A divisão celular em B. subtilis inicia-se pela formação de um complexo multiprotéico, o divisomo, no sítio onde a bactéria irá se dividir. FtsZ é a primeira proteína a se localizar no futuro sitio de divisão, formando uma estrutura em anel (anel Z) que se estende por toda a circunferência da célula. O anel Z funciona como um arcabouço responsável por recrutar outras quinze proteínas de divisão que irão participar da montagem do divisomo. Nesta tese, utilizamos abordagens quantitativas e qualitativas de microscopia de fluorescência vital para estudarmos duas questões ainda não esclarecidas sobre o funcionamento do divisomo. A primeira delas é como o divisomo é montado. Para estudarmos a montagem do divisomo nós realizamos ensaios de co-localização entre o anel Z (FtsZ-mCherry) e as proteínas ZapA, EzrA, FtsW, FtsL, YpsB , DivIVA, e MinC fusionadas a GFP. Quanto maior a freqüência de co-localização entre FtsZ e outra proteína de divisão, mais inicial é a participação da proteína na formação do divisomo. Portanto, a medida da freqüência de co-localização entre o anel Z e as proteínas componentes do divisomo permite que se deduza uma cinética da montagem deste complexo. Estes ensaios demonstraram uma freqüência de co-localização de 97,33% para ZapA; 98,31% para EzrA; 83,90% para FtsW; 78,43% para FtsL; 50% para YpsB; 41,7% para DivIVA e 31,64% para MinC. Estes resultados sugerem que o divisomo seja formado em três etapas. ZapA e EzrA se associam ao divisomo imediatamente após a formação do anel Z, em seguida FtsW e FtsL são recrutados para o divisomo, e por último YpsB, DivIVA, MinC associam-se ao divisomo. A segunda questão que investigamos nesta tese foi o mecanismo da mudança de posição do divisomo que ocorre durante a esporulação em B. subtilis. Na fase de esporulação a célula divide-se assimetricamente, com a formação do septo próxima a um dos pólos. Durante o crescimento vegetativo a divisão não ocorre próxima aos pólos por causa da ação das proteínas MinC, MinD e DivIVA, importantes reguladores espaciais da divisão. MinCD e DivIVA são inibidores da formação do anel Z que durante o crescimento vegetativo se localizam nos pólos das células.. Uma hipótese para explicar o uso dos sítios polares para a divisão durante a esporulação seria que as proteínas MinCD e DivIVA seriam removidas dos pólos celulares. Para testarmos esta hipótese, estudamos a localização das proteínas MinCD e DivIVA durante a esporulação. Nossos resultados demonstraram que MinCD e DivIVA se re-localizam e saem dos pólos celulares durante a esporulação. Porém esta dinâmica ocorre após a formação do anel Z assimétrico, sugerindo que o anel Z seja insensível a estes inibidores durante a esporulação. Por ensaios genéticos em B. subtilis demonstramos que a proteína SpoIIE, conhecida como provável proteína responsável por promover a formação do septo assimétrico, seja capaz de contrapor a ação de MinC no início da esporulação. Dessa maneira nós propomos um novo modelo de mudança da divisão simétrica para assimétrica durante a esporulação, diferentemente da simples saída do complexo MinCD dos pólos como é proposto na literatura. / Bacillus subtilis division begins through the formation of a multiprotein complex, the divisome, at the site of division. FtsZ is the earliest known protein to localize to the future division site where the protein forms a ring-like structure (Z-ring) that extends around the circumference of the cell. The Z-ring functions as a scaffold and recruits about fifteen other division proteins that compose the divisome. In this work, we used quantitative and qualitative methods of vital fluorescence microscopy to study two questions that have not been elucidated about the divisome dynamics. The first is how divisome is assembled. To address that problem, we made co-localization between Z-ring (FtsZ-mCherry) and proteins ZapA, EzrA, FtsW, FtsL, YpsB, DivIVA, and MinC fused to GFP. Higher is the match between GFP fusions to Z-ring, earlier is the assembly of division proteins to divisome. Therefore, the co-localization frequency between Z ring and divisome proteins will allow us to deduce the assemble kinetics of the divisome. This assays showed a co-localization frequency of 97,33% for ZapA; 98,31% for EzrA; 83,90 for FtsW; 78,43% for FtsL; 50% for YpsB; 41,7% for DivIVA and 31,64% for MinC. This data suggests that the divisome does not assemble in two but in three steps. ZapA and EzrA assemble into the divisome immediately after Z ring formation, secondly FtsW and FtsL were recruited to the divisome, and finally YpsB, DivIVA, MinC associated with the divisome. The second question that we investigated in this work is the mechanism responsible for change the divisome position that occurs during sporulation in B. subtilis. In sporulation the cell divides asymmetrically, with a septum formation near poles. During vegetative grown the divisiome does not occur near poles because of MinC, MinD and DivIVA action, relevant for spatial regulation of division. MinCD and DivIVA are inhibitors of Z ring formation that during vegetative growth are located at poles. A hypothesis to explain the use of polar sites for division during sporulation would be that MinCD and DivIVA would be removed from cellular poles. To test this hypothesis, we studied the location of MinCD and DivIVA proteins during sporulation. Our results demonstrated that MinCD and DivIVA re-localize and leave to cell poles during sporulation. However this process occurs after asymmetric Z ring formation, suggesting that Z ring would be unresponsive to this inhibitors during sporulation. Through genetics assays in B. subtilis we demonstrated that SpoIIE protein, known to probably play a role in asymmetric septum formation, would be able to contrapose MinC action during early sporulation. Therefore, we propose a novel model for change the symmetric to asymmetric division during sporulation, unlike the release of MinCD from pole proposed in the literature.

