O agregado proteico P-MAPA apresentou potencial imunomodulatório em diversos estudos, mas a sua ação sobre o sistema complemento e receptores do tipo Toll (TLRs) não é, ainda, conhecida. Neste estudo o P-MAPA promoveu ativação das vias clássica e alternativa do sistema complemento e produção de C3a e C5a. Utilizando um modelo ex vivo de sangue total humano, o composto promoveu aumento da expressão de CD11b e CD14, diminuição da expressão de C5aR, TLR2 e TLR4, em leucócitos de sangue periférico e também quando combinado com LPS, porém não promoveu alterações na expressão de C3aR. O P-MAPA induziu redução de IFN-g no plasma, aumento da produção de TNF-α, IL-8, IL-12 e peróxinitrito, mas não induziu produção de superóxido, IL-6, IL-1β, TGF-β ou IL-10. Por meio de testes in vivo, foi possível determinar a dose letal do P-MAPA. Em conjunto, os dados obtidos mostram que o P-MAPA apresenta ação pró-inflamatória em modelo ex vivo de sangue total humano e que o tratamento combinado com LPS leva a uma amplificação dos seus efeitos. / P-MAPA, a protein aggregate has been described as a promising immunomodulator, however, its role on the complement system and Toll-like receptors (TLRs) is unknown. In the study, P-MAPA has promoted activation of the complement\'s classical and alternative pathways and the production of C3a and C5a. Using an ex vivo model of human whole blood, the compound promoted increase of CD11b and CD14 expression, decrease of C5aR, TLR2 and TLR4, in peripheral blood leucocytes and when combined with LPS, but did not change C3aR expression. P-MAPA promoted reduction of IFN-g in plasma, increased production of TNF-α, IL-8, IL-12 and peroxynitrite, but did not induce the production of superoxide, IL-6, IL-1β, TGF-β or IL-10. Through in vivo tests, we were able to determine a lethal dose for P-MAPA. Altogether, our data indicate that P-MAPA has proinflammatory action in ex vivo model of human whole blood and that the treatment combined with LPS leads to amplification of its effects.

Toxoplasma gondii é um protozoário coccídio intracelular obrigatório conhecido por sua habilidade em parasitar uma ampla gama de espécies hospedeiras. A região apical do parasito é rica em organelas que, em função dos produtos liberados, estão envolvidas no processo de adesão e invasão da célula hospedeira. As proteínas liberadas por micronemas (MICs), solúveis e transmembrana, possuem domínios adesivos essenciais para a virulência do parasita. Algumas dessas proteínas são encontradas associadas entre si na superfície do taquizoíta, formando complexos como TgMIC1/MIC4/MIC6 e TgMIC3/MIC8. Em estudos anteriores demonstramos a que o subcomplexo TgMIC1/MIC4 (Fração LAC+) liga-se à lactose e estimula macrófagos a secretar IL-12. Verificamos, utilizando células HEK293 transfectadas, que um dos principais mecanismos responsáveis pela produção de IL-12 decorria do reconhecimento de N-glicanos do ectodomínio de TLR2 pelo domínio de reconhecimento de carboidrato de TgMIC1. O objetivo do presente estudo foi o de investigar a capacidade de TgMIC1 e TgMIC4 de ativar macrófagos murinos e qual o papel desempenhado por TLR2 e/ou TLR4 no desencadeamento dessa ativação. Mostramos que macrófagos derivados de medula óssea de camundongos C57Bl/6, estimulados com TgMIC1 e TgMIC4, utilizadas isoladamente ou em combinação, secretam altos níveis de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-?, IL-6, IL-12 e IL-1?, produzem altos níveis de óxido nítrico, e têm aumentadas suas capacidades migratória e fagocítica. Os ensaios que utilizaram macrófagos de camundongos C57Bl/6 nocauteados revelaram que a ausência de expressão de TLR2 ou de TLR4 prejudicou os efeitos ativadores exercidos por TgMIC1 e TgMIC4. Macrófagos TLR2-/- tiveram as manifestações de ativação celular significantemente reduzidas em relação aos macrófagos selvagens. Por outro lado, esses efeitos foram mais afetados pela ausência de TLR4, uma vez que as respostas obtidas frente ao estímulo com TgMIC1 ou TgMIC4 eram similares às verificadas em células não estimuladas (controle negativo). Concluímos que TgMIC1 e TgMIC4 interagem com os receptores do tipo toll 2 e 4 expressos por macrófagos, levando à ativação celular manifesta por alta produção de citocinas e outros mediadores inflamatórios, e aumento das capacidades migratória e fagocítica. A interação com TLR4 é preponderante em relação à estabelecida com TLR2 no desencadeamento