Les Streptomyces sont des bactéries communes des écosystèmes forestiers tempérés. Elles sont présentes au sein de différentes niches écologiques telles que la rhizosphère des plantes, la mycorhizosphère ou encore la minéralosphère. Dans ces niches, elles interagissent avec de nombreux autres genres bactériens et différents champignons symbiotiques, pathogènes et saprophytes. Nous avons entrepris une étude sur l'interaction entre deux souches bactériennes modèles du sol Streptomyces ambofaciens ATCC23877 et Pseudomonas fluorescens BBc6R8. Des expériences de cocultures sur différents milieux gélosés ont révélé que chaque souche bactérienne affecte la production de métabolites secondaires chez l'autre partenaire. Ainsi, P. fluorescens inhibe la capacité de S. ambofaciens à produire la kinamycine, un « effet ping-pong » a été mis en évidence. D'autre part, sur un milieu déficient en fer, P. fluorescens est capable d'utiliser les desferrioxamines et la coelicheline produites par S. ambofaciens en tant que xénosiderophores et ne produit alors plus ses propres sidérophores, la pyoverdine et l’énantio-pyochéline. Enfin, au cours des études d’interactions, P. fluorescens BBc6R8 s’est révélée capable d’inhiber la production du pigment bleu diffusible γ-actinorhodine chez Streptomyces coelicolor A3(2) M145 en acidifiant le milieu par la production d’acide gluconique. L’ensemble de ces résultats nous permet de proposer différentes hypothèses sur l’importance écologique de ces trois interactions en les replaçant au sein du contexte de l’écosystème sol / Streptomyces are common bacteria in temperate forest ecosystems, which inhabit various ecological niches such as plant rhizosphere and mycorrhizosphere, as well as mineralosphere. In these niches, they interact with many other bacterial genera and different symbiotic, pathogenic and saprotrophic fungi. We have initiated a study on interaction between two soil model bacteria strains Streptomyces ambofaciens ATCC23877 and Pseudomonas fluorescens BBc6R8. Cocultures experiments on different agar media have revealed that each bacteria affects the production of secondary metabolites in the other partner. Thus, P. fluorescens inhibits the ability of S. ambofaciens to produce kanamycin, a "ping-pong effect" was highlighted. On the other hand, on iron deficient medium, P. fluorescens is able to use the desferrioxamines and coelichelin produced by S. ambofaciens as xenosiderophores and does no longer produce its own siderophores, pyoverdin and enantio-pyochelin. In another way, during pairwise co-culture experiments, Pseudomonas fluorescens BBc6R8 was shown to prevent the production of the diffusible blue pigment antibiotic γ-actinorhodin by Streptomyces coelicolor A3(2) M145 by acidifying the medium through the production of gluconic acid. Other fluorescent Pseudomonas strains and the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa PAO1 also prevented the γ-actinorhodin production in a similar way. Altogether these results prompt us to propose some hypotheses on the ecological significance of these three interactions by replacing them in the soil ecosystem context

Les Streptomyces sont des bactéries de la rhizosphère qui contribuent à la fertilité des sols (recyclage de la matière organique), et à la croissance et la santé des plantes. Elles possèdent parmi les plus grands génomes bactériens (12 Mb) et présentent une variabilité génétique importante. Cette variabilité connue au niveau interspécifique n’a jamais été abordée à l’échelle de la population, c’est-à-dire entre individus sympatriques appartenant à la même espèce (souches sœurs) au sein de la même niche écologique. L’objectif de ce travail est de rechercher cette diversité dans les populations de l’écosystème sol forestier, d’approcher sa dynamique et son rôle fonctionnel. Après séquençage et comparaison des génomes complets, nous avons observé une grande diversité génomique en termes de taille, de présence/absence d’éléments extrachromosomiques, mais également en terme de présence/absence de gènes le long du chromosome. Un grand nombre d’événements d’insertions et délétions (indels) comprenant de 1 à 241 gènes différencient les individus de la population. Au vu des liens phylogénétiques étroits entre les individus, l’ancêtre commun de la population est récent, aussi la diversité génomique résulterait d’un flux massif et rapide de gènes. La forte prévalence d’éléments conjugatifs intégrés dans la population suggère que la conjugaison est le moteur prépondérant de cette diversité génomique. La production différentielle de métabolites spécialisés (antibiotiques) a également été utilisée pour estimer l’impact de la diversité génétique sur le fonctionnement de la population. Nous avons pu montrer que cette production était liée à des gènes spécifiques de souches et qu’elle pouvait constituer un bien commun pour la population. Nous proposons que l’évolution rapide du génome participe au maintien des mécanismes de cohésion sociale chez ces bactéries du sol. / Streptomyces are rhizospheric bacteria that contribute to soil fertility (recycling of organic matter), plant growth and health. They have among the largest bacterial genomes (12 Mb) with a high genetic variability. The genome variability, observed at the interspecific level has never been addressed within a population, i.e. between sympatric individuals belonging to the same species (Conspecific strains) within the same ecological niche. The objective of this work was to investigate this diversity in the forest soil ecosystem, to estimate its dynamics and its potential functional roles. After sequencing and comparison of the complete genomes, we observed a wide genomic diversity in terms of size, presence/absence of extrachromosomal elements, but also in terms of presence/absence of genes along the chromosome. A large number of insertion and deletion events (indels) from 1 to 241 genes differentiate individuals in the population. Given the close phylogenetic relationship of these strains, the common ancestor of the population is recent, hence the genomic diversity would result from a massive and rapid gene flux. The high prevalence of integrative and conjugative elements in the population suggests that conjugation could act as a driving force of this diversity. Differential production of specialized metabolites (antibiotics) was also used to estimate the impact of genetic diversity on population’s ecology. We were able to show that this production was linked to strain specific genes and that it may constitute a « public good » for the population. We propose that the rapid evolution of the genome contributes to the maintenance of social cohesion mechanisms within these soil bacteria.

Les phytases hydrolysent les phytates représentant la forme majeure de stockage du P dans les céréales. Ces phytates sont aussi des facteurs anti-nutritionnels qui chélatent les cations réduisant leur absorption. Dans le premier volet de cette thèse, une nouvelle souche bactérienne produisant une phytase extracellulaire a été isolée et identifiée comme Bacillus amyloliquefaciens US573. L’enzyme «PHY US573» a été purifiée et caractérisée en comparaison avec deux phytases commerciales Ronozyme PL et Natuphos. PHY US573 se distingue par sa forte thermostabilité en présence de calcium. En outre, PHY US573 se caractérise aussi par une tolérance remarquable aux sels comme le NaCl et LiCl. L’ensemble de ces propriétés montre que PHY US573 pourrait être une candidate intéressante pour des applications en alimentation animale ou en agriculture pour améliorer la biodisponibilité du P-phytique pour les plantes. Dans le deuxième volet, la souche Streptomyces sp. US42 produisant une activité phytase extracellulaire a été sélectionnée. L’enzyme «PHY US42» a été purifiée et caractérisée. PHY US42 est calcium dépendante également une grande stabilité en présence de sels biliaires et des protéases digestives. La modélisation moléculaire de PHY US42 indique qu'elle appartient au groupe des β-propeller phytases qui sont généralement calcium-dépendantes. Vu ses propriétés biochimiques intéressantes, PHY US42 constitue une bonne candidate comme additif dans les aliments pour animaux monogastriques en combinaison avec une histidine acide phytase. Enfin dans un troisième volet, nous nous sommes intéressés à l’étude de la régulation de l'expression du gène phytase de S. coelicolor M145 (sco7697) chez S. coelicolor M145, S. lividans TK24 ainsi que chez ses deux mutants ppk et phoP. Ainsi, en plus des boites pho localisées en amont de la région promotrice -35 siège de la régulation positive PhoP-dépendante, nous avons révélé pour la première fois que la RD localisée en aval de la région promotrice -10 est le siège d’une forte régulation négative par un répresseur inconnu. Ce dernier empêcherait l’activation PhoP-dépendante de l’expression du gène phytase. / Phytases hydrolyse phytate representing the major storage form of P in cereal. phytates are also anti-nutritional factors that chelate cations such as Ca²⁺, Mg²⁺, Fe²⁺, Z²⁺ reducing their absorption. The low bioavailability of phytic phosphorus in monogastric animals require their food supplementation with Pi to meet the needs of the animal in P. This creates an extra cost and increases the environmental pollution by the manure excretion highly charged phosphate. In the first part of this thesis, from soil samples taken near hot hydrothermal waters of the region Elhamma in southern Tunisian, a new bacterial strain producing extracellular phytase was isolated and identified as Bacillus amyloliquefaciens US573. The enzyme referred "PHY US573" was purified and characterized in comparison with two commercial acid histidine phytases Ronozyme PL and Natuphos. PHY US573 is calcium dependent and has an optimum activity at pH 7.5 (5 for Ronozyme and 5.5 for Natuphos) and 70°C (55°C for Ronozyme and Natuphos). PHY US573 is distinguished by its high thermostability, in fact, it keeps 93% of its activity after incubation for 10 min at 75°C in the presence of calcium while Ronozyme and Natuphos keep only 45% and 53% of their activity, respectively. This enzyme is specific for phytic acid and also has a very good stability at pH 3 to 9 and a perfect stability in presence of bile salts. In addition, PHY US573 is also characterized by a remarkable salt tolerance because it retains 80 to 95% of its activity in the presence of 20 g/l of NaCl and LiCl, respectively. All these properties shows that PHY US573 could be an interesting candidate for applications in feed industry alone or in combination with an histidine acid phytase. In a second part of this thesis, from the Streptomyces collection of LMB-CBS, a strain producing extracellular phytase activity was selected and identified as Streptomyces sp. US42. The enzyme "PHY US42" was purified and characterized. PHY US42 has a calcium-dependent activity (such as Bacillus phytases), optimally active at pH 7 and 65°C. PHY US42 is perfectly stable at pHs ranging from 5 to 10 and its thermal stability is greatly increased in the presence of calcium. Indeed, PHY US42 maintains 80% of its activity after 10 min of incubation at 75 °C in the presence of calcium. PHY US42 has also a high stability in the presence of bile salts and digestive proteases. Molecular modeling of PHY US42 indicates that it belongs to the β-propeller phytase group which are usually calcium-dependent. Given its interesting biochemical properties, PHY US42 which would operate mainly in the intestine, is a good candidate for use as an additive in agastriques fish food or in combination with an histidine acid phytase in feed industry. Finally in a third part, we are interested in studying the regulation of the expression of the phytase gene of S. coelicolor M145 (sco7697) in S.coelicolor M145, S.lividans TK24 and among its two mutants ppk and phoP. To do this, we merged the wild promoter regions (phyWT) or mutated (phym1, phym2, phym1+2) of sco7697 gene with the GUS reporter gene encoding ß-glucuronidase activity. Thus as expected, we demonstrated that the deletion of the PHO box located upstream of the -35 reduces the level of induction of sco7697 in conditions of Pi limitation. Moreover, we have revealed for the first time that the alteration of RD located downstream of -10 correlates with a dramatic increase of GUS expression when PhoP is present. Our results demonstrate that this RD is the seat of a strong negative regulation by an unknown repressor. This would prevent the PhoP-dependent activation of expression of the phytase gene.

Die Entwicklung des grampositiven Bodenbakteriums Streptomyces ist in einem komplexen Lebenszyklus koordiniert, bestehend aus drei Stufen: vegetativem Hyphenwachstum, Luftmycelbildung und Sporulation. C-di-GMP kontrolliert die Enwicklung über zwei Effektorproteine: dem Masterregulator BldD und dem Anti-Sigmafaktor RsiG. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das membranständige GGDEF-EAL Protein CdgC eine wichtige aktive Diguanylatzyklase (DGC) in S. venezuelae ist. Chromosomale Deletion von cdgC führte zu einer flachen, gräulichen Koloniemorphologie mit radialen Stegen und hydrophiler Oberfläche sowie zu frühzeitiger Sporulation ohne Lufthyphenbildung. Phänotypische Analysen zeigten, dass die DGC-Aktivität von CdgC essentiell ist für dessen biologische Rolle und deuten auf einen zusätzlichen Protein-spezifischen morphologischen Effekt von CdgC hin. CdgC-FLAG akkumuliert im Laufe des Lebenszyklus und scheint BldD-abhängig über eine c-di-GMP vermittelte Feedbackschleife reguliert zu werden. Frühere RNA-seq Daten, verifiziert für repräsentative Gene mittels qRT-PCR, deuten eine differentielle Expression der Bestandteile des hydrophoben Mantels als Ursache der Lufthyphendefizienz an. Konfokalmikroskopische Aufnahmen des bakteriellen Tubulin-Homologons FtsZ deuten einen c-di-GMP-sensitiven Einfluss von CdgC auf die Koordination der Zellteilung an. Zudem konnte nachgewiesen werden, dass CdgC mit sich selbst sowie drei potentiellen Membranproteinen interagiert. Demnach trägt CdgC zur Koordination von Zellteilungs- und hydrophoben Zelloberflächenproteinen bei und beeinflusst damit c-di-GMP-abhängig den Zeitpunkt der Sporenbildung. Insgesamt führt diese Studie CdgC als GGDEF-EAL-Tandemprotein mit spezifischem Knockout- Phänotyp ein, der von seiner DGC-Aktivität sowie seinem Membrananker bestimmt wird. Zudem ist CdgC, als Reaktion auf eine noch unbekannte Signalübertragungskaskade, an der Koordinierung von Zeitpunkt und Verlauf der Sporulation ausschlaggebend beteiligt. / The proliferation of Gram-positive soil bacteria Streptomyces is temporally and genetically coordinated with a complex developmental life cycle, including three main stages of differentiation: vegetative hyphal growth, formation of aerial mycelium and sporulation. The key factor of Streptomyces developmental control is c-di-GMP with to-date two identified effector proteins: the master regulator BldD and the anti-sigma factor RsiG. In this thesis, the membrane-associated GGDEF-EAL protein CdgC, was identified as a major active diguanylate cyclase (DGC) in S. venezuelae. Deletion of cdgC results in the unique flat gray colony morphology with radial wrinkles and a hydrophilic surface, that shows enhanced sporulation without forming aerial hyphae. Phenotypic analyses suggest, that the DGC activity is essential for its biological role, but hint to an additional protein specific role. The protein levels of CdgC-FLAG were found to accumulate during the life cycle of S. venezuelae. Further investigation of CdgC-FLAG in a strain carrying a DNA-binding deficient BldD_D116A allele indicated, that BldD represses the expression of CdgC in a regulatory feedback loop along with the DGCs CdgA, CdgB and CdgE. RNA‐sequencing data indicated that reduced expression levels of the major compounds of the hydrophobic sheath result in the initiation of sporulation out of the vegetative mycelium and were verified for representative examples via qRT-PCR. Confocal microscopic imaging of the bacterial tubulin homolog FtsZ indicated a contribution of CdgC via its DGC activity in coordination of the cell division. In addition, BTH screenings revealed self-interaction and identified three membrane associated interaction partners. In conclusion, this study introduces the GGDEF-EAL tandem protein CdgC, whose specific knockout phenotype is governed by its DGC activity and membrane association. CdgC seems to drive timing and mode of sporulation in response to an unknown signal to a major extend.