Submitted master’s thesis is focused on the study of possibilities of lipids degradation in particular wastewaters originating in food industry or restaurants. The effort is given to the employment of lipolytic activity presenting microorganisms. In the literature review, wastewater treatment with aim on the sludge management and fat separators are described, as a way how to pre-treat these wastewaters. In this part the enzymes lipases of microbial origin are researched from point of view of their production conditions and possible applications. The experimental part is dedicated to the research of optimization of cultivation conditions for lipases production employing selected microorganisms (Bacillus subtilis, Geobacillus thermodenitrificans, G. thermocatenulatus and mixed bacterial culture Thermus and Bacillus) and a commercial formulation (Sany Duo Spezial). Lipases production and growth of microorganisms are determined spectrofotometrically on various concentrations of lipids. Moreover, employing the solid nutrition medium, the effect of detergents onto the Bacillus subtilis culture was assessed, since detergents are generally abundant in this particular wastewaters. As a conclusion, vide supra mentioned microorganisms were characterized according to their abilities to degrade triacylglycerols.

<p>The relatively recent discoveries of bacterial small RNAs (sRNAs) and their important regulatory functions prompted us to conduct a genome wide survey for sRNAs in <em>Streptomyces coelicolor</em>. We used a combined bioinformatics and experimental approach to identify and characterize six sRNAs. sRNA expression profiles were determined throughout <em>S. coelicolor</em> development, including vegetative and reproductive growth, during growth on minimal and rich media. Additionally, we also tested sRNA expression in various <em>S. coelicolor</em> developmental mutants. Two sRNAs were expressed exclusively during growth on one medium type and all but one were expressed constitutively throughout growth apart from the late sporulation timepoint. One of the identified sRNAs, scr1906, appeared to be closely associated with development. scr1906 was only expressed in nutrient limiting conditions just prior to aerial development and sporulation. Expression of scr1906 was abolished in a mutant that was defective in sporulation (due to a mutation in the sporulation sigma factor gene, <em>whiG</em>); however, expression was detected in mutants of both known σ^WhiG target genes, <em>whiH</em> and <em>whiI</em>, which encode sporulation transcription factors. Intriguingly, <em>in silico</em> analysis predicted <em>whiH</em> to be a direct target for scr1906-mediated regulation based on potential nucleotide binding sites. The effects of deletion and overexpression of <em>scr1906</em> on WhiH levels were tested, but require further experimentation.</p> <p>In a separate line of investigation, we sought to characterize a novel actinobacterial-specific protein named sIHF. The <em>sIHF</em> mutant strain revealed that sIHF influenced DNA compaction and segregation during <em>S. coelicolor</em> sporulation and also affected antibiotic production. sIHF associated with the nucleoid, and <em>in vitro</em>, it bound to DNA non-specifically in a length dependent manner, although it was determined to have a preference for three distinct DNA motifs. Like most nucleoid-associated proteins, sIHF affected gene expression indicating the potential for an additional role as a transcription factor. Interestingly, sIHF impacted the activity of topoisomerase. Leveraging information that we have gained from the sIHF-DNA co-crystal complex, studies aimed at characterizing the sIHF regions that are important for DNA interaction and topoisomerase modulation are currently underway.</p> / Doctor of Philosophy (PhD)

Neste trabalho realizamos a análise das variações na expressão gênica global durante a fase de esporulação do fungo aquático Blastocladiella emersonii utilizando a tecnologia dos microarranjos de cDNA em lâminas contendo 3.773 genes distintos. Ao todo 615 genes foram classificados como induzidos enquanto 645 foram classificados como reprimidos ao longo da esporulação. As categorias funcionais mais representadas entre os genes induzidos foram: microtúbulo e citoesqueleto, transmissão de sinal, atividade de ligação ao íon Ca2+, proteólise (apenas no início da esporulação) e biogênese e organização do cromossomo (apenas no final da esporulação). Dentre os genes reprimidos, as categorias funcionais mais representadas foram: biossíntese de proteína, transporte de carboidratos e metabolismo energético. A comparação dos dados de expressão gênica da esporulação com aqueles obtidos recentemente em nosso laboratório para a germinação mostrou um grande número de genes regulados inversamente ao longo das duas fases de diferenciação do ciclo de vida de B. emersonii. Muitos genes induzidos na esporulação são reprimidos na germinação e vice versa. Analisamos também o efeito de glicose e triptofano sobre a expressão gênica durante a formação dos zoósporos, tendo em vista que tais nutrientes são capazes de inibir a esporulação de B. emersonii. Nossos resultados mostraram que na presença de glicose (1%) genes envolvidos na composição e atividade do citoesqueleto foram superexpressos, enquanto na presença do aminoácido triptofano houve um aumento na expressão de genes envolvidos no processo de enovelamento de proteínas e proteólise, e na resposta ao estresse oxidativo. Além disso, genes envolvidos no processo de esporulação propriamente dito foram reprimidos durante o tratamento com triptofano. Investigamos também a via de sinalização por GMP cíclico (cGMP), cujos níveis aumentam