Made available in DSpace on 2016-12-23T13:56:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao de Elisa Rabello Laignier.pdf: 3953920 bytes, checksum: ff30b5335f851f01e5d5f99a62c85930 (MD5) Previous issue date: 2011-03-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os métodos de Baermann-Moraes e Koga ágar, são os mais sensíveis para identificação de larvas de Strongyloides stercoralis nas fezes, mas exigem que as mesmas sejam frescas e com larvas vivas. Neste trabalho, apresentamos um método de sedimentação simples, que permite avaliar uma grande amostra de fezes, com exame de todo o sedimento obtido, utilizando microscópio invertido. Objetivos. Desenvolver e avaliar uma metodologia de diagnóstico de larvas de S. stercoralis a partir da sedimentação espontânea de fezes, examinando todo o sedimento ao microscópio invertido e comparar a metodologia proposta com o método de Hoffman, Pons e Janer (HPJ) e com o método de Baermann-Moraes, considerado de alta sensibilidade para diagnóstico de larvas de S. stercoralis. Material e Métodos. Para avaliar a eficácia da técnica proposta, foram realizadas duas observações experimentais: (a) utilização da técnica em laboratório de rotina que realizava os exames coproparasitólogicos pelo método de Hoffman, Pons & Janer; (b) realização simultânea, na mesma amostra, do método proposto e do método de Baermann-Moraes, para comparação. Para a primeira observação, a técnica proposta foi realizada no laboratório de rotina do Hospital Cassiano Antônio de Moraes (HUCAM) e no Hospital Fundação Concórdia, de Santa Maria de Jetibá. Foram examinadas 221 amostras de fezes de pacientes atendidos nos ambulatórios do HUCAM ou internados, que também foram rotineiramente examinadas pelo método de sedimentação (HPJ). No Hospital Fundação Concórdia em Santa Maria de Jetibá, foram avaliadas simultaneamente 102 amostras consecutivas de pacientes atendidos nos ambulatórios da fundação. Para a segunda observação, foram analisadas 112 amostras de pacientes internados e atendidos no HUCAM pelo método do microscópio invertido e pelo Baermann-Moraes. As amostras foram pesadas e homogeneizadas com água corrente e bastão de vidro, no próprio recipiente e em seguida, tamisadas em gaze em um cálice de sedimentação de 250 ml. Após uma hora, as amostras foram lavadas, com água corrente e sedimentadas por mais uma hora. Todo o sedimento (aproximadamente 15 ml), acrescido de duas a três gotas de lugol, foi colocado em uma câmara de vidro de 12x8x0,5 cm, coberta com lâmina de vidro com mesma superfície e examinada em microscópio invertido, com objetivas de 4X e 10X. Toda a câmara foi analisada, sendo contadas as larvas encontradas. Resultados. Das 221 amostras analisadas no Laboratório do HUCAM, larvas de S. stercoralis foram identificadas em 20 (9,05%) casos, enquanto o HPJ só identificou 9 (4,07%). Das 102 do Hospital Fundação Concórdia, onde a identificação de larvas nos seis meses anteriores não passou de 1,5%, 10 amostras foram positivas pelo exame do sedimento no microscópio invertido (9,8%). Das 112 amostras utilizadas para comparação com o Baermann-Moraes, 11 (9,82%) amostras foram positivas no exame do sedimento ao microscópio invertido, as quais foram também positivas no método de Baermann-Moraes. Conclusão. O método é simples, com as seguintes vantagens: (a) todo o sedimento obtido é examinado de uma só vez, permitindo identificar todas as larvas nele existentes; (b) como a quantidade de fezes examinada é grande (maior do que as 8 a 10g do Baermann-Moraes), a probabilidade de encontrar larvas aumenta, mesmo em casos com baixa carga parasitária; e (c) permite a identificação de larvas mortas, ao contrário do método de Baermann-Moraes, podendo, portanto ser aplicado em fezes preservadas com fixadores como formol tamponado ou MIF / The methods of Baermann-Moraes and Koga agar, are the most sensitive to identify Strongyloides stercoralis larvaes in stool, but they require a fresh stool. We present a simple sedimentation method, which allows to evaluate a large sample of feces, using an inverted microscope to observe the sediment obtained. Objectives. To develop and evaluate a modified methodology to identify larvae of S. stercoralis from the sedimentation of feces, by examining all the sediment using an inverted microscope and to compare the proposed method with the