COÊLHO, Zirlane Castelo Branco. Avaliação in vitro dos mecanismos imunossupressores induzidos por leishmania amazonensis na resposta imune de indivíduos sadios. 2004. 75 f. Dissertação (Mestrado em Patologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2004. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-01-03T16:17:06Z No. of bitstreams: 1 2004_dis_zcbcoelho.pdf: 312870 bytes, checksum: d65e7ff026729c92dd37e28f263fe1b8 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-02-01T12:13:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2004_dis_zcbcoelho.pdf: 312870 bytes, checksum: d65e7ff026729c92dd37e28f263fe1b8 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-02-01T12:13:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2004_dis_zcbcoelho.pdf: 312870 bytes, checksum: d65e7ff026729c92dd37e28f263fe1b8 (MD5) Previous issue date: 2004 / Previous studies have shown that individuals exposed to Leishmania amazonensis respond differentially with regard to interferon gamma (IFN)_ production. Individuals who have a low production of IFN_ develop a Th2 response, while those who produce high amounts of this cytokine during the early stages of infection show the Th1 response. In order to evaluate the mechanism of suppression induced by L. amazonensis, the profile and kinetics of chemokines and theirs receptors were determined, as also the cytokines in the cultures of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy individuals, stimulated with live promastigotes of L. amazonensis. A semiquantitative analysis of mRNA expression for the chemokines and their receptor was performed by RT-PCR, and the cytokines were quantified by ELISA, at 12, 48 and 120 hours after infection. The two patterns of IFN_ response were studied. Individuals with a production higher than 145,8 pg/mL were classified as high responders (HR), and those with lower levels of production were considered as low responders (LR). Individuals in the HR group developed a mixed response, with a predominance of Th1, which was associated with the expression of relevant quantities of MIP-1_, RANTES, MCP-1, IP-10, IL-8, CCR1, CCR2 and CXCR3, within 12 and 48 hours after infection. IL-12, IL-13 and IL-10 were observed in significant quantities. In the LR group, the suppression of expression of MIP-1_, RANTES, MCP-1, I-309, CCR2, CXCR3 and CCR5 during the entire period of study, and that of IP-10 during the first 48 hours of infection, was observed. IL-10 and IL-13 were found in elevated concentrations from 12 hours of infection onwards, with a peak production at 48 hours. These results suggest that the pattern of response apparently is defined around 48 hours of infection. IL-10 and IL-13 appear to exercise a relevant role in the modulation of suppression of IFN_, induced in the LR group by L. amazonensis. / Estudos anteriores mostraram que indivíduos expostos à Leishmania amazonensis apresentam resposta diferenciada em relação à produção de IFNγ. Aqueles com baixa produção geram uma resposta Th2 e os que apresentam alta produção desta citocina, desde as primeiras horas de infecção, uma resposta Th1. Com o objetivo de avaliar o mecanismo de supressão induzido por L. amazonensis, foi determinado o perfil e a cinética da expressão de quimiocinas e receptores de quimiocinas, como também de citocinas em culturas de células mononucleadas do sangue periférico de indivíduos sadios, estimuladas com promastigotas vivas de L. amazonensis. A análise semiquantitativa da expressão de RNAm das quimiocinas e seus receptores, através de RT-PCR, e a quantificação das citocinas foi determinada por ELISA, após 12 horas, 48 horas e 120 horas de infecção. Verificaram-se dois padrões de resposta em relação à secreção de IFNγ. Indivíduos com produção superior a 145,8 pg/mL foram classificados como alto respondedor (AR) e aqueles com produção inferior, como baixo respondedor (BR). Observou-se no grupo AR o desenvolvimento de uma resposta mista, com predomínio de Th1. Esta resposta está associada à expressão de quantidades relevantes de MIP-1α (CCL3), RANTES (CCL5), MCP-1(CCL2), IP-10 (CXCL10), IL-8 (CXCL8), CCR1, CCR2 e CXCR3 em 12 e 48 horas de infecção. IL-12, IL-13 e IL-10 foram observadas em altas concentrações. Em relação ao grupo BR, observou-se diminuição da expressão de MIP-1α (CCL3), RANTES (CCL5), MCP-1(CCL2), I-309 (CCL1), CCR2, CXCR3 e CCR5 durante todo o período avaliado e de IP-10 (CXCL10) nas primeiras 48h de infecção. IL-10 e IL-13 encontravam-se em elevadas concentrações desde 12h, tendo um pico de produção com 48h de infecção. Os resultados sugerem que após 48 horas de exposição é o momento em que há diferenciação na expressão das moléculas. IL-10 e IL-13 parecem ter papel relevante na modulação da supressão de INFγ induzida nos BR por L. amazonensis.