consideravelmente durante a esporulação de B. emersonii. Iniciamos o estudo com uma busca no banco de ESTs de B. emersonii (http://blasto.iq.usp.br) por seqüências que codificassem enzimas envolvidas na síntese e degradação de cGMP. Foram encontradas três ESTs que codificam domínios catalíticos que parecem pertencer a três diferentes guanilato ciclases e uma EST codificando uma fosfodiesterase com alta similaridade com fosfodiesterases que possuem alta afinidade por cGMP. Experimentos de microarranjos de cDNA validados por RT-PCR quantitativo em tempo real mostraram que os quatro transcritos são expressos durante esporulação, com picos de indução durante a fase tardia da esporulação, momento em que ocorre a biogênese dos zoósporos. Além disso, dados obtidos a partir de experimentos in vivo e in vitro utilizando inibidores das enzimas guanilato ciclase e óxido nítrico sintase, sugeriram a participação do íon Ca2+ e do radical livre óxido nítrico (&#8226;NO) na atividade de guanilato ciclase, em uma via do tipo Ca2+-&#8226;NO-cGMP. / In the present work, we analyzed global gene expression changes during the sporulation phase of the aquatic fungus Blastocladiella emersonii using cDNA microarray technology with chips containing 3773 distinct genes. A total of 615 genes were upregulated and 645 were down-regulated along the sporulation of the fungus. The overrepresented functional categories among the induced genes were: microtubule and cytoskeleton, signal transduction, Ca2+ binding activity, proteolysis (only at the beginning of sporulation), and chromosome biogenesis and organization (only at the end of sporulation). Among the down-regulated genes, the over-represented functional categories were: protein biosynthesis, carbohydrate transport, and energetic metabolism. Sporulation gene expression data were compared with those obtained recently in our laboratory for the germination phase, showing that a great number of genes are inversely regulated along the two differentiation stages of B. emersonii life cycle. We also analyzed the effects of glucose and tryptophan on gene expression during biogenesis of the zoospores, as such nutrients are able to inhibit B. emersonii sporulation. Our results showed that in the presence of glucose (1%) genes related to activity and composition of cytoskeleton were over-expressed, while in the presence of tryptophan genes involved in protein folding, proteolysis and oxidative stress were induced. In addition, genes involved in the sporulation process per se were downregulated by tryptophan treatment. We also investigated the cyclic GMP signaling pathway, as the levels of this cyclic nucleotide increase considerably during B. emersonii sporulation. Firstly, we searched for sequences encoding enzymes involved in cGMP synthesis and degradation using the B. emersonii EST databank (http://blasto.iq.usp.br). Three sequences were found encoding distinct guanylate cyclase catalytic domains, and one showed high similarity with phosphodiesterases that exhibit high affinity for cGMP. Microarray experiments, validated by real time quantitative RT-PCR, showed that the four transcripts are induced during sporulation, reaching maximum levels at the late stages of sporulation, when zoospore biogenesis occurs. In addition, data obtained from in vivo and in vitro experiments using inhibitors for the enzymes guanylate cyclase and nitric oxide synthase indicated the involvement of the ion Ca2+ and the free radical nitric oxide (&#8226;NO) in guanylate cyclase activity, suggesting the existence of a Ca2+-&#8226; NO-cGMP signaling pathway.

A incidência e severidade da mancha de cercospora, causada por Cercospora zeae-maydis Tehon & Daniels, aumentou significativamente em território brasileiro a partir do ano 2000, sendo hoje considerada uma das principais doenças foliares da cultura do milho. Mesmo assim, poucos estudos com este patossistema foram realizados no Brasil. Este trabalho teve por objetivo determinar meio de cultura e regime luminoso para adequada esporulação de C. zeae-maydis, estudar a reação de um grupo de 118 linhagens endogâmicas de milho quanto a resistência ao patógeno em dois ambientes distintos (Indianópolis-MG e Jardinópolis-SP), observar aspectos microscópicos da esporulação, germinação e penetração em hospedeira suscetível e avaliar diferenças morfológicas, genéticas e de agressividade entre isolados coletados na região centro-sul do país. Os resultados indicaram que a melhor esporulação do fungo foi obtida em meio V8 e suco de tomate temperado quando submetidos a fotoperíodo 12/12h (luz/escuro). Quanto a reação das linhagens à doença, foi possível verificar interação diferencial significativa entre genótipo de milho e os dois ambientes, indicando que fatores ambientais ou patogênicos, distintos entre os locais, podem ter contribuído para os discrepantes comportamentos de alguns genótipos. Também foi possível verificar elevado nível de resistência em 12 linhagens em ambos locais, demonstrando a existência de genótipos mais estáveis para resistência com possibilidade de uso em programas de melhoramento da cultura. Através da análise do padrão de restrição gerado pela digestão da região ITS-5.8S do rDNA, de 104 locos AFLP e de mensurações morfométricas dos conídios, foi possível verificar a existência de dois grupos geneticamente distintos de C. zeae-maydis em território brasileiro. Estes são relatados na literatura como grupos I e II ou espécies afins (siblings species). Estes grupos foram detectados em todos os locais de coleta do território brasileiro, com exceção de Goiás, onde o grupo I não foi observado. Quanto aos aspectos microscópicos deste patógeno, foi possível verificar que sob condições