Made available in DSpace on 2014-07-29T15:07:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Caroline Rocha de Oliveira Lima.pdf: 444731 bytes, checksum: f7805c76dff945571aca16f931a7c2a8 (MD5) Previous issue date: 2010-02-25 / In veterinary medicine, skin injuries represent a significant casuistry and require expensive therapies, considerable recovery time and often lead to unfavorable resolution. To establish an effective therapeutic protocol it is essential that the professional has a solid knowledge of the healing dynamic, as its phases, triggered events, features, as well as about the biological potential of the healing process coadjutants. Regarding these ones, it is known that phytotherapy has a wide range of botanical specimens with healing potential, and, among them, the barbatiman, native species of the Brazilian cerrado, by its antiseptic and astringent activities, becomes an attractive option for skin injures therapies. The chitosan biomaterial also has potential as coadjutant of the process, once it accelerates the triggering of the healing stages by its immunomodulatory property. To clarify the mechanism proposed by these agents, numerous tests are developed using laboratory animals, in order to give reliability to the therapy modality established. To follow clinical evolution in vivo, the clinical examination becomes essential, while morphometric analysis provide accurate data regarding the percentage of centripetal contraction of the lesions. Finally, the microscopic analysis is used to analyze the ultrastructure of the injured site, predominant kinds of cells in each stage and microscopic events triggered on the search for the morphofunctional restoration of the affected tissue. Considering it, with the development of this study it was aimed to evaluate the activity of 5% barbatiman cream (CB) and 5% chitosan cream (CQ) based therapeutic formulations, on the healing process of incisional skin wounds undergone healing by secondary intention, with rabbit as experimental model. In the first chapter it was performed a wide and detailed literature review about the topic of the study, which involved description of the target tissue, skin, hysiopathology of the healing process, barbatiman phytotherapic and chitosan biomaterial activities as healing coadjutants, use of laboratory animals in scientific research and evaluation methods of skin therapies. In the second chapter, it was tested the therapeutic activity of CB and CQ on healing of incisional cutaneous wounds with rabbit as experimental model, by daily clinical evaluation and morphometric analysis performed on days three, seven, 14 and 21 post-injury. There were performed four wounds on each animal, totaling 40 rabbits. Daily, all lesions of each animal received a specific topical therapy, which lasted for 21 consecutive days. First, we performed the antiseptic with 0.9% sodium chloride solution e and further applied treatment protocols themselves. In one of the protocols employed in cream barbatiman (CQ) in another cream chitosan (QC), and these were formulations tests. In the third protocol was the use of allantoin cream (positive control) and finally the cream neutral vehicle (negative control I). In other injury effected only without topical antiseptic and associated 0.9% sodium chloride solution (negative control II). The results showed that the CB and CQ contributed to the satisfactory progress of the healing process. Although there has been no statistical differences in the contraction percentage between the two treatments (CB and CQ), it was clinically observed that the wounds treated with CB showed better clinical responses than CQ. In the third chapter it was comparatively performed, by clinical and microscopic evaluations, the analysis of the action of CQ and CB in the wounds of the same animals that received the treatments from chapter two. For histological analysis, there were considered the predetermined period for morphometry and the samples were evaluated regarding the prevalence of polymorphic and mononuclear infiltrate, presence of necrosis, crust, granulation tissue, fibroplasia, angiogenesis, collagenization and skin reepithelialization. From the results obtained it can be affirmed that the activities attributed to barbatiman and chitosan contributed similarly to the satisfactory progress of the healing process, once both treatments did not differ significantly for any parameter considered in this study. It is suggested that therapeutic protocols chitosan and barbatiman based provided acute inflammation reduction, as much as promoted fibroblast activation, early development of connective tissue, neovascularization and tissue reepithelialization, providing proved effective and economically viable alternatives in the healing process. / Na clínica médica veterinária as injúrias cutâneas representam casuística significativa e cursam com terapias dispendiosas, tempo de recuperação considerável e resolução muitas vezes desfavorável. Para instituir um protocolo terapêutico eficaz é imprescindível que o profissional tenha conhecimento sólido da dinâmica cicatricial, como suas fases, eventos desencadeados, particularidades, bem como acerca do potencial biológico dos coadjuvantes do processo cicatricial. Quanto a estes últimos, sabe-se que a fitoterapia possui um leque variado de espécimes botânicos com potencial na cicatrização e dentre estes o barbatimão, espécie nativa do cerrado brasileiro, por suas atividades, antiséptica e adstringente, torna-se opção atraente quanto às terapias das injúrias cutâneas. O biomaterial quitosana também possui potencial como coadjuvante do processo, visto que por sua propriedade imunomoduladora acelera o desencadeamento das fases da cicatrização. Para esclarecer o mecanismo proposto por estes agentes, inúmeros ensaios são desenvolvidos, utilizando animais de laboratório, a fim de conferirem confiabilidade à modalidade terapêutica instituída. Para acompanhar a evolução clínica in vivo, o exame clínico torna-se essencial, enquanto que as análises morfométricas conferem dados precisos quanto ao percentual de contração centrípeta das lesões. Por último as análises microscópicas são empregadas para analisar a ultra-estrutura do sítio lesionado, tipos celulares predominantes em cada fase e eventos microscópicos desencadeados na busca do restabelecimento morfofuncional do tecido acometido. Diante do exposto, com o desenvolvimento desse estudo objetivou-se avaliar a atividade de formulações terapêuticas a base de creme de barbatimão a 5% (CB) e creme e quitosana a 5% (CQ) frente ao processo de cicatrização de feridas cutâneas incisionais submetidas à cicatrização por segunda intenção, tendo o coelho com o modelo experimental. No primeiro capítulo efetuou-se revisão de literatura ampla e detalhada do tema do estudo que envolveu descrição do tecido alvo, pele, fisiopatologia do processo cicatricial, atividade do fitoterápico barbatimão e do biomaterial quitosana como coadjuvantes da