Orientador: Lourival do Carmo Monaco / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-15T06:50:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ramos_LuisCarlosdaSilva_M.pdf: 4864211 bytes, checksum: 731001b7f65b2e1ada47a41e2a4197fb (MD5) Previous issue date: 1981 / Resumo: Duas variedades de tomateiro (Lycopersiocon esculentum) BGH 402 (PI 367977) e BGH 588 (PI 3677991), conhecidas como de respostas sensível e toleante ao Al, respectivamente, foram utilizadas em estudo visando conhecer a herança da reação de tolerância à toxidez de Al em solo. AS variedades foram multiplicadas e cruzadas reciprocamente em maio de 1978. em outubro do mesmo ano, os pais e os híbridos recíprcos foram plantados no campo para a obtenção de 'F IND. 2¿ e dos retrocruzamentos recíprocos. Nesta ocasião verificou-se que as duas variedades apresentavam desenvolvimento vegetativo semelhante, diferindo entre si apenas pelas características de fruto. Empregou-se um solo do tipo ¿Latossolo Vermelho Escuro Distrófico, textura argilosa, Unidade Limeira ¿ Fase Muito Ácida¿ com Al em saturação elevada (95%). A este solo foram adicionados seis níveis de calagem, a fim de se obterem seis níveis de saturação de Al (95, 90, 30 e 2%), sugere a inexistência de efeito citoplasmático para a redução de tolerância ao Al, como ocorre em outras espécies estudadas. Nos testes preliminares, verificou-se que a altura de plantas foi uma medida mais eficiente na discriminação das variedades para a tolerância ao Al, do que o pés seco de raízes ou da parte aérea ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The inheritance of aluminum tolerance in tomato. Two Lycopersicon esculentum lines, one tolerant BGH 588 (PI 367991) and other sensitive BGH 402 (PI 367977) to Al toxicity in both soil and nutient solution were used to investigation the inheritance of the Al tolerance in soil with saturation level of Al. the parental lines and the reciprocal hybrids were grown in the field. The 'F IND. 1¿s were selfed and that both parental lines had same vegetative growth in field conditions differing only in fruit characteristics. A clay soil classified as ¿Latossolo Vermelho Escuro, Distrófico, Unidade Limeira ¿ Fase Muito Àcida¿ was used because of its high level of Al saturation. To this sol was added six different amounts of lime in order to obtain the following Al levels of saturation: 95, 80, 60, 40, 30 and 2%. It was observed that differences between the lines were more clearly didtinguishable in the 60 ¿ 30% interval of Al saturation. In the 95% level both genotypes were equally affected in growth. In the 2% level, the vegetative growth of both lines were normal and similar to each other. Differences however were observed between the tolerant and intolerant lines in the intermediary levels of Al saturation ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas

As vacinas de DNA têm sido utilizadas para a indução de imunidade contra antígenos virais e bacterianos. A aplicação de modelos experimentais tem sido explorada visando a indução de tolerância imunológica através da expressão de genes cujos produtos podem modular o sistema imune para um estado de não responsividade. A terapia gênica oferece a possibilidade de manipulação do sistema imune do receptor, através de um sistema de administração de genes específicos sob condições pré-definidas. Sua eficácia depende dos níveis de expressão e da natureza do antígeno, da via de administração assim como de sua distribuição nos tecidos (a qual às vezes depende do promotor utilizado). Porém, sua aplicação clínica é limitada em parte devido aos baixos níveis de expressão obtidos in vivo. A VP22 é uma proteína do tegumento do vírus Herpes simples tipo 1, que tem a propriedade de fazer tráfego intercelular. Estudos recentes têm demonstrado a alta eficiência desta molécula no transporte de proteínas heterólogas como VP22-p53, VP22-β galactosidase e VP22-proteína verde fluorescente. Para a indução de tolerância imunológica, tem sido demonstrado que a persistência do antígeno, pelo menos por algum período, é muito importante. Moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) têm sido utilizadas para induzir tolerância a nível central ou periférico, em diferentes protocolos. Dentre estas, as moléculas da classe I do camundongo, Kb, têm sido utilizadas com sucesso. O objetivo desse trabalho foi de construir duas vacinas recombinantes: pVP22::Kb e pCIneo::Kb. A primeira contém dois genes clonados na mesma pauta de leitura: a cadeia pesada de classe I Kb e VP22. O cDNA que codifica para o Kb foi obtido pela extração de RNA total de baço de um camundongo C57BL/6 (haplótipo H-2b) seguido de transcrição reversa. Este produto foi amplificado pela reação em cadeia da polimerase. Esta molécula também foi obtida pela amplificação direta do gene Kb previamente clonado no sítio EcoR I do plasmídeo pBluescriptIISK (Stratagene®). Ambos os produtos de PCR foram subclonados com extremidades cegas no plasmídeo pCRBluntII (Invitrogen®). Foram obtidos dezenove plasmídeos recombinantes, denominados pCRBluntII::Kb, e um deles foi escolhido e digerido com as enzimas de restrição Spe I e Xba I e defosforilado com a enzima fosfatase alcalina (CIAP). O fragmento digerido foi clonado nos plasmídeos pVP22-myc/His (Invitrogen®) e pCIneo (Promega®) previamente digeridos com a enzima Xba I. Os novos plasmídeos pVP22::Kb e pCIneo::Kb foram utilizados para transfectar a linhagem celular eucariótica CHO. A expressão do mRNA para o Kb foi confirmada pela transcrição reversa e PCR e a expressão da proteína por imunofluorescência e citometria de fluxo.

