Thesis (Ph. D.)--University of Virginia, 2008. / Title from title page. Includes bibliographical references. Also available online through Digital Dissertations.

A cosmomicina D é um policetídeo aromático da família das antraciclinas com propriedades antitumorais e antimicrobianas produzida por Streptomyces olindensis. A elucidação de genes responsáveis pela síntese desta molécula foi abordada neste trabalho com as técnicas de LDGW-PCR e PCR que permitiram amplificar fragmentos gênicos envolvidos na formação da aglicona. O cluster gênico completo foi caracterizado numa região de 43,1 kb produto do seqüenciamento do genoma, onde se agruparam funcionalmente 40 ORFs em varias categorias: síntese de aglicona, reguladores, glicosiltransferases, deoxiaçúcares, resistência e com função desconhecida. Visando obter mutantes nulos para os genes cosS e cosY foram construidos os plasmídeos pCCSII e pCCYII onde a transformação da cepa selvagem com pCCSII resulto na cepa mutante SoDS, deficiente em produção de cosmomicina. As analises dos produtos obtidos da expressão de ambos os genes mostrou um efeito na redução de cosmomicina e supressão de intermediários do complexo antitumoral. / Cosmomycin D produced by Streptomyces olindensis is an aromatic polyketide of the anthracycline family with antitumor and antimicrobial properties. The amplification of genes responsible for the molecule synthesis were approached in this study by LDGW-PCR and PCR techniques, the obtained fragments showed high similarities with genes involved in aglycon core assembly. The complete gene cluster was characterized in a genome region of 43.1 kb product of genome sequencing, containing 40 ORFs grouped functionally into different categories: aglycon synthesis, regulators, glycosyltransferases, deoxisugars, resistance and unknown function. In order to obtain null mutants for cosS and cosY genes, the plasmids pCCSII pCCYII were constructed, the transformation of the wild strain with pCCSII result in SoDS mutant, deficient in production of cosmomycin. The analyses of the obtained products from the expression of both genes showed an effect in reducing cosmomycin levels and suppression of various intermediates in the antitumor complex.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-26Bitstream added on 2014-06-13T19:08:57Z : No. of bitstreams: 1 cavallieri_ap_me_araiq.pdf: 708556 bytes, checksum: 7e6135c09f6e81026381b8ad167bf086 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / β-lactâmicos são compostos de elevada importância clínica. Streptomyces clavuligerus produz vários destes compostos, como penicilina N (PenN), deacetilcefalosporina C, deacetoxicefalosporina C, cefamicina C (CefC) e ácido clavulânico (AC). Particularmente, CefC é um antibiótico de grande interesse por suas características de resistência a β-lactamases. A biossíntese deste antibiótico envolve uma série complexa de reações enzimáticas, iniciando-se com a etapa limitante de conversão de L-lisina em ácido L-α-aminoadípico (AAA) que, então, condensa-se com cisteína e valina para formar L-α-aminoadipil-L-cisteinil-D-valina (ACV), o precursor dos antibióticos β-lactâmicos. A formulação de meios utilizando-se estratégias racionais tem sido de fundamental importância para incrementar a produção de antibióticos β - lactâmicos em S. clavuligerus. No presente trabalho, visando contornar a etapa de conversão de L-lisina, investigou-se o efeito da adição de AAA e/ou L-lisina no processo de produção de CefC por S. clavuligerus ATCC 27064 em meio de produção complexo solúvel contendo amido e farinha de semente de algodão (ProfloTM) como principais fontes de C e energia e de N, respectivamente. Inicialmente, foram realizadas fermentações adicionando-se ao meio um ou outro aminoácido. Os resultados destes experimentos subsidiaram, então, a seleção de faixas de concentração dos aminoácidos, através de métodos de planejamento experimental, para investigar o efeito combinado destes compostos no processo. Os dados obtidos foram avaliados estatisticamente por meio de metodologia de superfície de resposta, relacionando-se concentração inicial e consumo de AAA e L-lisina com a produção de CefC. Nos experimentos com os meios contendo somente L-lisina ou AAA, como também naqueles estabelecidos através de metodologia de planejamento experimental... / β-lactams are compounds of high clinical importance. Streptomyces clavuligerus produces various of these compounds, such as penicillin N (PenN), deacetiylcephalosporin C, deacetoxycephalosporin C, cephamycin C (CefC), and clavulanic acid (AC). Particularly, CefC is an antibiotic of great interest for its characteristics of β-lactamases resistance. The biosynthesis pathway of CefC involves a complex series of enzymatic reactions, starting with the rate-limiting step of the lysine conversion to α-aminoadipic acid (AAA), followed of this compound condensation with cysteine and valine to form L-α-aminoadipyl-L-cysteinyl-D-valine (ACV), the precursor of β-lactam antibiotics. In this work, the effect of the addition of AAA and / or lysine on CefC production by S. clavuligerus ATCC 27064 was investigated. It was used a complex medium containing soluble starch and cottonseed flour (ProfloTM) as main sources of C and