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Teste pré-clínico em doença renal crônica canina, com o uso de células-tronco amnióticas / Preclinical test in canine chronic kidney disease in the use of amniotic stem cellsIngrid da Silva Gomes 18 December 2017 (has links)
A doença renal crônica (DRC) é uma afecção frequente em cães idosos, de alta morbidade e mortalidade, sendo definida como uma injúria renal morfo-funcional irreversível, de um ou ambos os rins, que está intrinsecamente associada à degeneração celular. Seu tratamento é paliativo, sendo que nos estágios mais avançados, o animal pode necessitar de hemodiálise ou transplante renal, prática dificultada e muitas vezes inviável na medicina veterinária. As células-tronco mesenquimais derivadas do tecido amniótico caracterizam-se por ser uma população de células de alta plasticidade e de grande potencial imunomodulador, sendo capazes de se diferenciar e produzir diferentes tipos celulares necessários num processo de reparação. Os avanços nos estudos das células-tronco podem tornar a terapia celular uma forma viável de tratamento alternativo ou adjuvante dessa doença, uma vez que estas poderiam restaurar a funcionalidade e manter a integridade do rim. O objetivo deste estudo foi avaliar se o tratamento experimental com células-tronco mesenquimais derivadas do âmnio (CTMAs) canino podem reduzir ou estabilizar a taxa de progressão e o quadro clínico da DRC em cães. Para tanto, células-tronco provenientes da membrana amniótica foram cultivadas até a segunda passagem (P2) e criopreservadas para posterior aplicação. Onze cães domésticos, machos e/ou fêmeas, acometidos pela DRC adquirida em graus II ou III segundo classificação da IRIS e sem outra afecção adjacente receberam duas aplicações de CTMAs nos dias D0 e D30, por via endovenosa. Para avaliar a progressão ou estabilização do quadro clínico foram colhidas amostras de sangue total, soro sanguíneo e urina para exames de hemograma, bioquímica sérica e urinaria e urinálise em quatro momentos: D0, D7, D30 e D60. A análise estatística foi realizada através da aplicação do teste ANOVA, para comparação de médias nas diferentes fases de tratamento, seguida pelo teste de Tukey, para comparação das médias entre os grupos. Do ponto de vista clínico, dois animais apresentaram melhora e se mantiveram estáveis durante todo o período de acompanhamento, dois animais apresentaram melhora nos primeiros 30 dias, apresentando novamente sintomatologia da doença após esse período e os demais apresentaram melhora nos primeiros sete dias de tratamento, havendo uma piora geral do quadro após esse período. Contudo, os exames laboratoriais em todos os casos não revelaram uma melhora significativa com o tratamento. Aparentemente, a utilização de células-tronco de origem amniótica não influencia de forma relevante na melhora da doença devido à extensa lesão renal que cães apresentam. / Chronic kidney disease (CKD) is a common condition in older dogs with high morbidity and mortality and is defined as an irreversible morpho-functional renal injury of one or both kidneys, which is intrinsically associated with cell degeneration. Its treatment is palliative, and in the more advanced stages, the animal may need dialysis or kidney transplantation, a practice that is difficult and often not feasible in veterinary medicine. The mesenchymal stem cells derived from amniotic tissue characterized by being a population of high plasticity and high cell immunomodulatory potential, being able to differentiate and produce different cell types required in a repair process. Advances in stem cell studies may make cell therapy a viable alternative or adjunctive treatment for this disease, since it could restore functionality and maintain kidney integrity. The objective of this study was to evaluate if the experimental treatment with the canine amnio- derived mesenchymal stem cells (AMSCs) can reduce or stabilize the rate of progression, and clinical condition of CKD in dogs. For this purpose, stem cells from the amniotic membrane were grown until the second pass (P2) and cryopreserved for later use. Eleven domestic male and / or female dogs, affected by the CKD acquired in grades II or III according to IRIS classification and without another adjacent disease, received two applications on days D0 and D30 intravenously. To evaluate the progression or stabilization of the clinical condition, whole blood, blood serum and urine samples were collected for hemogram, serum and urinary biochemistry and urinalysis at four moments: D0, D7, D30 and D60. Statistical analysis was performed using the ANOVA test, to compare means in the different treatment phases, followed by the Tukey test, to compare the means between the groups. From a clinical point of view, two animals showed improvement and remained stable throughout the follow-up period, two animals showed improvement in the first 30 days, showing again symptoms of the disease after this period and the other showed improvement in the first seven days of treatment, with a general worsening of the condition after this period. However, laboratory tests in all cases showed no significant improvement with treatment. Apparently, the use of stem cells of amniotic origin does not influence in a relevant way the improvement of the pathology due the extensive kidney lesion presented by dogs.
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Microencapsulação de células recombinantes superexpressando α-L-iduronidase para o tratamento da mucopolissacaridose tipo 1Martinelli, Bárbara Zambiasi January 2014 (has links)
A Mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é causada pela deficiência da α-Liduronidase (IDUA), uma hidrolase lisosomal responsável pela degradação dos glicosaminoglicanos (GAG) heparan e dermatan sulfato. Diversos processos bioquímicos e fisiológicos são afetados pelo acúmulo desses substratos nas células, levando a uma condição patológica multisistêmica. Apesar dos benefícios clínicos obtidos com os tratamentos atualmente disponíveis, várias limitações têm sido relatadas, sendo necessária a busca de novas estratégias terapêuticas. Uma abordagem promissora de terapia gênica/celular para o tratamento da MPS I é a microencapsulação de células geneticamente modificadas. Neste trabalho, produzimos microcápsulas com células recombinantes superexpressando IDUA, as quais foram implantadas em camundongos MPS I a fim de avaliar sua eficiência como uma terapia. No primeiro estudo, as cápsulas foram implantadas no tecido subcutâneo para um tratamento de 120 dias. A atividade de IDUA no soro teve um leve aumento nos primeiros 45 dias. Depois de 120 dias, a atividade de IDUA foi detectada no fígado, rim e coração. A dosagem bioquímica do acúmulo de GAG nos tecidos mostrou níveis reduzidos no rim. A análise histológica confirmou esses resultados e, de modo interessante, mostrou uma reorganização no parênquima hepático com menos células vacuolizadas. Além disso, as microcápsulas foram recuperadas para análise histológica e foi observada a presença de células inflamatórias e uma camada fibrótica em torno das cápsulas. O segundo estudo foi um tratamento de 60 dias com as microcápsulas implantadas no epíplon. Os níveis de IDUA no soro foram transitórios durante o tratamento e 60 dias depois da implantação a atividade enzimática foi detectada apenas no coração. A avaliação do acúmulo de GAG não apresentou diferenças entre os camundongos MPS I tratados e não tratados. Em ambos os estudos, alguns animais foram utilizados para um experimento em curto prazo e um aumento nos níveis de IDUA foi observado nos tecidos 24 horas após a implantação das cápsulas. Concluindo, as células microencapsuladas foram capazes de corrigir alguns aspectos da doença. No entanto, fatores como uma resposta imune contra a enzima e ao biomaterial, ou a dose de células nas cápsulas, podem ter prejudicado a eficiência do tratamento, sugerindo que modificações na técnica são necessárias para obter um melhor desempenho. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is caused by a deficiency of α-Liduronidase (IDUA), a lysosomal hydrolase responsible for the degradation of the glycosaminoglycans (GAG) heparan and dermatan sulfate. The consequent accumulation of these substrates throughout the cells affects several biochemical and physiological processes, leading to multisystemic pathological condition. Although the clinical benefits of the treatments currently available, several limitations have been noted and the search for alternative therapeutic strategies are necessary. A promising gene/cell therapy approach for treating MPS I is the microencapsulation of genetically modified cells. In this work, we produced microcapsules containing recombinant cells overexpressing IDUA, which were implanted in MPS I mice in order to evaluate their efficiency as a treatment. In the first study, capsules were implanted in the subcutaneous tissue for a 120-days treatment. Serum IDUA activity was slightly increased in the first 45 days. After 120 days, IDUA activity was detected in the liver, kidney and heart. The biochemical measurement of GAG accumulation in the tissues revealed decreased levels in the kidney. The histological analysis confirmed these results and, interestingly, showed a reorganization of the hepatic parenchyma with less cell vacuolization. In addition, microcapsules were retrieved for histological analysis and it was observed the presence of inflammatory cells and a fibrotic layer around the capsules. The second study was a 60- day treatment with the microcapsules implanted in the omentum. Serum IDUA levels were transient over treatment and 60 days post-implantation the enzyme activity was detected only in the heart. The evaluation of GAG storage did not reveal differences between treated and untreated MPS I mice. In both studies, some animals were used for a shortterm experiment and increased IDUA levels were observed in the tissues 24 h after capsules implantation. In conclusion, microencapsulated cells were able to correct some aspects of the disease. However, factors such as immune response against the enzyme and the biomaterial or the dose of cells in the capsules could be impairing the efficiency of the treatment, suggesting that modifications on the technique are necessary to achieve a better performance.
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Desenvolvimento e caracterização de sistemas de liberação tópica a base de cristais líquidos para veiculação de siRNA na terapia gênica / Development and characterization of topical delivery systems based on liquid crystals for siRNA in gene therapyLívia Vieira Depieri 10 May 2012 (has links)
A terapia gênica por interferência de RNA (RNAi) trata-se de um processo de silenciamento pós-transcricional capaz de suprimir a expressão de um determinado gene. A RNAi é uma proposta terapêutica promissora para o tratamento de muitas doenças severas que ainda não possuem cura ou terapias bem definidas. Porém, é necessário o desenvolvimento de sistemas de liberação clinicamente adequados, seguros e eficazes para se viabilizar essa nova terapêutica, uma vez que obstáculos na administração e distribuição in vivo comprometem o uso clínico dos siRNAs (small interfering RNA). Paralelamente, a liberação tópica de siRNAs surge como uma alternativa promissora para o tratamento de patologias cutâneas. Neste contexto, a presente pesquisa teve como objetivo o desenvolvimento de um sistema de liberação baseado em nanotecnologia para a liberação tópica de siRNAs, visando introduzir a terapia gênica como nova abordagem para o tratamento de patologias cutâneas. Como sistema de liberação, foram desenvolvidas nanodispersões líquido-cristalinas aquosas, compostas por monoleína (MO), um lipídeo polar biocompatível, associadas ou não com ácido oléico (AO). Foram incorporados a esses sistemas os adjuvantes catiônicos polietilenoimina (PEI) e oleilamina (OAM) para obtenção das nanodispersões. Dentre as nanodispersões aquosas desenvolvidas, foram escolhidas as preparações com as menores concentrações de adjuvantes catiônicos, a saber: MO e OAM a 0,4%, MO e PEI a 0,4%, MO, AO e OAM a 2,5% e MO, AO e PEI a 1,0%. Estas formulações apresentaram: reduzido tamanho médio das partículas, baixa polidispersividade, valores de potencial zeta positivos (característica interessante para interação com as moléculas de siRNA que apresentam carga negativa), baixa citotoxicidade in vitro e foram capazes de complexar o siRNA na concentração final de 2,5 ?M. A análise de difração de raios X caracterizou a fase líquido-cristalina desses sistemas como hexagonal, exceto a nanodispersão MO e PEI a 0,4% que foi caracterizada como uma mistura de fase hexagonal e cúbica. As nanodispersões obtidas foram capazes de aumentar a penetração cutânea de siRNA in vitro. Face aos resultados obtidos, podemos concluir que as formulações desenvolvidas são sistemas de liberação de base nanotecnológica promissores para administração tópica de siRNA para o tratamento de patologias cutâneas na terapia gênica. / Gene therapy by RNA interference (RNAi) is a post-transcriptional silencing process that can suppress the expression of a particular gene. The RNAi is a promising therapeutic approach for the treatment of many severe diseases that have no cure or well-defined treatments. However, the development of clinically appropriate, safe and effective delivery systems is necessary to enable this new therapy, since obstacles in the in vivo administration and distribution committed the clinical use of siRNAs (small interfering RNA). In addition, the topical delivery of siRNAs appears as a promising alternative for the treatment of cutaneous pathologies. In this context, this research aimed to develop a delivery system based on Nanotechnology for the topical delivery of siRNAs, aiming to introduce gene therapy as a new approach for the treatment of skin disorders. As a delivery system, liquid-crystalline nanodispersions, composed by monoolein (MO), a polar biocompatible lipid, associated or not with oleic acid (OA) were developed. The cationic adjuvants polyethylenimine (PEI) and oleylamine (OAM) were incorporated into these systems to obtain the nanodispersions. Among the aqueous nanodispersions developed, preparations with lower concentration of cationic adjuvant were chosen, these consisting of: MO and OAM at 0.4%, MO and PEI at 0.4%, MO, OA and OAM at 2.5% and MO, OA and PEI at 1.0%. These formulations presented: reduced average particle size, low polydispersity, positive values of zeta potential (an interesting feature for interacting with the siRNA molecules that have a negative charge), low cytotoxicity in vitro and they were able to complex the siRNA at a final concentration of 2.5 ?M. The X-ray diffraction analysis characterized the liquid crystalline phase of these systems as hexagonal, except the nanodispersion MO and PEI at 0.4% which was characterized as a mixture of cubic and hexagonal phases. The nanodispersions obtained were able to increase the skin penetration of siRNA in vitro. With the results obtained, we can conclude that the formulations developed are delivery systems based on nanotechnology, promising for topical administration of siRNA for the treatment of cutaneous diseases in gene therapy.
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Sistemas de liberação de geleificação in situ para veiculação de siRNA: desenvolvimento, caracterização e estudos in vitro e in vivo em modelo animal / In situ gelling delivery systems for siRNA: development, characterization and studies in vitro and in vivo in animal modelCardoso, Livia Neves Borgheti 02 August 2012 (has links)
A comprovação de que siRNA pode ser usado para supressão de genes em diferentes células de mamíferos atraiu grande atenção como nova possibilidade de tratamento para diversas doenças. No entanto, para aplicação terapêutica de siRNA é necessário o desenvolvimento de um sistema de liberação efetivo e não tóxico, que permita a captação celular do siRNA e também que evite a sua degradação por enzimas. A capacidade de supressão de genes promovido pelo siRNA depende tanto do número de moléculas de siRNA transfectadas quanto da taxa de duplicação da célula. Uma das formas farmacêuticas que vem sendo amplamente utilizadas na literatura com o objetivo de prolongar e proteger a liberação de fármacos são as formulações com capacidade de formação de gel in situ. Desta forma, a presente pesquisa teve por objetivo o desenvolvimento farmacotécnico de formulações líquido cristalinas com formação de gel in situ após administração por via subcutânea para veiculação sustentada de siRNA. Misturas adequadas de monoleína, propilenoglicol, tampão Tris e polietilenoimina ou oleilamina (polímero e lipídeo catiônico, respectivamente) formaram sistemas precursores capazes de se geleificar in situ com excesso de água e, como demonstrado pelo estudo de absorção de água, a formação do gel é um processo rápido. As formulações desenvolvidas também foram eficientes para complexar o siRNA comprovando a importância da incorporação dos aditivos catiônicos aos sistemas. A liberação in vitro dos sistemas líquido cristalinos mostraram que a liberação é dependente da taxa de absorção de água e os estudos in vivo em modelo animal para avaliação da formação do gel in situ e toxicidade demonstraram que o gel se forma in vivo com a absorção de água dos fluidos corporais, sendo biodegradável e biocompatível. Os sistemas desenvolvidos mostraram-se promissores para o tratamento de doenças onde a administração localizada e sustentada de siRNA é necessária. / The evidence that siRNA can be used for suppression of genes in different mammalian cells attracted wide attention as a new possibility of treatment for various diseases. However, for siRNA therapeutic application is necessary to develop an effective non-toxic delivery system, which facilitate the siRNA cell uptake and avoid its degradation by enzymes. The genes suppression promoted by siRNA depends on the number of siRNA molecules transfected as the cell replication rate. One of the dosage forms that have been widely used in literature in order to prolong and protect the drug release is the in situ gelling formulations. Thus, the present study aimed the development and characterization of the in situ gelling liquid crystal-based systems for subcutaneous application of siRNA in gene therapy. Appropriate mixtures of monoolein, propylene glycol, Tris buffer and polyethyleneimine or oleylamine (cationic polymer and lipid, respectively) was able to form precursor formulation that gelling in water excess and, as demonstrated by the swelling studies, the gel formation is a fast process. The developed formulations were also effective for complexing the siRNA, indicating the importance of the incorporation of cationic additives in the systems. The in vitro release study showed that the release is dependent on the water absorption rate. In vivo studies in animal models have shown the gel is formed in vivo after water uptake of body fluids, and it is biodegradable and biocompatible. The systems developed are promising for the treatment of diseases where the local and sustained administration of siRNA is necessary.
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Desenvolvimento e caracterização de vetores não virais para entrega gênica baseados em proteínas e lipossomas. / Development and characterization of non-viral vectors based in proteins and liposomes to gene delivery.Alves, Rafael Ferraz 24 October 2013 (has links)
Um dos principais limitantes do desenvolvimento de protocolos eficientes de terapia gênica e vacinação com DNA provém da baixa eficiência de transferência gênica por parte dos vetores não-virais. Isso surge, principalmente, pela dificuldade de transporte de DNA estrangeiro do exterior para o núcleo das células alvo, devido à presença de inúmeras barreiras. O principal objetivo do trabalho realizado foi o desenvolvimento e caracterização de novos vetores não virais multifuncionais, capazes de realizar eficientemente a entrega de material genético (DNA plasmidial, pDNA) ao núcleo de células de mamífero (HeLa). Para esse fim, complexos binários (CBs) foram formados combinando-se pDNA à protamina ou proteínas recombinantes (TRP3) anteriormente desenvolvidas por nosso grupo. Foi também estudado o encapsulamento destes CBs em lipossomas catiônicos, formados pelos lipídios EPC:DOPE:DOTAP, gerando então complexos pseudo-ternários (CPTs). Os estudos com a protamina revelaram que os CPTs formados apresentavam tamanhos relativamente pequenos (< 123 nm) e com valores de potencial zeta, variando de +22,8 mV a +36,3 mV, nas várias relações mássicas (pDNA:protamina) estudadas (1:0,5; 1:0,7, 1:0,9 e 1:1). Os ensaios de transfecção mostraram que o CPT na relação 1:0,5 (CB) obteve o melhor nível de transfecção das células (17,1%) com um nível de viabilidade celular de 73,2%. Os ensaios utilizando a TRP3 mostraram que os CPTs formados adquiriram tamanhos pequenos (< 134 nm) e valores de potencial zeta entre +36,8 mV e +11,9 mV dependendo da relação mássica do CB (1:1, 1:30 e 1:60). Os ensaios de transfecção mostram que os CPTs formados com a TRP3 aumentaram o nível de transfecção em todas as relações de pDNA-TRP3 usadas (1:1; 1:30 e 1:60). Vale ressaltar que nas relações mássicas 1:30 e 1:60 houve um aumento significativo na transfecção (25,2% e 24,5%, respectivamente). Os ensaios de citotoxicidade mostram que os CBs não afetaram a viabilidade célular, entretanto quando combinada ao lipossoma foi observado aumento da citotoxicidade. Finalmente, os resultados indicam que a TRP3 associada ao lipossoma (CPTs) aumenta a eficiência de entrega de pDNA sugerindo um efeito sinérgico entre essas duas moléculas na superação das várias barreiras físicas, químicas e difusionais encontradas na célula. / One of the major challenges on the development of efficient protocols for gene therapy and DNA vaccination is the low efficiency of gene transfer by non viral vectors. This is mainly attributed to the fact that, during the traffic to target cells nuclei, plasmid vectors must overcome a series of physical, enzymatic and diffusional barriers. The objective of this work was the development and characterization of new multifunctional non-viral vectors, based on lipids and proteins, able to delivery efficiently the foreign pDNA (plasmid DNA) to the nucleus of mammalian cells. A model pDNA containing the reporter gene GFP was complexed to protamine or the recombinant protein (TRP3), forming binary complexes (BC). In addition, we studied the ability of the cationic liposomes (EPC:DOPE:DOTAP) to encapsulate this binary complexes to form pseudo-ternary complexes (PTCs). The studies of size (DLS) and zeta potential revealed that both proteins were able to condense pDNA to form small complexes (BCS and PTCs) (~100 nm) and positively charged (+11,9 mV a +36,8 mV), both interesting characteristics for transfections. However, the CPTs formed by TRP3 was that showed the highest transfections level (25,3%). The cytotoxicity assays indicated the BCs had a low effect on the cell viability. On the other hand, the biggest effect on cell death was found when PTCs were used. The results indicated the TRP3 associated to liposomes (PTCs) increased the delivery efficiency due to differences in the intracellular trafficking, suggesting a synergic effect between these different molecules in the vector in order to overcome the barriers found inside the cell.
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Nanopartículas híbridas polimérico-lipídicas para veiculação de siRNA na terapia antisense de doenças cutâneas / Hybrid Lipid-Polyethylenimine (PEI) nanocarriers for delivery topical siRNA for antisense therapy of skin diseasesAraujo, Margarete Moreno de 16 November 2017 (has links)
A terapia gênica por RNA de interferência (RNAi) trata-se de um processo de silenciamento pós-transcricional capaz de suprimir a expressão de um determinado gene. No entanto, para se tornar eficaz, a terapia gênica utilizando siRNA (small interfering RNA - siRNA) é dependente de uma eficiente liberação e expressão do acido nucléico nas células-alvo dentro dos tecidos ou órgãos. A literatura atual mostra algumas propostas de sistemas de liberação tópica de siRNA, entretanto, o uso de nanopartículas híbridas polimérico-lipídicas para complexação e liberação de siRNA na pele para o tratamento tópico de doenças cutâneas, ainda é pouco explorado, o que configura a inovação deste trabalho. Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo o desenvolvimento de uma nanopartícula hibrida lipídica associada a um polímero catiônico (NLS-PEI) como sistema de liberação tópica para siRNA, visando a terapia gênica como nova abordagem no tratamento de patologias cutâneas. Primeiramente a composição e o método de produção das NLS-PEI foram otimizados. Como polímero catiônico, utilizou-se a polietilenoimina (PEI). As NLS-PEIs otimizadas, compostas pelo lipídeo Compritol® 888 ATO (2,0%), Poloxamer 188 (1,5%) e PEI (0,15 e 0,25%), apresentaram-se esféricas com superfície lisa e um tamanho médio de 165 nm, potencial zeta médio de +20 mV, concentração de partículas de 1013/mL e com alta estabilidade (90 dias a 4°C). Foi demonstrado, por DSC, que a PEI interage tanto com o tensoativo na superficie das nanoparticulas como também com o lipídeo. A avaliação de comportamento e ação in vitro das NLS-PEIs foi estudada em queratinócitos e fibroblastos, evidenciando que o tratamento não diminuiu a viabilidade celular e houve alta captação verificada por citometria de fluxo (acima de 80% de células transfectadas) e por microscopia confocal. No estudo in vitro de penetração das NLS-PEI complexado com siRNA-FAM em pele de orelha de porco, foi demonstrado a penetração cutânea aumentada de siRNA-FAM a partir das NLS-PEIs. Ensaio in vivo em modelo de inflamação cutânea aguda e crônica mostrou a eficácia das NLS-PEIs contendo siTNF-?, reduzindo a espessura da epiderme em comparação ao grupo controle, reduzindo o rubor, a descamação e os níveis da citocina pró-inflamatória TNF-? e seu RNAm correspondente. A NLS-PEI também promoveu a penetração cutânea das moléculas de siRNA nas camadas mais profunda da pele, in vivo. Diante dos resultados obtidos, podese concluir que as formulações desenvolvidas são sistemas de liberação promissores para administração tópica de siRNA para o tratamento de patologias cutâneas na terapia gênica. / Small-interfering RNA (siRNA) has a high application potential for therapeutic silencing of pathologic or drug-resistance genes. Nonetheless, free siRNA molecules are known to have poor transfection efficiency and biological stability, so a carrier use is necessary. Lipid-polymeric nanocarriers are the new generation of nanoparticulate that have been used as siRNA carrier system and are attracting attention as novel colloidal drug carrier for topical use. In this context, the aim of this study was to develop of hybrid lipidpolyethylenimine nanocarriers (SLN-PEI) as topical delivery systems for siRNA. First, the SLN-PEI composition and production method were optimized. Polyethyleneimine (PEI) was used as cationic polymer. The optimized SLN-PEIs, composed of the lipid Compritol® 888 ATO (2.0%), Poloxamer 188 (1.5%) and PEI (0.15 and 0.25%), were spherical with a smooth surface and average size of 200 nm, mean zeta potential of +20 mV, mean number of particles per mL in the 1013 frame and remained stable for 90 days at 4 °C. It has been demonstrated by DSC that PEI interacts with both the surface surfactant of the nanoparticles and with the lipid. The evaluation SLN-PEI\'s behavior and in vitro action was studied in keratinocytes and fibroblasts, evidencing that the nanoparticles did not decrease cell viability and there was high cellular uptake evidenced by flow cytometry (above 80% of transfected cells) and by confocal microscopy. In the permeation in vitro study, it was demonstrated that SLN-PEI increased cutaneous penetration of siRNA-FAM. In vivo assay, in model of acute and chronic skin inflammation, demonstrated the efficacy of SLN-PEIs carrying siTNF-?, reducing epidermal thickness compared to control group, reducing redness, desquamation and levels of the pro-inflammatory cytokine TNF- ? and its corresponding mRNA. SLN-PEI also promoted penetration of the siRNA molecules in the deeper layers of the skin, in vivo. In view of the results obtained, we can conclude that the formulations developed are promising delivery systems for topical administration of siRNA for the treatment of cutaneous pathologies in gene therapy.
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Obtenção de um modelo homólogo de terapia gênica mediante administração direta de um plasmídeo com o gene do hormônio de crescimento murino em camundongos anões imunocompetentes / An homologous model of gene therapy by in vivo administration of a plasmid containing the mouse growth hormone gene in immunocompetent dwarf miceCecchi, Claudia Regina 06 February 2013 (has links)
Níveis sustentáveis de hormônio de crescimento humano (hGH) circulante e aumento de peso altamente significativo, avaliados também em comparação a repetidas injeções de hormônio, foram observados em trabalhos anteriores, baseados na eletrotransferência de DNA plasmidial no músculo de camundongos anões imunodeficientes (lit/scid). No presente trabalho, um modelo animal homólogo de terapia gênica para GH foi estudado mediante clonagem da sequência genômica do DNA de GH de camundongo (mGH-gDNA), a qual substituiu o hGH-gDNA no vetor que havia sido utilizado em camundongos anões imunodeficientes. O novo vetor, agora nomeado UBI-mGH-gDNA, foi utilizado em camundongos anões imunocompetentes (lit/lit). Foi primeiramente realizado um teste in vitro, transfectando-se células humanas HEK 293 com este plasmídeo e obtendo-se uma expressão de 3,0 μg mGH/106 células/dia, contra 3,7 μg mGH/106 células/dia, para o UBI-hGH-gDNA. Estes dois plasmídeos foram então injetados (50 μg/animal) no músculo quadríceps de camundongos, seguido de eletroporação, realizando um ensaio de 94 dias. Enquanto após 15 dias, as inclinações das curvas de variação de peso relacionadas ao mGH, hGH e salina foram 0,130, 0,112 e 0,027 g/camundongo/dia, respectivamente, após 94 dias, as inclinações correspondentes foram 0,041, 0,028 e 0,033 g/camundongo/dia. As análises estatísticas mostraram que após 15 dias, as inclinações das duas curvas com o GH foram significativamente maiores que a inclinação do controle (P<0,001), enquanto que após 94 dias, somente a inclinação da curva do mGH foi maior que a do controle (P<0,005). A porcentagem de aumento de peso nos animais tratados com o gene do mGH, após 94 dias, foi de 34,3%, enquanto que o comprimento nariz-cauda e o comprimento do fêmur, dois parâmetros que medem diretamente o crescimento longitudinal, foram de 9,5% e 26%, respectivamente, quando comparados aos valores iniciais. A interrupção do crescimento progressivo do grupo tratado com hGH não foi inesperada, considerando a óbvia reação imunogênica dos animais imunocompetentes contra o GH humano e não contra o de camundongo (título do anticorpo anti-hGH 1:100 a 1:3200). A inclinação altamente positiva do grupo controle, já observada em camundongos lit/lit mas não em lit/scid, é provavelmente devida ao ganho de peso natural desta linhagem, não suportada, contudo, por um proporcional crescimento longitudinal. Níveis circulatórios de mGH da ordem de 4 ng/mL foram detectados após 15 dias para o grupo tratado com o mGH, enquanto o grupo controle apresentou níveis em torno de 0,7 ng mGH/mL (P<0,001). Níveis circulatórios de mIGF-I foram também determinados nos dias 15, 45 e 94 nos animais tratados com mGH, sempre mostrando valores 1,5 - 3,0 vezes maiores que o grupo controle, e valores 1,2-1,6 vezes maiores que o grupo tratado com hGH. Este modelo de tratamento homólogo pode ser considerado uma primeira abordagem e um importante suporte para futuros ensaios pré-clínicos baseados na administração de DNA plasmidial para o tratamento da deficiência de GH humano. / Sustained levels of circulating human growth hormone (hGH) and highly significant weight increases, also found comparable to repeated hormone injections, were observed in previous works, after electrotransfer of naked plasmid DNA into the muscle of immunodeficient dwarf mice (lit/scid). In the present work an homologous animal model for GH gene therapy was studied by cloning the genomic sequence of mouse GH-DNA (mGH-gDNA), which substituted hGH-gDNA in the plasmid that had been used in immunodeficient dwarf mice, now named UBI-mGH-gDNA and used in immunocompetent dwarf mice (lit/lit). An in vitro test was first carried out by transfecting HEK 293 human cells with this plasmid and obtaining an expression of 3.0 μg mGH/106 cells/day, against 3.7 μg /106 cells/day obtained with UBI-hGH-gDNA. The same two plasmids DNA (50 μg/mouse) were then injected into the quadriceps muscle of lit/lit, followed by electroporation, carrying out a 94-day assay. While after 15 days the slopes of the weight variation curves related to mGH, hGH and saline were 0.130, 0.112 and 0.027 g/mouse/day respectively, after 94 days the corresponding slopes were 0.041, 0.028 and 0.033 g/mouse/day. Statistical tests showed that after 15 days the slopes of both GH curves were significantly higher than the control (P<0.001), while after 94 days only the slope of the mGH curve was significantly higher than the control (P<0.005). Weight increase for mGH-treated mice, after 94 days, was 34.3%, while nose-to-tail and femur length, both directly measuring longitudinal growth, increased 9.5% and 26.0%, respectively, when compared to the initial values. The progressive growth arrest of the hGH-treated mice was not unexpected, considering the obvious immunogenic reaction of the immunocompetent animals against human and not against mouse GH ( anti-hGH antibody title 1:100 to 1:3200). The highly positive slope of the control group, already observed in lit/lit but never in lit/scid, is probably due to the natural weight gain of this strain, not supported, however, by a proportional longitudinal growth. mGH circulating levels of the order of 4 ng/mL were detected after 15 days for mGH-treated mice, while the control presented levels around 0.7 ng mGH/mL (P<0.001). Mouse IGF-I serum levels were also determined on day 15, 45 and 94 in mGH-treated mice, always showing 1.5-3.0 fold higher values than the control and 1.2-1.6 fold higher values than hGH-treated mice. This homologous treatment model can be considered a first approach and an important support to the preclinical testing of naked DNA administration for the treatment of human GH deficiency.
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Estabelecimento de linhagens celulares de melanoma canino e transdução com vetores adenovirais aprimorados / Establishment of canine melanoma cell lines and transduction with improved adenoviral vectorsSilva, Gissele Rolemberg Oliveira 25 February 2019 (has links)
NTRODUÇÃO: O melanoma é um câncer de alta mortalidade tanto na medicina quanto na veterinária, devido à baixa resposta às terapias utilizadas e à capacidade de evolução metastática da doença. Avanços no campo da oncologia têm mostrado que os agentes que têm como alvo componentes do sistema imunológico, bem como as terapias molecularmente dirigidas, são muito promissores no tratamento do melanoma. Nosso grupo tem desenvolvido vetores virais para a transferência gênica de fatores antitumorais. O aprimoramento no vetor adenoviral inclui a inserção do tripeptídeo RGD, que permite um amplo tropismo de transdução, e o uso de um promotor responsivo a p53 para controlar expressão do gene terapêutico. Visto que o melanoma canino pode ser um modelo experimental por se tratar de um câncer de ocorrência espontânea e de comportamento biológico semelhante ao melanoma humano, procuramos testar nossa abordagem, que chamamos AdRGD-PG, neste modelo. MÉTODOS: Para isso foram estabelecidas linhagens celulares de melanoma canino para a determinação da capacidade de transdução pelos vetores adenovirais. Em seguida foi realizado o sequenciamento dos exons 4 - 8 do gene TP53 e a avaliação da expressão de genes da via de TP53 induzidos por doxorrubicina e Nutlin-3. RESULTADOS: As quatro linhagens de melanoma canino estabelecidas possuem capacidade tumorigênica e de serem transduzidas pelos vetores adenovirais. Não foram identificadas alterações na sequência do TP53 na região avaliada e a doxorrubicina promoveu aumento da expressão dos transgenes dirigidos pelo promotor PG e a ativação de genes da via de TP53. CONCLUSÕES: A funcionalidade desta plataforma adenoviral aprimorada abre oportunidades para estudos da transferência gênica, incluindo da combinação p19ARF/IFN-beta, nas linhagens estabelecidas. Com