Hoffman, Pons and Janer method (HPJ) and the Baermann-Moraes, considered highly sensitive for diagnosis of larvae of S. stercoralis. Material and Methods. To evaluate the effectiveness of the technique, there were two things to consider: (a) test the technique in the laboratory that performs the routine fecal examinations using the Hoffman, Pons & Janer method; (b) use the same sample, simultaneously, performing the method proposed and the Baermann-Moraes, for comparison. For the first observation, we used the routine laboratory of the Hospital Cassiano Antonio de Moraes - HUCAM and the Hopital Fundação Concordia in Santa Maria de Jetibá. We examined 221 faecal samples from patients treated in ambulatory or hospitalized in HUCAM, without any choice, they were also routinely examined by sedimentation method (HPJ). At the Hospital Fundação Concórdia in Santa Maria de Jetibá we evaluated 102 consecutive samples from patients treated in ambulatory. For the second point, 112 samples were analyzed using the inverted microscope method and the Baermann-Moraes technique. The samples were weighed and mixed with water using a glass rod in the same small container and then strained through gauze into a glass sedimentation measuring 250 ml. After an hour, the samples were washed with water and then allowed to stand for one more hour. The sediment (about 15 ml), plus two to three drops of Lugol was placed in a glass chamber measuring 12x8x0,5 cm, covered with a glass slide with the same surface and examined using an inverted microscope with 4X and 10X objective . The entire chamber was analyzed, and the number of larvae, was counted. Results. Of the 221 samples analyzed at the HUCAM laboratory, larvae of S. stercoralis were identified in 20 (9.05%) cases, in which the HPJ identified only nine (4.07%). The 102 samples from Hospital Fundação Concórdia, where the identification of larvae in the previous six months did not exceed 1.5%, 10 samples were positive using the inverted microscope (9.9%). The 112 samples used simultaneously to compare with the Baermann-Moraes technique, 11 samples were positive using the inverted microscope and all were also positive in the Baermann-Moraes method. Conclusion. The method is simple, with the following advantages: (a) the sediment obtained is examined at once, allowing the identification of all larvae existed there; (b) as the amount of stool examined is large (more than 8 to 10g used in Baermann-Moraes and 2 to 4 g used to perform the Koga agar), the probability of finding larvae increases, even in cases with low parasite load; and (c) allows the identification of dead larvae, unlike both the Baermann-Moraes and the Koga agar and could also be applied in faeces preserved with buffered formalin as fixatives or MIF

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Human strongyloidiasis is an important intestinal parasitic infection worldwide, 50% of infected individuals are asymptomatic, however it can cause hyper infection and dissemination in immunocompromised hosts leading to death. Early detection of the disease prevents the development of hyper infection and dissemination syndromes, so the use of an efficient diagnostic tool has great importance to identify and control this parasitic disease. Due to the lack of efficiency in parasitological and serological tests currently available to detect human strongyloidiasis it is necessary to improve immunodiagnostic tests using recombinant and synthetic antigens once there are limitations to obtain and use homologous antigens produced from the parasite. The aim of this study was to select using phage display technology Strongyloides stercoralis mimetic peptides ligands to immunoglobulin G from patients with strongyloidiasis. The PhDTM-C7C library was used in the selection process and the DNA of the selected clones was extracted, sequenced and analyzed using bioinformatics tools. ELISA tests were done by using five distinct phage clones, which presented significant similarity with proteins from S. stercoralis, and the two synthetic peptides corresponding to the sequences displayed on two phage clones. Binding specificity of each phage clone to the pool of sera from patients with strongyloidiasis was analyzed by competitive ELISA. Sensitivity, specificity, diagnostic efficiency, area under curve and likelihood ratio were