As vacinas de DNA têm sido utilizadas para a indução de imunidade contra antígenos virais e bacterianos. A aplicação de modelos experimentais tem sido explorada visando a indução de tolerância imunológica através da expressão de genes cujos produtos podem modular o sistema imune para um estado de não responsividade. A terapia gênica oferece a possibilidade de manipulação do sistema imune do receptor, através de um sistema de administração de genes específicos sob condições pré-definidas. Sua eficácia depende dos níveis de expressão e da natureza do antígeno, da via de administração assim como de sua distribuição nos tecidos (a qual às vezes depende do promotor utilizado). Porém, sua aplicação clínica é limitada em parte devido aos baixos níveis de expressão obtidos in vivo. A VP22 é uma proteína do tegumento do vírus Herpes simples tipo 1, que tem a propriedade de fazer tráfego intercelular. Estudos recentes têm demonstrado a alta eficiência desta molécula no transporte de proteínas heterólogas como VP22-p53, VP22-β galactosidase e VP22-proteína verde fluorescente. Para a indução de tolerância imunológica, tem sido demonstrado que a persistência do antígeno, pelo menos por algum período, é muito importante. Moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) têm sido utilizadas para induzir tolerância a nível central ou periférico, em diferentes protocolos. Dentre estas, as moléculas da classe I do camundongo, Kb, têm sido utilizadas com sucesso. O objetivo desse trabalho foi de construir duas vacinas recombinantes: pVP22::Kb e pCIneo::Kb. A primeira contém dois genes clonados na mesma pauta de leitura: a cadeia pesada de classe I Kb e VP22. O cDNA que codifica para o Kb foi obtido pela extração de RNA total de baço de um camundongo C57BL/6 (haplótipo H-2b) seguido de transcrição reversa. Este produto foi amplificado pela reação em cadeia da polimerase. Esta molécula também foi obtida pela amplificação direta do gene Kb previamente clonado no sítio EcoR I do plasmídeo pBluescriptIISK (Stratagene®). Ambos os produtos de PCR foram subclonados com extremidades cegas no plasmídeo pCRBluntII (Invitrogen®). Foram obtidos dezenove plasmídeos recombinantes, denominados pCRBluntII::Kb, e um deles foi escolhido e digerido com as enzimas de restrição Spe I e Xba I e defosforilado com a enzima fosfatase alcalina (CIAP). O fragmento digerido foi clonado nos plasmídeos pVP22-myc/His (Invitrogen®) e pCIneo (Promega®) previamente digeridos com a enzima Xba I. Os novos plasmídeos pVP22::Kb e pCIneo::Kb foram utilizados para transfectar a linhagem celular eucariótica CHO. A expressão do mRNA para o Kb foi confirmada pela transcrição reversa e PCR e a expressão da proteína por imunofluorescência e citometria de fluxo.

As vacinas de DNA têm sido utilizadas para a indução de imunidade contra antígenos virais e bacterianos. A aplicação de modelos experimentais tem sido explorada visando a indução de tolerância imunológica através da expressão de genes cujos produtos podem modular o sistema imune para um estado de não responsividade. A terapia gênica oferece a possibilidade de manipulação do sistema imune do receptor, através de um sistema de administração de genes específicos sob condições pré-definidas. Sua eficácia depende dos níveis de expressão e da natureza do antígeno, da via de administração assim como de sua distribuição nos tecidos (a qual às vezes depende do promotor utilizado). Porém, sua aplicação clínica é limitada em parte devido aos baixos níveis de expressão obtidos in vivo. A VP22 é uma proteína do tegumento do vírus Herpes simples tipo 1, que tem a propriedade de fazer tráfego intercelular. Estudos recentes têm demonstrado a alta eficiência desta molécula no transporte de proteínas heterólogas como VP22-p53, VP22-β galactosidase e VP22-proteína verde fluorescente. Para a indução de tolerância imunológica, tem sido demonstrado que a persistência do antígeno, pelo menos por algum período, é muito importante. Moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) têm sido utilizadas para induzir tolerância a nível central ou periférico, em diferentes protocolos. Dentre estas, as moléculas da classe I do camundongo, Kb, têm sido utilizadas com sucesso. O objetivo desse trabalho foi de construir duas vacinas recombinantes: pVP22::Kb e pCIneo::Kb. A primeira contém dois genes clonados na mesma pauta de leitura: a cadeia pesada de classe I Kb e VP22. O cDNA que codifica para o Kb foi obtido pela extração de RNA total de baço de um camundongo C57BL/6 (haplótipo H-2b) seguido de transcrição reversa. Este produto foi amplificado pela reação em cadeia da polimerase. Esta molécula também foi obtida pela amplificação direta do gene Kb previamente clonado no sítio EcoR I do plasmídeo pBluescriptIISK (Stratagene®). Ambos os produtos de PCR foram subclonados com extremidades cegas no plasmídeo pCRBluntII (Invitrogen®). Foram obtidos dezenove plasmídeos recombinantes, denominados pCRBluntII::Kb, e um deles foi escolhido e digerido com as enzimas de restrição Spe I e Xba I e defosforilado com a enzima fosfatase alcalina (CIAP). O fragmento digerido foi clonado nos plasmídeos pVP22-myc/His (Invitrogen®) e pCIneo (Promega®) previamente digeridos com a enzima Xba I. Os novos plasmídeos pVP22::Kb e pCIneo::Kb foram utilizados para transfectar a linhagem celular eucariótica CHO. A expressão do mRNA para o Kb foi confirmada pela transcrição reversa e PCR e a expressão da proteína por imunofluorescência e citometria de fluxo.

Resumo:A disfunção mitocondrial está associada com a manifestação e com a origem de doenças e distúrbios metabólitos. Um novo paradigma complementa um dogma recente relacionado com esta função, onde moléculas presentes no meio extra ou intra-mitocondrial podem atuar como reguladores da resposta imunológica nata, decorrente de um estresse e/ou de uma infecção. O vírus da cinomose canina é responsável por um quadro de depleção quando se encontra em fase de produção viral, principalmente nas células imunocompetentes. Neste sentido, células mononucleares de sangue periférico canino (CMPC) foram coletadas de cães saudáveis, cultivadas e infectadas pela estirpe vacinal CDV (Onderstepoort). Após 24h post-infection (p.i.), as enzimas superóxido dismutase 1 (SOD1), proteína antioxidante 1 (AOP-1) e estresse térmico 70 (Hsp-70) foram detectadas pela reação de imunofluorescência. A expressão do mRNA dos respectivos genes foi realizada em CMPC CDV+ e CDV - após 24h de infecção com a reação em cadeia da ™ polimerase em tempo real. As sondas fluorescentes JC-1 e MitoTracker Green foram utilizadas para avaliar potencial de membrana e função mitocondrial, respectivamente. A estirpe vacinal induziu a perda da viabilidade em mais de 80% das células infectadas em comparação ao grupo controle (p = 0,001) após 24 h. A permeabilidade da membrana mitocondrial (Δψ) detectada pelo uso da sonda MitoTracker™Green e JC-1 revelou um aumento da Δψ e da atividade mitocondrial no grupo CDV + (p = 0,0012) em comparação com as CMPC não infectadas. Em contraste, a expressão do mRNA dos genes AOP-1 e SOD1 foram considerados superiores, enquanto o Hsp-70 não apresentou diferença na sua expressão nos grupos CDV + e CDV-. As CMPC infectadas pelo CDV aumentaram a transcrição dos genes AOP-1 e SOD1, uma defesa antioxidante celular, concomitante com a redução de viabilidade...(resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract:itochondrial dysfunction is associated with the manifestation and origin of diseases and disorders. The new paradigm complements the current mitochondrial dogma, whereby molecules present on or inside the mitochondria may act as immune regulators in response to stress or pathogens. Canine distemper virus infection (CDV) is responsible to immunosuppressive stage when the virus replicates among immune cells. For this purpose, canine peripheral blood mononuclear cells (PBMC) collected from healthy dogs were cultured and infected by CDV vaccine strain (Onderstepoort) and after 24 h post-infection (p.i.) superoxide dismutase (SOD1), antioxidant like protein 1 (AOP-1) and heat shock protein 70 (Hsp-70) enzymes were search in PBMC by immunofluorescence. The expression of mRNA of respective genes was performed in infected and uninfected canine PBMC at 24 h post-infection by real time polymerase chain reaction. Mitochondrial dysfunction was evaluated by the use of MitoTracker™Green