energy, and N, respectively. Initially, fermentations were carried out by adding to the medium one or other amino acid. The results of these experiments were used to select the concentration ranges of amino acids by using methods of experimental design. A three-level full-factorial design was applied to investigate the combined effects of lysine and AAA concentrations on CefC production. Response surface methodology was used to determine statistically the optimum amino acids concentration values in order to obtain the maximum concentration of antibiotic. Positive effects of these amino acids on the production of antibiotics were observed in the experiments using media containing lysine or AAA, as well in the designed experiments. The effect of adding phosphate ions in the production medium was investigated too. It was found that there was a maximum production with the addition of 15 mM, within the range studied (0 to 25 mM phosphate). To confirm the results, a fermentation run was... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3244.pdf: 1568153 bytes, checksum: ace013c6a0af80e75388b3ba5b97e8cf (MD5) Previous issue date: 2010-03-22 / The Brazilian tropical savannah occupies a large area in Brazil and includes a high variety of plant species. This diversity is an important source of endophytic microorganisms consisting mainly of bacteria and fungi that inhabit the interior of plants. Endophytes can produce bioactive metabolites that exhibit activities of biotechnological interest, such as antibacterial and antifungal action. The aim of this study was to isolate from Butia capitata var capitata (Coquinho-do-cerrado), Solanum lycocarpum (Lobeira), Stryphnodendron polyphyllu (Barbatimão), Miconia albicans (Quaresmeira-white) and Aegiphila lhotzliana (Tamanqueira), collected on Brazilian tropical savannah at São Carlos, SP, endophytic microorganisms with suggestive features of the genus Streptomyces. The samples were characterized through macroscopic, physiological, biochemical and morph-dying characteristics. The antagonistic potential was tested against Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Serratia marcensis ITB 1475, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Shigella sonnei ATCC 10231 and Candida albicans ATCC 10231. 26 samples of endophytic microorganisms were isolated and selected two, one from Butia capitata var capitata and another one from Miconia albicans. Both presented microbiological characteristics of Streptomyces. The microorganism isolated from Butia inhibited the growth of Staphylococcus aureus (13 mm) and Enterococcus faecalis (11 mm), and the one isolated from Miconia did not show bioactivity against the pathogens tested. / O Cerrado ocupa uma extensa área geográfica no Brasil comportando uma variedade de espécies de plantas. Essa diversidade é uma potencial fonte de microrganismos endofíticos constituídos principalmente por bactérias e fungos que habitam o interior das plantas. Os endofiticos podem produzir metabólitos secundários bioativos de interesse biotecnológico, como ação antibacteriana e antifúngica. Esse trabalho objetivou isolar das folhas das plantas Butia capitata var. capitata (Coquinhodo- cerrado), Solanum lycocarpum (Lobeira), Stryphnodendron polyphyllu (Barbatimão), Miconia albicans (Quaresmeira-branca) e Aegiphila lhotzliana (Tamanqueira), coletadas no cerrado de São Carlos, SP, microrganismos endofíticos produtores de substâncias bioativas com características sugestivas do gênero Streptomyces. As amostras foram identificadas através de características macroscópicas, fisiológicas, bioquímicas e morfo-tintoriais. O potencial antagônico foi testado contra Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Serratia marcensis IAL 1475, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Shigella sonnei ATCC 10231 e Candida albicans ATCC 10231. Vinte e seis amostras de endofíticos foram isoladas e duas selecionadas, provenientes de Butia capitata var capitata e de Miconia albicans. Ambas apresentaram características de Streptomyces. O endofítico isolado de Butia inibiu o crescimento de Staphylococcus aureus (13 mm) e de Enterococcus faecalis (11 mm), e o isolado de Miconia não apresentou bioatividade contra os microrganismos testados.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6193.pdf: 1697828 bytes, checksum: 4cc53ac247e8d63c069aaa864a656b3a (MD5) Previous issue date: 2014-02-27 / Financiadora de Estudos e Projetos / Clavulanic acid (CA) produced by Streptomyces clavuligerus, is a potent inhibitor of beta-lactamases used in combination with conventional beta-lactam antibiotics in the treatment of infections caused by resistant bacteria to these antibiotics. The biosynthesis of CA is limited by high concentrations of carbon source and like other beta-lactam compounds, it is highly unstable in acidic or basic pHs even at moderate temperatures. In this work, it was investigated different strategies to improve the production of AC. Batch and batch cultivations with glycerol pulses were carried out in shaker at 250 rpm and pH 6.8 at constant temperatures of 20, 25 and 30°C (run control), as well as with temperature reduction after cell growth phase from 30 to 25°C, 30 to 20°C and 25 to 20 C. It was also