calculated for each antigen. All phage clones presented high diagnostic potential achieving area under curves higher than 0.8, the C9 clone presented reasonable sensitivity (87.5%), specificity (80%) and diagnostic efficiency (82.5%).Synthetic peptides C10 and D3 showed superior diagnostic performance, with areas under the curve greater than 0.9 and excellent sensitivity (95%, 95%), specificity (86.3%, 92.5%) and diagnostic efficiency (89 2%, 93.3%) respectively. It was concluded that the selected peptides by Phage display can mimic S. stercoralis epitopes and represent promising alternative to the currently available antigens for human strongyloidiasis diagnosis. / Estrongiloidiase humana é uma importante parasitose intestinal em todo mundo, 50% das pessoas infectadas são assintomáticas, entretanto pode haver hiperinfecção e disseminação em pacientes imunocomprometidos, levando à morte. A detecção precoce da doença previne o desenvolvimento das síndromes de hiperinfecção e disseminação, assim, o uso de uma ferramenta diagnóstica eficiente é de grande importância para identificar e controlar esta parasitose. Devido à falta de eficiência nos testes parasitológicos e sorológicos disponíveis atualmente para detectar estrongiloidiase humana é necessário aprimorar os testes imunodiagnósticos utilizando antígenos recombinantes e sintéticos, uma vez que há limitações para obter e utilizar antígenos homólogos, produzidos a partir do parasito. O objetivo deste trabalho foi selecionar por Phage display peptídeos miméticos a Strongyloides stercoralis ligantes a imunoglobulinas G de pacientes com estrongiloidiase. Uma biblioteca PhDTM-C7C foi utilizada no processo de seleção e o DNA dos clones selecionados foi extraído, sequenciado e analisado por ferramentas de bioinformática. Os testes ELISA foram feitos utilizando cinco clones de fagos distintos, os quais tiveram similaridades significantes com proteínas de S. stercoralis, e dois peptídeos sintéticos correspondentes às sequências expressas por dois clones selecionados. A especificidade de ligação de cada clone de fago ao pool de soros de pacientes com estrongiloidiase foi analisada por ELISA de competição. Sensibilidade, especificidade, eficiência diagnóstica, áreas sob a curva e razão de verossimilhança foram calculados para cada antígeno. Todos os clones de fagos analisados apresentaram alto potencial diagnóstico alcançando área sob a curva maiores que 0,8, se destacando o clone C9 com razoável sensibilidade (87,5%), especificidade (80%) e eficiência de diagnóstica (82,5%). Os peptídeos sintéticos C10 e D3 apresentaram desempenho diagnóstico superior, com áreas sob a curva maiores que 0,9 e excelente sensibilidade (95%, 95%), especificidade (86,3%, 92,5%) e eficiência de diagnóstica (89,2%, 93,3%) respectivamente. Concluiu-se que os peptídeos selecionados por Phage display podem mimetizar epitopos de S. stercoralis e representam alternativa promissora aos antígenos atualmente disponíveis para utilização no diagnóstico da estrongiloidiase humana. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A estrongiloidíase humana é uma parasitose intestinal negligenciada com ampla distribuição mundial, podendo acarretar cronificação e hiperinfecção caso não seja diagnosticada precocemente. Os casos que merecem mais atenção são aqueles relacionados, principalmente, à pacientes imunocomprometidos. O diagnóstico parasitológico desta helmintose é pouco sensível devido a eliminação pequena e irregular de larvas nas fezes. Os métodos imunológicos, principalmente enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), apresentam elevada sensibilidade e especificidade. No entanto há sempre a necessidade de aprimorar e elevar a eficiência diagnóstica para evitar reatividade-cruzada e casos de resultados falsos-negativos. O objetivo deste estudo foi de produzir e padronizar antígenos de excreção/secreção (E/S) de larvas filarioides (L3) de Strongyloides venezuelensis para uso no imunodiagnóstico. As larvas L3 de S. venezuelensis foram obtidas para a produção de extrato salino total (SE), E/S no meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) e E/S em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Todos os antígenos foram utilizados na detecção de IgG anti-S. stercoralis em doentes com e sem condições imunossupressoras. Utilizaram-se 150 amostras de