o sucesso destas análises, teremos um importante modelo experimental a ser utilizado no desenvolvimento de novas terapias para o melanoma / INTRODUCTION: Melanoma is a cancer of high mortality both in human and veterinary medicine due to the poor response to therapies and the metastatic evolution of the disease. Advances in the field of oncology have shown that agents that target immune system components, as well as molecularly targeted therapies, are very promising for the treatment of melanoma. Our group has developed viral vectors for gene transfer of antitumor factors. The improvement in the adenoviral vector includes the insertion of the RGD tripeptide, which allows a broad transduction tropism, and the use of a p53 responsive promoter to control therapeutic gene expression. Canine melanoma may be considered as an experimental model since it is a spontaneous cancer with biological behavior similar to human melanoma, thus we aim to test our approach, which we call AdRGD-PG, in this model. METHODS: For this purpose, canine melanoma cell lines were established before determining the transduction capacity of adenoviral vectors. Next, sequencing of exons 4-8 of the TP53 gene and evaluation of the expression of genes in the TP53 pathway upon induction with doxorubicin and Nutlin-3 were performed. RESULTS: The four established canine melanoma lines have tumorigenic capacity and are transduced by the adenoviral vectors. No changes were identified in the TP53 sequence in the assessed region and doxorubicin promoted increased expression of the transgenes directed by the PG promoter as well as activation of the TP53 pathway genes. CONCLUSIONS: The functionality of this improved adenoviral platform opens up opportunities for gene transfer studies, including the p19ARF / IFN-beta combination, in the established cell lines. With the success of these analyses, we have an important experimental model to be used in the development of new therapies for melanoma
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Avaliação da vascularização do pâncreas de camundongos diabéticos após injeção de VEGF / Vascularization of pancreas in diabetic mice after VEGF injectionFonseca, Vanessa Uemura da 27 August 2012 (has links)
Há um número crescente de pessoas e animais com obesidade e sobrepeso, com consequente aumento no número de pacientes resistentes à insulina e portadores de Diabetes mellitus (DM). O fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) tem sido caracterizado como uma molécula importante em inúmeros mecanismos fisiopatológicos. Em diabéticos, pesquisas indicam uma redução deste fator em alguns tecidos estudados, sendo esta menor expressão envolvida com o desenvolvimento de hipóxia tecidual e não cicatrização de feridas. Neste contexto, este trabalho teve como objetivos caracterizar um modelo diabético induzido por dieta, avaliar a vascularização, expressão gênica e proteica do VEGFA e seus receptores FLT1 e KDR em pâncreas de camundongos diabéticos e não diabéticos, antes e após a terapia gênica com VEGF. O estudo consistiu de 2 fases para as quais foram utilizados cinquenta camundongos, na primeira fase foram utilizados 28 animais distribuídos em 6 grupos experimentais: submetidos à dieta controle (CT) e dieta hipercalórica (DH) por 3, 4 e 6 meses. Na segunda fase, 4 grupos experimentais foram avaliados aos 4 meses: CT e DH sem vetor terapêutico (CTPLL e DHPLL) e CT e DH com vetor terapêutico (CTVEGF e DHVEGF). A análise gênica pelo PCR em tempo real e proteica pela imuno-histoquímica evidenciou queda na expressão de VEGF, FLT1 e KDR no grupo DH, sendo que a variável estereológica de densidade de volume vascular (Vv) indicou queda significativa (p<0,05) da vascularização pancreática no grupo DH em relação ao CT aos 3, 4 e 6 meses do estudo. O DM foi caracterizado com queda significativa (p<0,05) na insulinemia após 4 meses com DH. Após a injeção pancreática no grupo DHVEGF do lentivírus contendo a sequência que condifica o VEGF, foram observados aumento na expressão gênica de VEGF , FLT1 e KDR (p<0,05), com aumento de Vv vascular pancreático e aumento na insulinemia. Os resultados obtidos sugerem que é possível obter um modelo animal diabético induzido por dieta, que o VEGF e seus receptores participam da evolução e estabelecimento do quadro diabético, levando a uma redução da vascularização pancreática, e que o aumento na expressão do transgene no pâncreas de camundongos diabéticos possa contribuir para a revascularização pancreática e função das células B. / There is an increasing number of people and pets showing overweight and obesity, with a consequent growth of the number of insulin-resistant and diabetic patients. The vascular endothelial growth factor (VEGF) has been characterized as an important molecule in many physiopathological states. Recent studies indicate a reduction in VEGF content in some tissues of diabetic patients causing tissue hypoxia and impairing cicatrization. In this context, this study aimed to characterize a diet-induced diabetic animal model and to evaluate vascularization, gene and protein expression of VEGFA and its receptors KDR and FLT1, in pancreas of diabetic and non-diabetic mice before and after gene therapy with VEGF. The study was divided in two phases and fifty male mice were used. In the first phase 28 animals were distributed into 6 groups: control diet (CT) and high calorie diet (DH) for 3, 4 and 6 months. In the second phase, four experimental groups were evaluated at 4 months: CT and DH without therapeutic vector (CTPLL and DHPLL) and CT and DH with therapeutic vector (CTVEGF and DHVEGF). The genetic analysis using real time PCR and protein by immunohistochemistry showed decrease in expression of VEGF, FLT1 and KDR in the DH group, and the stereological estimate of vascular volume density (Vv) indicated a significant decrease (p <0,05 ) of vascularization in pancreatic DH group relative to the CT at 3, 4 and 6 months of the study. Diabetic mice were characterized with a significant decrease (p <0,05) in insulin after 4 months with DH. After injection of lentivirus containing the VEGF sequence in DHVEGF´s pancreas, increase in VEGF, FLT1 and KDR gene expression (p <0.05) was observed, accompanied by the increase of vascular Vv and insulinemia. The results suggest that it is possible to obtain a diabetic animal model induced by diet, that VEGF and its receptors participate in the development and establishment of the diabetic state, leading to a reduction of pancreas vascularization, and that the increase of transgene expression in the pancreas of diabetic mice may contribute to the revascularization and function of pancreatic B cells.