ambientais adequadas a germinação dos esporos ocorre 13 horas após o contato do esporo com a hospedeira, e a penetração, via estômato, tem início 16 horas após a inoculação. Também foi observado o fenômeno da conidiação microcíclica nos isolados brasileiros. Vinte e seis por cento daqueles pertencentes ao grupo I produziram microconídios, enquanto nenhum do grupo II apresentou esta característica. Deste modo, este é o primeiro relato da existência deste fenômeno no grupo I e ausência no grupo II. Estes estudos demonstram que a população brasileira de C. zeae-maydis se assemelha àquelas existentes nos Estados Unidos e na África, com a prevalência dos dois grupos genéticos. / The incidence and severity of cercospora leaf spot, caused by Cercospora zeae-maydis Tehon & Daniels, increased significantly in Brazil in 2000, being considered today one of the major leaf disease of the crop. Despite this, few researches about the pathosystem come being carried in Brazil. The aims of this work were to identify the suitable culture media and light conditions for sporulation of C. zeae-maydis; to study the reaction of 118 mayze genotypes to pathogen in two different locations (Indianópolis - Minas gerais State and Jardinópolis - São Paulo State); to observe some microscopical aspects of esporulation, germination and penetration in a susceptible maize genotype; and finally to assess morphological and genetic differences among a group of isolates collected in center-south Brazil. The results showed that the better culture media for esporulation was the V8 media and tomato juice, under 12-hours photoperiod. Concerning to genotype reaction to disease, it was possible to verify significant interaction between genotypes and environment, indicanting that environmental or pathogenic factors, distinct between locations, may have influenced the reactions of some genotypes. It was possible to identify highly level of resistance in 12 lines in both places, evidencing the existence of stable genotypes that can be used in breeding programs. Analysis of restriction fragments from ITS-5.8S of rDNA, 104 AFLP loci, and conidial measurements, showed the existence of two genetically divergent groups of C. zeae-maydis in Brazil. These groups are similar to the ones reported previously reported as I and II groups or siblings species. Both groups were detected in all sampled regions, except Goiás State where no isolates from group I were detected. Concerning to microscopic traits, it was possible to verify that the brazilian isolates of this pathogen have the ability for production of microconidia. Twenty six percent of the isolates of the group I produced microconidia, while none of the group II showed this trait. Thus, this is the first report with presence of MC in the group I but absence in the group II. The results showed that Brazilian isolates are very similar to isolates from USA and Africa, occurring both genetic groups.

Com o intuito de gerar subsídios para melhoria do processo de produção de Metarhizium anisopliae, o presente estudo teve como principais objetivos, determinar os efeitos de inibidores de proteinases de soja no crescimento vegetativo, esporulação e virulência do fungo e comparar a produção, viabilidade e virulência dos conídios produzidos em diferentes tipos de arroz e aditivos. A adição de 5 g.L-1 de inibidores de proteinases semi-purificados de soja ou 0,5 g.L-1 de inibidor purificado do tipo Kunitz no meio de cultura ME resultou em grande aumento na esporulação (de duas a 75 vezes) sem afetar a viabilidade dos conídios de quatro isolados (ESALQ-1037, IBCB348, E9, F20) de M. anisopliae. A presença destes inibidores de proteinases também alterou a morfologia dos conídios produzidos em ME. Os mecanismos responsáveis por estas alterações fisiológicas não foram determinados, mas provavelmente estejam associados à ação anti-nutricional, diminuindo a absorção protéica e estimulando a esporulação. Os conídios produzidos no meio com adição de 0,5 g.L-1 de inibidor de proteinase do tipo Kunitz ou com 2,5 g.L-1 de albumina de soro bovino e no meio BDA apresentaram virulência superior aos conídios produzido no meio ME sem inibidores. Quando o inibidor de proteinase do tipo Kunitz foi adicionado à suspensão de conídios do fungo antes da pulverização de lagartas de Diatraea saccharalis, a eficiência de controle foi 35,1%, inferior ao apresentado pelos demais tratamentos sem a presença deste inibidor. Nos estudos para determinação dos melhores tipos de arroz para produção de M. anisopliae, tentou-se correlacionar à produção de conídios com características destes substratos como valor nutricional, teor de resíduos de agrotóxicos e densidade de microorganismos. O arroz parboilizado foi responsável pela maior produção de conídios (4,38 x 109 conídios.g-1). Este tipo de arroz apresentou teor de proteína bruta menor do que a maioria dos arrozes e o maior teor de umidade (41,3% após a autoclavagem). Além disto, os grãos após autoclavagem ficaram menos gelatinosos e mais soltos, o que facilita o processo de produção do fungo. Enquanto que os arrozes dos tipos brancos polidos, canjicão e integral ficaram pegajosos e formaram grumos, o que provavelmente deve acarretar em menor superfície de desenvolvimento para o fungo. O segundo melhor arroz, o canjicão, com produção de 3,42 x 109 conídios.g-1, teve a maior quantidade de fungos contaminantes nos grãos crus. Quantidades intermediárias de conídios foram produzidas pelos arrozes branco polido irrigado, de terras altas e orgânico. O integral foi o que resultou na menor quantidade de conídios (1,53 x 109 conídios.g-1), sendo o mais rico em minerais, proteína bruta e extrato etéreo. Nenhum dos aditivos (farelo de soja, grãos