investigated the effects of temperature and pH on the AC degradation at various cultivation times in the presence of different concentration of ammonium ion. It was observed that the use of low temperatures (20°C) during cultivation reduced the substrate uptake rate and provides a higher accumulation of AC, in the broth by reducing the effects of CA degradation and inhibition effects caused by carbon source. Batch cultivations with higher glycerol concentration (30 and 60 g/L) were also performed at low temperature (20 and 25°C). The results confirmed that glycerol inhibits or even represses the biosynthesis of CA, depending of the temperature condition employed. The highest CA concentration value (1543 mg/L) were obtained for the cultivation at 20°C and 30 g/L glycerol, 9.2 fold-higher than run control at 30°C. The kinetics of CA degradation at pHs 6.5 and 7.5 and at different concentrations of ammonium ion (0 to 1000 mg/L) were also evaluated. It observed that the degradation was highest at pH 7.5 and higher concentration of ammonium ion. For all proposals of cultivations for CA production, it was obtained a maximum CA concentration in fermentation broth of about 1.5 g/L, indicating that CA acts as an inhibitor of its own biosynthesis. Then, the potential CA removal from broth culture was evaluated by using of alternative adsorbents such as activated carbon, clinoptilolite calcined hydrotalcite, and an ion exchange resin Amberlite IRA 400, for application in extractive fermentation process. The use of resin IRA 400 as an adsorbent to remove CA during cultivation resulted in an increase of 48% in maximum CA concentration if compared with cultivation at the same temperature condition (20°C) and glycerol concentration (15 g/L) conducted without product removal, confirming the hypothesis of inhibition by product in the CA production process. In cultivation at 20°C with glycerol concentration of 30 g/L and product removal, it was obtained a highest CA production of 2841 mg/L. The results indicate that the use of low temperature combined with the removal of product during the production process of AC represent a new and effective strategies to greatly increase the yield of CA. / O ácido clavulânico (AC), produzido pela bactéria Streptomyces clavuligerus, é um potente inibidor de beta-lactamases utilizado em combinação com antibióticos betalactâmicos convencionais no tratamento de infecções causadas por bactérias resistentes a estes antibióticos. A biossíntese de AC é limitada por altas concentrações de fonte de carbono e assim como outros compostos beta-lactâmicos, é altamente instável em pH s básicos ou ácidos, mesmo em temperaturas moderadas. No presente trabalho, foram investigadas diferentes estratégias de melhoria da produção de AC. Foram realizados cultivos em batelada e batelada com pulsos de glicerol em mesa incubadora rotativa a 250 rpm e pH 6,8 em temperaturas constantes de 20, 25 e 30ºC (controle), bem como cultivos com redução de temperatura após a fase de crescimento celular de 30 para 25ºC, 30 para 20ºC e 25 para 20ºC. Foram também investigados os efeitos da temperatura e do pH na degradação de AC em diferentes tempos de cultivo e na presença de íons amônio. Observou-se que o uso de baixas temperaturas (20ºC) durante o cultivo reduz a velocidade de consumo de substrato e proporciona um maior acúmulo de AC, ao reduzir os efeitos de degradação e os efeitos de inibição pela fonte de carbono. Foram também realizados cultivos em batelada com alta concentração de glicerol (30 e 60 g/L) a baixa temperatura (20 e 25ºC). Os resultados confirmaram que o glicerol inibe ou até reprime a biossíntese de AC, dependendo da condição de temperatura empregada. Os maiores valores de concentração de AC foram obtidos para o cultivo a 20ºC e 30 g/L de glicerol (1543 mg/L), valor 9,2 vezes maior que o cultivo controle em batelada a 30ºC. As cinéticas de degradação de AC em pH s 6,5 e 7,5 e em diferentes concentrações de íons amônio (0 a 1000 mg/L) também foram avaliadas. Verificou-se que a degradação foi acentuada em pH 7,5 e com maiores concentrações de íons amônio. Para todas as propostas de cultivos de produção de AC, obteve-se uma concentração máxima de AC no caldo de cerca de 1,5 g/L, indicando ser o AC inibidor da sua própria biossíntese. Foram então avaliados os potenciais de remoção de AC do caldo de cultivo por adsorventes alternativos como carvão ativado, clinoptilolita e hidrotalcita calcinada, e por uma resina de troca iônica, Amberlite IRA 400, para aplicação no processo de fermentação extrativa. O uso de resina IRA 400 como adsorvente para remover AC durante o cultivo resultou num aumento de 48% na concentração máxima de AC em comparação com o cultivo na mesma condição de temperatura (20ºC) e concentração de glicerol inicial (15 g/L) realizadas sem a remoção do produto, comprovando a hipótese de inibição pelo produto no processo de produção de AC. Em cultivo a 20ºC com concentração de glicerol de 30 g/L e remoção de produto, obteve-se uma alta produção de AC de 2841 mg/L. Os resultados indicam que o uso de baixa temperatura aliado à remoção de produto durante a produção de AC representam novas e eficientes estratégias que elevam sobremaneira o rendimento da produção de AC.