cicatrização, emprego de animais de laboratório em pesquisas científicas e métodos de avaliação das terapias cutâneas. No segundo capítulo, testou-se a atividade terapêutica dos CB e CQ na cicatrização de feridas cutâneas incisionais, por meio da avaliação clínica efetuada diariamente e morfométrica nos dias três, sete, 14 e 21 pós-lesão. Foram realizadas quatro feridas em cada animal, totalizando 40 coelhos. Diariamente, todas as lesões de cada animal receberam uma terapia tópica específica, que se estendeu durante 21 dias consecutivos. Primeiramente, realizava-se a antissepsia com solução de cloreto de sódio a 0,9% e na sequência aplicavam-se os protocolos terapêuticos propriamente ditos. Em um dos protocolos empregou-se creme de barbatimão (CQ), em outro creme de quitosana (CQ), sendo estas as formulações testes. No terceiro protocolo fez uso do creme de alantoína (controle positivo) e por ultimo o creme base (controle negativo I). Em outra lesão efetuou-se apenas antissepsia sem terapia tópica associada com solução de cloreto de sódio a 0,9% (controle negativo II). Os resultados apontaram que os CB e o CQ contribuíram para que o processo de cicatrização evoluísse satisfatoriamente. Embora não tenham ocorrido diferenças estatísticas no percentual de contração entre os dois tratamentos (CB e CQ), clinicamente, notouse que as feridas tratadas com CB apresentaram respostas clínicas superiores ao CQ. No terceiro capítulo efetuou-se comparativamente, por meio da avaliação clínica e microscópica, a ação dos CQ e CB nas feridas dos mesmos animais submetidas aos tratamentos do capítulo dois. Para as análises histológicas foram considerados os períodos pré-definidos para morfometria e as amostras foram avaliadas quanto à predominância de infiltrado polimorfo e mononuclear, presença de crosta-necrose, tecido de granulação, fibroplasia, angiogênese, colagenização e reepitelização cutânea. A partir dos resultados obtidos pode-se afirmar que as atividades implicadas ao barbatimão e a quitosana contribuíram de forma semelhante para que o processo de cicatrização evoluísse satisfatoriamente, visto que os dois tratamentos não diferiram significativamente para nenhum parâmetro considerado neste estudo. Sugere-se que os protocolos terapêuticos à base de barbatimão e quitosana proporcionaram redução da inflamação aguda, bem como promoveram ativação fibroblástica, desenvolvimento precoce de tecido conjuntivo, neovascularização e reepitelização tecidual, conferindo alternativas comprovadamente eficazes e economicamente viáveis em relação ao processo de cicatrização.

O objetivo deste estudo foi avaliar e comparar a reparação tecidual após incisões com os lasers de CO2 e de diodo, bisturi elétrico e convencional em língua e pele de 30 ratos Wistar. Incisões de 5 mm de comprimento por 2 mm de profundidade na pele, e de 2,5 mm de comprimento por 1 mm de profundidade na língua, foram feitas nestes tecidos, e os animais sacrificados nos intervalos de zero, 24, 48, 72 horas, 7 e 14 dias após as intervenções. Cortes histológicos foram obtidos das incisões e submetidos a 3 tipos de análises: quantificação do dano tecidual, de mastócitos e da densidade de colágeno tipo I. Os dados foram submetidos à análise estatística pelo teste ANOVA de Kruskal-Wallis e pelo teste de comparações múltiplas de Turkey-Kramer, com nível de significância estabelecida para P < 0,05. Os resultados mostraram que o dano tecidual na pele das incisões realizadas com lasers e bisturi elétrico foi significativamente maior do que o do bisturi convencional (P < 0,05). Quanto às incisões na língua, houve diferença significante de menor dano tecidual resultante da incisão do bisturi convencional comparado com o das incisões realizadas com laser de CO2 2 W, laser de diodo 4 W e bisturi elétrico (P < 0,05). A quantificação de mastócitos mostrou diferenças estatísticas entre as incisões realizadas com bisturi convencional em relação às outras incisões (lasers e bisturi elétrico), principalmente nas 48 e 72h, tanto na pele quanto na língua. Quanto à quantificação de colágeno, apenas no 7º dia houve diferença estatisticamente significante, ocorrendo maior quantidade de colágeno tipo I somente na incisão com bisturi convencional comparada com a do bisturi elétrico (P < 0.05). No 14º dia, os dados morfométricos de colágeno foram semelhantes em todas as técnicas utilizadas. Concluímos que no período final analisado do processo reparacional, os dados morfométricos foram semelhantes em todas as técnicas utilizadas, apesar das diferenças ocorridas quanto ao dano tecidual, quantificação de mastócitos e colágeno tipo I no início do processo. Em princípio, dentro de um mesmo padrão de incisão, todos os instrumentos cirúrgicos geraram um processo reparacional semelhante, variações entre eles podem estar associadas às características do tecido, como foi observado entre a pele e mucosa. / The aim of this study was to quantify and compare the healing process after incision with CO2 (2 W e 4 W) and diode lasers (2 W and 4 W), electrosurgery (2 W) and scalpel in the skin and tongue of Wistar rats (30 animals were used). One incision of each technique (6 in total) of 5 mm long and 2 mm deep was made in the dorsal skin and dorsal tongue. The animals were sacrificed at zero, 24, 48, 72 hours, 7 and 14 days after incisions. Histological sections were made from the wound areas and subjected to analyses of area of tissue damage, quantification of mast cells and density of collagen type I. The data were submitted to the ANOVA of Kruskal-Wallis and compared by Turkey-Kramer. The level of significance was set at 5% (P < 0.05). The results showed difference concerning area of tissue damage, occurring significant statistically difference between the incisions with scalpel compared with those of other techniques (lasers and electrosurgery) in skin (P < 0.05). On the tongue, there was statistical difference, with less tissue damage on scalpel incision compared with that of CO2 (2 W) and diode lasers (4 W) and electrosurgery incisions (P < 0.05). The quantification of mast in the incisions showed statistical differences between the incisions, especially in 48 and 72h, both on the skin and tongue. Concerning the collagen quantification, statistical difference was found only in 7 th day, the collagen types I was only more evident on scalpel incision than with the electrosurgery (P < 0.05). In 14 th day, the morphometric data were similar in all types of incisions. Based on these results, it is possible to conclude that at the end of the analyzed period, the morphometric data were similar in all techniques, even though there were differences concerning tissue damage, quantification of masts cell and collagen type I at the beginning of the process. Additionally, the healing process proceeds similarly in all this technique as long as the incisions are made in a similar pattern; variations may occur depending on the type of the tissue, as was shown here between the skin and tongue.