de ativação celular / Toxoplasma gondii is an obligate intracellular coccidian protozoan known for its ability to parasitize a wide range of host species. The parasite\'s apical region is rich in organelles that, because of the products it releases, are involved in the processes of adhesion and invasion of the host cell. The soluble and transmembrane proteins released by the micronemes (MICs), have adhesive domains that are essential for the parasite virulence. Some of these proteins can be found associated with each other on the taquizoite surface, as it is the case of TgMIC1/MIC4/MIC6 or TgMIC3/TgMIC8 complexes. Our group has demonstrated in previous studies that the TgMIC1/TgMIC4 subcomplex (LAC+ fraction) binds to lactose and stimulates macrophages to release IL-12. Using HEK293 transfected cells, we showed that one of the main mechanisms leading to IL-12 release by macrophages, was the recognition of N-glycans of the TLR2 ectodomain by the carbohydrate recognition domain of TgMIC1. Thus, the objective of this study was to address whether TgMIC1 and TgMIC4 activate murine macrophages and what is the role of TLR2 and TLR4 in macrophage activation. Our results show that the stimulation of C57BL/6 mice bone marrow derived macrophages with TgMIC1 and TgMIC4, alone or in combination, induce the release of high levels of proinflammatory cytokines such as TNF-?, IL-6, IL-12 and IL-1?, and also nitric oxide; and increases phagocytic activity and cell migration activity. The assays using knockout C57Bl/6 macrophages showed that the absence of TLR2 or TLR4 expression impaired the activating effects of TgMIC1 e TgMIC4. TLR2-/- macrophages presented significantly reduced cell activation manifestations compared to WT macrophages. On the other hand, these effects were more affected in the absence of TLR4, once the responses obtained with TgMIC1 or TgMIC4 stimulation were similar to those observed in non stimulated cells (negative control). We conclude that TgMIC1 and TgMIC4 interact with the receptors Toll like 2 and 4 expressed in macrophages, leading to cell activation, resulting in high cytokine and inflammatory mediators production, and increased migratory and phagocytic capacity. The interaction with TLR4 is predominant over that established with TLR2 in the triggering of cell activation

Receptores do tipo Toll (TLRs) e o receptor do fator ativador de plaquetas (PAF-R) são altamente expressos em macrófagos. Neste estudo, investigamos o efeito da ativação do PAF-R na resposta de macrófagos peritoneais a agonistas de TLR. Descobrimos que PAF exógeno inibiu a produção de citocinas pró-inflamatórias (IL-6, IL-12p40 e TNF-α) e aumentou a produção de IL-10 em macrófagos estimulados com Pam3Cys (TLR2) e LPS (TLR4), mas não Poly(I:C) (TLR3). PAF não afetou a expressão de MyD88 e TRIF, sugerindo que o efeito do PAF na modulação das citocinas é downstream aos adaptadores. PAF inibiu a fosforilação induzida por LPS da subunidade p65 do NF-κB que direciona a expressão de genes pró-inflamatórios, e aumentou a fosforilação da proteína precursora p105 do NF-κB, que induz a expressão da IL-10. Esses resultados indicam que em macrófagos ativados com LPS, a diminuição da atividade transcricional da p65 e o aumento da fosforilação da p105 induzidos pelo PAF são responsáveis pela downregulation das citocinas pró-inflamatórias e upregulation da IL-10, respectivamente. / Toll-like receptors (TLRs) and platelet-activating factor receptor (PAF-R) are highly expressed in macrophages. In this work, we investigated the effect of PAF-R activation on peritoneal macrophages responses to TLR agonists. We found that exogenous PAF inhibited the production of pro-inflammatory cytokines (IL-12p40, IL-6 and TNF-α) and increased IL-10 in macrophages challenged with Pam3Cys (TLR2) and LPS (TLR4), but not by Poly(I:C) (TLR3). PAF did not affect MyD88 and TRIF expression, suggesting that PAF modulation on cytokines is downstream to adaptors. PAF inhibited LPS-induced phosphorylation of NF-κB p65 that drives inflammatory cytokine gene expression and increased NF-κB p105 precursor phosphorylation, which induces IL-10 expression. These findings indicate that in LPS-activated macrophages, the impaired transcriptional activity of p65 subunit and enhanced p105 phosphorylation induced by PAF are responsible for the downregulation of pro-inflammatory cytokines and up-regulation of IL-10, respectively.

INTRODUÇÃO: As infecções causadas por bactérias ou vírus são frequentes em pacientes com imunodeficiência comum variável (ICV) devido à deficiência de anticorpos e associação com alteração da função das células T. OBJETIVOS: Avaliar o efeito da ativação de receptores Toll-like (TLR) utilizando ligantes de TLRs em células T monofuncionais ou polifuncionais em pacientes com ICV. MÉTODOS: Foram selecionados 16 pacientes com ICV do Ambulatório de Manifestações Dermatológicas das Imunodeficiências Primárias ADEE3003 HC-FMUSP e 16 controles saudáveis. Os métodos utilizados de citometria de fluxo foram: a) análise em sangue periférico de linfócitos B, linfócitos T quanto ao perfil de ativação/maturação, linfócitos T foliculares (Tfh) e células T reguladoras (Treg); b) dosagem de citocinas e quimiocinas em amostras de soro e em sobrenadante de culturas de células mononucleares do sangue periférico (CMNs) estimuladas com agonistas de TLRs; c) avaliação das células TCD4+ mono e polifuncionais secretoras de IL-17a, IL-22, TNF, IFN- e IL-10, e expressão de marcador de ativação crônica de CD38 estimuladas por agonistas de TLR2, TLR3 e TLR7/8 e estímulos policlonais como enterotoxina B de Staphylococcus aureus (SEB) e acetato miristato de forbol e ionomicina (PMA/IONO); d) células Th22 e Tc22 estimuladas com TLR e SEB. RESULTADOS: Na ICV, os linfócitos B do sangue periférico mostram diminuída frequência, sendo em maior frequência de linfócitos B naïve (CD19+IgD+CD27-), e ausência de células B de memória. Além disto, um aumento na expressão do marcador de exaustão PD-1 foi observado nas células TCD4+ de memória efetora (CD45RA-CCR7-) e na expressão de CD38, em células TCD8+ terminalmente diferenciadas (CD45RA + CCR7-). Em contraste, houve diminuição na frequência de células T reguladoras naïve nos pacientes com ICV. Nos indivíduos com ICV foi observado aumento na frequência de células TCD4+ TNF+ sob estímulo TLR2 e TLR7/8 comparado ao grupo controle, enquanto que sob estímulo com PMA/IONO houve menor frequência de células TCD4+ e TCD8+ secretoras de IFN-y IL-17a, IL-22 ou TNF. Já em células TCD8+ houve importante redução na ativação via TLR3 na resposta de IL-22, IFN-y e IL-17a. Contudo, os estímulos com TLR7/8 e SEB foram capazes de aumentar a frequência de células Th22 e Tc22 nos pacientes com ICV. Em geral, as células TCD4+, que secretam simultaneamente 4 a 5 citocinas induzidas por TLR foram preservadas em ICV. Embora as células TCD4+ polifuncionais secretoras de 3 citocinas, foram capazes de responder a estímulos via TLR2 e TLR7/8, as células TCD8+ não responderam para qualquer estímulo via TLRs. Além disso, as células T que expressam CD38 mostraram menor polifuncionalidade aos estímulos via TLRs e PMA/IONO. O perfil inflamatório nos pacientes com ICV foi observado pela elevação sérica de IL-6, CCL-2, CCL-5, CXCL8, CXCL-9, CXCL-10. Alteração na resposta aos agonistas de TLRs em ICV pode ser observada com a ativação dos agonistas de TLRs em CMNs, que mostrou maior produção de TNF e diminuição de CCL2 e CXCL8 após ativação via TLR4. Em contraste, o agonista de TLR7/8, teve ação oposta induzindo CXCL10 e reduzindo os níveis de CXCL9. Chama atenção no ICV, à reduzida secreção de IFN-alfa induzida por TLR7/8, que não foi observada com a ativação via TLR9. CONCLUSÕES: Até o momento, os achados em ICV mostram alterações nas células T, seja quanto à baixa frequência de células T reguladoras naïve e a reduzida resposta efetora, em especial das células TCD8+. Contudo, enfatiza o potencial de adjuvante dos agonistas de TLR7/8 na ativação das células T / INTRODUCTION: Infections caused by bacteria or viruses are common in patients with Common Variable Immunodeficiency (CVID), due to antibody deficiency and association with altered function of T cells. OBJECTIVES: To evaluate the effect of Toll-like receptors (TLR) activation using TLR agonists on the monofunctional or polyfunctional T cells in patients with CVID. METHODS: We selected 16 patients with ICV from the Dermatologic Manifestations of Primary Immunodeficiencies Clinic ADEE3003 HC-FMUSP and 16 healthy controls. The methods used for flow cytometry were: a) analysis of peripheral blood B lymphocytes, T lymphocytes were assessed by the activation/maturation profile, follicular T cells (Tfh) and regulatory T cells (Treg); b)evaluation of cytokines and chemokines serum levels and in supernatants of mononuclear cell cultures from peripheral blood (PBMC) stimulated with TLR agonists; c) evaluation of mono and polyfunctional CD4+ T cells secreting IL-17a, IL-22, TNF, IFN-y and IL-10, and expression chronic activation marker of CD38 stimulated by agonists of TLR2, TLR3 and TLR7/8 and polyclonal stimuli such as Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB) and phorbol myristate acetate and ionomycin (PMA / IONO); d) analysis of Tc22 and Th22 cells stimulated with TLR and SEB. RESULTS: In the CVID, the peripheral blood B cells show decreased frequency, being higher frequency of naïve B cells (IgD+ CD19+ CD27-) and lack of memory B cells. Moreover, an increased expression of PD-1, an exhaustion marker, was detected in the CD4+ T cell effector memory (CD45RA- CCR7-) and expression of CD38 on CD8+ T terminally differentiated cells (CD45RA+ CCR7-). In contrast, a decreased frequency of naïve regulatory