O objetivo deste trabalho foi estudar a produção do antitumoral retamicina por células imobilizadas de Streptomyces olindensis ICB20 em biorreatores. A imobilização das células foi conseguida após uma etapa inicial de cultivo em erlenmeyers (reativação e pré-imobilização) e posterior envolvimento em gel, utilizando-se alginato de cálcio 3%; as esferas produzidas tinham diâmetro médio de 3,0 ± 0,2 mm. Foram utilizados neste trabalho os biorreatores tipo cesta (2,4 L de volume útil) e coluna de bolhas (1,6 L de volume útil), efetuando-se cultivos em batelada simples, bateladas repetidas e contínuos, visando-se uma comparação dos diferentes sistemas empregados. Também foram realizados alguns cultivos com células livres, a fim de efetuar uma comparação com os sistemas com células imobilizadas nos diferentes biorreatores. Os ensaios consistiram em empregar diferentes condições de agitação (300 e 500 rpm) e aeração (0,4 e 1 vvm) para o biorreator cesta em sistema com células imobilizadas, assim como diferentes vazões de aeração no biorreator coluna de bolhas (1, 2 e 3 vvm). Os cultivos em bateladas repetidas e contínuos foram operados a partir das melhores condições obtidas nos cultivos descontínuos. Foram aplicadas nos sistemas contínuos com células imobilizadas, as vazões específicas de alimentação de 0,05 e 0,2 h -1 no biorreator cesta e vazões de 0,015 a 0,05 h -1 no biorreator coluna de bolhas. A comparação entre os sistemas com células livres e imobilizadas mostrou que as limitações difusionais afetaram significativamente as cinéticas dos ensaios com células imobilizadas, considerando-se apenas uma batelada. A operação do biorreator cesta em sistema de bateladas repetidas apresentou os maiores valores de produção da retamicina (em torno de 1,5 a 1,7 UA), porém sua operação foi possível por apenas três bateladas. O sistema contínuo operado com vazão específica de alimentação de 0,03 h-1, com células imobilizadas no biorreator coluna de bolhas, mostrou ser o mais adequado dentre todos os ensaios realizados com células imobilizadas, apresentando estabilidade na produção, em torno de 0,8 UA, durante 96 horas de alimentação (cerca de três tempos de residência). / The purpose of this study was to investigate the production of the antitumor antibiotic retamycin by immobilized cells of Streptomyces. olindensis ICB20 in bioreactors. Cells were immobilized by entrapment in Ca-alginate gel (3%) after being grown in Erlenmeyers (reactivation and pre-immobilization cultures). The average diameter of the Ca-alginate beads was 3.0 ± 0.2 mm. Aiming to compare different cell systems, immobilized cell cultures were carried out in a 2.4L working volume basket-type stirred tank reactor (BSTR) and a 1.6 L working volume bubble column reactor (BCR) in batch, repeated-batch and continuous modes. Free cell suspension cultures were also performed and the results obtained compared to those in immobilized cell systems. Different agitation rates (300 and 500 rpm) and air flow rates (0.4 and 1.0 v.v.m.) were employed in the BSTR immobilized cell experiments.The BCR cultures were conducted at 1.0, 2.0 and 3.0 v.v.m. The optimal operating conditions for the batch mode were used in the repeated-batch and continuous cultures. Immobilized cells were grown in continuous mode at feed dilution rates of 0.05 and 0.2 h-1 in the BSTR and at 0.015 and 0.05 h-1 in the BCR. The comparative evaluation of the batch cultures with free and immobilized cells showed that diffusion limitations had affected the kinetics of cell growth and retamycin production in the immobilized cell systems. The highest average values of retamycin content (from 1.5 to 1.7 AU) were achieved in repeated batch cultures conducted in the basket-type reactor (BSTR) in spite of a limited number of batches (3 batches). Of all the systems, the continuous cell immobilized culture carried out in the BCR at a dilution rate of 0.03 h-1 proved to be the most adequate for retamycin production as retamycin levels remained stable (around 0.8 AU) over 96 hours (about 3 residence times).