Lebewesen nutzen nukleotid-basierte sekundäre Botenstoffe um extra- und intrazelluläre Signale zur Induktion einer entsprechenden Zellantwort weiterzuleiten. Das zyklische Dinukleotid c-di-AMP steuert verschiedene physiologische Prozesse und ist für viele Bakterien unter bestimmten Bedingungen essentiell. Dieses Signalmolekül muss präzise reguliert werden, da seine Akkumulation oft toxisch ist. Diadenylatzyklasen mit einer DAC-Domäne synthetisieren c-di-AMP, welches von Phosphodiesterasen (PDE) mit DHH/DHHA1- oder HD-Domänen abgebaut wird. Streptomyceten sind im Boden lebende, Gram-positive Actinobakterien mit einem komplexen Lebenszyklus, während welchem sie vielzählige sekundäre Metabolite, inklusive Antibiotika, produzieren. Die Regulierung des zellulären c-di-AMP und seine Bedeutung in der Streptomyceten-Biologie waren zu Beginn dieser Studie weitgehend unbekannt. Zur c-di-AMP-Synthese nutzen Streptomyces die DAC DisA, besitzen aber keine der typischen PDEs sowie die meisten der bekannten c-di-AMP-bindenden Effektoren. Diese Arbeit zeigt, dass DisA die wichtigste c-di-AMP-Synthetase in Streptomyces venezuelae ist. AtaC wurde als eine PDE identifiziert, welche eine neue Klasse von c-di-AMP PDEs begründet. Während eine ataC-Deletion zu Störungen in Differenzierung und Wachstum in S. Venezuelae führt, führt die Inaktivierung von disA zur Sensitivität gegenüber erhöhten Konzentrationen von monovalenten Kationen im Medium. CpeA und CpeD wurden als erste c-di-AMP-bindende Proteine im Streptomyces Signalnetzwerk charakterisiert. Die entsprechenden Gene sind in Operons mit putativen Kation/Proton-Antiportern cpeB bzw. cpeE kodiert und die jeweiligen Genprodukte interagieren c-di-AMP-abhängig in vivo. Obwohl Deletion von cpe und Überexpression von cpeABC in S. venezuelae keine Phänotypen zeigten, verbesserte die CpeABC-Expression in Escherichia coli das Wachstum in Kalium-supplementierten Medien, was auf eine Funktion von cpe in der Regulation von Kalium hindeutet. / Nucleotide second messengers are used by all forms of life to transduce extra and intracellular signals and translate them into a physiological cell response. The cyclic dinucleotide c-di-AMP is a signaling molecule involved in diverse functions in bacterial physiology and is essential for many bacteria under certain growth conditions. However, this second messenger has to be tightly regulated since increased levels of c-di-AMP can be toxic. In many bacteria diadenylate cyclases with a conserved DAC domain synthesize c-di-AMP and phosphodiesterases (PDEs) with a DHH/DHHA1 or HD domain degrade it. Streptomyces spp. are soil-inhabiting gram-positive Actinobacteria characterized by a sophisticated developmental life cycle during which they produce various secondary metabolites, including antibiotics. The regulation and role of c-di-AMP is not well understood in Streptomyces biology. For c-di-AMP synthesis, streptomycetes utilize the DAC DisA but do not encode any canonical PDE and most of the known effector proteins for c-di-AMP signal transduction are absent. In this work, I demonstrated that DisA is the primary c-di-AMP synthetase in Streptomyces venezuelae and characterized AtaC as the founding member of a novel class of c-di-AMP-specific PDEs. In S. venezuelae, deletion of ataC interferes with development and growth, whereas disA inactivation affects bacterial survival under high ion osmotic stress conditions. Further, I identified CpeA and CpeD as the first c-di-AMP-binding proteins in Streptomyces. The respective genes are encoded in operons with the predicted cation/proton antiporters cpeB and cpeE, respectively, and the gene products interact in vivo in a c-di-AMP-dependent manner. Although neither cpe deletion nor overexpression of cpeABC produced a phenotype in S. venezuelae, expression of cpeABC in Escherichia coli improved growth in liquid media supplemented with potassium, suggesting that Cpe transporters are involved in potassium homeostasis.