and JC-1 probes at the same post-infection time. The vaccine strain induced loss of PBMC viability in more than 80% of infected cells in comparison to control group (p<0.001) at 24h post-infection. The mitochondrial membrane permeability (Δψ) searched by MitoTracker™ Green and JC-1 probes revealed an increase of Δψ in the CDV + group (p<0.0012) in comparison to uninfected PBMC. In contrast, the expression of mRNA of AOP-1 and SOD 1 were considered higher, whereas the Hsp-70 has no difference in its expression between CDV+ and CDV- groups. PBMC infected by CDV increased AOP-1 and SOD1 gene transcription, an antioxidant cell defense, concomitant to a reduce level of PBMC viability. The viral replication also seems to regulate mitochondrial function by modify the membrane potential. However, at this point, host cells have developed an defense producing mediators related to protect against oxidative insult. This is the first... / Orientador: Tereza Cristina Cardoso da Silva / Banca: Vera Cláudia Lorenzetti Magalhães Curci / Banca: Roberto Gameiro Carvalho / Mestre

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-02-15T13:52:56Z No. of bitstreams: 1 Luciana Souza de Aragão França Redução....pdf: 995559 bytes, checksum: ba08fbe35c691051eb1d16b7657f0655 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-02-15T13:53:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Luciana Souza de Aragão França Redução....pdf: 995559 bytes, checksum: ba08fbe35c691051eb1d16b7657f0655 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-15T13:53:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luciana Souza de Aragão França Redução....pdf: 995559 bytes, checksum: ba08fbe35c691051eb1d16b7657f0655 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / As alergias afetam cerca de 20 a 30% da população mundial e sua prevalência, bem como a gravidade dos sintomas, tem aumentado nas últimas décadas. As terapias existentes para as desordens do trato respiratório ocorrem por períodos prolongados, apresentam efeitos colaterais, muitas vezes não são efetivas para pacientes graves e dependem do afastamento do alérgeno. Uma alternativa para esses pacientes seria a indução de tolerância imunológica, através da terapia celular com células dendríticas pulsadas com o alérgeno. O presente trabalho objetivou avaliar o efeito de células dendríticas mielóides sensibilizadas in vitro com extrato de B. tropicalis em modelo murino de alergia respiratória. Em modelos experimentais de alergia respiratória, células T auxiliares (Th2) alérgeno-específica produzem citocinas que regulam a síntese de anticorpos IgE alérgeno-específicos e controlam a inflamação eosinofílica e a remodelação do tecido das vias aéreas, e esses parâmetros foram analisados neste trabalho. Células dendríticas tolerogênicas de camundongos A/J foram obtidas na presença de GM-CSF e dexametasona e caracterizadas por apresentarem baixa expressão de MHC-II e moléculas coestimulatórias, redução acentuada de PD-L2 e um perfil antiinflamatório de produção de citocina.A inoculação prévia de células dendríticas sensibilizadascom Blomia reduziu especificamente e significativamente o número total de leucócitos e o número de eosinófilos no fluido de lavagem broncoalveolar e reduziu a produção de IgE, em comparação à inoculação de células sensibilizadas com ovalbumina, e estes efeitos foram mais intensos com uma segunda inoculação de células tolerogênicas. Além disso, redução do infiltrado inflamatório pulmonar foi observada em animais que tinham sido tratados com células dendríticas, independente do antígeno utilizado na sensibilização das mesmas. Estes resultados indicam que células dendríticas geradas como descrito neste trabalho podem inibir uma resposta alérgica Th2. A especificidade do tratamento, entretanto, deve ser melhor investigada. / Allergies affect about 20-30% of world population and its prevalence and severity of symptoms has increased in recent decades. Existing therapies to respiratory tract disorders are extense, with side effects, not effective for severe patients and depending on the allergen removal. An alternative for these patients is the induction of immune tolerance by cell therapy with dendritic cells pulsed with the allergen. This study aimed to evaluate the effect of myeloid dendritic cells sensitized in vitro with B. tropicalis extract in a murine model of respiratory allergy. In experimental models of respiratory allergy, T helper cells (Th2) produce allergen-specific cytokines which regulate the synthesis of allergen-specific IgE antibodies and control eosinophilic inflammation and tissue remodeling of the airways, these parameters were evaluated in this study. Tolerogenic dendritic cells from A / J mice were obtained in the presence of GM-CSF and dexamethasone and were characterized by low MHC-II expression and costimulatory molecules, marked reduction of PD-L2 and antiinflammatory profile of cytokine production. Prior inoculation of sensitized dendritic cells with Blomiasignificantly and specifically reduced the total number of leukocytes and eosinophils in the bronchoalveolar lavage fluid and reduces IgE production compared to inoculation with cells sensitized with ovalbumin, and these effects were improved with a second inoculation of tolerogenic cells. Furthermore, reducing the pulmonary inflammatory infiltrate was seen in animals that had been treated with dendritic cells regardless of the antigen used for sensitization. These results indicate that dendritic cells generated as described here can inhibit an allergic Th2 response. The specificity of the treatment, however, should be examined.