O objetivo deste projeto foi estudar a produção de retamicina em biorreatores de bancada por Streptomyces olindensis ICB20 em cultivos contínuos, visando avaliar a influência da freqüência de agitação (N=300, 500 ou 700rpm), da concentração de oxigênio dissolvido (OD=20, 50 ou 80%) e da velocidade específica de crescimento (µ=0,05, 0,15 ou 0,25 h-¹), segundo um planejamento fatorial completo (três fatores, N, OD e µ, em dois níveis) com seis repetições no ponto central. Os ensaios no ponto central serviram para avaliar a significância da curvatura nos modelos estatísticos e a variabilidade do processo. Buscou-se correlacionar a concentração de retamicina com estes fatores, com o diâmetro dos halos de inibição, determinados em testes de atividade biológica e com a morfologia do microrganismo, classificada em hifas, clumps ou pellets. Melhores resultados para a concentração de retamicina foram obtidos para N = 300 rpm e µ = 0,05 h-¹. A análise estatística mostrou que a concentração de oxigênio dissolvido não exerce influência sobre o processo na faixa estudada. Modelos estatísticos foram calculados, por regressão linear múltipla, para correlacionar a concentração celular, de retamicina, os fatores de conversão, a produção e as produtividades com os fatores N, OD e µ em unidades codificadas. A curvatura foi significativa (\'alfa\' = 10%) para a concentração de retamicina. Um modelo fenomenológico relacionando a concentração de retamicina à freqüência de agitação (N) e à velocidade específica de crescimento (µ) em estado estacionário foi determinado: Ret = (1005/N)*exp(-12,79*µ) R² = 0,97. Este modelo foi validado com ensaios além dos previstos no planejamento fatorial e também com os resultados obtidos por Pamboukian (2003). A correlação entre a concentração da retamicina e o diâmetro do halo de inibição (\'fi\'), determinada em testes de atividade biológica, foi: Ret = 0,2889 * \'fi\' - 1,4437 R² = 0,93 ( em mm). Com relação à morfologia, apenas a porcentagem de hifas, em relação a área total, sofreu influência de N, µ e das interações N*µ e N*OD* µ. Um modelo estatístico em unidades não codificadas foi calculado e combinado ao modelo fenomenológico. Este novo modelo considera a adição da porcentagem de clumps à de pellets, formando uma classe denominada de aglomerado (AGL): Ret = [(34 + 100*µ)/(83 - %AGL - 116* µ)] * (exp(-12,79*µ)) R² = 0,95. Foi possível correlacionar a produtividade específica de retamicina à área média dos aglomerados (AM): Pret / Xc = 0,015 * [((AM - 3,75)/AM) + exp(-0,3 * (AM - 3,75)2)] R² = 0,8. Foram testados diferentes corantes para identificar partes viáveis da célula. Apenas o corante BacLight® apresentou bons resultados, porém não foi possível concluir estes estudos por atraso no processo de importação dos filtros de fluorescência. / The aim of this project was to study the production of retamycin in bench-top bioreactors by Streptomyces olindensis ICB20 in continuous cultures in order to evaluate the influence of the agitation rate (N=300, 500 or 700 rpm), the dissolved oxygen concentration (20%, 50% or 80%) and the specific growth rate (µ=0.05, 0.15 or 0.25 h-¹). A full factorial experimental design (three factors, two levels) was used to perform these experiments, including six runs at the central point, to analyse the significance of the curvature of the statistical models and variability of the process. Models to calculate retamycin concentration in function of these factors, growth inhibition diameter, determined by disc diffusion tests and the morphology of the microrganism, grown as filaments, clumps or pellets were investigated. Best results were achieved for retamycin concentration when N = 300 rpm and µ = 0.05 h-¹. Statistical analysis showed no influence of the dissolved oxygen concentration in the range studied. Statistical models were calculated by multiple linear regression for the responses of interest (biomass, reatmycin and glucose concentration, conversion yields and productivities) in function of N, OD and µ in coded units. Curvature was significant (\'alfa\' = 10%) for retamycin concentration. A phenomenological model for retamycin concentration in function of the agitation rate (N) and specific growth rate (µ) in steady state was determined: Ret = (1005/N)*exp(-12.79*µ) R² = 0.97. This model was checked by calculation with data of all runs included in this project and also of some continuous experiments reported by Pamboukian (2003), when 0.05 µ 0.25 h-¹. A correlation between retamycin concentration as a function of the diameter of the growth inhibitory area (\'fi\') was determined (biological activity tests): Ret = 0.2889 * \'fi\' - 1.4437 R² = 0.93, ( in mm). It was not possible to establish a correlation between either clumps or pellets percentage and the factors of the experimental design. Filaments percentage was related to N, µ and the interactions N*µ and N*OD* µ. A statistical model in uncoded units was calculated and combined with the phenomenological model. In this case the percentage of clumps was added to the percentage of pellets; this morphological class was identified as AGL: Ret = [(34 + 100*µ)/(83 - %AGL - 116* µ)] * (exp(-12.79*µ)) R² = 0.95. Another model relating the specific retamycin productivity to the average area of AGL was proposed: Pret / Xc = 0,015 * [((AM - 3.75)/AM) + exp(-0,3 * (AM - 3.75)2)] R² = 0.8. Different dyes were tested to identify non-viable cells. Good results were achieved using BacLight® . Unfortunatelly it was not possible to conclude these experiments due to some delay occurred in the process to import specific fluorescense filters.

