônico-degenerativas, muitas das quais podem provocar alterações no tecido muscular. Buscando prevenir perturbações nesses tecidos, o uso de vibrações mecânicas vem crescendo, visando promover o ganho de força muscular. Dessa forma, este trabalho objetivou analisar e comparar os efeitos do tratamento com plataforma vibratória, em diferentes períodos, no tecido muscular de ratas Wistar ooforectomizadas, modelo que simula a privação hormonal. Para tal, 72 animais foram randomizados nos grupos Pseudooforectomia (GP) e Ooforectomia (GO). Decorridos 60 dias do pós-operatório, os animais foram submetidos a intervenções terapêuticas e divididos em oito subgrupos: animais que não realizaram nenhum tratamento e eutanasiados, após quatro (GP4 e GO4) e oito (GP8 e GO8) semanas, e animais tratados durante os mesmos períodos (GPT4, GOT4, GPT8 e GOT8) semanas. O tratamento consistiu no uso de plataforma vibratória, utilizando frequência de 60Hz e duração de 10 minutos, três vezes por semana, durante quatro ou oito semanas. Acabados os tratamentos, os animais foram eutanasiados e os músculos sóleos coletados e processados. Os dados foram analisados quanto à normalidade e análise da variância de três vias, adotando-se nível de significância de 5%. Na análise morfológica, os grupos ooforectomizados, especialmente GO8, apresentaram hipotrofia muscular; já os grupos que realizaram o tratamento, revelaram fibras maiores que os que não o realizaram, bem como GOT4 e GOT8 assemelharam-se aos animais dos grupos pseudo-ooforectomia. Em relação à área de secção transversa, GPT4 teve valores maiores que GP4 e GPT8, enquanto que GO8 foi menor que GO4, GP8 e GOT8; para maior e menor diâmetros das fibras musculares, os animais que não passaram pela ooforectomia possuíram valores maiores que os que foram submetidos ao procedimento, bem como os que realizaram o tratamento em relação aos que não o realizaram. Para a relação núcleos/fibra, GP4 e GO4 possuíram médias maiores em relação à GPT4 e GOT4 e, ao comparar-se o tempo, a relação é maior, em quatro semanas do que em oito. Não houve diferença estatística entre a relação capilares/fibra e porcentagem de tecido conjuntivo. Em relação ao estresse oxidativo, houve aumento da lipoperioxidação nos grupos GO8 e GOT8, com o tratamento não sendo eficaz na reversão desse dano; para as demais variáveis SOD, CAT e ChE não houve diferença significativa. Para avaliação, apenas dos grupos de quatro semanas, GO4 apresentou área das junções neuromusculares, menor que GP4, porém, o GOT4 igualou-se ao GPT4. Para o maior diâmetro das junções, GO4 também se apresentou diferente dos demais, porém, os animais do GOT4 foram maiores que GPT4. Houve predominância de fibras oxidativas no músculo sóleo. Com este trabalho, pode-se atribuir à privação hormonal a hipotrofia muscular nos grupos ooforectomizados, principalmente, em GO8, e a reversão desse processo e hipertrofia muscular nos grupos que realizaram o tratamento com plataforma vibratória.