T cells was detected in the patients with CVID. In CVID patients it was observed increased frequency of T CD4+ TNF+ cells upon TLR2 and TLR7/8 agonists compared to the control group, while under stimulation with PMA /IONO there was a lower frequency of CD4+ and CD8+T cells secreting IFN-y, IL-17a, IL-22 or TNF. The CD8+T cells showed a significant reduction of in the IL-22 response, IFN-? and IL-17a induced by TLR3 activation. However, stimulation with TLR7/8 and SEB were able to increase the frequency of Th22 and TC22 cells in the patients with CVID. In CVID patients it was observed increased frequency of T CD4+ TNF+ cells upon TLR2 and TLR7/8 agonists compared to the control group, while under stimulation with PMA /IONO there was a lower frequency of CD4+ and CD8+ T cells secreting IFN-y, IL-17a, IL-22 or TNF. The CD8+ T cells showed a significant reduction of in the IL-22 response, IFN-y and IL-17a induced by TLR3 activation. However, stimulation with TLR7/8 and SEB were able to increase the frequency of Th22 and TC22 cells in the patients with CVID. In general, CD4+ T cells that secrete simultaneously 4 to 5 cytokines induced by TLR were preserved in CVID. Although polyfunctional CD4+ T cells secreting 3 cytokines were able to respond to TLR2 and TLR7/8 agonists, the CD8+ T cells did not respond to any stimuli. In addition, T cells expressing CD38, showed lower polyfunctionality to the stimuli via TLRs and PMA/IONO. Furthermore, the inflammatory status in the patients with CVID was observed by the increased serum levels of IL-6, CCL-2, CCL-5, CXCL8, CXCL-9, CXCL-10. In contrast, the agonist of TLR7/8 had opposite action inducing CXCL10 and reducing the CXCL9 levels. Noteworthy in CVID, that the reduced secretion of IFN-alfa induced by TLR7/8 was not observed with TLR9 activation. CONCLUSIONS: To date, the CVID findings shows alterations in the T cells, as the low frequency of naïve regulatory T cells and reduced effector response, mainly of CD8+ T cells. However, it emphasizes the adjuvant potential of the TLR7/8 agonist in the T cells activation

Introdução: A dermatite atópica (DA) é uma enfermidade cutânea inflamatória de caráter crônico, na qual o prurido é constante, e com marcada xerose. Dermatose que geralmente se inicia na infância, e pode surgir em indivíduos com história pessoal ou familiar de asma, rinite alérgica e/ou DA. A pele com DA apresenta colonização por Staphylococcus aureus (S. aureus) em 80-100% dos casos, sendo responsável pela produção enterotoxinas, capazes de exacerbar a resposta inflamatória na DA. Nesta enfermidade, existem distintos subtipos de células apresentadoras de antígeno ou dendríticas (DC), tanto na pele quanto circulantes. As DC exercem papel relevante na inflamação da DA, em especial um subgrupo de células dendríticas mieloides (mDC), as chamadas células dendríticas inflamatórias epidérmicas (IDEC). Objetivo: Avaliar o fenótipo e a função das mDC (IDEC-like) em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) na DA do adulto. Métodos: Foram selecionados 21 pacientes com DA (idades entre18 e 65 anos, sendo 13 homens e oito mulheres) e 21 controles (idades entre 21 e 41 anos, sendo oito homens e 13 mulheres), nos quais foram realizadas as avaliações fenotípica e funcional das mDC (IDEC-like) em PBMC. Para tal, foram analisadas as expressões de: Fc?RI, TNF, IFN-y, IL-10, CD36 e CD83 nas mDC, estimuladas com enterotoxina estafilocócica B (SEB), agonistas de TLR2 (Pam3CSK4), TLR4 (LPS) e de TLR7/8 (CL097) através da citometria de fluxo. Resultados: Os principais achados nos pacientes com DA foram: aumento da frequência de células IDEC-like frente ao estímulo com agonista de TLR2 (Pam3CSK4); aumento da frequência de IFN-y em condição não estimulada, e de IL-10 frente a estímulo com agonista de TLR7/8 (CL097) nesta população de células dendríticas. Conclusão: A caracterização das mDC circulantes na DA evidencia perfil pró-inflamatório em condição não estimulada, impactando na resposta imune adaptativa. O aumento significativo na frequência de células IDEC-like nos pacientes com DA sugere sua participação na perpetuação do processo inflamatório da DA / Introduction: Atopic dermatitis (AD) is an inflammatory skin disease with a chronic course, with constant pruritus and marked xerosis. It usually starts during childhood, and a personal or familial history of skin and/or respiratory allergy may be present. Around 80-100% of the patients show a cutaneous colonization of Staphylococcus aureus (S. aureus), which produces enterotoxins that may exacerbate the inflammatory response in AD. In this disease, there are distinct subtypes of antigen-presenting cells or dendrytic cells (DC), either circulating or present in the affected tissue. DC exert a relevant role in AD inflammation, especially a subgroup of myeloid cells (mDC), known as epidermal inflammmatory dendritic cells (IDEC). Objective: To evaluate the phenotype and function of mDC (IDEC-like) in mononuclear cells of the peripheral blood (PBMC) of adults with AD. Methods: Twenty-one adults with AD (age 18/65; male/female: 13/8) and 21 healthy controls (age 21/41; male/female: 8/13) were selected for the current study. Phenotypical and functional analysis of mDC (IDEC-like) of PBMC were performed, through the expression of Fc?RI ,TNF, IFN-y, IL-10, CD36 and CD83 in mDC, stimulated with enterotoxin B (SEB) and with agonists of TLR2 (Pam3CSK4), TLR4 (LPS) and TLR7/8 (CL097) by flow cytometry. Results: Main findings of AD patients included: elevation of IDEC-like cell frequency with TLR2 (Pam3CSK4) agonist, augmented unstimulated frequency of IFN-y, and of IL-10 with TLR7/8(CL097) agonist of this population of dendritic cells. Conclusion: Characterization of circulating mDC on AD shows proinflammatory profile in unstimulated conditions, therefore causing impact on the adaptive immune response. The significant increase in the frequency of IDEC-like cells in AD patients suggest a role in the maintenance of inflammation in AD

Introdução: A resistência a infecção pelo HIV-1 depende de fatores virais, genéticos e imunológicos do hospedeiro, incluindo os componentes da resposta imune inata e adaptativa. As células Natural Killer (NK) e as células T CD8+ são as principais células efetoras que medeiam atividade citotóxica contra células transformadas ou infectadas, que exercem importante papel protetor nos indivíduos expostos e não infectados por HIV-1 (ENI). Objetivo: Avaliar a expressão de receptores de ativação e inibição/exaustão nas células NK e T CD8+, e a capacidade das células NK em secretar citocinas e componentes citotóxicos após estimulação via receptores Toll-like (TLRs), e a resposta de células T CD8+ a peptídeos da Gag do HIV-1 em indivíduos ENI e seus parceiros infectados por HIV-1. Resultados: No grupo ENI foi observado aumento da frequência de células NK CD56bright que expressam moléculas de ativação NKG2D e CD95 na população CD56dim, enquanto no grupo HIV-1 foi mais prevalente a expressão de MIC A/B em ambas populações de células NK, com redução da expressão de NKG2D na população CD56dim. Além disto, foi observado expansão da população de células NK CD56dim que expressam CD94, NKG2C e principalmente de CD57 foi mais prevalente nos indivíduos ENI, com correlação positiva com títulos de anticorpos IgG anti-citomegalovírus humano. Nos indivíduos ENI foi observado que a ativação via TLR-3, TLR-7 ou TLR-7/8 foi capaz de potencializar a expressão de marcadores de desgranulação e de citotoxicidade, CD107a e granzima B, principalmente na população CD56dim, e de IFN-y e TNF nas populações CD56bright e CD56dim. Além disto, somente o grupo ENI, foi detectado aumento da freqüência de células NK secretoras de CD107a, granzima B, IFN-y e TNF, após estimulação com acetato de miristato de forbol e ionomicina. A frequência de expressão de alelos de KIR (killer cell immunoglobulin-like receptors) foi similar entre os grupos analisados. Elevada frequência de células T CD8+ CD38+ e CD8+PD-1+ (programmed cell death protein 1) foi detectado nos grupos ENI e HIV-1, cuja alteração foi observada em todas as fases de maturação celular. Os indivíduos ENI mostraram presença de resposta antígeno-específica de células T CD8+ secretoras de CD107a, granzima B, IFN-y e TNF, semelhante ao grupo HIV-1. Conclusão: Os resultados mostraram que no grupo ENI, as células NK expressam um perfil de ativação, com potente resposta aos estímulos de resposta inata e células NK com perfil de memória. Presença de células TCD8+ antígeno-específica foi evidenciada no grupo ENI, com perfil semelhante, mas de menor magnitude ao detectado no grupo infectado por HIV. Em conjunto, os achados mostraram que no grupo ENI a resposta inata está potencialmente ativa, e que em associação a resposta T CD8+ antígeno-específica podem contribuir para a resistência a infecção pelo HIV-1 / Introduction: Resistance to human immunodeficency virus 1 (HIV-1) is dependent on viral, genetic and immunological host factors, including components of innate and adaptive immune response. Natural Killers cells (NK) and CD8+ T cells are main effectors cells mediating cytotoxic role against transformed or infected cells, playing a crucial role in HIV-1 exposed uninfected individuals (EU). Aim: To evaluate the expression of activation and inhibitory/exhaustion receptors on NK cells and CD8+ T-cells, and to determine the NK cells ability to cytokines and cytotoxic molecules secretion upon Toll-like receptors (TLRs) pathway activation as well as CD8+ T-cells response to HIV Gag peptides in EU individuals and HIV-1 infected partner. Results: Increased frequency of NK CD56bright cells expressing NKG2D and CD95 on CD56dim cells have been observed in EU group, while HIV-1 group was more prevalent MIC A/B expression in both NK cells subsets, with reduced expression of NKG2D in CD56dim cells. Moreover, expansion of NK CD56dim cells expressing CD94, NKG2C, and CD57 was prevalent on ENI group, which positive correlation with anti-human cytomegalovirus IgG serum titers. EU individuals showed that TLR-3, TLR-7 or TLR-7/8 pathway activation was able to enhance CD107a and granzyme B expression in CD56dim cells, and IFN-y and TNF expressions levels in both CD56bright and CD56dim NK cells. Moreover, only in EU group, high frequency of NK cells expressing CD107a, granzyme B, IFN-y and TNF were detected upon phorbol myristate acetate and ionomicyn stimulation. Frequency of KIR alleles (killer cell immunoglobulin-like receptors) was similar between groups. High frequency of CD8+CD38+ and CD8+PD-1+ (programmed cell death protein 1) T-cells were observed in EU and HIV-1 groups, in all stages of cellular differentiation. EU subjects showed presence of antigen-specific response by CD8+ T-cells secreting CD107a, granzyme B, IFN-y and TNF similar to HIV-1 group. Conclusion: The results showed that NK cells in EU subjects express activating profile, with potent ability to innate immune stimuli, as well as NK cells with memory profile. Presence of antigen-specific CD8+ T-cells was detected in EU group, with similar profile, but in less magnitude than HIV-1 group. Taken together, the findings showed an enhanced innate immune response in EU subjects, in association with antigen-specific CD8+ T-cell response can contribute to resistance to HIV-1 infection