de soja partidos, extrato de soja, peptona de soja, inibidores de proteinases de soja semipurificados e purificado do tipo Kunitz, polpa cítrica e levedura) resultou em aumento na produção de conídios em comparação com o arroz parboilizado sem aditivos. Os conídios produzidos em todos os arrozes e aditivos apresentam viabilidade superior a 99%. As vantagens da utilização do arroz parboilizado levando-se em consideração custo, facilidade de manuseio e produtividade são discutidas. / In order to optimize the production process of Metarhizium anisopliae, the present study aimed to determine the effects of soybean proteinase inhibitors on growth, sporulation and virulence of the fungus and to compare yield, viability and virulence of M. anisopliae conidia produced in different types of rice and additives. The addition of 5 g.L-1 of semi-purified soybean proteinase inhibitor or 0.5 g.L-1 of Kunitz-type inhibitor purified on the culture medium ME resulted in large increases in sporulation (two to 75 times) without affecting the viability of conidia of four M. anisopliae isolates (ESALQ-1037, IBCB348, E9, F20). The presence of proteinase inhibitors altered morphology of conidia produced in ME. Mechanisms responsible for these physiological changes in the fungus have not been determined, but it is probably associated to an anti-nutritional action, reducing the absorption of protein and stimulating sporulation. Spores produced in the medium with the addition of 0.5 g.L-1 Kunitz-type inhibitor purified or 2.5 g.L-1 of bovine serum albumin (BSA) and PDA medium showed higher virulence of conidia produced in ME without inhibitors. When the Kunitz-type inhibitor was added to conidial suspension of the fungus before spraying larvae of Diatraea saccharalis, control efficiency was 35.1% lower than that presented in other inhibitor-free treatments. In the studies aiming to determine the best types of rice for production of M. anisopliae, we tried to correlate production of conidia with characteristics of these substrates such as nutritional content, pesticide residues and density of microorganisms. The parboiled rice was responsible for greater production of conidia (4.38 x 109 conidia.g-1). This type of rice showed crude protein content lower than most rice and the highest moisture content (41.3% after autoclaving). Besides that, grains became less gelatinous and loose after autoclaving, and these feature favored fungus production. While types of polished white, brown rice and course (broken) rice grain were sticky and formed clumps, providing a smaller area for fungus development. The second best rice, course rice grain, with production of 3.42 x 109 conidia.g-1, had the highest amount of fungal contaminants in raw grains. Intermediate amounts of conidia were produced by white irrigated polished rice, upland rice and organic rice. The brown rice was the kind that resulted in fewer conidia (1.53 x 109 conidia.g-1), being the richest in minerals, protein and lipids. None of the additives (soybean meal, soybean parties, soy extract, soy peptone, semi-purified soybean proteinase inhibitor, Kunitz-type inhibitor purified, citrus pulp and yeast) resulted in increased production of conidia compared to parboiled rice without additives. Conidia produced in all types of rice and additives presented viability greater than 99%. The advantages of the use of parboiled rice taking into consideration the cost, easy handling and productivity are discussed.

Com o intuito de gerar subsídios para melhoria do processo de produção de Metarhizium anisopliae, o presente estudo teve como principais objetivos, determinar os efeitos de inibidores de proteinases de soja no crescimento vegetativo, esporulação e virulência do fungo e comparar a produção, viabilidade e virulência dos conídios produzidos em diferentes tipos de arroz e aditivos. A adição de 5 g.L-1 de inibidores de proteinases semi-purificados de soja ou 0,5 g.L-1 de inibidor purificado do tipo Kunitz no meio de cultura ME resultou em grande aumento na esporulação (de duas a 75 vezes) sem afetar a viabilidade dos conídios de quatro isolados (ESALQ-1037, IBCB348, E9, F20) de M. anisopliae. A presença destes inibidores de proteinases também alterou a morfologia dos conídios produzidos em ME. Os mecanismos responsáveis por estas alterações fisiológicas não foram determinados, mas provavelmente estejam associados à ação anti-nutricional, diminuindo a absorção protéica e estimulando a esporulação. Os conídios produzidos no meio com adição de 0,5 g.L-1 de inibidor de proteinase do tipo Kunitz ou com 2,5 g.L-1 de albumina de soro bovino e no meio BDA apresentaram virulência superior aos conídios produzido no meio ME sem inibidores. Quando o inibidor de proteinase do tipo Kunitz foi adicionado à suspensão de conídios do fungo antes da pulverização de lagartas de Diatraea saccharalis, a eficiência de controle foi 35,1%, inferior ao apresentado pelos demais tratamentos sem a presença deste inibidor. Nos estudos para determinação dos melhores tipos de arroz para produção de M. anisopliae, tentou-se correlacionar à produção de conídios com características destes substratos como valor nutricional, teor de resíduos de agrotóxicos e densidade de microorganismos. O arroz parboilizado foi responsável pela maior produção de conídios (4,38 x 109 conídios.g-1). Este tipo de arroz apresentou teor de proteína bruta menor do que a maioria dos arrozes e o maior teor de umidade (41,3% após a autoclavagem). Além disto, os grãos após autoclavagem ficaram menos gelatinosos e mais soltos, o que facilita o processo de produção do fungo. Enquanto que os arrozes dos tipos brancos polidos, canjicão e integral ficaram pegajosos e formaram