soro humano, divididas em 5 grupos. Indivíduos imunocompetentes positivos para estrongiloidíase (n = 30) ou negativos para estrongiloidíase (n = 30); Pacientes com outros parasitas (n = 30), como ancilostomídeos, Ascaris lumbricoides, Hymenolepis nana, Giardia lamblia, Schistosoma mansoni, Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura e Taenia sp; pacientes imunossuprimidos positivos para estrongiloidíase (N = 30), incluindo HIV, diabetes, alcoólatras, tuberculose, câncer e alcoólatras com câncer e pacientes imunossuprimidos negativos para parasitas intestinais (n = 30), incluindo HIV, diabetes, alcoolistas, tuberculose e câncer. Observou-se que todos os antígenos apresentaram frações antigênicas semelhantes com peso molecular de 62, 44, 39, 33 e 18 kDa. No entanto, quando utilizados em teste ELISA os antígenos E/S tanto em meio RPMI quanto em PBS apresentaram-se mais específicos que o SE, 94,4%, 96,7% e 77,8% respectivamente, enquanto que o antígeno E/S em PBS foi mais sensível (95,0%) que os outros dois antígenos (SE 93,3% e RPMI 86,7%). Os antígenos E/S apresentaram-se de fácil execução e o produto E/S em PBS mostrou-se mais sensível e específico que os demais antígenos em estudo. Concluiu-se que, o antígeno E/S em PBS é uma boa alternativa para diagnóstico mais sensível e específico da estrongiloidíase humana. / Human strongyloidiasis is a neglected intestinal parasitosis, with a large worldwide distribution, affecting millions of people, and may lead to chronification and hyperinfection if not diagnosed early. The cases that deserve more attention are those related, mainly, to immunocompromised patients. The parasitological diagnosis of this helminth is not very sensitive due to the small and irregular larval output in the faeces. Immunological methods, especially enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), present high sensitivity and specificity, however, there is always a need to improve and increase diagnostic efficiency to avoid cross-reactivity and cases of false-negative results. The aim of this study was to produce and standardize excretion/secretion (E/S) antigens of filarial larvae (L3) of Strongyloides venezuelensis for immunodiagnostic use. The L3 larvae of S. venezuelensis were obtained for the production of total saline extract (SE), E/S in Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) and E/S in phosphate-buffered saline (PBS). All antigens were used in the detection of IgG anti- S. stercoralis in patients with and without immunosuppressive conditions. A total of 150 human serum samples were used, divided into 5 groups. Immunocompetent individuals positive for strongyloidiasis (n=30) or negatives for strongyloidiasis (n=30); patients with others parasites (n=30) such as hookworms, Ascaris lumbricoides, Hymenolepis nana, Giardia lamblia, Schistosoma mansoni, Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura and Taenia sp; immunosuppressed patients positive for strongyloidiasis (n=30), including HIV, diabetes, alcoholics, tuberculosis, cancer, and alcoholics with cancer and negative immunosuppressed patients for intestinal parasites (n=30) including HIV, diabetes, alcoholics, tuberculosis and cancer. All antigens were observed to have similar antigenic fractions having molecular weights of 62, 44, 39, 33 and 18 kDa. However, when used in the ELISA test the E/S antigens in both RPMI and PBS media were more specific than SE, 94.4%, 96.7% and 77.8%, respectively, whereas the antigen E/S in PBS was more sensitive (95.0%) than the other two antigens (SE 93.3% and RPMI 86.7%). The E/S antigens were easy to perform and the E/S product in PBS was more sensitive and specific than the other antigens in the study. It may conclude that the E/S in PBS antigen is a good alternative for a more sensitive and specific diagnosis of human strongyloidiasis. / Dissertação (Mestrado)