O Líquen Plano Oral (LPO) é uma doença inflamatória crônica que pode apresentar quadros sintomáticos por longos períodos, afetando a qualidade de vida dos portadores desta doença. Sua etiologia ainda é desconhecida, desse modo os tratamentos disponíveis atualmente se restringem ao controle dos períodos sintomáticos. Acredita-se que a patogênese do LPO possa estar relacionada com alterações imunológicas e genéticas que levam a uma aberrante ativação das vias de sinalização dos receptores Toll-like (TLR). O objetivo deste estudo foi verificar a expressão do TLR2 e duas variantes genéticas deste receptor (rs1898830 e rs4696480) em estudo caso-controle envolvendo 91 amostras de pacientes com LPO e 83 amostras de indivíduos controles, pareados por sexo e idade. Não foram observadas diferenças na expressão do TLR2 entre grupo caso e controle, e nenhuma das variantes avaliadas foi relacionada com relação de risco para o desenvolvimento de LPO. Poucos estudos avaliaram os TLR no LPO, e os dados da literatura sugerem que a cronicidade da lesão e alterações na tolerância oral poderiam estar associadas a resposta imunológica via TLR2, que apresenta sua expressão inalterada no LPO, de forma que estudos mais aprofundados são necessários para se confirmar a real participação deste grupo de receptores no LPO. / Oral lichen planus (OLP) is a chronic inflammatory disease, which can be symptomatic for long periods, affecting the patient quality of life. LPO etiology still unknown, thus the treatments currently available are limited to symptomatic period. Probably the pathogenesis of OLP is related to immunological and genetic changes that provide aberrant Toll-like receptors (TLR) signaling. The aim of this study was to investigate the expression of TLR2 and two genetic variants of this receptor (rs1898830 and rs4696480) in a case-control study involving 91 samples from OLP patients and 83 samples from control subjects, matched for age and sex. No differenc es were observed in TLR2 expression between case and control groups, and neither of the variants was associated with an increased risk ratio for LPO development. Few studies have been conducted on TLR and OLP, and the literature suggests that the chronicity of the lesion in addition to the changes in oral tolerance may be associated with immune response through TLR2 stimulation, which shows unchanged expression in LPO. Further studies are required to confirm the actual participation of this group of receptors in OLP.

A interação entre a imunidade inata e adaptativa acontece durante diversas fases da resposta imune. Os Toll-like receptors (TLRs) tem importante papel na ativação de macrófagos e portanto, no conjunto de moléculas secretadas por estas células. Pouco se sabe sobre o papel destas substâncias no processo de contração da população de células T ativadas (Activation-induced cell death - AICD). Portanto, o objetivo do presente trabalho foi avaliar se macrófagos estimulados com diferentes agonistas de TLRs poderiam produzir fatores solúveis com capacidade modulatória da morte por AICD. Primeiramente, demonstramos que tanto a linhagem macrofágica J774, quanto os macrófagos derivados de medula óssea (BMDMs) expressam todos os TLRs, com excessão do TLR11. Comprovamos que estas proteínas são funcionais, uma vez que o estímulo com agonistas de TLRs leva à ativação de NF-<font face=\"Symbol\">&#954B nestes macrófagos. Finalmente, mostramos que os sobrenadantes gerados pelos macrófagos são capazes de proteger as células DO11.10 da AICD, via a regulação negativa de FasL, parcialmente mediada por PGE2. / The interaction between innate and adaptative immunity occurs in several phases of the immune response. The Toll-like receptors (TLRs) have an important role in the activation of macrophages directly acting on the molecules secreted by these cells. Little is known about the role of these secreted molecules on the survival control of activated T lymphocytes (Activation-induced cell death - AICD). Therefore, the objective of the present work was to evaluate the effects of soluble factors produced by macrophages activated with several TLRs agonists, on the survival of T lymphocytes. First we sought the expression of TRLs on both bone marrow-derived and J774 macrophage cell line and we could see that both cells express all TLRs, except for TLR 11. The stimulation of both cells with TLRs agonists leads to the expression of NF-<font face=\"Symbol\">&#954B and the production of soluble factors that are able to protect DO11.10 T lymphocyte cell line from AICD, via down regulation of FasL partially mediated by PGE2.