grumos, o que provavelmente deve acarretar em menor superfície de desenvolvimento para o fungo. O segundo melhor arroz, o canjicão, com produção de 3,42 x 109 conídios.g-1, teve a maior quantidade de fungos contaminantes nos grãos crus. Quantidades intermediárias de conídios foram produzidas pelos arrozes branco polido irrigado, de terras altas e orgânico. O integral foi o que resultou na menor quantidade de conídios (1,53 x 109 conídios.g-1), sendo o mais rico em minerais, proteína bruta e extrato etéreo. Nenhum dos aditivos (farelo de soja, grãos de soja partidos, extrato de soja, peptona de soja, inibidores de proteinases de soja semipurificados e purificado do tipo Kunitz, polpa cítrica e levedura) resultou em aumento na produção de conídios em comparação com o arroz parboilizado sem aditivos. Os conídios produzidos em todos os arrozes e aditivos apresentam viabilidade superior a 99%. As vantagens da utilização do arroz parboilizado levando-se em consideração custo, facilidade de manuseio e produtividade são discutidas. / In order to optimize the production process of Metarhizium anisopliae, the present study aimed to determine the effects of soybean proteinase inhibitors on growth, sporulation and virulence of the fungus and to compare yield, viability and virulence of M. anisopliae conidia produced in different types of rice and additives. The addition of 5 g.L-1 of semi-purified soybean proteinase inhibitor or 0.5 g.L-1 of Kunitz-type inhibitor purified on the culture medium ME resulted in large increases in sporulation (two to 75 times) without affecting the viability of conidia of four M. anisopliae isolates (ESALQ-1037, IBCB348, E9, F20). The presence of proteinase inhibitors altered morphology of conidia produced in ME. Mechanisms responsible for these physiological changes in the fungus have not been determined, but it is probably associated to an anti-nutritional action, reducing the absorption of protein and stimulating sporulation. Spores produced in the medium with the addition of 0.5 g.L-1 Kunitz-type inhibitor purified or 2.5 g.L-1 of bovine serum albumin (BSA) and PDA medium showed higher virulence of conidia produced in ME without inhibitors. When the Kunitz-type inhibitor was added to conidial suspension of the fungus before spraying larvae of Diatraea saccharalis, control efficiency was 35.1% lower than that presented in other inhibitor-free treatments. In the studies aiming to determine the best types of rice for production of M. anisopliae, we tried to correlate production of conidia with characteristics of these substrates such as nutritional content, pesticide residues and density of microorganisms. The parboiled rice was responsible for greater production of conidia (4.38 x 109 conidia.g-1). This type of rice showed crude protein content lower than most rice and the highest moisture content (41.3% after autoclaving). Besides that, grains became less gelatinous and loose after autoclaving, and these feature favored fungus production. While types of polished white, brown rice and course (broken) rice grain were sticky and formed clumps, providing a smaller area for fungus development. The second best rice, course rice grain, with production of 3.42 x 109 conidia.g-1, had the highest amount of fungal contaminants in raw grains. Intermediate amounts of conidia were produced by white irrigated polished rice, upland rice and organic rice. The brown rice was the kind that resulted in fewer conidia (1.53 x 109 conidia.g-1), being the richest in minerals, protein and lipids. None of the additives (soybean meal, soybean parties, soy extract, soy peptone, semi-purified soybean proteinase inhibitor, Kunitz-type inhibitor purified, citrus pulp and yeast) resulted in increased production of conidia compared to parboiled rice without additives. Conidia produced in all types of rice and additives presented viability greater than 99%. The advantages of the use of parboiled rice taking into consideration the cost, easy handling and productivity are discussed.

Submitted by Jorge Silva (jorgelmsilva@ufrrj.br) on 2018-03-28T19:19:31Z No. of bitstreams: 1 2015 - Fernanda Corr?a de Souza.pdf: 1439461 bytes, checksum: 2ae132a0a7316575d458f10db44101a4 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-28T19:19:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015 - Fernanda Corr?a de Souza.pdf: 1439461 bytes, checksum: 2ae132a0a7316575d458f10db44101a4 (MD5) Previous issue date: 2015-10-08 / CAPES / CNPq / FAPERJ / The tomato crop is subject to attack by diseases of different etiologies, especially the gray leaf spot, caused by Stemphylium sp., which infects the aerial part of the plant and has shown higher incidences and losses in growing areas in recent years. Despite the disease importance, few studies are developed to elucidate the aspects of epidemiology and control of the disease. The use of trials involving pathogen inoculations is essential for carrying out these studies, which requires efficient methods of in vitro multiplication. The aim of this study was to verify the influence of some factors applied during incubation on the mycelial growth and sporulation of the pathogen under controlled conditions. Different culture media (V8 juice agar, tomato juice, PDA, oat, carrot, corn flour, tomato leaf and V8+PDA), temperature (25?C; 25+10?C; 25+15?C; 25+20?C; 25/10?C; 25/15?C; 25/20?C), photoperiods (day/night, respectively, of 0h/24h, 4h/20, 6h/18h, 8h/16h and 12h/12h), luminosity (cool white lamps and black light lamps) and stress types applied to the colony (scratching and UV) were tested. Promising factors were determinate and, after this, the virulence of conidia obtained on the selected system was evaluated. Results