Validamycin A (Val-A) is an aminoglycoside's antibiotic with anti-fungal activity. Val-A synthesized by Streptomyces hygroscopicus strain depending on the growth and development of this actinomyces. In this study, the effects of Mn and Zn on the antifungal activity and biomass of the Streptomyces hygroscopicus were conducted. The results showed that micronutrients Mn, Zn had significant effects on biomass as well as antifungal activity of strain Streptomyces hygroscopicus- DA15. With the addition of Mn at a concentration of 1μg/l of the nutrient medium, biomass of Streptomyces hygroscopicus was 2.85±0.02g/ml, the anti-fungal Rhizoctoniasolani (R. solani) round diameter reached 3.5±0.2cm. With the addition of Zn=3μg/l of the nutrient medium, biomass of Streptomyces hygroscopicus DA15 was 4.5±0.02g/ml, the anti-fungal R. solani round diameter reached 3.4±0.2cm. / Validamycin A (val-A) là một loại kháng sinh có khả năng kháng nấm, được tổng hợp bởi xạ khuẩn Streptomyces hygroscopicus và phụ thuộc vào quá trình sinh trưởng, phát triển của xạ khuẩn. Bài báo này đánh giá ảnh hưởng của nguyên tố vi lượng Mn, Zn đến hoạt tính kháng nấm Rhizoctonia solani (R. solani) và sinh khối của chủng Streptomyces hygroscopicus DA15. Khi bổ sung Mn vào môi trường nuôi cấy với nồng độ 1μg/l, sinh khối của Streptomyces hygroscopicus- DA15 đạt 2,85±0,02g/ml, đường kính vòng kháng nấm đạt 3,5±0,2cm. Bổ sung Zn vào môi trường nuôi cấy với hàm lượng Zn=3μg/l, sinh khối của Streptomyces hygroscopicus DA15 đạt 4,5±0,02g/ml và đường kính vòng kháng nấm đạt 3,4±0,2cm.

Research and application of microbial control of brown spot disease on the dragon fruit caused by fungi Neoscytalidium dimetiatum have important implications towards the safe and sustainable dragon fruit production. In this article, the research team has identified two strains of microorganisms capable of inhibiting fungi Neoscytalidium dimitiatum denoted A3, B7. Classification results determined that A3 belongs to Actinomyces group 3 with similarities of 100% (1500/1500 bp) with 16S rDNA segment of Streptomyces fradiae; B7 with similarities of 100% (1414/1414 bp) with 16S rDNA segment of bacteria Bacillus polyfermenticus and ensure biosafety when released into the environment. / Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật kiểm soát bệnh đốm nâu trên cây thanh long do nấm Neoscytalidium dimetiatum gây ra có ý nghĩa quan trọng hướng tới ngành sản xuất thanh long an toàn và bền vững. Trong bài viết này nhóm nghiên cứu đã xác định được hai chủng vi sinh vật có khả năng ức chế nấm Neoscytalidium dimitiatum cao kí hiệu là A3, B7. Kết quả phân loại xác định chủng A3 thuộc nhóm xạ khuẩn 3 tương đồng 100% (1500/1500 bp) với đoạn 16S rDNA của Streptomyces fradiae; chủng B7 tương đồng 100% (1414/1414 bp) với đoạn 16S của vi khuẩn Bacillus polyfermenticus và đảm bảo an toàn sinh học khi phóng thích ra môi trường.