Os receptores do tipo Toll (TLRs) são as primeiras proteínas do sistema imune a identificarem distúrbios, reconhecem patógenos como bactérias, fungos e vírus. Como o processo inflamatório possui um importante papel em diversas doenças, os TLRs foram considerados potenciais alvos em estratégias terapêuticas, incluindo o tratamento de câncer. No entanto, o papel dos TLRs permanece ambíguo. Esse estudo teve como objetivos analisar os níveis de expressão dos TLRs presentes em membrana plasmática, TLRs (TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6) em astrocitomas de diferentes graus de malignidade (grau II-IV), tumor mais prevalente do Sistema Nervoso Central (SNC). Nós demonstramos que a expressão dos TLRs foi mais alta em amostras de astrocitomas comparadas com tecido cerebral não-neoplásico, por qRT-PCR. A expressão gênica e proteica foi observada em células de linhagem de glioblastoma (GBM) U87MG e A172, mostrando sua presença em células tumorais. Foi observada expressão associada entre os heterodímeros TLR1- TLR2. Em GBMs, o subtipo mesenquimal mostrou maior nível de expressão dos TLRs comparados aos subtipos clássico e proneural. Com o objetivo de identificar o papel dos TLRs nas células tumorais, foi selecionado dentre os TLRs o que apresentou maior nível de expressão, o TLR4, e realizamos ensaios funcionais estimulando a U87MG com LPS, um agonista natural para TLR4. A taxa de proliferação da célula tratada com LPS foi similar a não tratada. No entanto, foi observado a ativação do NF-kB após 12hrs do estímulo com LPS. Quando a sinalização do receptor foi inibida por um composto químico (VGX-1027), o nível de proliferação da U87MG decaiu. Adicionalmente, análise in silico revelou uma forte associação dos TLRs hiperexpressos com aumento da expressão de genes relacionados à sinalização do ciclo celular, inflamassoma e ripoptossoma. O que sugere serem os TLRs alvos para complementação do tratamento do câncer / Toll-like receptors (TLRs) are the first to identify disturbances in the immune system, recognizing pathogens such as bacteria, fungi, and viruses. Since the inflammation process plays an important role in several diseases, TLRs have been considered potential therapeutic targets, including treatment for cancer. However, TLRs\' role in cancer remains ambiguous. This study aims to analyze the expression levels of plasmatic cell membrane TLRs (TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, and TLR6) in different grades (II-IV) of human astrocytoma, the most prevalent tumor of CNS. We demonstrated that TLR expressions were higher in astrocytoma samples compared to non-neoplastic brain tissue, by qRT-PCR. The genes and proteins expressions were observed in U87MG and A172 GBM cell lines, proving their presence in the tumor cells. Associated expressions between the known heterodimers TLR1-TLR2 were found in diffusely infiltrative astrocytoma. In GBM, the mesenchymal subtype showed higher levels of TLR expressions in relation to classical and proneural subtypes. Aiming to indentify the role of TLRs in tumor cells, we chose the highest TLR expressed in GBM cells, the TLR4, and performed functional assays stimulating U87MG-GBM cell line with LPS, a natural agonist for TLR4. The proliferation rate was similar in treated and non-treated cell with LPS. However, NF-kB activation was detected after 12hrs of LPS stimulation. When TLR4 signaling pathway was inhibited by a chemical compound (VGX-1027) a decrease in the proliferation rate was observed. Additionally, in silico analysis revealed a strong association of TLRs upregulation with increased expression level of genes related to cell cycle, inflammasome and ripoptosome pathways, further highlighting TLRs as interesting targets for cancer complementary treatment

Orientador: Karina Gonzales Silvério Ruiz / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-22T13:33:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Albiero_MayraLaino_M.pdf: 1767389 bytes, checksum: 14c8bc6c823503f78c08850abc5ed95b (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O objetivo do presente estudo foi avaliar se a exposição das células mesenquimais indiferenciadas do ligamento periodontal (PDLMSCs) ao lipopolissacarídeo da Porphyromonas gingivalis (Pg) e da Escherichia coli (Ec), levaria a alterações biológicas que comprometessem as propriedades relacionadas ao fenótipo mesenquimal indiferenciado. Para testar essa hipótese, inicialmente foi verificado se as cinco populações de células mesenquimais indiferenciadas purificadas para o antígeno de superfície CD105 (células CD105+) expresssavam os receptores Toll-like 2 e 4 (TLR2 e 4). Em seguida, as células foram cultivadas na presença do LPS da Pg e da Ec, e avaliadas quanto a sua viabilidade e proliferação pelo ensaio do MTS, expressão dos genes para citocinas inflamatórias IL-1?, IL-6, IL-8 e TNF-? (técnica do PCRq), imunomarcação para STRO-1 e expressão do gene identificador de pluripotencialidade - Oct-4, e capacidade de diferenciação