O gênero Streptomyces constitui-se em um grupo diferenciado de procariotos fitopatogênicos, por serem morfologicamente similares aos fungos e produzirem diversos importantes metabólitos secundários. A sarna comum da batata é principal doença causada pelo gênero. O principal agente causal da doença, Streptomyces scabies, produz fitotoxinas denominadas concanamicinas, porém, não foi comprovada a importância da produção das mesmas na agressividade dos isolados de S. scabies. Dessa forma, neste trabalho procurouse avaliar a reação dos cultivares mais plantados no Brasil a isolados de S. scabies exibindo diferentes níveis de produção de concanamicinas. O nível de produção de concanamicinas A e B de dez isolados de Streptomyces spp. foi avaliado por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e dois isolados (produtor de alto nível da toxina; baixo produtor) foram selecionados e utilizados na avaliação da resistência de seis cultivares de batata em casa de vegetação. Vasos contendo o substrato esterilizado receberam a suspensão de esporos bacterianos junto com os tubérculos sadios no momento do plantio e após quatro meses, a severidade da doença foi avaliada. Os resultados demonstraram aumento na agressividade do isolado produtor de elevadas quantidades de concanamicinas apenas sobre os cultivares Mondial, Monalisa e Asterix. Por sua vez, os resultados da avaliação do nível de resistência ao patógeno demonstraram que os cultivares Monalisa, Ágata, Asterix e Cupido são suscetíveis e os cultivares Atlantic e Mondial mostraram-se resistentes aos dois isolados de Streptomyces spp. avaliados. Por outro lado, a fitotoxina taxtomina A é a toxina mais frequentemente produzida pelas espécies fitopatogênicas de Streptomyces spp. O estudo do mecanismo de ação desta fitotoxina poderá auxiliar no entendimento de sua contribuição no desenvolvimento da doença. A taxtomina A é uma fitotoxina não específica e causa efeitos semelhantes em plantas de diferentes famílias botânicas. Desta forma, modificações citológicas, ultraestruturais e bioquímicas induzidas pela taxtomina A foram analisadas em plântulas de sorgo. Os tecidos foram tratados com taxtomina A e avaliados após sete dias do tratamento. Observou-se desorganização em todas as células dos tecidos tratados com a taxtomina A. A membrana plasmática das células do mesofilo foliar foi retraída e destacada da parede celular em diversos pontos. Entretanto, o plasmalema não pareceu rompido. O efeito sobre a permeabilidade seletiva da membrana plasmática também foi avaliado bioquimicamente, onde foi observado aumentos na saída de eletrólitos. Os cloroplastos apresentaram deformações na superfície e perda de turgidez. Estas deformações provavelmente contribuíram para a redução do teor de clorofilas A e B. As plântulas também apresentaram elevado acúmulo de fitoalexinas do tipo deoxiantocianidinas. Desta forma, conclui-se que a taxtomina A age principalmente sobre a membrana plasmática e organelas membranosas. Em contrapartida, o acúmulo de fitoalexinas evidencia que concentrações mínimas desta toxina podem ser exploradas como eliciador da resposta de defesa em plantas. / The genus Streptomyces is a different prokaryote phytopathogen group, being morphologically similar to fungi and able to produce several important secondary metabolites. The potato common scabies is the main plant disease caused by the members of the genus. The main causal agent of the plant disease, Streptomyces scabies, is able to produce the phytoxins concanamycins. However, the importance of these toxins in the aggressiveness of S. scabies strains was not proven. This research aimed to evaluate the reaction of main potato cultivars used in Brazil to Streptomyces spp. strains, exhibiting different levels of concanamycins production. The toxin production by several strains was quantified by high performance liquid chromatography (HPLC) and two strains (higher and lower producers) were chosen and used for resistance evaluation of six potato cultivars under greenhouse. Pots containing sterile substratum received a suspension of bacterial spores and the healthy seed tubers at the same time. After four months, the level of disease was evaluated and the results showed increasing in aggressiveness for the higher concanamycins producer only in the Mondial, Monalisa and Asterix cultivars. For the two strains, the cultivars Atlantic and Mondial were resistant and the cultivars Monalisa, Cupido, Ágata and Asterix were susceptible. On the other hand, the thaxtomin A is the main phytotoxin of plant pathogenic Streptomyces spp. Therefore, the study of the thaxtomin A action mechanism is important to explain its contribution to disease development. The thaxtomin A is not a specific toxin and causes similar effect in several plants of different botanical families. Thus, the cytological, ultrastructural and biochemical modifications induced by thaxtomin A were evaluated in sorghum seedlings. Leaf tissues of seedlings were treated with high levels of thaxtomin A and evaluated 7 days after treatment. Cytological disorganization was observed in all treated cells. The plasmma membrane of the cells of immature leaves was detached from the wall in several places. However, plasmmalema did not seem degraded. The chloroplasts had showed significant deformations in the surface and volume reduction. Theses changes in chloroplasts probably contributed for the reduction of chlorophylls A and B levels. The sorghum seedlings also showed high phytoalexin accumulation (deoxiantocianydins) in response to thaxtomin A treatment. Thus, the thaxtomin A acts mainly on plasmma membrane and membranous organelles, causing plasmolises, cell disorganization, deformations in chloroplasts and chlorophyll reduction in sorghum seedlings. Finally, the accumulation of phytoalexins in response to thaxtomin A treatment points out it potential to induce resistance in plants.