Nosso objetivo, neste trabalho, foi verificar se a interação das células dendríticas (DCs) com antígenos da Hsp60 induz um efeito sinérgico no direcionamento de uma resposta imune reguladora, no sistema humano. Células dendríticas humanas maduras (mDC) e imaturas (iDC e iDC IL-10) foram geradas, in vitro, a partir de monócitos de 15 de indivíduos saudáveis. Estas células foram caracterizadas quanto à (i) morfologia, (ii) imunofentotipagem, (iii) produção de citocinas e, (iv) capacidade de estimular aloproliferação. Analisamos a auto-reatividade de linfócitos T (LT) dirigida a diferentes DCs (mDC, iDC e iDC IL-10). Na interação de antígenos da Hsp60 com essas diferentes DCs, verificamos: (i) a capacidade de induzir a produção de citocinas pelas DCs e de inibir a sua produção espontânea, (ii) a auto-reatividade de linfócitos T dirigida a esses antígenos (proliferação e produção de citocinas), (iii) a expressão gênica de um painel de moléculas reguladoras (TGFb, receptor de TGF-b, IL-10 e GATA3) e inflamatórias (IFNg, TNF-a e T-bet) em linfócitos, T no contexto de células dendríticas imaturas. As mDC apresentaram expressão de CD83, maior expressão de CD80, e CD86, assim como induziram respostas alogenéicas mais intensas do que as DCs imaturas. Apesar de haver variabilidade na produção de citocinas, apenas as DC imaturas produziram espontaneamente IL-10, e as DCs maduras produziram mais freqüentemente IFN-g e TNF-a. Analisando o efeito dos antígenos da Hsp60 sobre a produção de citocinas, observamos tanto indução quanto inibição da produção de IFN-g, TNF-a, IL-4 e IL-10 nos três grupos de DC. Porém, a inibição predominou sobre a produção nos três grupos de DC. A auto-reatividade proliferativa de LT dirigida às diferentes DCs foi mais freqüente nas culturas com as DCs maduras (6/10) do que com as DCs imaturas (4/10). Também detectamos produção das citocinas IFN-g, TNF-a, e IL-2 para todos os grupos de células, porém, mais freqüentemente na auto-reatividade contra as DCs maduras. Diversos antígenos da Hsp60 foram capazes de inibir esta auto-reatividade. O peptídeo N7 teve um efeito dominante na inibição da auto-reatividade proliferativa de linfócitos T dirigida às mDCs. A auto-reatividade a antígenos da Hsp60, de um modo geral, foi maior com as DCs imaturas. Diversos antígenos foram capazes de induzir proliferação e produção de citocinas. Todavia, o peptídeo C3 foi imunodominante (6/10) na indução de resposta linfoproliferativa, no contexto das iDCs. A expressão gênica de moléculas reguladoras e inflamatórias foi verificada em linfócitos T, na auto-reatividade a antígenos da Hsp60. Observamos modificações importantes de praticamente todas as moléculas estudadas. Verificamos um predomínio de modificações reguladoras para os genes TGFb, TGF-bR, GATA3, TNF-a e T-bet. O peptídeo N7 induziu modificações dominantemente reguladoras em todas as condições em que ele foi testado. Em conclusão, verificamos que antígenos da Hsp60 têm efeito direto na produção de citocinas das diferentes DCs. Também têm a capacidade de ativar, simultaneamente, em linfócitos T, na interação com as células dendríticas, genes funcionalmente antagônicos. Isto reafirma a diversidade funcional da Hsp60. Ademais, identificamos o peptídeo N7 como potencialmente imunorregulador e o consideramos um candidato a ser testado em protocolos para indução de tolerância. / The aim of the present study was to determine whether the interaction of dendritic cells (DCs) with antigens derived from Hsp60 is capable of inducing a synergistic effect in directing a regulatory immune response, using a human system. Human DCs with mature (mDC) and immature (iDC and iDC IL-10) phenotype were generated in vitro from monocytes obtained from 15 healthy subjects. These cells were characterized according to (i) morphology, (ii) expression of surface markers, (iii) cytokine production, and (iv) ability to stimulate alloproliferation. We analyzed the autoreactivity of T lymphocytes (TL) directed against different DC types (mDC, iDC, and iDC IL-10). For the interaction of Hsp60 antigens with these different DCs, we determined: (i) the ability to induce cytokine production by DCs as well as to inhibit their spontaneous production, (ii) the autoreactivity of TL to these antigens (proliferation and cytokine production), and (iii) gene expression levels of a panel of regulatory (TGFb, TGF-b receptor, IL-10, and GATA3) and inflammatory (IFN-g, TNF-a, and T-bet) molecules by TL when stimulated by mDC. mDC expressed CD83 and showed higher levels of CD80 and CD86 and induced stronger allogeneic responses than immature DCs. Although cytokine production varied, only immature DCs spontaneously produced IL- 10, and mature DCs more frequently produced IFN- and TNF-. An analysis of the effects of Hsp60 antigens on cytokine production showed both induction and inhibition of production of IFN-g, TNF-a, IL-4, and IL-10 by the three sets of DCs; however, inhibition predominated over induction in all three DC groups. The proliferative autoreactivity of LT directed towards the different DCs was more frequent in cultures containing mDCs (6/10) than in those containing immature DCs (4/10). We also detected production of IFN-g, TNFa, and IL-2 by all groups of cells; however this was more frequent in the context of autoreactivity against mDCs. Several Hsp60 antigens were capable of inhibiting this autoreactivity. Peptide N7 had a dominant effect on the inhibition of the proliferative autoreactivity of LT directed towards mDCs. Autoreactivity to Hsp60 antigens was generally greater in cultures containing immature DCs. Several antigens were capable of inducing proliferation and cytokine secretion. However, peptide C3 was immunodominant (6/10) in the induction of a lymphoproliferative response in cultures containing iDCs. Gene expression of regulatory and inflammatory molecules was determined in LTs in the context of autoreactivity to Hsp60 antigens. There were important modifications in virtually all molecules studied. There was a predominance of regulatory-oriented changes in expression of TGFb, TGF-bR, GATA3, TNFa, and T-bet. Peptide N7 induced dominantly regulatory changes in gene expression in all conditions in which it was tested. In conclusion, we have shown that Hsp60 antigens have a direct effect on cytokine production by different DCs. These antigens are also able to activate, during the interaction of LT with DCs, genes that are functionally antagonistic. This finding reinforces the functional diversity of Hsp60. Furthermore, we have identified peptide N7 as potentially immunoregulatory, and consider it as a candidate to be tested in protocols for the induction of tolerance.

A endometriose é uma doença inflamatória crônica, estrógeno-dependente e de etiologia multifatorial, caracterizada pela implantação e crescimento de tecido endometrial fora da cavidade uterina e associada à dor pélvica e infertilidade. A doença é classificada de acordo com os estádios e sítios de acometimento nos órgãos pélvicos. Variantes genéticas, endócrinas e ambientais podem contribuir para a geração de uma deficiência na resposta imune local permitindo a implantação das células ectópicas na cavidade pélvica. Alterações constatadas no padrão de citocinas presentes no microambiente pélvico poderiam promover um ambiente imunossupressor, justificando a diminuição da resposta imune efetora verificada na endometriose. Dentre os possíveis fatores imunomoduladores, está o antígeno leucocitário humano-G (HLA-G), cuja expressão se dá intensamente nas células trofoblásticas, sendo reconhecido por induzir a tolerância materno-fetal. A proteína HLA-G pode ser expressa na membrana celular ou ser secretada na forma solúvel. HLA-G encontra receptores inibitórios nas células do sistema imune inato e adaptativo e tem sua expressão induzida sob condições não fisiológicas, como em transplantes alogênicos, doenças inflamatórias ou neoplasias malignas. Assim, a hipótese deste estudo é a de que a proteína HLA-G seria produzida em níveis superiores nas mulheres com endometriose, o que poderia contribuir para a imunossupressão no microambiente da doença. Para testar esta hipótese, a proteína solúvel foi mensurada no soro e no fluido peritoneal de mulheres com e sem endometriose, por ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). Além disto, a expressão gênica de HLA-G foi avaliada nos tecidos de endométrio, por qRT-PCR, bem como a expressão da proteína, avaliada por imunohistoquímica, nos tecidos de endométrio e de lesão de endometriose, em mulheres com e sem a doença. Como resultados, verificaram-se maiores níveis da proteína solúvel no soro de mulheres que apresentavam endometriose em estádios avançados, especialmente naquelas com endometriose ovariana. Entretanto, na comparação entre os fluidos peritoneais, não houve diferença significativa entre os grupos com e sem endometriose. A expressão do transcrito gênico (mRNA) se mostrou maior no endométrio de mulheres sem a doença, mas a presença da proteína foi semelhante entre os endométrios de mulheres com e sem endometriose. Por outro lado, a expressão da proteína HLA-G nos tecidos de lesão de endometriose avançada se mostrou superior à do endométrio de mulheres sem a doença, indicando que a expressão de HLA-G seria induzida ectopicamente, no microambiente pélvico da doença. Portanto, os resultados apontam para um aumento da expressão de HLA-G em endometriose avançada / Endometriosis is a chronic inflammatory, estrogen-dependent disease of multifactorial etiology characterized by implantation and growth of endometrial tissue outside the uterine cavity, and associated with pelvic pain and infertility. Endometriosis is classified according to the stages and sites of the disease. Genetic, endocrine and environmental factors may contribute to the deficit on local immune response, allowing ectopic implantation of endometrial cells into the pelvic cavity. Changes in cytokines pattern in the pelvic microenvironment might promote an immune suppressor environment and explain the decreased immune effector cells response verified in endometriosis. Among possible immunomodulatory factors is the human leucocytary antigen-G (HLA-G) which is intensively expressed in trophoblasts and recognized by inducing maternal-fetal tolerance. HLA-G protein is expressed in both membrane-bound and soluble forms. HLA-G binds inhibitory receptors on innate and adaptive immune cells surface and its expression is induced in non-physiological conditions, such as allogeneic transplants, inflammatory diseases or neoplastic malignancies. Thus, this study hypothesizes that the HLA-G protein would be overexpressed in women with endometriosis, and could contribute to the immunosuppression in the disease microenvironment. To test this hypothesis soluble HLA-G protein was measured in serum and peritoneal fluid of women with and without endometriosis. Moreover, HLA-G gene expression were evaluated on endometrial tissue using RT-qPCR, and HLA-G protein expression were evaluated in matched ectopic and eutopic endometrium of women with and without endometriosis. As results, higher levels of soluble HLA-G were found in serum of women with advanced endometriosis, especially in those with ovarian endometriosis. However, soluble HLA-G levels in peritoneal fluid did not show significant differences between women with and without endometriosis. HLA-G mRNA expression were higher in eutopic endometrium of women without endometriosis, but the HLA-G protein expression were similar in eutopic endometrium of women with and without endometriosis. On the other hand, HLA-G protein expression in ectopic endometrium of women with advanced endometriosis was higher than in eutopic endometrium of women without endometriosis, suggesting that HLA-G expression was induced ectopically, in the pelvic microenvironment of the disease. In conclusion, the results point to an upregulation of HLA-G expression in advanced endometriosis

Introdução: Desde a década de 1970, quando se observou que a transfusão pré-transplante renal diminuía a rejeição ao enxerto, o efeito transfusion-related immunomodulation (TRIM) vem sendo estudado, não havendo, ainda, um entendimento completo de seu mecanismo. Recentemente, a descrição das células T reguladoras (TREG) trouxe novas possibilidades de compreensão desse fenômeno, com grande implicação terapêutica. Objetivos: Avaliar a proporção de células TREG antes e após a transfusão de concentrado de hemácias em uma amostra de pacientes clínicos não imunossuprimidos e correlacionar os resultados com o volume transfundido e o tempo de estocagem do sangue. Métodos: Pacientes com diversas patologias clínicas e com indicação de transfusão de concentrado de hemácias foram recrutados consecutivamente. Após assinatura do consentimento informado, o número de células TREG pré e pós-transfusão foi avaliado, bem como sua correlação com o número de unidades transfundidas e o tempo de estocagem. Resultados: Observou-se um aumento estatisticamente significativo na proporção de células TREG (CD4+, CD25+, FOXP3+) 72 horas após a transfusão (p=0,003). Tal aumento mostrou correlação com o número de unidades transfundidas, mas não com o tempo de estocagem (p=0,017 e 0,49, respectivamente). Conclusão: O aumento do numero de células TREG parece estar presente após transfusão de hemácias não leucodepletadas mesmo em uma amostra heterogênea, o que reforça sua importância clínica. A influência do número de unidades mas não do tempo de estocagem corrobora estudos anteriores. O mecanismo molecular do efeito TRIM, bem como seu impacto clínico em um cenário real, ainda precisam ser melhor avaliados. / Background: Transfusion-related immunomodulation (TRIM) has been the subject of research since the 1970s, when transfusion before kidney transplantation was found to decrease the rates of allograft rejection, but the mechanisms underlying this effect have yet to be fully elucidated. The recent description of regulatory T cells (TREG) has paved the way for a new understanding of this phenomenon, with major therapeutic implications. Objectives: To assess the levels of TREG cells before and after transfusion of packed red blood cells in a clinical sample of non-immunosuppressed patients and to correlate findings with the volume of blood transfused and length of storage. Methods: Patients with a variety of clinical conditions and with an indication for transfusion of packed red blood cells were recruited consecutively. After providing informed consent, pre- and post-transfusion TREG levels were measured, and their correlation with number of units transfused and length of storage was assessed. Results: There was a significant increase in the levels of TREG cells (CD4+/CD25+/FOXP3+) within 72 hours of transfusion (p=0.003). This increase correlated with the number of units transfused, but not with length of storage (p=0.017 and 0.49, respectively). Conclusion: An increase in TREG cell levels appears to follow transfusion of non-leukoreduced packed red blood cells even in a heterogeneous sample, which highlights the clinical relevance of this phenomenon. The influence of number of transfused units, but not of length of storage, on the results corroborates the findings of previous non-clinical studies. Further research is warranted to better investigate the molecular mechanism of the TRIM effect, as well as its clinical impact in real-world settings.