A insuficiência cardíaca (IC) é uma síndrome complexa que envolve múltiplos sistemas e mecanismos compensatórios neuro-hormonais, acompanhada de altos índices de morbidade e mortalidade, e caracterizada por sintomas clínicos como fadiga, dispneia, e intolerância aos esforços físicos. Embora a IC seja uma síndrome de origem cardíaca, observam-se alterações em outros tecidos, como na musculatura esquelética. As modificações do fenótipo muscular e a perda de massa muscular esquelética observadas na IC contribuem para o mau prognóstico e para o aumento da mortalidade dos pacientes. Considerando que os receptores 2-adrenérgicos medeiam a atividade do sistema nervoso simpático na musculatura esquelética, e que a hiperatividade simpática é um dos principais componentes envolvidos no desenvolvimento da miopatia esquelética observada IC, sugere-se que estes receptores estejam associados às alterações morfofuncionais da musculatura esquelética na síndrome. Na presente Dissertação, avaliamos a contribuição dos receptores 2-adrenérgicos nas alterações metabólicas e morfofuncionais da musculatura esquelética e na intolerância aos esforços físicos decorrentes da IC. Para isso, utilizamos camundongos da linhagem FVB controles e com inativação gênica dos receptores 2-adrenérgicos (2KO) que foram submetidos à cirurgia de infarto ou à cirurgia fictícia (sham). O infarto induziu disfunção e remodelamento cardíacos nos animais controles, acompanhados de aumento nos níveis de noradrenalina e adrenalina circulantes, intolerância ao esforço físico, mudança na tipagem de fibras musculares e rarefação capilar nos músculos sóleo e plantar. Essas mesmas respostas foram observadas nos animais com inativação gênica dos receptores 2-adrenérgicos após o infarto do miocárdio, no entanto, os animais 2KO infartados apresentaram uma maior redução da tolerância ao esforço físico e um quadro mais grave de miopatia esquelética. Acompanhando essa atrofia muscular esquelética presente nos animais 2KO infartados, foi observado aumento da expressão de proteínas relacionadas ao sistema proteolítico ubiquitina-proteassoma, aumento da atividade do 26S-proteassoma e tendência a diminuição na expressão proteica de p-Akt (ser473), p-4E-BP1 (thr37/46) e p-FoxO3 (ser253). Os resultados sugerem que a ausência dos receptores 2-adrenérgicos agrava e/ou antecipa as alterações musculoesqueléticas observadas na insuficiência cardíaca, principalmente a atrofia muscular, e que a ativação do sistema proteolítico ubiquitina proteassoma e a inibição da síntese proteica por meio da via Akt/4E-BP1 parecem colaborar para estas respostas / Heart failure (HF) is a complex syndrome involving multiple systems and neurohumoral compensatory mechanisms accompanied by high morbidity and mortality, and it is characterized by clinical signs like fatigue, dyspnea, and increased exercise intolerance. Although HF is a syndrome of cardiac origin, it promotes changes in other tissues, such as skeletal muscle, where modifications of muscle phenotype and the loss of skeletal muscle mass observed in HF contribute to poor prognosis and increased mortality of patients. Taking into consideration that 2-adrenoceptors mediate the activity of sympathetic nervous system in skeletal muscle and that sympathetic hyperactivity is one of the main components involved in developing skeletal muscle abnormalities in HF, it has been suggested that 2-adrenoceptors would be associated with morphofunctional alterations due to chronic sympathetic hyperactivity in skeletal muscles in HF. In the present study, we evaluated the contribution of 2-adrenoceptors on metabolic and morphofunctional alterations in skeletal muscle and also on exercise intolerance-induced by HF. For this, we used FVB mice and mice lacking 2-adrenoceptors (2KO) that were submitted to myocardial infarction or sham surgery. Myocardial infarction induced cardiac dysfunction and remodeling in FVB mice, which was accompanied by significantly increased plasma levels of norepinephrine and epinephrine, exercise intolerance, changes in muscle fiber type and vascular rarefaction in both soleus and plantaris muscles. These same responses were observed in mice lacking 2-adrenoceptors submitted to myocardial infarction. However, infarcted 2KO mice presented a higher decrease of exercise tolerance and more severe skeletal myopathy. Accompanying the skeletal muscle atrophy of infarcted 2KO mice, it was observed a significantly increased protein expression of proteins related with the ubiquitin-proteasome system, an increased 26S-proteassome activity and a trend toward decreased protein expression of p-Akt (ser473), p-4E-BP1 (thr37/46) and p- FoxO3a (ser253). These results suggest that the lack of 2-adrenoceptors worsens and/or anticipates the skeletal muscle alterations observed in HF, mainly muscular atrophy, and the activation of ubiquitin-proteassome system and inhibition of protein synthesis by Akt/4E-BP1 pathway seem to play an important role in skeletal muscle myopathy