Na literatura encontram-se referências de estudos envolvendo micro-organismos endofíticos, e mais recentemente estudos que avaliam a interação entre micro-organismos o que resulta na modificação, no tipo ou quantidade dos compostos que são produzidos. Neste trabalho foram realizados cultivos simples e mistos do fungo Colletotrichum boninense FLe 8.1 e da actinobacteria Streptomyces albospinus RLe 7, endófiticos isolados de Lychnophora ericoides que pertencem à coleção do Laboratório de Química de Microorganismos (LQMo) da FCFRP-USP, com o objetivo de aumentar suas capacidades de produção de novos compostos com atividade biológica. O cultivo misto, ou co-cultivo, é uma estratégia que tem sido usada para o acesso aos produtos naturais de origem microbiana. Existem poucos relatos de compostos com atividade biológica isolados a partir de S. albospinus e não há relatos de metabólitos secundários obtidos a partir de C. boninense. Nenhum desses micro-organismos tem sido descrito como endofítico na literatura e não existem relatos sobre co-cultivos envolvendo qualquer um deles na busca de compostos bioativos. Juntando as informações geradas através das diferentes técnicas de detecção utilizadas, como TLC, HPLC-DAD, GC-MS, ESI-MS, RMN e depois da análise correspondente, foi possível identificar e atribuir as estruturas de algumas substâncias conhecidas de origem microbiana como a mevalonolactona, o tirosol, a fisostigmina, a desferrioxamina E. ESI-MS foi utilizada para análises dos extratos brutos originados dos cultivos em meio arroz parbolizado permitindo visualizar compostos produzidos em baixas quantidades pelos micro-organismos na cultura simples quanto na co-cultura. Além disso, foram obtidos os perfis metabólicos desses micro-organismos a partir de cultivos em placa de Petri, possibilitando a detecção dos metabólitos em regiões específicas da interação microbiana, o que conduziu à identificação da fisostigmina e o seu análogo N-etilcarbamato produzidos pela actinobactéria, na interação com o fungo. Análises posteriores de MS sequencial permitiram obter perfis de fragmentação, os quais, juntamente com os dados dos íons detectados nos extratos, foram comparados com a informação disponível em bases de dados como DNP, METLIN e MassBank. Tais informações geradas a partir dessas análises permitiram sugerir possíveis compostos envolvidos na interação dos micro-organismos endofíticos mencionados. Foi sugerido que a fisostigmina, substância produzida pela actinobactéria S. albospinus RLe 7 e isolada nesse trabalho, poderia ter algum papel na inibição do crescimento do fungo C. boninense FLe 8.1 já que a inibição só foi observada quando cultivados ambos os micro-organismos na mesma placa de Petri. Porém, bioensaios com fisostigmina pura demonstraram que essa substância não possui atividade antifúngica per se, mas é possível que exista uma sinergia com outras substancias produzidas pela actinobactéria. Os resultados apresentados nesse trabalho demonstram a importância do uso de técnicas de detecção muito sensíveis, como a ESI-MS, na identificação de substâncias envolvidas na troca metabólica e permitiram gerar informações que serão utilizadas em estudos futuros utilizando esses micro-organismos endofíticos. / There are several studies involving endophytic microorganisms, and more recently some studies evaluate microbial interaction resulting in metabolic profiles modifications. In this study, simple and mixed cultures of the fungus Colletotrichum boninense FLe 8.1 and the actinobacteria Streptomyces albospinus RLe 7 were carried out. These endophytic microorganisms, isolated from Lychnophora ericoides, belong to the collection of the Laboratory of Microbial Chemistry (LQMo) of the FCFRP-USP. The main goal of this work was to increase the bioactive compounds production capacities. Co-culture, or mixed culture, is a recent strategy for accessing microbial natural products. There are few reports of bioactive metabolites from S. albospinus RLe 7 and there are no one