indicated the tomato juice and V8 juice agar more favorable for growth and sporulation, respectively. The temperature of 25?C continuous favored mycelial growth and alternation of 25?C (day) and 10?C (night) the sporulation. The growth was more stimulated by 12h light/ 12h dark of photoperiod and the sporulation was higher 6h light/ 18h dark. The different light sources had influence on sporulation and cool white lamps were the most stimulating. Not stressed colonies had better results in conidia production. Thus, the suggested protocol in this study consisted in incubation in V8 juice agar media, alternately temperature of 25?C (day) and 10?C (night), 12h light / 12 h dark photoperiod. The produced conidia in this methodology showed great capacity of infection on tomato plants. / A cultura do tomate est? sujeita ao ataque de doen?as de diferentes etiologias, com destaque para a mancha-de-estenf?lio, causada por Stemphylium sp., que infecta a parte a?rea da planta e tem apresentado maiores incid?ncias e perdas nas ?reas de cultivo nos ?ltimos anos. Apesar da import?ncia desta doen?a, s?o poucos os estudos realizados visando esclarecer aspectos da epidemiologia e controle da doen?a. Para realiza??o desses trabalhos ? fundamental o uso de ensaios que envolvam inocula??es do pat?geno o que requer m?todos eficientes de sua multiplica??o in vitro. O presente trabalho teve o objetivo de avaliar a influ?ncia de alguns fatores sobre o crescimento micelial e esporula??o do pat?geno em condi??es controladas. Diferentes meios de cultura (V8, suco de tomate, BDA, aveia, cenoura, farinha de milho, folha de tomate e V8+BDA), temperatura (25 ?C, 25+10 ?C, 25+15 ?C, 25+20 ?C, 25/10 ?C, 25/15 ?C; 25/20 ?C), fotoper?odo (luz/escuro respectivamente, 0h/24h, 4h/20h, 6h/18h, 8h/16h e 12/12h), luminosidade (l?mpadas brancas frias e l?mpadas de luz negra) e tipos de estresse aplicado ? col?nia (raspagem e comprimento de onda) foram testados. Ap?s a determina??o das melhores combina??es de temperatura, fonte de luz e fotoper?odo avaliou-se a virul?ncia dos con?dios obtidos no sistema selecionado. Os resultados indicaram o meio suco de tomate e V8 como os mais favor?veis ao crescimento e esporula??o respectivamente. A temperatura de 25 ?C cont?nuos favoreceu o crescimento micelial e a altern?ncia de 25 ?C (diurno) e 10 ?C (noturno) a esporula??o. O fotoper?odo 12h luz/12h escuro foi o que mais estimulou o crescimento, j? para esporula??o o estimulo foi maior quando foi oferecido 6h luz/18h escuro. As diferentes fontes de luz utilizadas tiveram influ?ncia marcante na esporula??o, sendo as l?mpadas brancas frias as mais estimulantes. As col?nias que n?o sofreram estresse obtiveram melhores resultados na produ??o de con?dios. Dessa forma, o protocolo sugerido neste trabalho consistiu de inocula??o em meio V8, temperatura alternada de 25 ?C (diurno) e 10 ?C (noturno), fotoper?odo de 6 horas de luz branca/18 horas de escuro. Os con?dios produzidos nesta metodologia apresentam grande capacidade de infec??o de plantas de tomateiro.

Apesar da espécie Vigna unguiculata (L.) Walp. ser bastante rústica e estar adaptada às condições adversas de clima e solo brasileiros, seu rendimento é muito baixo. Diversas causas têm sido levantadas para explicar esse comportamento; entre elas destacam-se as doenças fúngicas, sobretudo aquelas cujos patógenos são transmitidos por sementes, em especial a podridão cinzenta do caule, causada por Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid. A abordagem analítica desse patossistema revelou alguns problemas emergentes. Entre eles, destacam-se: a) desconhecimento da qualidade sanitária das sementes de caupi, utilizadas para semeadura; b) desunifomidade na metodologia usada para detectar os patógenos presentes nas semente; c) dificuldade na esporulação do patógeno, máxime de alguns isolados reticentes em esporular em meios artificiais de cultivo, cujo comportamento dificulta os trabalhos de seleção de genótipos resistentes; d) carência de medidas de controle do patógeno, que empreguem práticas naturais, como uso de sementes sadias, de indutores de resistência e de cultivares resistentes, de fácil uso e passível de adoção por parte dos produtores. Na estruturação da matriz lógica do presente estudo, referidos problemas foram transformados em objetivos. Os trabalhos foram conduzidos no Departamento de Entomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrícola da ESALQ/USP, em Piracicaba-SP. Os resultados indicaram o teste de sanidade de sementes de caupi empregando o método do papel de filtro com restrição hídrica utilizando NaCl a -0,8Mpa, como o mais adequado para detecção dos fungos presentes nas sementes de caupi, especialmente M. phaseolina. A análise sanitária das amostras de sementes originadas de vários estados brasileiros revelou que, em 62% das amostras analisadas, o fungo M. phaseolina estava presente, sendo as amostras originadas do estado da Paraíba, Piauí, Pará e Bahia as que apresentaram maiores níveis de incidência do patógeno. Os melhores níveis de esporulação do patógeno foram conseguidos com a combinação de sobreposição de discos de folhas de trigo ao meio BDA, com temperatura de 25oC. Quanto à identificação de indutores de resistência, capazes de controlar M. phaseolina, os resultados revelaram que o acibenzolar-S-metil (ASM) foi o mais eficiente, quando comparado com quitosana e com um produto silicatado derivado de rocha micronizada (PSiM), apresentando um controle residual por mais de 40 dias após a semeadura. A maior eficiência verificada pelo ASM ocorreu devido a sua capacidade de ativar mecanismos bioquímicos de defesa, configurando-se em efetivo ativador da resistência induzida nas plantas de caupi, por