osteoblástica/cementoblástica através dos ensaios para identificação de nódulos minerais e expressão dos genes para RUNX2, ALP e OCN. Os resultados mostraram que todas as populações celulares apresentaram fenótipo mesenquimal indiferenciado com marcação positiva para STRO-1, além de se mostrarem positivas para os receptores TRL2 e 4. O ensaio de MTS revelou que a exposição às três concentrações de LPS da Pg e da Ec (100 ng, 1 ?g e 10 ?g/ml) não comprometeu a viabilidade celular, mantendo todas as populações de PDLMSCs proliferativas ao longo dos 10 dias de cultivo. Em paralelo, verificou que LPS da Pg não alterou os níveis de RNAm para citocinas estudadas enquanto que, o LPS da Ec promoveu um aumento significativo na expressão de IL-6 e IL-8, quando aplicado nas concentrações de 100 ng e 1 ?g/ml. Adicionalmente, os resultados revelaram que a exposição celular aos LPS bacterianos, ambos na concentração de 1?g/ml, não alterou o fenótipo mesenquimal indiferenciado destas populações, uma vez que a expressão do gene OCT-4 e a marcação positiva para STRO-1 mantiveram-se semelhantes às células do grupo controle. Além disso, as células mantiveram a capacidade de diferenciação em fenótipo osteoblástico/cementoblástico, confirmado pela produção de nódulos minerais (ensaio de vermelho de alizarina) e expressão dos genes para RUNX-2, ALP e OCN semelhante ao grupo controle (células cultivadas em meio osteogênico). Somente foi observado um aumento significativo (p<0,05) na produção de nódulos minerais quando as células foram cultivadas na presença de 1?g/ml do LPS de Ec. Contudo, esse aumento da matriz mineral não está relacionado ao aumento nos níveis de RNAm para os genes relacionados ao fenótipo osteogênico comparado ao grupo controle. Dentro das condições experimentais avaliadas, concluí-se que a exposição das PDLMSCs ao LPS da Porphyromonas gingivalis e da Escherichea coli não alterou as propriedades biológicas destas células, mantendo assim, as características que conferem a estas a condição de mesenquimal indiferenciada / Abstract: The aim of this study was to evaluate if the exposure of mesenchymal stem cells of the periodontal ligament (PDLMSCs) to lipopolysaccharide (LPS) of Porphyromonas gingivalis (Pg) and Escherichia coli (Ec), would lead to biological changes that compromised the properties related to undifferentiated mesenchymal phenotype. To test this hypothesis, initially it was checked whether the five populations of mesenchymal stem cells purified by surface antigen CD105 (CD105+ cells) expressed the Toll-like receptors 2 and 4 (TRL2 and 4). Then, cells were cultured in the presence of LPS from Pg and Ec, and evaluated for viability and proliferation by the MTS assay, expression of proinflammatory cytokines IL-1?, IL-6, IL-8 and TNF-? (PCRq technique), immunostaining for STRO-1 and OCT-4 gene expression, an identifier of pluripotency, and osteoblast/cementoblastic differentiation capacity through assays to identify minerals nodules, as well as the gene expression of RUNX2, ALP and OCN. All these assays were carried out also in the presence of LPS from Escherichia coli (Ec), which is not considered a periodontal pathogen. The results showed that all cell populations with undifferentiated mesenchymal phenotype had positive staining for STRO-1, and also showed to be positive for the receptors TLR2 and 4. The MTS assay revealed that exposure to the three concentrations of Pg and Ec LPS (100 ng, 1?g and 10?g/ml) did not affect cell viability, keeping all PDLMSCs populations proliferative over 10 days of culture. In parallel, it was found that the LPS Pg did not alter mRNA levels for the cytokines studied, while the Ec LPS caused a significant increase in IL-6 and IL-8, when applied concentrations of 100ng/ml and 1?g/ ml. Additionally, the results revealed that cellular exposure to both LPS in the concentration of 1?g/ml, did not alter the undifferentiated mesenchymal phenotype of these populations, since the expression of gene OCT-4 and positive STRO-1 staining remained similar to cells in the control group. In addition, these cells retained their ability to differentiate into osteoblastic/cementoblastic phenotype confirmed by production of mineral nodules (alizarin red assay) and expression of the genes for RUNX-2, ALP and OCN similar to cells control group (cultured in osteogenic medium only). It was only observed a significant increase (p<0.05) in the production of mineral nodules when cells were cultured in the presence of 1?g/ml Ec LPS. However, this increase in the mineral matrix it is not related to increased levels of mRNA for genes related to osteogenic phenotype compared to the control group. Within the experimental conditions, it can be concluded that exposure of PDLMSCs to LPS of Porphyromonas gingivalis and Escherichia coli did not alter the biological properties of these cells thereby, maintaining the characteristics that confer to these cells the condition of mesenchymal stem cells / Mestrado / Periodontia / Mestra em Clínica Odontológica