about secondary metabolites obtained from C. boninense FLe 8.1. Neither the actinobacteria nor the fungus have been described as endophytic microorganisms and there are no co-culture studies involving these microorganisms in order to obtain natural products. Joining and analyzing all together the generated information from several detection techniques, such as TLC, HPLCDAD, GC-MS, ESI-MS, NMR, it was possible to identify and attribute the chemical structures of some known natural, such as mevalonolactone, tyrosol, physostigmine and deferrioxamine E. ESI-MS was used for extracts analysis from cultures in parboiled rice medium, allowing visualization of compounds produced in very low yields. Besides that, it was possible to obtain metabolic profiles from cultures in Petri dishes, leading to the detection of metabolites in specific regions of the microbial interaction. Physostigmine and its N-ethylcarbamate analogue were identified as actinobacteria metabolites in the interaction against the fungus. Posterior analysis by MS/MS allowed to obtain fragmentation profiles, which together with the ions detected from the extracts analysis, were compared by searching in databases, such as DNP, METLIN and MassBank. Such information allowed to suggest possible candidates for the compounds involved in the microbial metabolic exchange. It was hypothesized that physostigmine, isolated from the actinobacteria in this work, had a role in the fungal growth inhibition observed when both microorganisms were co-cultured. However, this substance did not show considerable antifungal activity when tested against C. boninense FLe 8.1, but it is possible that other compounds produced by this actinobacteria are acting in a synergistic way. The results showed here demonstrated the importance of very sensitive techniques, as ESI-MS, in the identification of molecules involved in the microbial metabolic exchange and will help in the generation of information for future studies involving those endophytic microorganisms.

A espécie Streptomyces olindensis DAUFPE 5622 produz o complexo antibiótico retamicina, que apresenta atividade contra leucemia em seres humanos mas possui limitações de uso devido ao seu grande efeito cardiotóxico. Uma linhagem mutante de S. olindensis, So20, obtida por tratamento da linhagem selvagem com MMS (metanossulfonato de metila), apresentou diferença qualitativa quanto à produção deste complexo antibiótico. O extrato metanólico das células desta linhagem mutante sofreu diversos tratamentos com solventes orgânicos e foi submetido a diversas técnicas de separação cromatográfica. Algumas substâncias foram parcialmente isoladas e foram submetidas a análise espectrométrica, que indicaram diferenças nas suas estruturas com relação ao complexo obtido da linhagem selvagem DAUFPE 5622. Algumas destas frações parcialmente purificadas da linhagem mutante foram testadas quanto a sua atividade antimicrobiana, contra Bacillus subtilis 007, e quanto sua capacidade de intercalação em fragmentos de DNA em gel de eletroforese, no ICB-USP, indicando resultados promissores. / Streptomyces olindensis DAUFPE 5622 species produces the antibiotic complex retamycin, which are active against human leukemia, but is still not used in human treatments due to its cardiotoxic effects. The S. olindensis mutant, So20, obtained by treatment with MMS (methyl methanesulfonate), showed qualitative differences in the antibiotic production. The methanolic extract from these mutant strains cells was purified by means of solvent partition and by chromatographic purification techniques. Some compounds were partially purified and the analysis of their spectrometric data indicated structural differences from that obtained from DAUFPE 5622 strains. Some of these partially purified substances from mutant strains were tested for their antimicrobian activity, against Bacillus Subtilis 007, and for their DNA intercalation ability on eletroforesis gel, in the ICB-USP laboratories, showing promising results.