atuar na cinética de importantes enzimas relacionadas à defesa, como a fenilalanina amônia-liase, peroxidase e quitinase. Quanto à reação de cultivares de caupi à doença, foi possível verificar razoável nível de resistência de algumas cultivares, tendo sido consideradas resistentes Mulato, Guariba e Maratauã. / Notwithstanding the specie Vigna unguiculata (L.) Walp is sufficiently rustic and adapted to the adverse conditions of the Brazilian soil and climate, its improvement is very low. Many causes have been raised in order to explain such behavior; among them the fungal diseases stand out, over all those whose pathogens are transmitted by the seeds especially the charcoal rot disease caused by Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid. The analytical approach of such pathosystem has revealed some emerging problems. Among them, it stands out: a) the ignorance of the sanitary quality of the cowpea seeds used for sowing; b) the non-uniformity in the used methodology in order to detect the pathogens, which are present in the seed; c) the difficult in pathogen sporulation, principally of some isolated reticent in forming spores in cultivation artificial environments whose behavior hampers the selection works of the resistant genotypes; d) lack of pathogen control measures, which utilize natural practices, such as the use of healthy seeds, resistance inducers and resistant cultivars of easy utilization and liable to adoption by the producers. In structuring the logical matrix of this study, such problems were transformed into objectives. The works were conducted at the Entomology, Phytopathology and Agricultural Zoology Departments of ESALQ/USP, in Piracicaba-SP. The results have pointed out the sanity test of the cowpea seeds through the method of filter paper with hydric restriction using NaCI - 0,8Mpa, as the most suitable for detecting the current fungus in cowpea seeds, especially M. phaseolina. The sanitary analysis of the seeds samples originated from several Brazilian states has revealed that in 63% of the analyzed samples, the fungus M. phaseolina was present, and the samples originated from the states of Paraíba, Piauí, Pará and Bahia were those that have presented higher incident levels of pathogen. The best levels of sporulation were obtained with the combination of the superposition of wheat leaves disks in the middle of BDA in 25ºC. As to the identification of the resistance inducers, capable of controlling the M. phaseolina, the results have revealed that the acinbezolar-S-methyl (ASM) was more efficient when compared to chitosan and with a silicate product originated from micronized rock (PsiM), presenting a residual control for more than 40 days after the sowing. The greatest efficiency ascertained by ASM has occurred due to its capacity of activate the defense biochemistries mechanisms, forming itself in an activator effect of the induced resistance in cowpea plants because it acts in the kinetic of important enzymes related to the defense, such as the phenylalanine ammonia-lyase, peroxidase and chitinase. As to the cowpea cultivars reaction to the disease, it was possible to ascertain a reasonable resistance level of some cultivars, and BR 14 Mulato, Guariba e Maratauã were considered as resistant.

Les bactéries utilisent un mode de communication appelé quorum sensing pour régulerl'expression des gènes en fonction de la densité de population et contrôler ainsi de façonmulticellulaire des processus tels que la sporulation, la compétence ou la virulence. Chez les bactériesà Gram-positif, le quorum sensing repose principalement sur la production, la sécrétion et la détectionde petits peptides de signalisation.Le projet porte sur l'étude du système quorum sensing: NprR/NprX chez Bacillus cereus, oùNprR est l'effecteur qui reconnait spécifiquement le peptide de signalisation NprX. NprR est uneprotéine bi-fonctionnelle. Seule, elle agit en tant qu'inhibiteur de la sporulation, en complexe avecNprX, elle perd sa fonction initiale au profit d'une activité facteur de transcription impliquée dans lavirulence. NprR appartient à une famille d'effecteurs de quorum sensing appelée RNPP (Rap, NprR,PlcR et PrgX) encore mal caractérisée au niveau structural. Mon projet de thèse a consisté en l'analysestructure-fonction du système NprR/NprX.Pour comprendre la régulation fonctionnelle de NprR par NprX, des études en solution (SECMALSet DLS) ont permis de mettre en évidence un switch moléculaire qui repose sur un changementd'oligomérisation. Ainsi NprX fait basculer NprR d'une conformation Apo dimérique à uneconformation compléxée tétramérique.L'étude structurale par cristallographie a aboutit à la résolution de la structure du complexeNprR/NprX. L'analyse de ce tétramère suggère la reconnaissance de 2 sites distincts sur l'ADN.L'étude structurale par SAXS, a quant à elle, permis de proposer une conformation dimérique de laforme Apo NprR, modèle conforté grâce à une étude par mutagénèse dirigée des résidus d'interface. Ils'agit d'un mode de dimérisation semblable à celui des protéines Rap (membres de la famille RNPP).La caractérisation par ITC de l'interaction NprR/NprX avec différentes formes du peptide,ainsi que l'analyse de la poche de fixation du complexe, ont permis de mieux comprendre la spécificitéd'interaction et de mettre en évidence deux résidus clés de l'effecteur : l'Asn275 essentielle à lafixation du peptide et l'Arg 126 essentielle à l'activation de la fonction facteur de transcription.Ces travaux ont contribué à une meilleure compréhension du système quorum sensingNprR/NprX grâce à l'élucidation du switch moléculaire contrôlé par NprX mais aussi à une meilleureconnaissance de la famille d'effecteurs RNPP.