Die Untersuchung der antimikrobiellen Fähigkeiten von Bodenisolaten ist von großer Bedeutung, um neue antibiotische Substanzen zu entdecken. Im Rahmen eines mikrobiologischen Praktikums wurden von Studierenden Bodenproben gesammelt und daraus 32 Streptomyces-Isolate gewonnen. Diese Isolate wurden auf ihre antimikrobiellen Leistungen untersucht und taxonomisch eingeordnet. Mittels Multi-Locus-Sequenz-Typisierung (MLST) wurden die 32 Bodenisolate der Gattung Streptomyces zugeordnet. Es gelang, alle Isolate erfolgreich dieser Gattung zuzuordnen. Allerdings konnte nicht für jedes Isolat eine eindeutige Spezieszugehörigkeit durch MLST festgestellt werden. Der Fokus lag insbesondere auf der detaillierten Analyse und Charakterisierung der Bodenisolate #4I1 und #12I2. Mittels Baumrekonstruktionen, basierend auf 16S-rRNA, MLST- und Gesamtgenomanalysen, wurden diese Stämme der Spezies Streptomyces silvae For3T zugeordnet. Das Genom des endophytischen Streptomyces sp. M3, welches aus der NCBI-Datenbank entnommen wurde, konnte ebenfalls dieser Spezies zugeordnet werden. Weiterhin wurde eine vergleichende Genomanalyse durchgeführt, um die genetische Struktur und die metabolischen Eigenschaften der S. silvae-Stämme zu erforschen. Diese umfassenden genetischen Untersuchungen trugen erheblich zum Verständnis der innerartlichen Variabilität und der adaptiven Merkmale der untersuchten Streptomyces-Stämme bei. Die physiologischen Profile der S. silvae-Stämme wurden mittels verschiedener Tests auf ihre antimikrobiellen Eigenschaften und ihre Anpassungsfähigkeit an verschiedene Umweltbedingungen untersucht. Besondere Aufmerksamkeit wurde dem Stamm S. silvae #4I1 gewidmet. Dieser wurde ausführlichen physiologischen Tests unterzogen, um eine präzise taxonomische Beschreibung als Repräsentant seiner Spezies zu ermöglichen. Die Ergebnisse der Studie zeigten, dass die S. silvae-Stämme ein breites Spektrum antimikrobieller Aktivitäten aufweisen. Die Ergebnisse der vergleichenden Genomanalyse verdeutlichten eine enge evolutionäre Verwandtschaft zwischen den S. silvae-Stämmen und offenbarten das Potenzial dieser Stämme zur Produktion von Sekundärmetaboliten, die zur Bekämpfung von pathogenen Mikroorganismen beitragen könnten.:Inhaltsverzeichnis___________________________________________________ I Abkürzungsverzeichnis______________________________________________ VI Zusammenfassung________________________________________________ VIII Summary_________________________________________________________ X Einleitung________________________________________________________ 1 Antibiotika________________________________________________________ 1 Innovative Lösungen zur Bekämpfung von Antibiotikaresistenzen_____________ 3 Identifizierung von Antibiotikaklassen mittels Ganzzell-Biosensoren____________ 4 Gattung Streptomyces______________________________________________ 6 1.4.1 Merkmale und Lebensweise von Streptomyces spp.___________________ 8 1.4.2 Genomstruktur von Streptomyces: Charakteristika und Besonderheiten___ 13 1.4.3 Genomische Organisation der Gene für Sekundärmetaboliten in Streptomyces spp. ____ 15 Zielstellung______________________________________________________ 17 2 Material und Methoden___________________________________________ 18 Verwendete Laborgeräte____________________________________________ 18 Materialien______________________________________________________ 19 2.2.1 Verbrauchsmaterialien_________________________________________ 19 2.2.2 Chemikalien_________________________________________________ 19 2.2.3 Medien_____________________________________________________ 21 2.2.4 Verwendete Bakterienstämme und Oligonukleotide___________________ 29 Physiogische Methoden____________________________________________ 31 2.3.1 Isolierung und Herstellung der Sporensuspensionen von Streptomyces spp. aus Bodenproben 31 2.3.2 Kultivierung der Streptomyces-Stämme____________________________ 32 2.3.3 Kultivierung der Biosensoren und Testorganismen___________________ 33 Methodische Herangehensweisen zur Evaluierung der antimikrobiellen Aktivitäten von Streptomyces spp. 34 2.4.1 Evaluierung des Hemmpotenzials von Streptomyces-Stämmen gegenüber ausgewählten Testorganismen 34 2.4.2 Biosensor-basierte Identifikation antibiotischer Substanzklassen_________ 36 Vergleichende Morphologie der S. silvae-Stämme 37 Physiologische Charakterisierung von S. silvae #4I1______________________ 37 2.6.1 Morphologie und Bildung melanoider Pigmente______________________ 37 2.6.2 Bestimmung der Nutzung verschiedener Kohlenstoffquellen sowie der Natriumchloridtoleranz und Lysozymresistenz_ 37 2.6.3 Evaluierung der pH-Präferenzen_________________________________ 38 2.6.4 Bestimmung der Hämolyseaktivität________________________________ 39 2.6.5 Bestimmung des Temperaturoptimums_____________________________ 39 2.6.6 Analyse der Mikromorphologie mittels Elektronenmikroskopie___________ 39 Molekularbiologische