Nesta Dissertação de Mestrado foram estudadas as respostas inflamatórias e de reparo de tecido muscular de ratos a implantes de hidróxidos duplos lamelares (HDL) contendo íon cloreto e sulindaco (fármaco anti-inflamatório não-esteroidal - FAINE) em seu espaço interlamelar. As técnicas empregadas nesta investigação foram as espectroscopias Raman e de absorção no infravermelho (FTIR), a difratometria de raios X (XRD) e a análise histomorfológica dos tecidos corados pelas técnicas de Hematoxilina e Eosina (HE) (Michalany, 1990)(Michalany, 1990)(Michalany, 1990) e Picrosirius Red (Picro). Simulações do espectro vibracional foram feitas por DFT usando o pacote computacional Gaussian 09 e as análises estatísticas foram feitas usando o pacote Unscrambler X.10.1. Os experimentos in vivo foram realizados fazendo-se a implantação das pastilhas de HDL por microcirurgia entre as camadas do músculo externo oblíquo de ratos (Wistar) e como experimento controle foi feita a separação de tais camadas simulando um implante. Os tecidos foram coletados após 7, 21, 28 e 35 dias de pós operatório, divididos em duas porções (uma para análise histomorfológica e outra para análise por espectroscopia Raman). Inicialmente foram feitos os cálculos teóricos e a caracterização espectroscópica do sulindaco, que possibilitou melhorar sua atribuição vibracional encontrada na literatura. O mesmo ocorreu com as matrizes de HDL, de Zn(II) e de Mg(II), intercaladas com íons cloreto, o que também resultou em um aprimoramento da atribuição que é encontrada na literatura. Os dois HDLs intercalados com sulindaco também foram caracterizados espectroscopicamente e os espectros Raman mostraram grande semelhança com a espécie do fármaco desprotonado. O difratograma obtido dos intercalatos mostra expansão do espaçamento basal (de 7 Å para 26 Å) compatível com a intercalação do sulindaco inclinado em relação ao plano das lamelas. Os espectros Raman do tecido controle mostram alterações mais significativas nas banda amida I e amida III com o tempo de pós-operatório e por PCA foi possivel observar a nítida separação do grupo que apresenta um processo inflamatório agudo (7 dias). Os tecidos expostos à pastilha de HDL intercalada com íons cloreto, mostraram resposta inflamatória reduzida em relação ao tecido controle e as alterações espectrais observadas evidenciam a presença de colágenos, o que indica uma aceitação da pastilha por parte do organismo (biocompatibilidade). As pastilhas também foram analisadas espectroscopicamente e mostraram que houve incorporação de íons CO32- no espaço interlamelar, indicado pela presença da banda Raman em 1060 cm-1 (estiramento simétrico C-O nesse íon), mas não foi possivel determinar se eventuais variações no pH local exerceram efeitos na resposta inflamatória. No caso dos tecidos expostos à pastilha de HDL com sulindaco, a análise por microscopia Raman mostrou que o processo inflamatório foi significativamente reduzido, evidenciando uma ação local do fármaco, além do crescimento de colágenos do tipo III. A pastilha de HDL com sulindaco implantado foi analisada por FT-Raman e a liberação do fármaco foi confirmada. Os resultados de espectroscopia Raman de tecidos foram confirmados pela análise histomorfológica, que mostrou haver de fato um acúmulo de colágeno do tipo III nas regiões próximas às pastilhas implantadas, assim como a formação de invaginações e neovascularização. / In this Master\'s Thesis the inflammatory responses and tissue repair of rat muscles caused by implants of Lamellar Double Hydroxides (LDH) containing chloride ion and sulindac (anti-inflammatory non-steroidal drug - NSAID) in its interlayer space was studied. The techniques used in this research were the Raman spectroscopy and infrared absorption spectroscopy (FTIR), the X-ray diffraction (XRD) and the histomorphological analysis of tissues stained by techniques of Hematoxylin and Eosin (HE) and Picrosirius Red (Picro). Simulations of vibrational spectrum were made by DFT using the computational package Gaussian 09 and the statistical analyzes were performed using the Unscrambler X.10.1 package. In vivo experiments were performed by making the implantation of HDL tablets by microsurgery between the layers of the external oblique muscle of rats (Wistar) and as a control experiment the separation of the layers to simulate an implant was conducted. The tissues were collected after 7, 21, 28 and 35 days postoperatively, divided into two parts (one for histomorphological analysis and the other for analysis by Raman spectroscopy). Initially, theoretical calculations and spectroscopic characterization of sulindac where made, which enabled improving its vibrational assignment in the literature. The same happened for the LDH matrices, Zn(II) and Mg(II), both with chloride ions in the interlamelar space, which also resulted in an improving of it vibrational assignment found in the literature. Both LDH intercalated with sulindac were also characterized spectroscopically and their Raman spectra showed great agreement to the deprotonated species of thedrug. The diffraction pattern obtained from intercalated compounds shows an expansion of the basal spacing (7 Å to 26 Å) compatible with the hypothesis of the sulindac inclined relative to the lamelar plane. The Raman spectra control tissues show the most significant changes in the band amide I and amide III after diferente surgery times and through PCA was possible to observe the clear separation of the group that presenting an acute inflammatory process (at 7 days). Tissues exposed to LDH pellet intercalated with chloride ions showed a reduced inflammatory response relative to control tissue and the spectral changes demonstrate the presence of collagen, which indicates an acceptance of the insert by the body (biocompatibility). The pellets were also analyzed spectroscopically and showed that there was incorporation of CO32- ions in the interlayer space, indicated by the presence of the Raman band at 1060 cm-1 (symmetric stretch C-O of this ion), but it was not possible to determine if changes in local pH affect the inflammatory response. In the case of tissues exposed to LDH tablet with sulindac, analysis by Raman microscopy showed that inflammation was significantly reduced, indicating a local action of the drug, in addition, the collagen type III growth has been observed. The implanted LDH pellet with sulindac was analyzed by FT-Raman and the drug release was confirmed. The results of Raman spectroscopy of tissues were confirmed by histomorphological analysis, which showed that there is indeed an accumulation of collagen type III in the tissue regions near to the implanted pellets, as well as the formation of invagination and neovacularization.