Strongyloidiasis stercoralis hyperinfection presenting as vasculitic-like skin lesions is rare. An autoinfection cycle allows intestinal strongyloidiasis, usually a benign infection, to persist for many decades. We report a woman with disseminated S stercoralis infection presenting as nonpalpable purpuric skin rash and syndrome of inappropriate secretion of antidiuretic hormone (SIADH). Upon admission, she was treated with corticosteroids for her vasculitic skin lesions, which then worsened her status. When the diagnosis was recognized, steroids were stopped, thiabendazole treatment was instituted, and she gradually recovered. Serious or fatal infection can occur in patients with strongyloidiasis who were treated with immunosuppressive drugs. Stool specimen screening and/or serological tests for S stercoralis infection in patients who require immunosuppressive therapy helps to prevent complications before embarking on such treatment. Unexplained hyponatremia, severe hypoalbuminemia without proteinuria, and unusual skin rashes, especially over the lower aspect of the abdomen and upper aspects of the thighs, in persons living in areas endemic to S stercoralis should raise suspicion of S stercoralis infection.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The diagnosis of strongyloidiasis is difficult the irregular larval excretion and in most cases, individuals are asymptomatic; detection of latent cases of Strongyloides stercoralis in immunosuppressed may decrease morbidity and mortality. In this sense, the improvement of reliable diagnostic methods is essential. The objective of the study was to compare the release of eggs in the feces by the technique of Egg counts per gram of feces (EPG), coproantigens detection by ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) and amplification bands by conventional (Polymerase Chain Reaction) PCR from feces of non immunosuppressed and immunosuppressed mice experimentally infected with Strongyloides venezuelensis. In the experimental kinetic days 0 and 5, 8, 13, and 21 after infection p.i. were used. Comparing the EPG, coproantigens detection by ELISA and PCR, it was observed in the non immunosuppressed group the release of eggs from the EPG test day on 5 to day 13 p.i, being absent on day 21 p.i. Coproantigen positivity was observed in 33.3% 5 and 8 p.i. and 100% on days 13:21 p.i. and PCR, the presence of amplified bands was observed along the entire kinetics. In immunosuppressed animals, 100% of the released eggs in the feces, the data of the ELISA, 100% of the animals were evaluated in both positive and PCR, the presence of amplified bands during kinetics. It is concluded that detection of coproantigens by ELISA and PCR diagnosis could be useful tools for diagnosis of strongyloidiasis especially in cases of immunosuppression. / O diagnóstico da estrongiloidíase é difícil, pois, a excreção larval é irregular e na maioria dos casos, os indivíduos são assintomáticos; a detecção de casos latentes de Strongyloides stercoralis em imunossuprimidos pode diminuir a morbidade e mortalidade da infecção. Assim, o aprimoramento de métodos confiáveis de diagnóstico são imprescindíveis. O objetivo do estudo foi comparar a liberação de ovos nas fezes pela técnica de Contagem de Ovos por Grama de Fezes (OPG), a detecção de coproantígenos pelo ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) e amplificação de bandas pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) convencional de fezes de ratos não imunossuprimidos e imunossuprimidos e experimentalmente infectados por Strongyloides venezuelensis. Na cinética experimental foram utilizados os pontos 0 e 5, 8, 13 e 21 pós-infecção (d.p.i). Para o cálculo dos resultados foram utilizadas porcentagens simples e descrição dos resultados obtidos. Comparando-se o OPG, a detecção de coproantígenos pelo ELISA e a PCR, observou-se no grupo não imunossuprimido a liberação de ovos no teste OPG do dia 5 ao dia 13 p.i, sendo ausente no 21 d. p.i. Para a detecção de coproantígeno observou-se positividade de 33,3% no 5 e 8 d. p.i e de 100% no 13 e 21 d. p.i e na PCR, a presença de bandas amplificadas em todos os dias da cinética. Nos animais imunossuprimidos, 100% liberaram ovos nas fezes, no teste ELISA, 100% dos animais foram positivos e na PCR, a presença de bandas amplificadas em toda a cinética. Concluiu-se que a detecção de coproantígenos pelo ELISA e o diagnóstico por PCR podem ser ferramentas úteis para o diagnóstico em animais não imunossuprimidos e imunossuprimidos. Em comparação ao OPG, a detecção de coproantígenos pelo ELISA e amplificação de bandas pela PCR mostraram mais sensíveis nos dias analisados e podem ser métodos de escolha para diagnóstico da estrongiloidíase principalmente nos casos de imunossupressão. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas