L'étude des populations de lymphocytes T CD4+ effecteurs (Teff) chez l'Homme présente un intérêt croissant dans les enjeux actuels que constitue l'élaboration de nouvelles immunothérapies. Ces travaux détaillent la caractérisation et la régulation d'une population de Teff exprimant l'ecto-nucléotidase CD73 ayant pour fonction de dégrader l'AMP extracellulaire en adénosine (Ado) immunosuppresseur. Cette population, enrichie en lymphocytes T helper de type Th1.17, est très polyfonctionelle et pro-inflammatoire. Les Teff CD73+ expriment peu de points de contrôles immunitaires inhibiteurs mais sont régulés par leur production autocrine d'Ado qui limite leurs fonctions effectrices et leurs capacités prolifératives. Les Teff CD73+ expriment par ailleurs fortement le transporteur ABC multidrug-resistance 1 (MDR1), responsable de l'exclusion de nombreuses drogues du cytoplasme des cellules. L'étude de cette population dans différents contextes pathologiques a permis de détailler le fonctionnement de cette population. J'ai pu mettre en évidence que l'expression de CD73 est en effet dynamique. Elle est notamment diminuée dans des pathologies arthritiques auto-immunitaires (la polyarthrite rhumatoïde et le rhumatisme psoriasique) dans lesquelles les Th17 et les Th1.17 sont fortement activés. La diminution d'expression de CD73 sur ces cellules constitue la levée d'un frein qui leur permet de contribuer pleinement à l'inflammation chronique caractérisant ces pathologies. Les Teff CD73+, présents dans les tumeurs solides humaines de sein et d'ovaire, pourraient en revanche présenter un avantage sélectif en contexte tumoral de par leur expression de MDR1 leur permettant de résister aux traitements de chimiothérapie. Ces traitements substrats de MDR1, combinés à des thérapies inhibant la fonction enzymatique de CD73, pourrait permettre la restauration d'une réponse immunitaire anti-tumorale efficace médiée par cette population pro-inflammatoire / Requirement for CD4+ effector T lymphocytes (Teff) comprehensive study in human is increasing since it can contribute to the emergence of new immunotherapy strategies. This work brings up important information concerning the characterization and regulation of a Teff population expressing the CD73 ecto-nucleotidase, which is able to degrade extracellular AMP into immunosuppressive adenosine (Ado). This population, highly polyfunctional and pro-inflammatory, is enriched in Th1.17 cells. CD73+ Teff express low levels of inhibitory immune checkpoints but are negatively regulated by the autocrine Ado production that limits their pro-inflammatory function and proliferative capacities. In addition, CD73+ Teff express high levels of the ABC transporter multi-drug resistance 1 (MDR1), responsible for the exclusion of cells’ cytoplasm of many drugs. The study of this population in different pathological contexts enabled to decipher its functions. I could evidence that CD73 expression is dynamic. CD73 is notably decreased in autoimmune arthritic pathologies (rheumatoid arthritis (RA) and psoriatic arthritis (PsA)) in which Th1.17 and Th17 are highly activated. CD73 decreased expression by these cells is a mechanism that alleviates self-inhibition by autocrine Ado production and enables them to fully contribute to chronic inflammation characterizing these pathologies. In tumor context, CD73+ Teff present in breast and ovarian tumors could on the contrary bear a selective advantage due to their high MDR1 expression enabling them to resist MDR1 substrates-based chemotherapy treatments. These chemotherapy treatments combined to therapies blocking CD73 enzymatic function could allow the restauration of an efficient anti-tumor immune response

Introdução: A artrite reumatóide (AR) é uma artropatia autoimune, de caráter inflamatório, com prevalência em torno de 1% da população. O tabagismo é considerado o principal fator de risco para o desenvolvimento da AR. O receptor de hidrocarbonetos de arila (AhR), um fator de transcrição intracelular ativado por hidrocarbonetos aromáticos componentes da fumaça do cigarro, foi identificado como alvo de regulação da diferenciação de células Th17. Objetivos: Avaliar se os polimorfismos genéticos do AhR estariam associados ao desenvolvimento da AR , e se este receptor estaria mais expresso em pacientes com AR. Pacientes e Métodos: Nós analisamos sete polimorfismos genéticos por mudança de única base (SNP) por PCR em tempo real utilizando sondas TaqMan em 138 pacientes com AR e 129 indivíduos saudáveis. A quantificação da expressão do mRNA do AhR em células mononucleares isoladas de pacientes com AR e indivíduos saudáveis foi realizada por PCR em tempo real. Resultados: Identificamos que haplótipos formados por SNPs no AhR estariam associados com desenvolvimento da AR, podendo ser fator protetor ou de risco para a doença. Em adição, os pacientes com haplótipos de risco apresentavam doença com índice de atividade elevado, principalmente quando o tabagismo estava presente. De fato, pacientes com AR apresentaram aumento na expressão de AhR (mRNA) em relação a indivíduos saudáveis. Conclusões: Em conjunto estes resultados sugerem que o AhR possui um papel importante para o desenvolvimento da artrite reumatóide. Possivelmente mutações neste receptor podem estar relacionadas com alterações na sua atividade e conseqüentemente na diferenciação de células Th17 e a susceptibilidade a AR. / Introduction: Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic autoimmune arthropaty with inflammatory characteristics and prevalence around 1% in the population. Tabagism is the main risk factor to RA development. The aryl hydrocarbon receptor (AhR) is an intracellular transcription factor activated by aromatic hydrocarbons present in smoking, whichwas identified to be a target of regulation of Th17 differentiation. Purpose: Study the relationship of genetic polymorphisms in AhR with RA development, and if this receptor expression is upregulated in RA patients. Patients and Methods: We analyzed seven genetic single nucleotide polymorphisms by Real-Time PCR using TaqMan probes in 138 patients with Rheumatoid Arthritis and 129 healthy controls. The AhR mRNA quantization in mononuclear cells isolated from AR patients and healthy controls has been done by Realt-Time PCR. Results: We identified that AhR haplotypes were associated with RA development and that they could be protector or risk factors to disease. In addition, patients with risk haplotypes showed higher disease activity index, mainly when smoking was present. Indeed, patients with RA showed upregulation in the AhR expression (mRNA) when compared with healthy controls. Conclusions: These results suggest that AhR has an important role in AR development. Probably, mutations in this receptor could be related with alterations in its activity and consequently in the differentiation of Th17 cells and RA susceptibility.

O diabetes tipo 1 (DM1) é uma doença autoimune caracterizada pela destruição das células b presentes nas ilhotas pancreáticas por linfócitos T auto-reativos, especialmente Th1 e Th17, levando o indivíduo a um estado de hiperglicemia. Embora existam diversos estudos que abordam a resposta imune adaptativa no contexto do DM1, poucos trabalhos tentaram elucidar o papel da resposta imune inata no desenvolvimento da doença. Neste contexto, avaliamos o perfil de expressão e o papel do receptor NLRP1 na patogênese do DM1 experimental e em humanos. Nossos dados apontam que no modelo de DM1 induzido por STZ, NLRP1 possui um papel protetor no desenvolvimento da doença de forma independente da ativação do inflamassoma, através da inibição da translocação de bactérias para os linfonodos pancreáticos (LNPs), além de reduzir a diferenciação de células Th17 e Tc17 nos LNPs, o que foi correlacionado à diminuição de IL-17 no pâncreas. Posteriormente, analisamos o papel de NLRP1 em outro modelo experimental, o NOD (nonobese diabetic), onde descrevemos que NLRP1 também é expresso no desenvolvimento da doença. Por fim, avaliamos o papel de NLRP1 em pacientes com DM1, através da genotipagem desses pacientes para um polimorfismo com ganho de função em NLRP1, o rs12150220. Ao contrário do que acontece em camundongos, NLRP1 em humanos parece ter um papel patogênico, uma vez que detectamos mais células T produtoras de IL-17 em células mononucleares do sangue periférico de indivíduos com o polimorfismo, além de níveis elevados da citocina no soro. Em suma, nossos dados apontam para papéis distintos de NLRP1 em camundongos e humanos com DM1, sugerindo cautela ao tentarmos transpor os achados sobre o receptor em camundongos para a clínica. / Type 1 diabetes (T1D) is an autoimmune disease that is caused by the destruction of the pancreatic b cells by autoreactive T cells, especially Th1 and Th17, leading to a state of hyperglycemia. Even though there are several studies on the role of the adaptive immune response in T1D, little is known about the role of an innate immune response in the development of the disease. Thus, we investigated the role of NLRP1 in the pathogenesis of mouse and human T1D. Our data indicate that in STZ-induced T1D, NLRP1 exerts a protective role in the development of the disease in an inflammasome-independent pathway, through the inhibition of bacterial translocation to the pancreatic lymph nodes (PLNs), and inhibition of the differentiation of Th17 and Tc17 cells in the PLNs, which correlated with decreased levels of IL-17 in the pancreas. Then, we analyzed the role of NLRP1 in nonobese diabetic (NOD) mice. We demonstrate that NLRP1 is also expressed in the development of T1D in this murine model. Lastly, we evaluated the role of NLRP1 in T1D patients, by genotyping these individuals for a polymorphism with a gain-of-function in NLRP1, the rs12150220. Unlike murine NLRP1, NLRP1 in humans appears to be pathogenic, considering that we detected more IL-17-producing T cells in peripheral blood mononuclear cells in patients carrying the polymorphism, besides elevated levels of this cytokine in the serum. Overall, our data suggest distinct roles for murine and human NLRP1 in the context of T1D, suggesting carefulness when translating the findings from murine NLRP1 to the clinic.

Em países tropicais como o Brasil, as micoses superficiais (dermatofitoses) são comumente encontradas. O Dermatófito mais comum é o Trichophyton rubrum (Tr). Mananas e galactomananas na parede do Tr podem suprimir a resposta celular ao fungo. Quanto à resposta imune antifúngica, sabe-se a importância da via Th17. Algumas lectinas do tipo C (CLRs) como o receptor de manose e/ou receptores similares a Toll (TLRs) regulam o equilíbrio entre as vias Th1 e Th17. Nossos objetivos foram obter um extrato antigênico de Tr que induza resposta imune celular; quantificar e qualificar a resposta imune de indivíduos controles com lesão branda e de pacientes com dermatofitose extensa e/ou persistente causadas pelo Tr e por fim, avaliar a expressão de CLRs em monócitos do sangue periférico nos mesmos grupos. Para tanto, produzimos 11 extratos antigênicos de Tr. Pudemos observar na eletroforese em gel de poliacrilamida proteínas com pesos moleculares de aproximadamente 70 kDa e 38 kDa para os extratos fúngicos: Extrato TCA - Meta 1, Extrato tindalizado G1 e Extrato Coca 1. Avaliamos a resposta linfoproliferativa de células mononucleares por incorporação de timidina triciada em controles e pacientes ao peptídeo YIIDTGIDID do fungo Tr (Tri R2) e aos extratos antigênicos produzidos em nosso laboratório. Utilizamos como estímulos: PWM, CMA, Tri R2, PMA/Ionomicina. Para os ensaios funcionais avaliamos quatro pacientes e 6 indivíduos controles. Para a fenotipagem das células Th17, Th17MEM, Tc17 e Tc17MEM por citometria de fluxo, utilizamos a análise Booleana no software FlowJo X. A avaliação da expressão dos CLRs: CD206 (Receptor de Manose), Dectin 1 e Dectin 2 em monócitos do sangue periférico de controles e pacientes foi efetuada por citometria de fluxo. Dos 11 extratos produzidos de Tr, 7 se mostraram bons estimuladores para pelo menos um dos controles analisados, expressos como ponto máximo de índice de estimulação (p.m.I.E.). Dentre eles destacamos: Extrato TCA - Meta 1 (p.m. I.E. = 14,49 em 5 ug/mL), Extrato Tindalizado G1 (p.m.I.E. = 23,00 em 2,5 ug/mL) e Extrato Coca 1 (p.m.I.E. = 173,36 em 0,31 ug/mL). Na avaliação da expressão dos receptores das células Th17 e Tc17 (Th17R e Tc17R, respectivamente) após seis dias de estímulo por: Tri R2, extrato Coca 1 e o extrato TCA - Meta 1, o extrato Coca se mostrou o melhor estimulador para as populações Th17, com a frequência de 8,40% (controle) e 12,30% (paciente 1). Na avaliação da expressão de Th17R e Tc17R por 6 horas ao estímulo por PMA/Iono, todos os controles (n=3) se mostraram responsivos e no grupo de pacientes (n=3) pudemos observar maior frequência para o paciente 1 nas populações Th17 (1,64%) e Th17MEM (3,27%), e para as células Tc17 (10,70%) e Tc17MEM (3,58%). Observamos redução da expressão de CLRs nos pacientes: CD206: média 60,24% (controles) e 21,27% (pacientes), Dectin 1: 22,42% (controles) e 12,06% (pacientes) e Dectin 2: 20,26% (controles) e 4,99% (pacientes). Controles (n=6) e pacientes (n=3). A inovação na produção de extrato antigênico Extrato TCA - Meta 1 encoraja o estudo dos extratos fúngicos, para se obter melhores condições de avaliações imunológicas em pacientes com dermatofitose. Caracterizamos e qualificamos a resposta imune celular frente ao peptídeo TriR2 e aos extratos antigênicos, além de avaliarmos a expressão dos CLRs nesse grupo especial de pacientes / In tropical countries like Brazil, superficial fungal infections (dermatophytosis) are commonly found. The most common dermatophyte is Trichophyton rubrum (Tr). Mannans and galactomannans of Tr cell wall can suppress cellular responses to the fungus. Regarding the antifungal immune response, the importance of Th17 pathway is warranted. Some C-type lectins (CLRs) as the mannose receptor and / or Toll-like receptors (TLRs) regulate the balance between Th1 and Th17 pathways. Our objectives were to obtain an antigenic extract of Tr to induce cellular immune response; to quantify and classify the immune response of control subjects with mild injury and patients with extensive and / or persistent dermatophytosis caused by Tr, and finally evaluating the expression of CLRs in peripheral blood monocytes in the same groups. Therefore, we produced 11 antigenic extracts of Tr. Proteins with molecular weights of approximately 70 kDa and 38 kDa were evidenced in polyacrylamide gel electrophoresis for the following fungal extracts: extract TCA - Target 1, Tindalized extract G1 and extract Coca 1. We assessed the lymphoproliferative response of mononuclear cells by tritiated thymidine incorporation in the controls and patients, stimulated by YIIDTGIDID peptide fungus Tr (Tri R2) and the antigenic extracts produced in our laboratory. We used as stimuli: PWM, CMA, Tri R2, and PMA/Iono. For functional assays we evaluated four patients and 6 control individuals. For the phenotyping of Th17 cells, Th17MEM, Tc17 and Tc17MEM by flow cytometry, we used a Boolean analysis performed by FlowJo X software. Evaluation of the expression of CLRs: CD206 (mannose receptor), Dectin 1 and Dectin 2 in peripheral blood monocytes from patients and controls was performed by flow cytometry. Of the 11 extracts produced from Tr, seven proved to be able to stimulate proliferation of peripheral blood mononuclear cells of at least one of the analyzed controls, expressed as peak stimulation index (p.m.I.E.). Among them, were included: extract TCA - Target 1 (pmIE = 14.49 at 5 ug /mL), Tindalized G1 Extract (pmIE = 23,00 at 2.5 ug /mL) and extract Coca 1 (pmIE = 173.36 at 0.31 ug /mL). In the evaluation of the expression of receptors of Th17 cells and Tc17 (Th17R and Tc17R, respectively) after six days of stimulation by: Tri R2, Coca extract and the extract TCA 1 - Meta 1, Coca extract showed to be the best stimulator for Th17 populations, with the frequency of 8.40% (control) and 12.30% (patient 1). In the evaluation of the expression of Th17R and Tc17R after 6 hours of stimulation by PMA / Iono, all controls (n = 3) responded and in the group of patients (n = 3) we observed response more frequently for the patient #1, in Th17 populations (1.64%), Th17MEM (3.27%), Tc17 cells (10.70%) and Tc17MEM (3.58%). We observed a reduction of expression of CLRs in patients: CD206: average 60.24% (controls) and 21.27% (patients), Dectin 1: 22.42% (controls) and 12.06% (patients) and Dectin2: 26% (controls) and 4.99% (patients). Controls (n = 6) and patients (n = 3). Innovation in the production of antigenic extract extract TCA - Target 1 encourages the study of fungal extracts to obtain better conditions of evaluation of the immune response in patients with dermatophytosis. We characterized and qualified the cellular immune response to the TriR2 peptide, to antigen extracts, and evaluated the expression of CLRs in this special group of patients

Selon les facteurs solubles de l’environnement (cytokines), les monocytes peuvent se différencier en macrophages (Mφ) ou en cellules dendritiques. Mes travaux de thèse montrent que l’IL-34, un second ligand du M-CSF-R (c-fms ou CD115), induit la différenciation de monocytes humains en macrophages CD14+ CD163+ (IL-34-Mφ), phénotypiquement et fonctionnellement similaires aux M-CSF-Mφ et aux macrophages associés aux tumeurs (TAM) isolés du cancer de l’ovaire. Ils possèdent des propriétés immunosuppressives et diminuent la prolifération des lymphocytes T CD4+ activés. Comme les Mφ orchestrent la réponse immunitaire, j’ai évalué la capacité des M-CSF-Mφ, IL-34-Mφ et des TAM à polariser les LT CD4+ mémoires. Les résultats montrent qu’ils polarisent des LT non-Th17 mémoires en LTh17 CCR4+ CCR6+ CD161+ conventionnels exprimant ou non de l’IFN. Ce processus est médié par l’expression constitutive de l’IL-1α membranaire exprimées sur ces macrophages.Dans le but d’identifier des stratégies pour prévenir l’accumulation de ces Mφ dans le cancer, j’ai montré que (i) l’IFNγ et le GM-CSF inhibent la différenciation des M-CSF-Mφ et IL-34-Mφ et que (ii) l’IFNγ permet la réversion des M-CSF-Mφ et IL-34-Mφ en Mφ immunostimulants. En conclusion, mes travaux montrent que les M-CSF-Mφ, IL-34-Mφ et les TAM, considérés initialement comme anti-inflammatoires, induisent la génération de lymphocytes Th17 via une expression constitutive de l’IL-1α. Ce processus pourrait contribuer à maintenir, localement, une inflammation modérée nécessaire au développement tumoral. / According to the soluble factors in the environment (cytokines), monocytes differentiate into macrophages (Mϕ) or dendritic cells. This project demonstrates that IL-34, a second ligand of the M-CSF receptor (c-fms or CD115), induces the differentiation of human monocytes into CD14high CD163 high Mφ (IL-34-Mφ), phenotypically and functionally similar to M-CSF-Mφ and to tumorassociated macrophages (TAM) isolated from the ovarian cancer. They exhibit potent immunosuppressive properties and decrease the proliferation of stimulated Tcells. As Mφ orchestrate the immune response, I have evaluated the capacity of M-CSF-Mφ, IL-34-Mφ and TAM to polarize human memory CD4+ T cells. Unexpectedly, results showed that they switch non- Th17 memory CD4+ T cells into conventional CCR4+ CCR6+ CD161+ Th17 cells, expressing or not IFNγ. This process is mediated by the constitutive expression of membrane IL-1α on these Mϕ subsets. In an attempt to identify strategies to prevent an accumulation of immunomodulatory Mϕ in cancer, I have shown that (i) IFNγ and GM-CSF prevent M-CSFandIL-34-induced monocyte differentiation into immunosuppressive Mφ and (ii) that IFNγ switchesestablished M-CSF-Mφ and IL-34-Mφ into immunostimulatory Mφ. In conclusion, this study demonstrates that human MCSF- Mφ, IL-34-Mφ and TAM initially considered as antiinflammatorycells, induce in vitro Th17 cell generation via a constitutive expression of membrane IL-1α. This process may contribute to maintain locally a restrained and smoldering inflammation required for angiogenesis and metastasis in tumors.

Les cellules T auxiliaires TH17 sont caractérisées par l’expression de la cytokine IL-17A, ainsi que le facteur de transcription RORɣt. Elles sont connues pour jouer un rôle clé dans la pathogenèse de la sclérose en plaques. Ces cellules existent sous deux formes : les cellules régulatrices, immunomodulatrices, et les cellules pathogènes qui sont critiques pour l'inflammation. Il est donc important de comprendre le mécanisme qui sous-tend la différenciation des cellules TCD4+ naïves en ces deux types cellulaires. J'ai trouvé que le facteur de transcription Ikaros est un répresseur indirect de la transcription des gènes pathogéniques (Il3, Csf2, Ifng, Stat4…) dans les cellules TCD4+ naïves murines, cultivées pour induire une polarisation vers le phénotype TH17 régulateur. De plus, en absence d’Ikaros et en conditions de culture régulatrice, l’ajout d’IL-6 seul augmente l’expression de GM-CSF, facteur clé dans l’induction des maladies auto-immunes, suggérant un rôle d’Ikaros dans la régulation de cette voie. En conclusion, nos résultats suggèrent que Ikaros est nécessaire pour polariser correctement les cellules TCD4+ naïves dans le programme TH17. / TH17 cells are characterized by the expression of the cytokine IL-17A, as well as the transcription factor RORɣt. They are known to play key role in the pathogenesis of the multiple sclerosis. These cells exist in two forms: the regulating cells, immunomodulatory, and the pathogenic cells which are critical for the inflammation. Thus it is important to understand the mechanism which underlies the differentiation of naïve CD4+ T cells in these two cellular types. I found that the transcription factor Ikaros is an indirect repressor of the transcription of pathogenic genes (Il3, Csf2, Ifng, Stat4…) in naïve CD4+ T cells, cultured to induce a polarization toward regulatory TH17 cells. Moreover, in absence of Ikaros and in regulatory condition of culture, adding IL-6 alone increases the expression of GM-CSF, key factor to induce auto-immune diseases, suggesting a role of Ikaros in this pathway. In conclusion, our results suggest that Ikaros is necessary to polarize correctly naïve CD4+ T cells in TH17 cells.

Introdução: A artrite reumatóide (AR) é uma artropatia autoimune, de caráter inflamatório, com prevalência em torno de 1% da população. O tabagismo é considerado o principal fator de risco para o desenvolvimento da AR. O receptor de hidrocarbonetos de arila (AhR), um fator de transcrição intracelular ativado por hidrocarbonetos aromáticos componentes da fumaça do cigarro, foi identificado como alvo de regulação da diferenciação de células Th17. Objetivos: Avaliar se os polimorfismos genéticos do AhR estariam associados ao desenvolvimento da AR , e se este receptor estaria mais expresso em pacientes com AR. Pacientes e Métodos: Nós analisamos sete polimorfismos genéticos por mudança de única base (SNP) por PCR em tempo real utilizando sondas TaqMan em 138 pacientes com AR e 129 indivíduos saudáveis. A quantificação da expressão do mRNA do AhR em células mononucleares isoladas de pacientes com AR e indivíduos saudáveis foi realizada por PCR em tempo real. Resultados: Identificamos que haplótipos formados por SNPs no AhR estariam associados com desenvolvimento da AR, podendo ser fator protetor ou de risco para a doença. Em adição, os pacientes com haplótipos de risco apresentavam doença com índice de atividade elevado, principalmente quando o tabagismo estava presente. De fato, pacientes com AR apresentaram aumento na expressão de AhR (mRNA) em relação a indivíduos saudáveis. Conclusões: Em conjunto estes resultados sugerem que o AhR possui um papel importante para o desenvolvimento da artrite reumatóide. Possivelmente mutações neste receptor podem estar relacionadas com alterações na sua atividade e conseqüentemente na diferenciação de células Th17 e a susceptibilidade a AR. / Introduction: Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic autoimmune arthropaty with inflammatory characteristics and prevalence around 1% in the population. Tabagism is the main risk factor to RA development. The aryl hydrocarbon receptor (AhR) is an intracellular transcription factor activated by aromatic hydrocarbons present in smoking, whichwas identified to be a target of regulation of Th17 differentiation. Purpose: Study the relationship of genetic polymorphisms in AhR with RA development, and if this receptor expression is upregulated in RA patients. Patients and Methods: We analyzed seven genetic single nucleotide polymorphisms by Real-Time PCR using TaqMan probes in 138 patients with Rheumatoid Arthritis and 129 healthy controls. The AhR mRNA quantization in mononuclear cells isolated from AR patients and healthy controls has been done by Realt-Time PCR. Results: We identified that AhR haplotypes were associated with RA development and that they could be protector or risk factors to disease. In addition, patients with risk haplotypes showed higher disease activity index, mainly when smoking was present. Indeed, patients with RA showed upregulation in the AhR expression (mRNA) when compared with healthy controls. Conclusions: These results suggest that AhR has an important role in AR development. Probably, mutations in this receptor could be related with alterations in its activity and consequently in the differentiation of Th17 cells and RA susceptibility.

Leprosy is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae. It is estimated that less than 1% of the individuals infected with M. leprae develop the disease. Several authors suggest that the genetic pattern and variations in the mechanisms of the patient's immune response influence the susceptibility or resistance to disease. The most recent studies have established the role of Th1, Th2 and Treg cell responses in immunopathogenesis of leprosy. However, several mechanisms of the immune response that act in clinical evolution still lack clarification, such as the role of Th17 cells, and the innate immune response. The objective of this study was to evaluate the role of the immune response in the clinical presentation of leprosy and the use of M. leprae recombinant antigens as a perspective for the development of prognostic and immunoprophylaxis tools. To investigate the involvement of immune response in the pathogenesis of leprosy, we analyzed the cytokine profile in lesions, in serum, and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) stimulated with M. leprae antigens in leprosy patients and household contactants (HHC). CD4+IL-17+ T cells expressing IL-17A, IFN-γ and IL-10 were evaluated by confocal microscopy in lesions from patients with tuberculoid (TT, n = 09) and lepromatous leprosy (LL, n = 08). Inflammatory cytokines were measured in serum samples from 23 paucibacillary (PB) patients, 28 multibacillary (MB) and 23 HHC, using the Luminex technique. The phenotype of lymphocytes producing IL-17A and IFN-γ was determined by flow cytometry. In addition, PBMC from leprosy patients and HHC were stimulated with crude M. leprae (MLCS) and M. tuberculosis (PPD) and a recombinant antigen of M. leprae (ML2028), and the cytokine profile and the CD4+ and CD8+ multifunctional T cells (producing IFN-γ, IL-2 or TNF-α) of effector and central memory were analyzed. We observed that TT lesions expressed more CD4+IL-17A+ cells than LL. Higher levels of IFN-γ were detected in PB patients, but also in MB patients who presented leprosy reactions (LR) at the time of evaluation (MB LR+). Significantly, higher concentrations of IL-17A and IL-1β were observed in serum from PB than in from MB patients. Ex vivo cell analysis by flow cytometry revealed higher frequency of Th17 cells in TT than LL patients, and it is not high in LL patients with LR. These results indicate that the Th17 cells are associated with an effective inflammatory response that occurs in PB presentation of leprosy but were not associated with the inflammatory response in LR. Th1 response was also associated with PB presentation. However, high levels of IFN-γ were also associated with LR. Multiparameter analyzes by flow cytometry revealed a higher frequency of multifunctional T cells specific for M. leprae antigens in HHC than in leprosy patients, and it might explain the absence of disease in these individuals. These data indicate that these antigens are capable of inducing a more effective immune response and multifunctional T cell memory against M. leprae infection, and open perspectives for the future development of immunoprophylaxis with M. leprae antigens. Additionally, this study suport the attempt to induce a Th1 and Th17 response in individuals at risk of acquiring the disease, even considering this could induce only a partial protection, because it would protect against the most severe MB forms of leprosy, and reduce the disease transmission. This Thesis includes one paper accepted for publication, about the role of Th1 and Th17 cells in subjects with different clinical forms of leprosy, and another paper submitted about the immune response to M. leprae crude and recombinant antigens. / A Hanseníase é uma doença infecciosa crônica e de evolução lenta causada pelo Mycobacterium leprae. A literatura sugere que menos de 1% dos indivíduos infectados pelo bacilo evolui com a doença. O padrão genético dos indivíduos e diferenças nos mecanismos da resposta imune do paciente influenciam na susceptibilidade ou resistência à infecção e apresentação clínica da doença. Os estudos mais recentes estabeleceram o papel das respostas de células Th1, Th2 e Treg na imunopatogênese da hanseníase. No entanto, diversos mecanismos das células Th17 e o papel da resposta imune inata na doença ainda não estão bem estabelecidos. Diante disso, este estudo teve como objetivo avaliar o papel da resposta imune na apresentação clínica da hanseníase e o uso de antígenos brutos e recombinante de M. leprae como perspectiva para o desenvolvimento de ferramentas de prognóstico e imunoprofilaxia. Para investigar o envolvimento das células da resposta imune na patogênese da hanseníase, analisamos o perfil de citocinas em lesões, nos soros, e em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) estimuladas com antígenos de M. leprae em pacientes com hanseníase e controles contactantes sadios (CCS). As células T CD4+IL-17+ e que expressam IL-17A, IFN- e IL-10 foram avaliadas por microscopia confocal em biópsias de lesões de pacientes com hanseníase tuberculóide (HT, n = 9) e virchowiana (HV, n = 8). As citocinas inflamatórias foram dosadas em amostras de soro de 23 paucibacilares (PB), 28 multibacilares (MB) e em 23 CCS, pela técnica de Luminex. O fenótipo de linfócitos produtores de IL-17A e IFN-γ foi determinado por citometria de fluxo. Além disso, PBMC de pacientes com hanseníase e de CCS foram estimuladas com os antígenos brutos de M. leprae (MLCS), M. tuberculosis (PPD) e recombinante de M. leprae, (ML2028), e o perfil de citocinas e o fenótipo das células T CD4+ e CD8+ multifuncionais (produtoras de IFN-γ, IL-2 ou TNF-α) de memória efetora e central foram analisados. Observamos que as lesões de HT expressaram mais células CD4+IL-17A+ do que as de HV. Níveis mais elevados de IFN-γ sérico foram detectados em pacientes com as formas HT e em MB que apresentavam reações hansênicas (MB RH+). Concentrações mais elevadas de IL-17A e IL-1β foram observadas nos soros de pacientes PB do que em MB. As análises das células ex vivo por citometria de fluxo revelaram maior frequência de células Th17 nos pacientes com hanseníase tuberculóide (HT) em comparação com aqueles com hanseníase virchowiana (HV). Estes resultados indicam que a resposta Th17 está associada a uma resposta inflamatória efetiva que se apresenta nas formas PB, mas não estão associadas à resposta inflamatória durante as reações hansênicas. A resposta Th1 também está associada às formas PB, entretanto altos níveis de IFN-γ foram associados também aos episódios de reação hansênica. As análises multiparamétricas por citometria de fluxo revelaram maior frequência de células T multifuncionais antígeno-específicas em CCS, do que em pacientes com hanseníase. Nossos dados indicam que controles contactantes, quando estimulados com antígenos brutos e com o ML2028 recombinante, produziram mais células T multifuncionais e isto sugere que estas células proporcionam uma resposta imunológica mais eficaz contra a infecção por M. leprae, podendo explicar a ausência de doença nesses indivíduos. Estes dados sugerem que esses antígenos são capazes de induzir uma resposta protetora e indutora de células T multifuncionais de memória e abrem perspectivas para o desenvolvimento futuro de imunoprofilaxia com estes antígenos de M. leprae. Além disso, o estudo dá suporte à busca de induzir uma resposta Th1 e Th17 em indivíduos em risco de adquirir a doença, mesmo que haja uma proteção parcial, pois neste caso haveria uma proteção contra formas mais graves MB, e reduziria também a transmissão da doença. Esta tese é composta por um artigo aceito para publicação sobre a resposta de células Th17 e Th1 nas formas clínicas da hanseníase e outro submetido sobre a resposta a antígenos recombinantes de M. leprae na indução de células T multifuncionais.