O processo adaptativo a hipóxia implica em modificações nas funções endócrinas e metabólicas. Embora seja bem estabelecido que o metabolismo de carboidratos é profundamente alterado pela hipóxia, muito pouco se sabe acerca dos efeitos in vivo do estresse hipóxico no metabolismo de proteínas na musculatura esquelética. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos agudos da hipóxia intermitente nos processos de síntese e degradação protéica em músculos esqueléticos de ratos e a possível participação dos glicocorticóides na resposta induzida pela hipóxia. Para isso, ratos jovens (~80g) foram expostos à hipóxia intermitente aguda (HIA) por 8 horas (6% O2 durante 40 segundos em intervalos de 9 minutos). Os resultados mostram que a HIA é uma situação catabólica que resulta no aumento da glicose e insulina plasmática, na redução do conteúdo do glicogênio hepático (97%), oxidação de glicose muscular (40%) e massa do tecido adiposo branco retroperitoneal e epididimal (30%), sem alterações na massa muscular. No metabolismo protéico, os animais hipóxicos apresentaram aumento da proteólise total em músculos soleus e EDL acompanhada por uma hiperativação dos sistemas proteolíticos dependente de ubiquitina (Ub)-proteassoma e dependente de cálcio, sem que houvesse alterações na síntese protéica. Essa resposta foi associada ao maior conteúdo de proteínas miofibrilares conjugadas à Ub e à ativação da expressão de genes relacionados à atrofia (atrogina-1 e MuRF1) e autofagia (LC3 e GABARAP ). Adicionalmente, em músculos soleus, observou-se redução da fosforilação da Akt (Ser473), uma proteína chave no controle do metabolismo protéico. Verificou-se ainda que a adrenalectomia em animais hipóxicos preveniu a ativação dos sistemas proteolíticos e a transcrição do RNAm dos \"atrogenes\" sem alterar a autofagia. Esses dados mostram que a HIA, durante 8 horas, age como um gatilho catabólico no processo de degradação de proteínas dependente de Ub-proteassoma e cálcio assim como na hiperexpressão de genes relacionados à atrofia e autofagia. A ativação do programa atrófico induzido pela HIA parece ser mediada pelos glicocorticóides sendo esta resposta provavelmente importante para o fornecimento de aminoácidos do músculo para o fígado e manutenção da hiperglicemia. Portanto, essa resposta catabólica se sustentada pode levar à perda de massa muscular esquelética em situações de exposição prolongada à hipóxia intermitente. / The adaptive process to hypoxia involves changes in endocrine and metabolic functions. Although it is well established that the carbohydrate metabolism is profoundly altered by hypoxia, the in vivo effects of hypoxic stress on protein metabolism in skeletal muscle is still poorly understood. Thus, the main goal of the present work was to investigate the acute effects of intermittent hypoxia on the processes of synthesis and protein degradation in rat skeletal muscles and the possible role of glucocorticoids in the responses induced by hypoxia. For this, young rats (~80g) were exposed to acute intermittent hypoxia (AIH) for 8 hours (6% O2 for 40 seconds at 9 minutes intervals). The data show that AIH is a catabolic situation that increases plasma levels of glucose and insulin, reduces the content of liver glycogen (97%), the muscle glucose oxidation (40%) and the retroperitoneal and epididymal white adipose tissue mass (30%), without changing muscle mass. With respect to the protein metabolism, AIH rats showed an increase in the rates of overall proteolysis in soleus and EDL muscle, which were accompanied by a hyperactivity of the ubiquitin (Ub)-proteasome and calcium-dependent proteolytic systems, without changes in rates of protein synthesis. This response was associated with a high content of myofibrillar proteins Ub-conjugates and mRNA levels of atrophy-related genes (atrogin-1 and MuRF1) and autophagic genes (LC3 and GABARAP). Furthermore, in soleus muscle, we observed reduction of Akt phosphorylation (Ser473), a key protein in the control of protein metabolism. It was also found that adrenalectomy prevented activation of proteolytic systems and gene transcription of \"atrogenes\" in hypoxic rats, while the autophagic genes were not affected. The data suggest that the AIH, during 8 hours, acts as a catabolic trigger activating the Ub-proteassome and calcium-dependent proteolytic processes, as well as the expression of atrophy-related genes and autophagy. The activation of atrophy program induced by hypoxia seems to be mediated by glucocorticoids, and is probably important for the provision of amino acids from muscle to the liver which maintains the hyperglycemia. Therefore, this catabolic response, if sustained, can lead to the loss of skeletal muscle mass in situations of prolonged exposure to intermittent hypoxia.