O ácido clavulânico (AC) é um potente inibidor de β-lactamases utilizado na área médica. Métodos alternativos, econômicos e simples para sua purificação são de grande interesse. Este trabalho objetivou produzir e extrair AC de Streptomyces spp. por fermentação extrativa utilizando sistema de duas fases aquosas (SDFA) - polietileno glicol (PEG)/sais fosfato. Foi selecionado o melhor produtor de AC entre sete linhagens de Streptomyces spp. Avaliou-se a influência de cinco fatores no cultivo do melhor produtor em frascos agitados (pH, temperatura, velocidade de agitação, concentrações das fontes de nitrogênio e de carbono), utilizando planejamento experimental estatístico. Definidas as melhores condições de cultivo, foram estudadas a produção e a extração do AC em fermentação extrativa utilizando SDFA em frascos agitados e em sistema descontínuo utilizando biorreator. Em biorreator também foram realizados o estudo termodinâmico do processo de fermentação nas condições ótimas obtidas nas etapas anteriores e a determinação do coeficiente volumétrico de transferência de massa (kLa), comparando os sistemas de fermentação no meio de cultivo simples (SF) e fermentação extrativa utilizando sistema SDFA PEG/sais fosfato (SFE) sem e com crescimento microbiano. A linhagem de Streptomyces selecionada como a melhor produtora de AC foi a DAUFPE 3060, a qual apresentou a maior produção desse inibidor, 494 mg/L em 48h, em frascos agitados nas condições: pH 6,0, 32°C, 150 rpm, 5 g/L de glicerol e 20 g/L de farinha de soja. Após a etapa de otimização realizada para o estudo da temperatura e da concentração de farinha de soja, variáveis mais significativas no estudo de seleção, a temperatura e a concentração de farinha de soja ótimas, foram 32°C e 40 g/L, respectivamente, com produção de 629 mg/L de AC em 48h. O estudo termodinâmico confirmou que a temperatura de 32°C é a máxima de produção do AC; após esse valor, inicia-se, gradualmente, a degradação do AC. No estudo da determinação do coeficiente de transferência de massa, kLa, sem crescimento microbiano, observaram-se valores maiores de kLa para o SF, devido à viscosidade do PEG utilizado no SFE. A massa molar do PEG e a velocidade de agitação foram as variáveis que mais influenciaram na extração de AC no SFE em frascos agitados, apresentando comportamento semelhante em biorreator. E, finalmente, o estudo da transferência de oxigênio do SFE utilizando SDFA com crescimento microbiano foi avaliado para otimizar a produção e a extração de AC. Os resultados obtidos demonstraram que existe uma faixa ideal de velocidade de agitação e de aeração para evitar o rompimento celular e aumentar a recuperação de AC. / Clavulanic acid (CA) is a potent inhibitor of β-lactamases used in the medical field. Alternative methods, economic and simple purification are of great interest. This PhD project aims to produce and extract clavulanic acid of Streptomyces spp. By extractive fermentation using aqueous two-phase system (ATPS) - Polyethylene glycol (PEG)/phosphate salts. The best producer of clavulanic acid among seven strains of Streptomyces spp was selected. The influence of five factors in the cultivation of the best producer in flasks (pH, temperature, agitation velocity, concentrations of nitrogen and carbon sources) using statistical experimental design was evaluated. Defined the best cultivation conditions, the production and extraction of clavulanic acid by extractive fermentation using ATPS in flasks and in a batch system using a bioreactor was analyzed. In batch system using a bioreactor were also carried out the thermodynamic study of the fermentation process in optimum conditions determined in previous steps and also determined the volumetric mass transfer coefficient (kLa) comparing the fermentation systems in simple culture medium (SF) and in a extractive fermentation using aqueous two-phase system (ATPS) PEG/phosphate salts (SEF) medium with and without microbial growth. A strain of Streptomyces spp. selected as the best producer of AC was DAUFPE 3060, which showed the highest production of this inhibitor, 494 mg/L at 48h, in flasks under the conditions of pH 6.0, 32 °C, 150 rpm, 5 g/L of glycerol and 20 g/L of soybean flour. After the optimization step, the most significant variables in the study selection, temperature and concentration of soybean flour, were studied. The optimal values were 32 °C and 40 g/L of temperature and soybean flour concentration, respectively, with production of 629 mg/L of CA after 48h of cultivation. The thermodynamic study confirmed that 32 °C is the maximum temperature production of CA, after this value, starts gradually, the degradation of CA. In the study of volumetric mass transfer coefficient, kLa, without microbial growth, showed higher values of kLa for the SF, because the high viscosity of the PEG used in the SFE. The PEG molar mas and agitation velocity were the variables that most influenced the extraction of CA in flasks using a SFE, with similar behavior in a bioreactor. Finally, the study of oxygen transfer rate in SFE using ATPS with microbial growth was evaluated to optimize the production and extraction of CA. The results showed that there is an ideal range of agitation and aeration to prevent cell disruption and increase the CA recovery.

Der Einfluss der Rhizosphärenbakterien Bacillus subtilis FZB 24, FZB 37, FZB 42, Bacillus pumilus RK 13 und Streptomyces graminofaciens und des Algenpräparates Goemar Fruton Spezial® (Ascophyllum nodosum) auf Wachstum, Ertrag und Toleranz gegenüber Fusarium spp. bei Spargel wurde untersucht. Es wurden mehrjährige Parzellenfeldversuche und Modellversuche unter kontrollierten Bedingungen mit natürlich Fusarium spp. belasteten Böden und mit speziellen Fusarium Erregern inokulierten Substraten durchgeführt. Die Analyse des verwendeten Nachbaubodens ergab eine wesentlich höhere Kontamination mit Fusarium spp. (56%) in Relation zum Fruchtfolgeboden (14%). F. oxysporum war die dominante Fusariumart. Desweiteren wurde eine ganze Reihe anderer Arten, wie z.B. F. acuminatum, F. culmorum, F. proliferatum und F. culmorum bestimmt, was die Komplexität der Wurzel- und Stängelfäuleerkrankung belegt. Analog zu diesem Ergebnis konnten im Vergleich zur Fruchtfolgevariante von den in dem Nachbauboden kultivierten Spargelpflanzen signifikant mehr Fusarium spp. (80%) isoliert werden. Das Wurzelwachstum war hier extrem reduziert. Unter diesen konduktiven Bedingungen gelang es durch Rhizombakterisierung (107 cfu/ml) mit B. subtilis FZB 42, eine signifikante Förderung des Wurzelwachstums relativ zur unbehandelten Kontrolle und zur B. subtilis FZB 37 Variante zu erzielen. In Pathogenitätstests konnten F. culmorum, F. oxysporum und F. proliferatum als bedeutende Spargelpathogene mit signifikant reduzierter Trieb- und Wurzelmasse nachgewiesen werden, während F. acuminatum nur geringe Symptome verursachte. Eine bakterielle Saatgutbeizung (108 cfu/ml) und zusätzliche präinfektionelle Gießapplikation (107 cfu/ml) konnte eine Infektion mit F. oxysporum f.sp. asparagi nicht verhindern. Dennoch waren die negativen Effekte im Vergleich mit der nicht bakterisierten Kontrolle in den B. subtilis Varianten FZB 24 und vor allem bei FZB 42 deutlich kompensiert. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass eine Resistenz- bzw. Toleranzinduktion ein potentieller Wirkmechanismus der Bakterien ist. In den Feldversuchen erbrachte eine Bakterisierung einjähriger Rhizome (107 cfu/ml) zur Pflanzung und ergänzende Gießbehandlungen (108 cfu/ml/1l/m) in den folgenden 2 Jahren eine tendenzielle Reduzierung der Trieblänge und des Triebdurchmessers, insbesondere in Kombination mit dem Algenpräparat. Einen eindeutigen Einfluss auf das Sortierungsergebnis konnte nicht nachgewiesen werden. Im Gegensatz hierzu resultierte eine Saatgutbakterisierung mit B. subtilis FZB 24 in einem generell geförderten Triebwachstum und einer signifikant gesteigerten Wurzelentwicklung. Auch die anderen Mikroorganismen erbrachten eine tendenzielle Wuchsförderung. Es konnte eine gesicherte Korrelation zwischen Wurzelmasse und Knospenanzahl ermittelt werden. Blattapplikationen mit Goemar Fruton Spezial® während der Hauptvegetationsphase hatten keinen Einfluss auf das Pflanzenwachstum. / The effects of the rhizobacteria Bacillus subtilis, Strain FZB 24, FZB 37and FZB 42, Bacillus pumilus RK 13, Streptomyces graminofaciens N6 and the alga Ascophyllum nodosum (Goemar Fruton Spezial®) on plant growth, yield and Fusarium spp. tolerance of Asparagus officinalis (L.) were investigated. The trials were carried out under field conditions over sev-eral years by sawing and planting and as pot trials in the greenhouse and climate chamber with soil naturally infested with Fusarium spp. and with steamed substrates inoculated with particularly Fusarium species. Asparagus replant soil was considerable higher infested with Fusarium spp. (56 %) than fresh soil without asparagus history (14 %). F. oxysporum was the most determined Fusarium species followed by F. redolens, F. acuminatum, F. culmorum, F. proliferatum, F. solani a.o.. That indicates the complex character of root and crown rot of asparagus. From asparagus plants cultivated in replant soil a significant higher rate of Fusarium isolations (80 %) could be worked out compared to the fresh soil treatment. The root growth in the contaminated soil was extremely reduced. In these conductive situation bacterial treatments with B. subtilis FZB 42 done as rhizom soaking (107cfu/ml) resulted in significantly increased root growth up to 32, 9 % related to the non treated control. B. subtilis FZB 37 was ineffective. F. oxysporum, F. culmorum and F. proliferatum showed a high pathogenicity to asparagus seedlings, manifested in significantly reduced fresh and dry weights of shoots and roots, while F. acuminatum caused only slight symptoms. None of the tested microorganisms applicated as seed coating (108 cfu/ml) and substrate drenching before pathogen inoculation (107 cfu/ml) could prevent seedlings from being infected by F. oxysporum f. sp. asparagi. The negative effects of infection are significantly compensated by Bacillus subtilis FZB 42 and FZB 24. The results support the conclusion, that induced tolerance is a potential mechanism of bacterial mode of action. Under field conditions rhizom bacterization of one year old asparagus plants (107 cfu/ml) before planting and additional soil drenching (108 cfu/ml/1,5l/m) during the following two years reduced shoot length, shoot diameter and yield, especially in combination with Goemar Fruton Spezial®. There was no remarkable influence on spear quality. Seed coating with B. subtilis FZB 24 (108 cfu/ml) and a soil drenching (108 cfu/ml/1l/m) in summer however re-sulted in higher shoots and significantly increased fresh weight and dry substance of roots. But also the other tested microorganisms showed a plant growth promoting trend. There was a significant positive correlation between root fresh weight and number of buds. By spraying the phylloclads four times during the main vegetation season the alga application only gave a slight improvement of plant growth in the field trials.

O ácido clavulânico (AC) é um potente inibidor de β-lactamases utilizado na área médica. Métodos alternativos, econômicos e simples para sua purificação são de grande interesse. Este trabalho objetivou produzir e extrair AC de Streptomyces spp. por fermentação extrativa utilizando sistema de duas fases aquosas (SDFA) - polietileno glicol (PEG)/sais fosfato. Foi selecionado o melhor produtor de AC entre sete linhagens de Streptomyces spp. Avaliou-se a influência de cinco fatores no cultivo do melhor produtor em frascos agitados (pH, temperatura, velocidade de agitação, concentrações das fontes de nitrogênio e de carbono), utilizando planejamento experimental estatístico. Definidas as melhores condições de cultivo, foram estudadas a produção e a extração do AC em fermentação extrativa utilizando SDFA em frascos agitados e em sistema descontínuo utilizando biorreator. Em biorreator também foram realizados o estudo termodinâmico do processo de fermentação nas condições ótimas obtidas nas etapas anteriores e a determinação do coeficiente volumétrico de transferência de massa (kLa), comparando os sistemas de fermentação no meio de cultivo simples (SF) e fermentação extrativa utilizando sistema SDFA PEG/sais fosfato (SFE) sem e com crescimento microbiano. A linhagem de Streptomyces selecionada como a melhor produtora de AC foi a DAUFPE 3060, a qual apresentou a maior produção desse inibidor, 494 mg/L em 48h, em frascos agitados nas condições: pH 6,0, 32°C, 150 rpm, 5 g/L de glicerol e 20 g/L de farinha de soja. Após a etapa de otimização realizada para o estudo da temperatura e da concentração de farinha de soja, variáveis mais significativas no estudo de seleção, a temperatura e a concentração de farinha de soja ótimas, foram 32°C e 40 g/L, respectivamente, com produção de 629 mg/L de AC em 48h. O estudo termodinâmico confirmou que a temperatura de 32°C é a máxima de produção do AC; após esse valor, inicia-se, gradualmente, a degradação do AC. No estudo da determinação do coeficiente de transferência de massa, kLa, sem crescimento microbiano, observaram-se valores maiores de kLa para o SF, devido à viscosidade do PEG utilizado no SFE. A massa molar do PEG e a velocidade de agitação foram as variáveis que mais influenciaram na extração de AC no SFE em frascos agitados, apresentando comportamento semelhante em biorreator. E, finalmente, o estudo da transferência de oxigênio do SFE utilizando SDFA com crescimento microbiano foi avaliado para otimizar a produção e a extração de AC. Os resultados obtidos demonstraram que existe uma faixa ideal de velocidade de agitação e de aeração para evitar o rompimento celular e aumentar a recuperação de AC. / Clavulanic acid (CA) is a potent inhibitor of β-lactamases used in the medical field. Alternative methods, economic and simple purification are of great interest. This PhD project aims to produce and extract clavulanic acid of Streptomyces spp. By extractive fermentation using aqueous two-phase system (ATPS) - Polyethylene glycol (PEG)/phosphate salts. The best producer of clavulanic acid among seven strains of Streptomyces spp was selected. The influence of five factors in the cultivation of the best producer in flasks (pH, temperature, agitation velocity, concentrations of nitrogen and carbon sources) using statistical experimental design was evaluated. Defined the best cultivation conditions, the production and extraction of clavulanic acid by extractive fermentation using ATPS in flasks and in a batch system using a bioreactor was analyzed. In batch system using a bioreactor were also carried out the thermodynamic study of the fermentation process in optimum conditions determined in previous steps and also determined the volumetric mass transfer coefficient (kLa) comparing the fermentation systems in simple culture medium (SF) and in a extractive fermentation using aqueous two-phase system (ATPS) PEG/phosphate salts (SEF) medium with and without microbial growth. A strain of Streptomyces spp. selected as the best producer of AC was DAUFPE 3060, which showed the highest production of this inhibitor, 494 mg/L at 48h, in flasks under the conditions of pH 6.0, 32 °C, 150 rpm, 5 g/L of glycerol and 20 g/L of soybean flour. After the optimization step, the most significant variables in the study selection, temperature and concentration of soybean flour, were studied. The optimal values were 32 °C and 40 g/L of temperature and soybean flour concentration, respectively, with production of 629 mg/L of CA after 48h of cultivation. The thermodynamic study confirmed that 32 °C is the maximum temperature production of CA, after this value, starts gradually, the degradation of CA. In the study of volumetric mass transfer coefficient, kLa, without microbial growth, showed higher values of kLa for the SF, because the high viscosity of the PEG used in the SFE. The PEG molar mas and agitation velocity were the variables that most influenced the extraction of CA in flasks using a SFE, with similar behavior in a bioreactor. Finally, the study of oxygen transfer rate in SFE using ATPS with microbial growth was evaluated to optimize the production and extraction of CA. The results showed that there is an ideal range of agitation and aeration to prevent cell disruption and increase the CA recovery.

Os compostos de origem microbiana tem readquirido interesse pela biodisponibilidade, especificidade de alvo e diversidade química, mas as vias biosintéticas permanecem crípticas em condições de cultura. Uma estratégia para expressa-las é a super-expressão de genes ativadores. O laboratório de Bio-Produtos no ICB na USP tem trabalhado com Streptomyces olindensis produtor da Cosmomicina D uma molécula com atividade antitumoral de interesse devido ao padrão de glicosilação. O genoma de S. olindensis foi sequenciado e submetido ao NCBI (JJOH00000000) e utilizando o software antiSMASH foram identificados 33 clusters envolvidos na produção de metabolitos secundários. Encontraram-se clusters gênicos para a produção de metabolitos como Melanina, Geosmina, entre outros. Além, foi realizada uma analise de genômica comparativa para caracterizar e anotar as 22 vias biossintéticas desconhecidas em S. olindensis. Finalmente, escolheram-se a via do aminociclitol e um Policetídeo Tipo I para a super-expressão de genes reguladores levando a detecção do composto sob condições de cultura. / Microbial metabolites regain interest due to its bioavailability, target specificity and chemical diversity, but the biosynthetic pathways remain silenced under culture conditions. A strategy to obtain them is the over expression of regulatory genes. Bio-products laboratory at USP has been working with Streptomyces olindensis, products of Cosmomycin D, an antitumoral molecule with a distinctive glycosylation pattern. S. olindensis genome was sequenced and submitted to NCBI (JJOH00000000) and employing antiSMASH server 33 secondary metabolite related clusters were identified. Known pathways were found such as genes for melanin production, Geosmin and others. Additionally, a comparative genomic approach was used to characterize the 22 biosynthetic unknown pathways described in S. olindensis. Subsequently, Aminocyclitol and Polyketide Type I were chosen to evaluated, over expressing the regulatory genes, leading to the compound detection in regular culture conditions.

A espécie Streptomyces olindensis DAUFPE 5622 produz o complexo antibiótico retamicina, que apresenta atividade contra leucemia em seres humanos mas possui limitações de uso devido ao seu grande efeito cardiotóxico. Uma linhagem mutante de S. olindensis, So20, obtida por tratamento da linhagem selvagem com MMS (metanossulfonato de metila), apresentou diferença qualitativa quanto à produção deste complexo antibiótico. O extrato metanólico das células desta linhagem mutante sofreu diversos tratamentos com solventes orgânicos e foi submetido a diversas técnicas de separação cromatográfica. Algumas substâncias foram parcialmente isoladas e foram submetidas a análise espectrométrica, que indicaram diferenças nas suas estruturas com relação ao complexo obtido da linhagem selvagem DAUFPE 5622. Algumas destas frações parcialmente purificadas da linhagem mutante foram testadas quanto a sua atividade antimicrobiana, contra Bacillus subtilis 007, e quanto sua capacidade de intercalação em fragmentos de DNA em gel de eletroforese, no ICB-USP, indicando resultados promissores. / Streptomyces olindensis DAUFPE 5622 species produces the antibiotic complex retamycin, which are active against human leukemia, but is still not used in human treatments due to its cardiotoxic effects. The S. olindensis mutant, So20, obtained by treatment with MMS (methyl methanesulfonate), showed qualitative differences in the antibiotic production. The methanolic extract from these mutant strains cells was purified by means of solvent partition and by chromatographic purification techniques. Some compounds were partially purified and the analysis of their spectrometric data indicated structural differences from that obtained from DAUFPE 5622 strains. Some of these partially purified substances from mutant strains were tested for their antimicrobian activity, against Bacillus Subtilis 007, and for their DNA intercalation ability on eletroforesis gel, in the ICB-USP laboratories, showing promising results.

Ce travail décrit l’analyse de la distribution des flux de carbones au sein de deux souches de Streptomyces coelicolor A3(2) : la souche sauvage nommée M145 et son mutant M1146 incapable de produire les antibiotiques actinorhodine, undecylprodigiosine, et l’antibiotique dépendant du calcium. Metabolite Balance Analysis et Isotopomer Balance Analysis sont mis en œuvre pour proposer un modèle de distribution des flux de carbones de S. coelicolor en phase exponentielle de croissance. Les souches M145 et M1146 sont cultivées dans un milieu minimum limitant en azote et leurs comportements métaboliques sont comparés. Dans la souche non productrice M1146, un taux de croissance plus élévé, un flux plus important dans la voie des pentoses phosphates, un flux plus faible au niveau du cycle de Krebs ainsi qu’une activité respiratoire plus faible sont mis en évidence. Cela traduit le coût énergétique important associé à la production d’actinorhodine par M145. De plus, ce travail propose un rôle important de la nicotinamide nucléotide transhydrogénase pour le maintien de l’homéostasie du NADPH lors de la production d’actinorhodine par M145. Comme il existe de bonnes corrélations entre les données expérimentales et celles issues de la modélisation au niveau des bilans carbones, des bilans de pouvoir réducteur et des échanges gazeux, il sera intéressant d’utiliser cette modélisation avec la technique de Flux Balance Analysis pour prédire les variations de la distribution des flux de carbones dans des mutants de S. coelicolor pour lesquels des gènes auraient été sur-exprimés ou délétés. / This work describes an analysis of carbon flux distribution in two strains of Streptomyces coelicolor A3(2), namely the wild type strain M145 and its derivative M1146 that is no longer able to produce the antibiotics actinorhodin, undecylprodigiosin and the calcium dependent antibiotic. Metabolite Balance Analysis and Isotopomer Balance Analysis were used to propose a model for carbon flux distribution in S. coelicolor during the exponential phase of growth. Strains M145 and M1146 were grown under nitrogen limitation in minimal medium and their metabolic behaviour were compared. In the non-producing strain M1146, a higher growth rate, a higher flux via the pentose phosphate pathway, a decreased flux through the TCA cycle and a decreased respiratory activity were evidenced. This highlighted the high energetic cost for actinorhodin production in M145. In this paper, we also propose a key role for the nicotinamide nucleotide transhydrogenase in NADPH homeostasis in M145 during actinorhodin production. As there are good correlations between experimental data and the model in terms of carbon balance, reducing power balance and gas exchanges, this model will be of great interest for Flux Balance Analysis to predict carbon-flux distribution changes in S. coelicolor strains in which gene are deleted or overexpressed.

No description available.