und genetische Methoden__ 40 2.7.1 Isolation genomischer DNA aus Bodenisolaten______________________ 40 2.7.2 Messung der Konzentration genomischer DNA______________________ 40 2.7.3 Gesamt-Genom-Sequenzierung__________________________________ 40 2.7.4 MLST (Multi-Locus-Sequenz-Typisierung)__________________________ 41 2.7.4.1 PCR (Polymerasekettenreaktion)_______________________________ 41 2.7.4.2 Gelektrophorese____________________________________________ 43 2.7.4.3 Extraktion und Aufreinigung der PCR-Produkte____________________ 43 2.7.4.4 Sequenzierung der PCR-Produkte______________________________ 43 Bioinformatische Methoden__________________________________________ 44 2.8.1 Anwendung der MLST-Methode bei den Bodenisolaten________________ 44 2.8.2 Bioinformatische Methoden zur vergleichenden Genomik der vier S. silvae-Stämme ___ 45 2.8.3 Bioinformatische Strategien zum Genomassembling__________________ 46 2.8.3.1 Optimierung der Sequenzdaten aus der Gesamtgenomsequenzierung__ 47 2.8.3.2 de-novo-Genomassembling___________________________________ 48 2.8.3.3 Mapping__________________________________________________ 48 2.8.3.4 Extraktion der Genomsequenz_________________________________ 50 2.8.3.5 Auswahl der Referenzsequenzen für die Contig-Verschmelzung (Scaffolding) _ 50 2.8.3.6 Genomrekonstruktion durch Scaffolding__________________________ 51 2.8.4 Bioinformatische Ansätze zur Ermittlung genomischer Kennziffern________ 52 2.8.4.1 Berechnung des ANI-Wertes___________________________________ 53 2.8.4.2 Berechnung des genomischen GC (Guanin-Cytosin)- und AT (Adenin-Thymin)-Gehaltes 53 2.8.4.3 Berechnung des GC-Versatzes_________________________________ 54 2.8.5 16S-rRNA-Analyse____________________________________________ 55 2.8.5.1 16S-rRNA-Sequenzextraktion__________________________________ 55 2.8.5.2 16S-rRNA-Prozessierung und Alignment__________________________ 56 2.8.5.3 Generierung des 16S-rRNA-Baums_____________________________ 57 2.8.6 AutoMLST_______________________________________________________ 59 2.8.7 Gesamtgenom-basierte Konstruktion eines phylogenetischen Baumes____ 60 2.8.8 Genomische Charakterisierung und Identifizierung relevanter Gencluster in den Genomen von S.silvae__ 61 2.8.8.1 Genannotation___________________________________________________ 61 2.8.8.2 Identifikation von BGCs_______________________________________ 62 2.8.8.3 Identifikation von Antibiotikaresistenzgenen_______________________ 63 2.8.9 Visualisierung____________________________________________________ 63 2.8.9.1 Erstellung zirkulärer Genomkarten______________________________ 64 2.8.9.2 MAUVE-Alignement__________________________________________ 64 3 Ergebnisse_____________________________________________________ 66 Systematische Taxonomie von Streptomyces-Bodenisolaten mittels MLST__ 66 Vielfalt und Spezifität von Streptomyces-Isolaten: Inhibitorische Kapazitäten und biosensorische Charakterisierungen_ 69 3.2.1 Bestimmung der inhibitorischen Kapazität von Streptomyces-Isolaten gegenüber ausgewählten Testorganismen__70 3.2.2 Systematische Evaluierung der biosensorischen Profile von 36 Streptomyces-Stämmen _ 73 Komparative Genomanalyse von S. silvae______ 78 3.3.1 Optimierung der Genomassemblierung der Streptomyces-Isolate #12I2 und #4I1 ______ 79 3.3.2 Phylogenetische Einordnung von S. silvae-Stämmen mittels 16S-rRNA-Analyse und MLST 81 3.3.3 GBDP-gestützte Analyse zur Aufklärung der Phylogenie von S. silvae-Stämmen_______ 82 3.3.4 Komparative Genomkartografie zur Visualisierung der genetischen Diversität in der S. silvae-Klade_ 84 3.3.5 Identifikation homologer Genombereiche___________________________ 88 3.3.6 Vergleichende Analyse der BGCs für Sekundärmetabolite in den vier S. silvae-Genomen 91 3.3.7 Komparative Analyse der Antibiotikaresistenz-assoziierten Gentypen in den S. silvae-Stämmen__ 95 Vergleichende physiologische Untersuchungen von S. silvae-Stämmen________ 99 3.4.1 Differenzierte Analyse antimikrobieller Aktivitäten von S. silvae-Stämmen in Abhängigkeit vom Nährmedium__ 99 3.4.2 Klassifikation der antimikrobiellen Sekundärmetaboliten von S. silvae-Stämmen unter Einsatz lumineszierender Biosensoren_101 3.4.3 Vergleichende Analyse der Makromorphologie von S. silvae-Stämmen auf diversen Nährmedien_ 103 Physiologische Charakterisierung von S. silvae #4I1_____________________ 106 3.5.1 REM-basierte Untersuchung der Mikromorphologie von S. silvae #4I1___ 107 3.5.2 Morphologische Analyse und Melanoidpigmentsynthese von S. silvae #4I1 auf ISP-Medien__ 108 3.5.3 Analyse des Verwertungsspektrums von Kohlenstoffquellen durch S. silvae #4I1 _____ 110 3.5.4 Bestimmung der Salztoleranz von S. silvae #4I1_____________________ 112 3.5.5 Einfluss des pH-Wertes auf das Wachstum von S. silvae #4I1__________ 113 3.5.6 Bestimmung der Lysozymresistenz bei S. silvae #4I1_________________ 114 3.5.7 Untersuchung der hämolytischen Aktivität von S. silvae #4I1___________ 116 