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Desenvolvimento de modelos animais de terapia gênica para o hormônio de crescimento utilizando queratinócitos transduzidos e injeção direta de DNA plasmidial / Development of animal models of growth hormone gene therapy using transduced keratinocytes and direct injection of naked DNAOliveira, Nélio Alessandro de Jesus 03 December 2010 (has links)
Queratinócitos são células bastante atrativas para a transferência gênica ex vivo e liberação sistêmica, uma vez que as proteínas secretadas por estas células podem atingir a circulação via um mecanismo similar ao processo natural. No presente trabalho, queratinócitos transduzidos mediante um vetor retroviral com o gene do hormônio de crescimento de camundongo (mGH) foram submetidos a um tratamento de aderência ao colágeno e à análise clonal, com o intuito de enriquecer esta população de queratinócitos em células-tronco. O principal resultado foi um aumento da viabilidade celular in vitro dos queratinócitos tratados, que poderá se refletir num aumento da durabilidade da secreção do hormônio in vivo, quando realizado o implante de culturas organotípicas em camundongos anões imunodeficientes (lit/scid). Foi também utilizado um modelo de terapia gênica in vivo, baseado na eletrotransferência de DNA plasmidial (naked DNA), contendo o gene do hormônio de crescimento humano (hGH), no músculo quadríceps de camundongos anões (lit/lit) e anões imunodeficientes (lit/scid). Foram padronizadas as condições de eletroporação em 8 pulsos de 50 V e 20 ms com 0,5 s de intervalo, utilizando um plasmídeo com o promotor da ubiquitina C e a sequência genômica do hGH. A administração de uma dose única de 50 g do plasmídeo pUC-UBI-hGH em camundongos lit/scid, seguida de eletroporação, propiciou pela primeira vez na literatura obtenção de níveis sustentáveis na circulação de 1,5-3,0 ng hGH/ml, durante 60 dias. Esses animais tratados com DNA apresentaram um aumento de peso altamente significativo (P<0,001) de 33,1%, comparado a uma perda de peso, não significativa, no grupo controle (camundongos injetados com salina + eletroporação). Os músculos quadríceps dos animais tratados apresentaram um aumento de 48%, quando comparados aos dos animais do grupo controle (P<0,001). Outro estudo de eletrotransferência foi realizado comparando a utilização da sequência genômica do hGH (gDNA) com a complementar (cDNA), em plasmídeos sob o controle do promotor de citomegalovírus (CMV). Foi observado que o cDNA do hGH foi expresso de maneira mais eficiente na circulação de camundongos lit/scid, por um período de 21 dias. Foram também construídos vetores lentivirais com os genes do hGH (cDNA e gDNA) e do mGH (cDNA), que serão utilizados num próximo estudo, tanto para a transdução de queratinócitos, como para a eletrotransferência in vivo. Vetores lentivirais serão de fato necessários para futuros estudos devido a sua reduzida toxicidade em comparação com os retrovirais. Os resultados deste trabalho, assim como as perspectivas de estudo abertas, têm como meta estabelecer condições para que a terapia gênica seja num futuro próximo uma alternativa viável e segura para o tratamento da deficiência de GH e de outras doenças sistêmicas. / Keratinocytes are very attractive cells for ex vivo gene transfer and systemic delivery, since proteins secreted by these cells may reach the circulation via a mechanism which mimics the natural process. In this study, retrovirally transduced keratinocytes with the mouse growth hormone (mGH) gene underwent a treatment for adhesion to collagen and clonal analysis, in order to enrich in stem cells the keratinocyte population. The main result was an in vitro increase of cell viability for treated keratinocytes, which should result in an increase of the in vivo sustainability of hormone secretion, when implanting organotypic cultures onto immunodeficient dwarf (lit/scid) mice. A model for in vivo gene therapy based on the electrotransfer of human growth hormone (hGH)-coding naked DNA in the exposed quadriceps muscle of dwarf (lit/lit) and immunodeficient dwarf (lit/scid) mice was also utilized. Electroporation conditions were optimized, setting up eight 50-V pulses of 20 ms at a 0.5 s interval, using a plasmid containing the ubiquitin C promoter and the genomic hGH sequence. Administration of a single dose of 50 g of this plasmid led, for the first time in the literature, to sustained levels of circulating hGH of the order of 1.5-3 ng/ml, up to 60 days. The DNA-treated animals presented a highly significant weight gain (P<0.001) of 33.1%, compared to a non-significant weight loss of 4.2% for the control group (saline injected mice + electroporation). The injected quadriceps muscles of the DNA-treated mice showed a 48% weight increase, when compared to the control group (P<0.001). Another electrotransfer study was carried out comparing the use of the genomic hGH sequence (gDNA) with the complementary sequence (cDNA), cloned under the control of the cytomegalovirus (CMV) promoter. It was observed that hGH was more efficiently expressed in the circulation of lit/scid mice, for 21 days, when injecting cDNA. Lentiviral vectors containing the hGH (cDNA and gDNA) and the mGH (cDNA) genes were also constructed and will be used in a next study, both for the transduction of keratinocytes or for in vivo electrotransfer. Lentiviral vectors will in fact be necessary for future studies, considering their reduced toxicity when compared to retroviral vectors. The results of this work, as well as opening perspectives of new studies, will establish in the near future conditions for gene therapy as a feasible and safe option for the treatment of GH deficiency and other systemic diseases.
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