O diabetes tipo 1 (DM1) é uma doença autoimune caracterizada pela destruição das células b presentes nas ilhotas pancreáticas por linfócitos T auto-reativos, especialmente Th1 e Th17, levando o indivíduo a um estado de hiperglicemia. Embora existam diversos estudos que abordam a resposta imune adaptativa no contexto do DM1, poucos trabalhos tentaram elucidar o papel da resposta imune inata no desenvolvimento da doença. Neste contexto, avaliamos o perfil de expressão e o papel do receptor NLRP1 na patogênese do DM1 experimental e em humanos. Nossos dados apontam que no modelo de DM1 induzido por STZ, NLRP1 possui um papel protetor no desenvolvimento da doença de forma independente da ativação do inflamassoma, através da inibição da translocação de bactérias para os linfonodos pancreáticos (LNPs), além de reduzir a diferenciação de células Th17 e Tc17 nos LNPs, o que foi correlacionado à diminuição de IL-17 no pâncreas. Posteriormente, analisamos o papel de NLRP1 em outro modelo experimental, o NOD (nonobese diabetic), onde descrevemos que NLRP1 também é expresso no desenvolvimento da doença. Por fim, avaliamos o papel de NLRP1 em pacientes com DM1, através da genotipagem desses pacientes para um polimorfismo com ganho de função em NLRP1, o rs12150220. Ao contrário do que acontece em camundongos, NLRP1 em humanos parece ter um papel patogênico, uma vez que detectamos mais células T produtoras de IL-17 em células mononucleares do sangue periférico de indivíduos com o polimorfismo, além de níveis elevados da citocina no soro. Em suma, nossos dados apontam para papéis distintos de NLRP1 em camundongos e humanos com DM1, sugerindo cautela ao tentarmos transpor os achados sobre o receptor em camundongos para a clínica. / Type 1 diabetes (T1D) is an autoimmune disease that is caused by the destruction of the pancreatic b cells by autoreactive T cells, especially Th1 and Th17, leading to a state of hyperglycemia. Even though there are several studies on the role of the adaptive immune response in T1D, little is known about the role of an innate immune response in the development of the disease. Thus, we investigated the role of NLRP1 in the pathogenesis of mouse and human T1D. Our data indicate that in STZ-induced T1D, NLRP1 exerts a protective role in the development of the disease in an inflammasome-independent pathway, through the inhibition of bacterial translocation to the pancreatic lymph nodes (PLNs), and inhibition of the differentiation of Th17 and Tc17 cells in the PLNs, which correlated with decreased levels of IL-17 in the pancreas. Then, we analyzed the role of NLRP1 in nonobese diabetic (NOD) mice. We demonstrate that NLRP1 is also expressed in the development of T1D in this murine model. Lastly, we evaluated the role of NLRP1 in T1D patients, by genotyping these individuals for a polymorphism with a gain-of-function in NLRP1, the rs12150220. Unlike murine NLRP1, NLRP1 in humans appears to be pathogenic, considering that we detected more IL-17-producing T cells in peripheral blood mononuclear cells in patients carrying the polymorphism, besides elevated levels of this cytokine in the serum. Overall, our data suggest distinct roles for murine and human NLRP1 in the context of T1D, suggesting carefulness when translating the findings from murine NLRP1 to the clinic.

Leprosy is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae. It is estimated that less than 1% of the individuals infected with M. leprae develop the disease. Several authors suggest that the genetic pattern and variations in the mechanisms of the patient's immune response influence the susceptibility or resistance to disease. The most recent studies have established the role of Th1, Th2 and Treg cell responses in immunopathogenesis of leprosy. However, several mechanisms of the immune response that act in clinical evolution still lack clarification, such as the role of Th17 cells, and the innate immune response. The objective of this study was to evaluate the role of the immune response in the clinical presentation of leprosy and the use of M. leprae recombinant antigens as a perspective for the development of prognostic and immunoprophylaxis tools. To investigate the involvement of immune response in the pathogenesis of leprosy, we analyzed the cytokine profile in lesions, in serum, and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) stimulated with M. leprae antigens in leprosy patients and household contactants (HHC). CD4+IL-17+ T cells expressing IL-17A, IFN-γ and IL-10 were evaluated by confocal microscopy in lesions from patients with tuberculoid (TT, n = 09) and lepromatous leprosy (LL, n = 08). Inflammatory cytokines were measured in serum samples from 23 paucibacillary (PB) patients, 28 multibacillary (MB) and 23 HHC, using the Luminex technique. The phenotype of lymphocytes producing IL-17A and IFN-γ was determined by flow cytometry. In addition, PBMC from leprosy patients and HHC were stimulated with crude M. leprae (MLCS) and M. tuberculosis (PPD) and a recombinant antigen of M. leprae (ML2028), and the cytokine profile and the CD4+ and CD8+ multifunctional T cells (producing IFN-γ, IL-2 or TNF-α) of effector and central memory were analyzed. We observed that TT lesions expressed more CD4+IL-17A+ cells than LL. Higher levels of IFN-γ were detected in PB patients, but also in MB patients who presented leprosy reactions (LR) at the time of evaluation (MB LR+). Significantly, higher concentrations of IL-17A and IL-1β were observed in serum from PB than in from MB patients. Ex vivo cell analysis by flow