3.5.8 Bestimmung der Temperaturpräferenz von S. silvae #4I1______________ 117 4 Diskussion____________________________________________________ 118 Genetische und Phänotypische Diversität der Streptomyces-Isolate__________ 119 4.1.1 MLST-basierte Einordnung und genetische Diversität der Streptomyces-Isolate _______ 119 4.1.2 Kultivierbarkeit der Streptomyces-Isolate__________________________ 119 4.1.3 Hemmeffekte von Streptomyces-Isolaten__________________________ 120 4.1.4 Biosensorische Profile und antimikrobielle Fähigkeiten von Streptomyces-Bodensolaten 123 Fokussierte Untersuchungen der S. silvae-Stämme_______ 125 4.2.1 Signifikanz der 16S-rRNA-Sequenzidentität in S. silvae_______________ 125 4.2.2 Etablierung von S. silvae als monophyletischen Gruppierung__________ 126 4.2.3 Sekundärmetabolismus und der Einfluss variabler Kulturbedingungen auf die antimikrobielle Aktivität und Biosensor-Induktion der S. silvae-Stämme__130 5 Ausblick______________________________________________________ 139 Literaturverzeichnis_______________________________________________ 142 Anhang________________________________________________________ 173

La thaxtomine A (TA) est la principale toxine produite par l'agent pathogène causant la gale commune Streptomyces scabies.La TA est nécessaire et suffisante à l'induction des symptômes de la maladie.La TA a un rôle d'inhibiteur de la synthèse de la cellulose et cause une inhibition importante de la croissance racinaire chez Arabidopsis thaliana. Ce projet avait pour objectif de caractériser un mutant d'Arabidopsis plus résistant à la TA, 9F32, dans le but de mieux comprendre le mécanisme d'action de la TA. 9F32 a démontré une résistance trois fois plus importante à la TA que Col 0, autant au niveau du phénotype global qu'au niveau de la croissance racinaire. Le taux d'entrée de la TA mesuré chez 9F32 est significativement inférieur à celui du type sauvage et comparable à celui d'un mutant présumé du transport de la toxine, txr1. Une analyse de micro-puces à ADN a montré la variation d'expression de 195 gènes chez 9F32, 174 gènes ont une expression augmentée et 21 sont réprimés (FC [supérieur ou égal] 2). Cette analyse a montré que le mutant présente une expression augmentée des réponses de stress, et plus particulièrement de la voie de réponse de défense de l'acide salicylique. 9F32 présente un phénotype et une expression transcriptionnelle partageant les caractéristiques d'une privation de phosphore, soit une petite taille et une production accrue d'anthocyanines. Finalement, l'infection du mutant 9F32 avec la bactérie S. scabies a montré une diminution des symptômes par rapport au type sauvage Col 0. Ces résultats suggèrent que la résistance à la TA procure un avantage important lors de l'infection. 9F32 est donc un outil adéquat pour l'étude du mécanisme de la TA et ses phénotypes laissent présager un nouveau mécanisme de résistance à la toxine.

Le rôle des protéines avec un motif TerD est depuis toujours insaisissable. La séquence en acides aminés qui correspond au motif TerD est répandue dans les génomes de plusieurs espèces bactériennes. Les recherches effectuées dans le cadre de ce doctorat avaient pour objectif d’identifier le rôle du gène tdd8 (SCO2368) qui code pour une protéine avec un motif TerD chez Streptomyces coelicolor. Sur la base d’une étude comparative du transcriptome de souches présentant une expression différentielle de tdd8, il a été possible de déterminer l’implication de tdd8 dans plusieurs systèmes de régulation. Les résultats obtenus ont permis d'établir que le niveau d’expression de tdd8 peut jouer un rôle dans le mécanisme de la différenciation morphologique et de la sporulation, dans le métabolisme de l’azote et dans l’équilibre redox. La protéine Tdd8 semble avoir un rôle dans divers processus cellulaires de par son implication dans l’homéostasie du calcium intracellulaire qui a été démontrée dans cette étude. Parmi les gènes qui semblent affectés par le taux d’expression de tdd8, ces recherches ont identifié un regroupement de gènes impliqués dans la réponse au stress redox. La plupart de ces gènes sont positionnés sur deux loci et leur expression implique un système de régulation analogue au régulon DosR retrouvé chez Mycobactérium tuberculosis. La croissance de la souche M145 de S. coelicolor en conditions de stress (hypoxie et présence d’oxyde nitrique) a permis de confirmer l’induction de ces gènes et des recherches bioinformatiques ont permis d’identifier un motif de liaison DosR dans les séquences qui précèdes la région codante de plusieurs gènes situés dans les deux loci identifiés. Les recherches ont également permis une meilleure caractérisation du métabolisme de l’azote et notamment une implication de tdd8 dans la régulation de ce métabolisme. Ces travaux s’inscrivent dans un processus de recherche fondamentale qui permet de mieux comprendre le rôle des protéines avec un motif TerD.