Os micro-organismos são profícuas fontes de produtos naturais bioativos. Diversos fármacos de importância clínica são de origem microbiana, sendo que a maioria dos antibióticos usados clinicamente é produzida por actinobactérias, principalmente do gênero Streptomyces. A resistência a múltiplas drogas por microorganismos patogênicos e também pelas células tumorais leva à necessidade por novos fármacos antibacterianos e antitumorais. Actinobactérias endofíticas têm demonstrado grande potencial para a busca de produtos naturais bioativos. O presente trabalho relata o estudo químico de duas linhagens de actinobactérias endofíticas, Streptomyces sp. RTd 22 e Streptomyces sp RTd 31, isoladas das raízes de Tithonia diversifolia. As frações ativas nos ensaios biológicos foram fracionadas para a identificação dos compostos bioativos, sendo eles os antibióticos macrolídeos concanamicinas A (S31-1) e B (S31-2), anidro-agliconas das concanamicinas A (S31-3) e B (S31-4), todos produzidos por Streptomyces sp RTd31, e o ionóforo poliéter grisorixina (S22-2), produzido por Streptomyces sp. RTd22. Foi realizado o monitoramento da produção desses compostos bioativos por UPLC-MS através do modo SIM. As concanamicinas A e B tiveram um máximo de produção com 96h, já a grisorixina obteve um máximo com 192h. Outros compostos identificados por desreplicação dos extratos butanólicos de ambas as actinobactérias foram os sideróforos norcardamina (S31-7) e desoxi-nocardamina (S31-8), já o sideróforo desferrioxamina B (S31-9) foi identificado apenas nos extratos butanólicos de Streptomyces sp RTd31. Experimentos de variação do meio de cultivo e co-cultura com bactérias patogênicas foram empregados a fim de estimular a biossíntese de novos compostos, porém nenhum novo metabólito foi identificado. O sequenciamento genético da actinobactéria Streptomyces sp. RTd22 permitiu verificar a presença de vários clusters biossintéticos nesse micro-organismo através da análise feita pelo antiSMASH. Foi possível identificar o cluster da himastatina (S22-4) e da coeliquelina (S22-5), sendo que ambos os compostos não foram biossintetizados nas condições de cultivo utilizadas. O cluster biossintético da grisorixina foi determinado e o experimento de recombinação homóloga para a deleção do gene análogo a flavina mono-oxigenase da nigericina nigC foi realizado. Dois mutantes foram obtidos e um deles foi cultivado para a análise do perfil metabólico por espectrometria de massas. Não houve a produção da grisorixina nem do seu possível precursor pelo mutante, mas outros metabólitos foram produzidos / Microorganisms are prolific sources of bioactive natural products. Several clinically important drugs have microbial origin, and most of the therapeutically used antibiotics are produced by actinobacteria, mainly from the genus Streptomyces. The multidrug resistance observed in pathogenic microorganisms and tumor cells lead to the need for new antibacterial and antitumor drugs . Endophytic actinobacteria have shown great potential in the search for bioactive natural products. This work describes the chemical study of two endophytic actinobacteria strains: Streptomyces sp. RTd 22 and Streptomyces sp RTD 31, isolated from Tithonia diversifolia roots. Active fractions in biological assays were further fractionated for identifying the bioactive compounds, which are: the macrolide antibiotics concanamycins (S31-1) and B (S31-2), anhydrous aglycones of concanamycins A (S31-3) and B (S31-4), all four produced by Streptomyces sp. RTd31, and the