cytometry revealed higher frequency of Th17 cells in TT than LL patients, and it is not high in LL patients with LR. These results indicate that the Th17 cells are associated with an effective inflammatory response that occurs in PB presentation of leprosy but were not associated with the inflammatory response in LR. Th1 response was also associated with PB presentation. However, high levels of IFN-γ were also associated with LR. Multiparameter analyzes by flow cytometry revealed a higher frequency of multifunctional T cells specific for M. leprae antigens in HHC than in leprosy patients, and it might explain the absence of disease in these individuals. These data indicate that these antigens are capable of inducing a more effective immune response and multifunctional T cell memory against M. leprae infection, and open perspectives for the future development of immunoprophylaxis with M. leprae antigens. Additionally, this study suport the attempt to induce a Th1 and Th17 response in individuals at risk of acquiring the disease, even considering this could induce only a partial protection, because it would protect against the most severe MB forms of leprosy, and reduce the disease transmission. This Thesis includes one paper accepted for publication, about the role of Th1 and Th17 cells in subjects with different clinical forms of leprosy, and another paper submitted about the immune response to M. leprae crude and recombinant antigens. / A Hanseníase é uma doença infecciosa crônica e de evolução lenta causada pelo Mycobacterium leprae. A literatura sugere que menos de 1% dos indivíduos infectados pelo bacilo evolui com a doença. O padrão genético dos indivíduos e diferenças nos mecanismos da resposta imune do paciente influenciam na susceptibilidade ou resistência à infecção e apresentação clínica da doença. Os estudos mais recentes estabeleceram o papel das respostas de células Th1, Th2 e Treg na imunopatogênese da hanseníase. No entanto, diversos mecanismos das células Th17 e o papel da resposta imune inata na doença ainda não estão bem estabelecidos. Diante disso, este estudo teve como objetivo avaliar o papel da resposta imune na apresentação clínica da hanseníase e o uso de antígenos brutos e recombinante de M. leprae como perspectiva para o desenvolvimento de ferramentas de prognóstico e imunoprofilaxia. Para investigar o envolvimento das células da resposta imune na patogênese da hanseníase, analisamos o perfil de citocinas em lesões, nos soros, e em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) estimuladas com antígenos de M. leprae em pacientes com hanseníase e controles contactantes sadios (CCS). As células T CD4+IL-17+ e que expressam IL-17A, IFN- e IL-10 foram avaliadas por microscopia confocal em biópsias de lesões de pacientes com hanseníase tuberculóide (HT, n = 9) e virchowiana (HV, n = 8). As citocinas inflamatórias foram dosadas em amostras de soro de 23 paucibacilares (PB), 28 multibacilares (MB) e em 23 CCS, pela técnica de Luminex. O fenótipo de linfócitos produtores de IL-17A e IFN-γ foi determinado por citometria de fluxo. Além disso, PBMC de pacientes com hanseníase e de CCS foram estimuladas com os antígenos brutos de M. leprae (MLCS), M. tuberculosis (PPD) e recombinante de M. leprae, (ML2028), e o perfil de citocinas e o fenótipo das células T CD4+ e CD8+ multifuncionais (produtoras de IFN-γ, IL-2 ou TNF-α) de memória efetora e central foram analisados. Observamos que as lesões de HT expressaram mais células CD4+IL-17A+ do que as de HV. Níveis mais elevados de IFN-γ sérico foram detectados em pacientes com as formas HT e em MB que apresentavam reações hansênicas (MB RH+). Concentrações mais elevadas de IL-17A e IL-1β foram observadas nos soros de pacientes PB do que em MB. As análises das células ex vivo por citometria de fluxo revelaram maior frequência de células Th17 nos pacientes com hanseníase tuberculóide (HT) em comparação com aqueles com hanseníase virchowiana (HV). Estes resultados indicam que a resposta Th17 está associada a uma resposta inflamatória efetiva que se apresenta nas formas PB, mas não estão associadas à resposta inflamatória durante as reações hansênicas. A resposta Th1 também está associada às formas PB, entretanto altos níveis de IFN-γ foram associados também aos episódios de reação hansênica. As análises multiparamétricas por citometria de fluxo revelaram maior frequência de células T multifuncionais antígeno-específicas em CCS, do que em pacientes com hanseníase. Nossos dados indicam que controles contactantes, quando estimulados com antígenos brutos e com o ML2028 recombinante, produziram mais células T multifuncionais e isto sugere que estas células proporcionam uma resposta imunológica mais eficaz contra a infecção por M. leprae, podendo explicar a ausência de doença nesses indivíduos. Estes dados sugerem que esses antígenos são capazes de induzir uma resposta protetora e indutora de células T multifuncionais de memória e abrem perspectivas para o desenvolvimento futuro de imunoprofilaxia com estes antígenos de M. leprae. Além disso, o estudo dá suporte à busca de induzir uma resposta Th1 e Th17 em indivíduos em risco de adquirir a doença, mesmo que haja uma proteção parcial, pois neste caso haveria uma proteção contra formas mais graves MB, e reduziria também a transmissão da doença. Esta tese é composta por um artigo aceito para publicação sobre a resposta de células Th17 e Th1 nas formas clínicas da hanseníase e outro submetido sobre a resposta a antígenos recombinantes de M. leprae na indução de células T multifuncionais.