A mucosite oral (MO) é uma consequência debilitante do tratamento quimioterápico, que pode ser aliviada com o uso de fototerapias. A terapia fotodinâmica (Photodynamic Therapy - PDT), pode ser usada para o tratamento da MO, quando esta se encontra infectada por microrganismos. No entanto, não há estudos que demonstrem se a PDT, quando aplicada sobre lesões em mucosa oral, pode interferir na reparação tecidual. Assim, este trabalho tem o objetivo de induzir a MO, em hamsters, através da confecção de ranhuras em animais que receberam o quimioterápico 5-Fluorouracil (5-FU), e avaliar, através de análises clínicas, bioquímicas e histológica, o efeito da PDT no reparo destas lesões. Os animais foram divididos em dois grupos, controle e experimental. O grupo controle é formado pelo grupo CN, o qual recebeu o veículo da quimioterapia e anestesia. O grupo experimental é formado pelos grupos CQ, o qual recebeu quimioterapia (QT), anestesia e indução da MO; CQC, o qual recebeu QT, anestesia, indução da MO e aplicação do corante azul de metileno (AM) 0,01%; CQL, o qual recebeu QT, anestesia, indução da MO e irradiação com laser de baixa potência (LBP - 660nm, 120J/cm2, 40mW, 4,4J por ponto); e PDT, o qual recebeu QT, anestesia, indução da MO, aplicação do AM 0,01% e irradiação com LBP (mesmo protocolo do grupo CQL). O 5-FU foi aplicado através de injeções intraperitoneais ao que se seguiu a indução da MO pela confecção de ranhuras com o auxílio de uma agulha de ponta fina. O experimento teve duração total de 10 dias sendo que a avaliação da severidade da MO foi realizada diariamente através da utilização das escalas propostas pela Organização Mundial de Saúde (OMS) e por W-Smith modificadas para animais. Os animais foram sacrificados após 5, 7 e 10 dias de experimento e suas mucosas jugais (direita e esquerda) foram removidas para a realização das análises bioquímicas (através da determinação da concentração total de proteína e da avaliação de parâmetros do sistema antioxidante, como a atividade enzimática da Superóxido Dismutase - SOD e da Catalase) e histológica (por microscopia de luz). Após análises estatísticas, os resultados clínicos, bioquímicos e histológico mostraram que a PDT diminuiu a severidade da MO no décimo dia do experimento (p<0,05) e mostrou maior queratinização do epitélio com deposição de fibras colágenas organizadas na lâmina própria. Com base no protocolo experimental desenvolvido neste estudo e nos resultados obtidos podemos concluir que a PDT pode ser utilizada de maneira segura em lesões infectadas de MO, pois a mesma não interferirá na reparação destas lesões. / Oral mucositis (OM) is a debilitating side effect of chemotherapy, which can be relieved with the use of phototherapy. Photodynamic therapy (PDT) may be used for the treatment of OM, when infection is present. However, there are no studies that demonstrate PDTs interference on tissue repair processes when applied on lesions of the oral mucosa. In this sense, this work aims to induce OM in hamsters, by grooving the oral mucosa of animals receiving 5-fluorouracil (5-FU) chemotherapy, and evaluate through clinical, biochemical and histological parameters the effect of PDT in repairing these lesions. The animals were divided into two groups, experimental and control. The control group is formed by the C group, which received the vehicle of chemotherapy and anesthesia. The experimental group is formed by the Ch group, which received chemotherapy, anesthesia and induction of OM; ChP, which received chemotherapy, anesthesia, induction of OM and application of methylene blue (MB) 0.01%; ChL, which received chemotherapy, anesthesia, induction of OM and irradiation with low-power laser (LPL - 660nm, 120J/cm2, 40 mW, 4.4 J per point); and PDT, which received chemotherapy, anesthesia, induction of OM, application of MB 0.01% and LPL irradiation (same protocol as ChL group). 5-FU was administered by intraperitoneal injection, which was followed by the induction of OM by making mucosal grooves. The experimental period was of 10 days and the assessment of the severity of OM was performed on a daily basis using the scales proposed by the World Health Organization (WHO) and by W-Smith modified for animals. The animals were sacrificed after 5, 7 and 10 days of the experiment and their cheek pouch mucosa (left and right) were removed for carrying out the biochemical (by measuring the total protein concentration and by evaluating the antioxidant system parameters, such as enzymatic activity of Superoxide Dismutase - SOD and catalase) and histological (by light optical microscopy) analyzes. After statistical analysis, the clinical, biochemical and histological results showed that PDT reduced the severity of OM on the tenth day of the experiment, when compared to the initial mucositis score (p<0.05) and showed greater keratinization with organized collagen deposition in the lamina propria. Based on the experimental protocol developed in this study and the results obtained we can conclude that PDT can be used safely in infected OM injuries because it does not interfere with the repair of these lesions.

Sublinhagens de camundongos AIRmax e AIRmin homozigotas para os alelos S do gene Slc11a1 diferem na capacidade de reparar um orifício na orelha. Os animais AIRmaxSS regeneraram o tecido da orelha 30 dias após a perfuração, enquanto que os animais AIRminSS apenas cicatrizaram a ferida mas nunca a restauraram completamente. A regeneração da orelha observada nos animais AIRmaxSS deve-se a inflamação menos intensa da área ferida no início do processo de reparação, culminando em baixa deposição de colágeno e expressão da proteína a-SMA na orelha desses animais e a repressão de genes participantes em funções relacionadas à contração muscular. Além disso, detectamos alguns genes candidatos no cromossomo 11 regulando o fenótipo de cicatrização tissular da orelha de camundongos AIRminSS. Os resultados obtidos sugerem que o grau da resposta inflamatória, assim como a ativação ou repressão de genes participantes durante os eventos de reparação tissular podem modular a qualidade da resolução da injúria, culminando em um processo regenerativo ou de cicatrização. / Homozygous AIRmax and AIRmin sublines for Slc11a1 R and S alleles differ in the ability to repair to the ear hole. AIRmaxSS mice exhibited regeneration 30 days after ear punch while AIRminSS animals did not show regeneration. The regeneration observed in AIRmaxSS mice was due to lower inflammation at the beginning of repair process resulting in less deposition of collagen and expression of a-SMA protein in the ears of these animals. Down regulated genes related with muscle contraction was observed in AIRmaxSS mice. In addition, AIRminSS mice presented gene cluster on chromosome 11 with expression profile that predispose them to wound healing with scar. These results suggest that the importance of regulating inflammation in the initial events and the activation and repression of some genes related to the wound healing phenotype can drives tissue regeneration or wound healing after ear punch.

L'élastine est la protéine matricielle responsable de l'élasticité des tissus retrouvée dans des tissus soumis à de fortes contraintes mécaniques tels que les poumons, les artères ou la peau. La dégradation de cette protéine lors de processus physiopathologiques produit des peptides bologiquement actifs nommés peptides d'élastine portant le motif GXXPG essentiel à leur activité. Ces peptides régulent diverses fonctions biologiques telles que le chimiotactisme, la synthèse de protéases, la prolifération. Tous ces effets dépendent de la fixation des peptides d'élastine au complexe récepteur de l'élastine. Ce complexe est composé de trois sous-unités : une protéine périphérique de 67 kDa, l'Elastin Binding Protein (EBP), et deux protéines associées à la membrane, la Protective Protein/Cathepsin A (PP/CA) et la Neuraminidase-1 (Neu-1) de 55 et 61 kDa respectivement. L'activité sialidase de Neu-1 est responsable de l'activation de ERK 1/2 après fixation des peptides d'élastine au complexe récepteur de l'élastine.Dans cette étude, nous démontrons que l'EBP et les radeaux lipidiques sont colocalisés à la membrane plasmique. Nous montrons, de plus, que la déstructuration de ces microdomaines aussi bien que leur déplétion en glycolipides bloque la signalisation du récepteur. L'utilisation d'un anticorps monoclonal bloquant dirigé contre le GM3 montre qu'il est essentiel à la signalisation. Après traitement par les peptides d'élastine, le contenu cellulaire en GM3 diminue alors que celui en lactosylcéramide augmente suggérant une conversion du GM3 en lactosylcéramide. L'utilisation de lactose ou de siRNA Neu-1 bloque cette conversion ce qui tend à démontrer que le complexe récepteur de l'élastine est impliqué dans ce mécanisme. Une analyse par cytométrie en flux confirme cette production de lactosylcéramide induite par les peptides d'élastine.L'analyse par spectrométrie de masse mettrait en évidence deux lactosylcéramides (C23:0 et C24:1) potentiellement bioactifs dont la synthèse chimique a été entreprise. La purification des radeaux lipidiques par ultracentrifugation différentielle en gradient de saccharose ainsi que leur identification par Dot-blot couplé à la fluorescence montre un changement de densité de ces microdomaines après stimulation par les peptides d'élastine.L'évaluation biologique in vitro de ces lactosylcéramides montre qu'ils miment les effets des peptides d'élastine sur l'activation de ERK 1/2, la prolifération et la synthèse de MMP-1. Enfin, l'évaluation ex vivo des lactosylcéramides démontre une réduction de la zone de tissu cardiaque nécrosé suggérant un rôle cardioprotecteur de ces molécules. Ce travail propose un mécanisme original de transduction du signal à la membrane plasmique et nous laisse envisager le complexe récepteur de l'élastine, les peptides d'élastine et le lactosylcéramide comme de nouveaux agents thérapeutiques potentiels. / Elastin is the matrix protein responsible for the elasticity of tissues where resilience is required such as lung, arteries or skin. Elastin degradation during physiopathological processes produces biologically active peptides named elastin peptides bearing the GXXPG pattern essential for their activity. These peptides regulate various biological functions such as chemotaxis, proteases synthesis and proliferation. These effects are dependent of elastin peptide binding to the elastin receptor complex (ERC). This complex is composed of three subunits: a peripheral protein of 67 kDa called elastin binding protein (EBP) and two membrane-associated proteins, protective protein/cathepsin A (PP/CA) and neuraminidase-1 (Neu-1) of 55 and 61 kDa, respectively. The sialidase activity of Neu-1 is responsible for ERK 1/2 pathway activation following binding of elastin peptide on the elastin receptor complex.In this study, we demonstrate that EBP and lipid rafts colocalize at the plasma membrane. We also show that the disruption of these microdomains and their depletion in glycolipids block the receptor signaling. The use of a monoclonal anti-GM3 blocking antibody shows that this glycosphingolipid is essential for signaling. Following elastin peptide treatment, cellular GM3 level decreases while the lactosylceramide one increases consistently with a GM3/LacCer conversion. The use of lactose or Neu-1 siRNA blocks this process suggesting that the elastin receptor complex is involved in this mechanism. Flow cytometry analysis confirms this elastin peptide-driven LacCer generation.Mass spectrometry analysis of elastin peptide-stimulated cell membrane extracts identified two potentially bioactive lactosylceramides (C23:0 and C24:1) and their synthesis has been realized. Lipid rafts purification by differencial ultracentrifugation in sucrose gradient shows a variation of the microdomains density as well as their identification by fluorescence linked-Dot-blot following elastin peptide stimulation.In vitro biological evaluation of these lactosylceramides shows that they mimic the elastin peptide effects on ERK 1/2 activation, proliferation and MMP-1 synthesis. Finally, ex vivo lactosylceramides evaluation demonstrates a decrease of cardiac tissue necrosis area suggesting that these molecules could be cardioprotective agents. This work proposes an original mechanism of signal transduction at the plasma membrane and let us foresees the elastin receptor complex, elastin peptides and lactosylceramide as new potential therapeutical targets.

Sublinhagens de camundongos AIRmax e AIRmin homozigotas para os alelos R ou S do gene Slc11a1 apresentam distinta capacidade regenerativa à perfuração de suas orelhas. Animais AIRmaxSS exibiram regeneração tecidual precoce em comparação aos animais AIRmaxRR, sugerindo que o alelo S favorece a regeneração nestes animais. Camundongos das sublinhagens AIRmin não apresentaram regeneração após perfuração de suas orelhas. Em resposta ao estímulo, animais AIRmaxSS exibiram inflamação local mais intensa e tardia do que animais AIRmaxRR, demonstrando elevados níveis de MPO e edema, e influxo celular predominantemente de neutrófilos. Ensaios de expressão gênica global demonstraram genes diferencialmente expressos entre as sublinhagens, evidenciando genes sobre-representados no tema biológico proliferação celular em ambas sublinhagens, enquanto somente nos animais AIRmaxSS ocorreu sobre-representação para resposta inflamatória nos genes ativados e para contração muscular nos genes reprimidos. Os resultados de microarray foram validados por qPCR. / Homozygous AIRmax and AIRmin sublines for Slc11a1 R and S alleles present distinct regenerative capacity to the ear hole. AIRmaxSS mice exhibited early tissue regeneration compared to AIRmaxRR animals, suggesting that the Slc11a1 S allele promotes regeneration in these animals. AIRmin sublines didnt show regeneration after ear punch. In response to the stimulus, AIRmaxSS animals exhibited more intense and later local inflammation than AIRmaxRR animals, presenting elevated levels of MPO, edema and cellular influx predominantly of neutrophils. Global gene expression analysis showed differentially-expressed genes between the sublines, in which over-represented biological theme is cell proliferation in both sublines. AIRmaxSS animals displayed over-representation of inflammatory response in up-regulated genes and of muscle contraction in down-regulated genes. Microarray results were validated by using quantitative PCR.

OBJETIVO El objetivo nuestro proyecto de investigación es demostrar si la presencia de plasma rico en plaquetas (PRP) autólogo, que aporta varios factores de crecimiento en proporciones fisiológicas, en la interfase injerto tendinoso-hueso modifica el proceso de reparación de los tejidos locales en nuestro modelo experimental. MATERIAL Y MÉTODO Diseñamos un estudio de tipo experimental, longitudinal y prospectivo. Diez conejos albinos de Nueva Zelanda son intervenidos en sus 2 extremidades traseras, en una se realiza la técnica Experimental aplicando PRP y la otra sirve de control, sin aplicar PRP . Una vez intervenidos, los animales son divididos en 2 grupos de 5 de forma aleatoria. Un grupo es sacrificado a la 2ª semana y el otro a la 4ª semana postintervención. El área quirúrgica fue estudiada macroscópica, radiográfica, histológica e inmunohistoquímicamente. RESULTADOS El estudio macroscópico y radiográfico de las piezas muestra la presencia de un área de reacción ósea de mayor tamaño en la zona de entrada del tendón en el interior del túnel óseo en el grupo Experimental sacrificado a la 4ª sem. respecto al resto de grupos. Microscópicamente, en ningún corte histológico, tanto de los grupos Control como Experimental, se observa la línea de separación basófila, denominada tidemark190 entre el fibrocartílago mineralizado y el no mineralizado. Si se evidenció la aparición de una mayor cantidad de los elementos tisulares fibrosos, cartilaginosos y osteoides, y un mayor grado de ordenación celular en el fibrocartílago y sustancia osteoide en los grupos Experimentales respecto a sus correspondientes grupos Control. Además se observa la aparición de zonas de anclaje hueso-tendón en dos extremidades del grupo Experimental sacrificado a la 4ª sem., no encontradas en ningún caso Control. En el estudio inmunohistoquímico no apreciamos diferencias en el patrón de distribución del colágeno tipo II entre los distintos grupos, aunque si existe una mayor área de tinción de colágeno tipo II en los grupos Experimentales respecto a sus correspondientes grupos Control, ya que la cantidad de tejido fibrocartilaginoso, en sus variadas formas de presentación, también es mayor en los grupos que recibieron PRP. CONCLUSIONES El análisis de los resultados concluye que macroscópica, radiográfica y microscópicamente, este estudio demuestra que la administración de PRP como fuente de FC afecta al proceso de reparación del autoinjerto tendinoso dentro de un túnel óseo en nuestro modelo experimental. El PRP aceleró la curación, anticipando en el tiempo la aparición de elementos celulares y tisulares propios de fases posteriores del proceso de cicatrización, y además incrementó la cantidad éstos. / EFFECT OF PLATELET RICH PLASMA IN THE BIOLOGIC INCORPORATION OF A TENDON GRAFT IN A BONE TUNNEL Objective: To study the effect of the platelet rich plasma (PRP) in the biological process of tendon healing inside a bone tunnel Material y Methods: We designed an experimental, longitudinal and prospective research study. Ten animals were operated on their back legs (one as Experimental group and the other as Control group). In the Experimental group the tendon of the internal gastrocnemius muscle was cut, infiltrated with PRP, placed in a tibial bone tunnel filled with PRP, and finally, fixed by a bioabsorbable screw. The same procedure was practiced in the Control group without the use of PRP. Five rabbits were sacrificed on the second week and five on the fourth week after surgery. The legs were evaluated macroscopic, radiographic, histologic and immunohistochemically. Results: The macroscopic and radiographic study of the pieces shows the presence of a larger bone reaction area in the entrance of the tendon within the bone tunnel in the Experimental group sacrificed on the fourth week compared to other groups. Microscopically, the "tidemark" isn’t observed between mineralized and unmineralized fibrocartilage in any group . The Experimental group presents a statistically significant greater amount of chondroid tissue, osteoid tissue and trabecular bone, both the second and fourth week. We observe continuity zones between tendinous fibers and bone in some cases of the Experimental group on the fourth week . Immunohistochemically, no appreciable differences in the distribution pattern of type II collagen between the groups could be seen, although there is a greater area of staining in the Experimental group compared to their corresponding Control group Conclusion: The analysis of results and assessment of the comparison established between the research groups concludes that macroscopic, radiographic and microscopically, this study demonstrates that administration of PRP affects the repair process of tendon autograft in a bone tunnel in our experimental model. The PRP accelerated the healing time anticipating the emergence of cellular and tissue elements characteristic of later stages of the healing process, and also increased the amount of them.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os receptores &#946;1- e &#946;2-adrenérgicos estão presentes em inúmeras células que participam do processo de reparo como fibroblastos, queratinócitos, células inflamatórias e células endoteliais. Diversos trabalhos demonstram que estes receptores modulam o processo de reparo tecidual. Entretanto, nenhum trabalho demonstrou se o bloqueio destes receptores compromete o reparo de úlceras de pressão. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do bloqueio dos receptores &#946;1- e &#946;2-adrenérgicos no reparo de úlceras de pressão em camundongos, para isto utilizamos um modelo não invasivo de lesão por isquemia e reperfusão. No presente estudo, utilizamos animais que foram tratados por gavagem com propranolol (um antagonista não seletivo dos receptores &#946;1- e &#946;2-adrenérgicos). A administração do antagonista teve início um dia antes do início dos ciclos de isquemia e reperfusão e se manteve diariamente até a eutanásia. Para desenvolver a úlcera de pressão, um par de magnetos foi aplicado no dorso dos animais previamente depilado. O período de permanência do magneto é caracterizado como período de isquemia, enquanto sua retirada é caracterizada como período de reperfusão. Os ciclos de isquemia e reperfusão foram repetidos duas vezes, e ao final do último ciclo, duas úlceras circulares foram criadas no dorso dos animais. Os animais foram mortos 3, 7, 14 e 21 dias após a lesão. Após o último ciclo de isquemia, o fluxo sanguíneo da área comprimida foi nulo, 7 horas após a compressão o fluxo sanguíneo estava elevado, com níveis superiores ao da pele normal. Após 24 e 48 horas, o fluxo sanguíneo estava reduzido e abaixo dos níveis da pele normal. O bloqueio dos receptores &#946;1- e &#946;2-adrenérgicos aumentou os níveis de peróxidos lipídicos 3 dias após a lesão, comprometeu a migração dos queratinócitos, levando a um aumento da proliferação epitelial, resultando em uma re-epitelização atrasada. O retardo na formação da neo-epiderme induzido pelo bloqueio destes receptores prejudicou a remoção do tecido necrótico. O bloqueio dos receptores &#946;1- e &#946;2-adrenérgicos aumentou o número de células inflamatórias (neutrófilos e macrófagos), os níveis proteicos de elastase neutrofílica 3 dias após a lesão e reduziu os níveis proteicos de MCP-1 3 dias após a lesão e os níveis proteicos de MMP-12 7 dias após a lesão. O bloqueio dos receptores &#946;1- e &#946;2-adrenérgicos aumentou a proliferação celular e apoptose no tecido conjuntivo 7 dias após a lesão e aumentou a densidade de vasos sanguíneos 14 e 21 dias após a lesão. O bloqueio dos receptores &#946;1- e &#946;2-adrenérgicos retardou a diferenciação miofibroblástica e reduziu os níveis proteicos de TGF-&#946; 1/2/3 3 dias após a lesão e a contração da lesão. Vinte e um dias após a lesão, o bloqueio dos receptores &#946;1- e &#946;2-adrenérgicos aumentou a espessura da neo-epiderme e a expressão de tenascina-C em fibroblastos e reduziu a deposição de colágeno. Em conclusão, o bloqueio dos receptores &#946;1- e &#946;2-adrenérgicos atrasa o reparo tecidual em úlceras de pressão. / &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptors are present in several cells that participate in tissue repair such as fibroblasts, keratinocytes, inflammatory cells and endothelial cells. Several studies demonstrate that these receptors modulate cutaneous wound healing. However, neither study demonstrated if the blockade of theses receptors compromises the cutaneous wound healing of pressure ulcers. Thus, the aim of this study was to evaluate the effect of blockade of &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptors in wound healing of pressure ulcer in mice using a noninvasive model of lesion induced by ischemia and reperfusion. In this study, animals were also treated with propranolol (a nonselective antagonist of &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptors). Antagonism administration began one day before ischemia-reperfusion cycles and daily maintained until euthanasia. In order to develop a pressure ulcer, a shaved skin was placed between a pair of magnet disks. The period of magnet placement is characterized as ischemia period, whereas release period as reperfusion period. Two cycles of ischemia and reperfusion were performed, and after last cycle, two circular ulcers per animal were created in the animal dorsum. Animals were killed 3, 7, 14 and 21 days after wounding. After last ischemia cycle, blood flow of compressed area was nulled, 7 hours after compressed area underwent reperfusion during subsequent hours reaching blood flow 98% superior of normal skin. After 24 and 48 hours, blood flow of compressed area was again reduced when compared with normal skin. Blockade of &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptors increased the levels of lipid peroxydes 3 days after wounding, compromised keratinocyte migration leading to an increase epithelial proliferation and impairment in the re-epithelialization. The impairment in the neo-epidermis formation induced by &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptor blockade delayed the necrotic tissue loss. Blockade of &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptors increased the inflammatory cell number (macrophages and neutrophils), protein levels of neutrophil elastase 3 days after wounding and reduced protein levels of MCP-1 3 days after wounding and protein levels of MMP-12 7 days after wounding. Blockade of &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptors increased cell proliferation and apoptosis in connective tissue 7 days after wounding and blood vessel density 14 and 21 days after wounding. Blockade of &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptors impaired myofibroblastic differentiation and reduced protein levels of TGF-&#946; 1/2/3 3 days after wounding and lesion contraction. Twenty-one days after wounding, &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptor blockade increased neo-epidermis thickness and tenascin-C-positive fibroblast number and reduced collagen deposition. In conclusion, blockade of &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptors delays cutaneous wound healing of pressure ulcers.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os receptores &#946;1- e &#946;2-adrenérgicos estão presentes em inúmeras células que participam do processo de reparo como fibroblastos, queratinócitos, células inflamatórias e células endoteliais. Diversos trabalhos demonstram que estes receptores modulam o processo de reparo tecidual. Entretanto, nenhum trabalho demonstrou se o bloqueio destes receptores compromete o reparo de úlceras de pressão. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do bloqueio dos receptores &#946;1- e &#946;2-adrenérgicos no reparo de úlceras de pressão em camundongos, para isto utilizamos um modelo não invasivo de lesão por isquemia e reperfusão. No presente estudo, utilizamos animais que foram tratados por gavagem com propranolol (um antagonista não seletivo dos receptores &#946;1- e &#946;2-adrenérgicos). A administração do antagonista teve início um dia antes do início dos ciclos de isquemia e reperfusão e se manteve diariamente até a eutanásia. Para desenvolver a úlcera de pressão, um par de magnetos foi aplicado no dorso dos animais previamente depilado. O período de permanência do magneto é caracterizado como período de isquemia, enquanto sua retirada é caracterizada como período de reperfusão. Os ciclos de isquemia e reperfusão foram repetidos duas vezes, e ao final do último ciclo, duas úlceras circulares foram criadas no dorso dos animais. Os animais foram mortos 3, 7, 14 e 21 dias após a lesão. Após o último ciclo de isquemia, o fluxo sanguíneo da área comprimida foi nulo, 7 horas após a compressão o fluxo sanguíneo estava elevado, com níveis superiores ao da pele normal. Após 24 e 48 horas, o fluxo sanguíneo estava reduzido e abaixo dos níveis da pele normal. O bloqueio dos receptores &#946;1- e &#946;2-adrenérgicos aumentou os níveis de peróxidos lipídicos 3 dias após a lesão, comprometeu a migração dos queratinócitos, levando a um aumento da proliferação epitelial, resultando em uma re-epitelização atrasada. O retardo na formação da neo-epiderme induzido pelo bloqueio destes receptores prejudicou a remoção do tecido necrótico. O bloqueio dos receptores &#946;1- e &#946;2-adrenérgicos aumentou o número de células inflamatórias (neutrófilos e macrófagos), os níveis proteicos de elastase neutrofílica 3 dias após a lesão e reduziu os níveis proteicos de MCP-1 3 dias após a lesão e os níveis proteicos de MMP-12 7 dias após a lesão. O bloqueio dos receptores &#946;1- e &#946;2-adrenérgicos aumentou a proliferação celular e apoptose no tecido conjuntivo 7 dias após a lesão e aumentou a densidade de vasos sanguíneos 14 e 21 dias após a lesão. O bloqueio dos receptores &#946;1- e &#946;2-adrenérgicos retardou a diferenciação miofibroblástica e reduziu os níveis proteicos de TGF-&#946; 1/2/3 3 dias após a lesão e a contração da lesão. Vinte e um dias após a lesão, o bloqueio dos receptores &#946;1- e &#946;2-adrenérgicos aumentou a espessura da neo-epiderme e a expressão de tenascina-C em fibroblastos e reduziu a deposição de colágeno. Em conclusão, o bloqueio dos receptores &#946;1- e &#946;2-adrenérgicos atrasa o reparo tecidual em úlceras de pressão. / &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptors are present in several cells that participate in tissue repair such as fibroblasts, keratinocytes, inflammatory cells and endothelial cells. Several studies demonstrate that these receptors modulate cutaneous wound healing. However, neither study demonstrated if the blockade of theses receptors compromises the cutaneous wound healing of pressure ulcers. Thus, the aim of this study was to evaluate the effect of blockade of &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptors in wound healing of pressure ulcer in mice using a noninvasive model of lesion induced by ischemia and reperfusion. In this study, animals were also treated with propranolol (a nonselective antagonist of &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptors). Antagonism administration began one day before ischemia-reperfusion cycles and daily maintained until euthanasia. In order to develop a pressure ulcer, a shaved skin was placed between a pair of magnet disks. The period of magnet placement is characterized as ischemia period, whereas release period as reperfusion period. Two cycles of ischemia and reperfusion were performed, and after last cycle, two circular ulcers per animal were created in the animal dorsum. Animals were killed 3, 7, 14 and 21 days after wounding. After last ischemia cycle, blood flow of compressed area was nulled, 7 hours after compressed area underwent reperfusion during subsequent hours reaching blood flow 98% superior of normal skin. After 24 and 48 hours, blood flow of compressed area was again reduced when compared with normal skin. Blockade of &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptors increased the levels of lipid peroxydes 3 days after wounding, compromised keratinocyte migration leading to an increase epithelial proliferation and impairment in the re-epithelialization. The impairment in the neo-epidermis formation induced by &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptor blockade delayed the necrotic tissue loss. Blockade of &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptors increased the inflammatory cell number (macrophages and neutrophils), protein levels of neutrophil elastase 3 days after wounding and reduced protein levels of MCP-1 3 days after wounding and protein levels of MMP-12 7 days after wounding. Blockade of &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptors increased cell proliferation and apoptosis in connective tissue 7 days after wounding and blood vessel density 14 and 21 days after wounding. Blockade of &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptors impaired myofibroblastic differentiation and reduced protein levels of TGF-&#946; 1/2/3 3 days after wounding and lesion contraction. Twenty-one days after wounding, &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptor blockade increased neo-epidermis thickness and tenascin-C-positive fibroblast number and reduced collagen deposition. In conclusion, blockade of &#946;1- and &#946;2-adrenergic receptors delays cutaneous wound healing of pressure ulcers.