ionophore polyether grisorixin (S22-2), produced by Streptomyces sp. RTd22. The production of these bioactive compounds was monitored by UPLC-MS via the SIM mode. Concanamycins A and B had maximum production at 96 h, and grisorixin at 192 h. Other compounds identified by the dereplication of buthanolic extracts of both actinobacteria were the siderophore norcardamine (S31-7) and deoxy-nocardamine (S31-8), the siderophores desferrioxamine B (S31-9) was identified only in buthanolic extracts of Streptomyces sp RTd31. Experiments varying media and co-culture were tested to stimulate the biosynthesis of novel compounds, but nothing new was identified. By genome sequencing of Streptomyces sp RTd22 and antiSMASH analysis it was possible to verify the presence of several biosynthetic clusters in the genome of this strain. It was possible to identify the biosynthetic clusters of himastatin (S22-4) and its analogous compound coelichelin (S22-5); however, these compounds were not biosynthesized in the culture conditions used. The grisorixin biosynthetic cluster was determined, and homologous recombination was performed for deleting the analogue gene of nigericin flavin monooxygenase nigCI. Two mutants were obtained, and one of them was cultured for analyzing its metabolic profile by mass spectrometry. There was no production of grisorixin or its possible precursor by the mutant, but others compounds were produced.

O gênero Streptomyces tem sido estudado nas últimas décadas, pela sua capacidade de produzir vários produtos naturais bioativos. Os microrganismos produtores de antibióticos exigem um ou mais mecanismos de resistência durante a produção destes. Streptomyces olindensis DAUFPE 5622 produz o antitumoral cosmomicina D que faz parte da família das antraciclinas. Neste estudo, se apresenta um modelo de resistência que é expresso conjuntamente com a biossíntese do antibiótico. Os três mecanismos incluem uma bomba de efluxo, um mecanismo enzimático envolvido na resposta a espécies reativas de oxigênio, e um mecanismo envolvido no reparo do DNA, pela ação da proteína homóloga UvrA. Os genes de resistência de S. olindensis foram clonados e expressos em S. albus, contendo o plasmídeo de expressão PEM4A com o promotor constitutivo ermE*p. Avaliou-se a capacidade de resistência à diferentes concentrações das antraciclinas cosmomicina D e doxorubicina. A expressão de cada um dos mecanismos de resistência incrementou a resposta às antraciclinas. / Streptomyces produce various bioactive natural products and possess resistance systems for these metabolites, which are co-regulated with antibiotic biosynthesis genes. Antibiotic producer microorganisms require one or more self-resistance determinants to survival during antibiotic production. Streptomyces olindensis DAUFPE 5622 produces the antitumoral Cosmomycin D, a member of the anthracycline family. In this study we show the resistance genes in Cosmomycin D biosynthetic cluster that provide self-resistance, including an ATP-dependent efflux pump, resistance to DNA damage through UvrA class IIa protein, and response to reactive oxygen species by the enzyme Glutathione peroxidase. We cloned and expressed the resistance genes from S. olindensis in <i.S. albus, containing the expression plasmid PEM4A with the constitutive promoter ermE*p. We evaluated the capacity of resistance to different concentrations of anthracyclines Cosmomycin D and the commercial Doxorubicin. The expression of each resistance component increment the response to anthracyclines.

Orientador: Hélia Harumi Sato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-22T23:52:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Melo_RicardoRodriguesde_M.pdf: 1621799 bytes, checksum: 14182717e9ba5de8c1d5014f330c1b6c (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Transglutaminase é uma enzima capaz de catalisar a formação de ligações cruzadas intra- e intermoleculares entre proteínas, peptídeos e aminas primárias por meio de ligações covalentes entre resíduos de lisina e glutamina. Desta forma, transglutaminase pode ser utilizada em diversos setores industriais para o desenvolvimento de novos produtos ou para a modificação de suas características. A linhagem B6 isolada de amostra de solo coletada na região do Estado de Minas Gerais foi identificada como tendo características morfológicas típicas de actinomicetos e pela análise da região 16S rRNA há colocou na subclasse Streptomyces próximo a linhagem Streptomyces angustmycinicus NBRC 3934T. A fim de aumentar a produção de transglutaminase (2,75 U/mL) pela linhagem Streptomyces sp. B6, o meio de fermentação foi submetido a processos de otimização. Como primeiro passo da otimização, o crescimento do micro-organismo e a produção da enzima foram estudados através de uma pré-seleção de fontes de carbono, nitrogênio e sais no meio de produção. Após as análises das diferentes fontes, um delineamento experimental do tipo Plackett-Burman foi utilizado para a seleção dos componentes do meio de cultivo que afetam a produção de transglutaminase. Os resultados do delineamento experimental indicaram que a produção de transglutaminase foi influenciada negativamente pela peptona bacteriológica e MgSO4.7H2O, positivamente pelo amido de batata, glicose, peptona de caseína e KH2PO4.7H2O e não foi influenciada pelo farelo de soja, considerando um nível de confiança de 95%. A concentração de amido de batata foi fixada no maior nível testado no planejamento Plackett-Burman devido à gelificação do meio de fermentação em concentrações maiores. Assim, os três fatores que influenciaram a produção de transglutaminase (glicose, peptona de caseína e KH2PO4.7H2O) foram otimizados para obter o máximo de produção da enzima utilizando delineamento composto central. Sob a condição otimizada, a qual continha 25 g/L de farinha de soja, 35 g/L de amido de batata, 5 g/L de glicose, 24,5 g/L de peptona de caseína e 8 g/L de KH2PO4.7H2O, a atividade enzimática atingiu 6,13 U/mL, apresentando 125% à mais de atividade em relação á obtida no meio antes da otimização. A transglutaminase microbiana produzida pela linhagem Streptomyces sp. B6 exibiu atividade ótima em 45°C e em pH de 6,5 e 11,0. A enzima manteve-se estável na faixa de pH 3,0-11,0 durante 60 minutos à 40°C durante 3 horas. A transglutaminase não foi inibida por Ca2+, Na+, Co2+, Mn2+, K+, Mg2+, Ba2+, EDTA, L-cisteína e glutationa na concentração de 5 mM, mas foi inibida na presença de Hg2+, Cu2+, Zn2+ e Fe2+ na concentração de 5mM. A linhagem Streptomyces sp. B6 é uma nova fonte de transglutaminase com características interessantes para aplicações biotecnológicas / Abstract: Transglutaminase is an enzyme capable of catalyzing the forming intra-and intermolecular cross-linking between proteins, peptides and primary amines by covalent bonds between lysine and glutamine residues. Thus, transglutaminase can be used in food processing industries to develop new products and modify their characteristics. The B6 strain was isolated from soil sample collected in the region state of Minas Gerais was identified as having morphological characteristics typical of the actinomycetes, and the 16S rRNA analysis placed it in the Streptomyces subclade, closely related to Streptomyces angustmycinicus NBRC 3934T. In order to increase the transglutaminase production (2.75 U/mL) from Streptomyces sp. B6 strain, the fermentation medium was subjected to optimization processes. In the first step of optimization, the micro-organism growth and enzyme production were studied through a pre-selection of carbon, nitrogen and salts sources in the culture medium. After analysis of different sources, the Plackett¿Burman experimental design was used for screening the components of the culture medium that affect the transglutaminase production. Results of the experiment indicated that production of transglutaminase was negatively influenced by bacteriological peptone and MgSO4.7H2O, positively influenced by potato starch, glucose, casein peptone and KH2PO4.7H2O and was not influenced by soybean meal, considering 95% of confidence level. The potato starch concentration was fixed at the highest level tested in Plackett¿Burman design due to gelation of the fermentation medium in higher concentrations. Thus, the three factors that influence the transglutaminase production (glucose, casein peptone and KH2PO4.7H2O concentrations) were optimized to obtain the maximum transglutaminase production using central composite design. Under the proposed optimized condition, which contained 25 g/L soybean meal, 35 g/L potato starch, 5 g/L glucose, 24.5 g/L casein peptone and 8 g/L KH2PO4.7H2O, the enzyme activity reached 6.13 U/mL, which was 125% more than the activity in relative obtained medium before optimization. The microbial transglutaminase produced by Streptomyces sp. B6 strain exhibited optimal activity at 45 oC and at pH 6.5 and 11.0. The enzyme remained stable in the pH range from 3.0 - 11.0 for 60 minutes and at 40 oC temperature for 3 hours. The transglutaminase was not inhibited by Ca2+, Na+, Co2+, Mn2+, K+, Mg2+, Ba2+, EDTA, L-cysteine and glutathione in concentration 5 mM, but was inhibited in the presence of Hg2+, Cu2+, Zn2+ and Fe2+ in concentration 5 mM. In conclusion, Streptomyces sp. B6 strain is a new source of transglutaminase with interesting features for biotechnological applications / Mestrado / Ciência de Alimentos / Mestre em Ciência de Alimentos