MORAES, Janne Keila Sousa. Aspectos estruturais da toxina da soja (SBTX) e sua participação na defesa vegetal. xviii, 133 f. : Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2007. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-05-25T13:09:16Z No. of bitstreams: 1 2007_dis_jksmoraes.pdf: 1562360 bytes, checksum: 11d738b376765025a92cd19e28a5f414 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-05T20:07:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_dis_jksmoraes.pdf: 1562360 bytes, checksum: 11d738b376765025a92cd19e28a5f414 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-05T20:07:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_dis_jksmoraes.pdf: 1562360 bytes, checksum: 11d738b376765025a92cd19e28a5f414 (MD5) Previous issue date: 2007 / This work describes the structural characterization of the soybean toxin (SBTX), isolated from seeds by Siebra (2004). In addition, it is discussed the involvement of this protein in plant defense against pathogens. SBTX was isolated using ammonium sulfate fractionation (20-55%), ion exchange and gel filtration chromatographies. Judging by the SDS-PAGE patterns, it was reported to SBTX an apparent molecular mass of 44 kDa, composed of subunits of 27 kDa and 17 kDa, both linked by disulfide bond. NH2-terminal sequencing of electroblotted samples showed that 44 and 27 kDa bands possess identical NH2-terminal amino acid sequences, ADPTFGFTPLGLSEKANLQIMKAYD that differs from that of the 17 kDa band, PNPKVFFDMTIGGQSAGRIVMEEYA. In the fluorescence spectroscopy, excitation of the toxin solution at 280 m gave a maximum emission in 332 m, which is typically for tryptophan residues buried inside the protein. The secondary structure of SBTX by circular dicroism classified this protein as belonging to alpha- and beta class, showing 35% -helix, 13% -sheet and strand, 27% -turn, 25% random coil and 1% aromatic residues and disulfide bonds. SBTX (50 gP/mL) inhibited the spore germination of the filamentous fungi Aspergillus niger and Penicillium herguei, but did not inhibit those of Fusarium solani e F. oxysporum, even at concentrations ten times higher. Nevertheless, SBTX did not interfere in the vegetative growth of the fungus cited above. On the other hand, SBTX slowed the growth of the yeasts Candida albicans and Kluyveromyces marxiannus, but did not have effect on Saccharomyces cerevisiae, suggesting that its effect would be species-specific. The mechanism by which SBTX acts seems to be not related to alteration of the plasmatic membrane permeability. The treatment of soybean seeds with 50 M jasmonic acid, for 24 h, led to remarkable increase in SBTX content. The results suggest that SBTX may have a role in the plant defense strategy against pathogens / Este trabalho descreve a caracterização estrutural da toxina de soja (SBTX), isolada de sementes por Siebra (2004), e discute o envolvimento desta proteína na defesa da planta contra patógenos. A SBTX foi purificada por precipitação do extrato total com sulfato de amônio (20-55%) e cromatografias de troca iônica e filtração em gel. Por PAGE-SDS, SBTX apresentou massa molecular aparente de 44 kDa, originando duas subunidades, uma de 27 kDa e outra de 17 kDa, quando tratada com 5% de -mercaptoetanol por 15 minutos. A proteína intacta (44 kDa) e a subunidade de 27 kDa apresentaram a mesma seqüência NH2-terminal ADPTFGFTPLGLSEKANLQIMKAYD. Já a subunidade de 17 kDa mostrou uma outra seqüência NH2-terminal, representada por PNPKVFFDMTIGGSAGRIVMEEYA. Por espectroscopia de fluorescência, foi observado que a excitação de uma solução aquosa de SBTX, a 280 m, provocou emissão máxima a 332 m, que é típico da contribuição de resíduos de triptofano enterrados no interior da molécula. A análise da estrutura secundária da SBTX por dicroísmo circular classificou esta toxina como pertencente à classe alfa e beta, apresentando 35% de α-hélice, 13% de fitas e folhas β, 27% de volta­β, 25% de estrutura não ordenada e 1% de resíduos aromáticos e pontes dissulfeto. SBTX (0,05 µgP/µL) inibiu a germinação dos esporos dos fungos filamentosos Aspergillus niger e Penicillium herguei, mas não teve ação sobre Fusarium solani e F. oxysporum, mesmo em concentração dez vezes maior. Todavia, essa toxina não interferiu no crescimento de hifas de nenhum dos fungos citados. Por outro lado, a SBTX retardou o crescimento das leveduras Candida albicans e Kluyveromyces marxiannus, mas não de Saccharomyces cerevisiae, sugerindo ser o seu efeito espécie-específico. O mecanismo pela qual a SBTX atua parece não estar relacionado com alteração da permeabilidade da membrana plasmática. O tratamento das sementes de soja com ácido jasmônico 50 µM, por 24 h, induziu aumento expressivo no conteúdo de SBTX. Os resultados obtidos sugerem que SBTX pode ter um papel na estratégia de defesa vegetal contra patógenos

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:48:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Disertacao Lislane Rocha Schaeffer.pdf: 4914861 bytes, checksum: f00b3579c743c0a084ee90c0f399d063 (MD5) Previous issue date: 2007-12-10 / O presente trabalho foi realizado na região costeira próxima da área estuarina de Anchieta, ES, em uma área de malacocultura. As amostragens foram realizadas mensalmente no período de janeiro a dezembro de 2004 em 10 (dez) pontos: Rio, 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C. Foi realizada análise quali-quantitativa da comunidade fitoplanctônica e das variáveis ambientais, tais como temperatura da água, transparência, salinidade, pH e oxigênio dissolvido. Os resultados de temperatura da água e pH pouco variaram ao longo do ano. A pluviosidade interferiu na transparência da água e, portanto, foi a variável ambiental que mais influenciou na comunidade fitoplanctônica local. As diatomáceas foram as mais representativas (em análise qualitativa e quantitativa) das Classes. Os dados de densidade foram baixos se comparados a outras regiões costeiras, mas teve uma alta diversidade e equitabilidade demonstrando que a área de estudo ainda é uma região bem preservada, com poucos impactos ambientais. Os baixos valores de densidade e biovolume indicam que os mexilhões dependem muito pouco da comunidade fitoplanctônica como alimento. Em relação às espécies potencialmente tóxicas, a Classe Bacillariophyceae novamente teve a maior representatividade no número de ocorrências dos táxons ao longo do ano. As espécies fitoplanctônicas potencialmente tóxicas ainda não promovem florações, mas deve se considerar um alerta, uma vez que a população de Anchieta lançar seus efluentes domésticos no rio Benevente ou diretamente no mar. Esta pesquisa é um sub-projeto de maricultura sustentada do Projeto RECOS Milênio, financiado pelo CNPq a partir de 2004. / The actual paper was made in the coastol region near Anchieta estuarian area in Espírito Santo State in na malacoculture area. The samples were taken monthly from January to December 2004 in 10 (ten) points: Rio, 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C. The analysis made were both a phytoplankton comunity quali-quantitative and environmental variables as water temperature, transparency, pH, salinity, and oxigen dissolved analysis . The water temperature and pH results had little variation throughout the year. The amount of rain changed the water transparency, therefore, pluviosity was the most influencing factor in the local phytoplankton comunity. Diatom were the most significant kind ( concearning a qualitative and quantitative analysis). Density data was low compared to other beach regions, though it showed a high diversity and equitability levels, which assures the well preserved with low environment impact area. The low density and biovolume levels indicate that mussels almost do not depend on phitoplancton comunity to eat. The Bacillariophyceae kind had the most representation concearning toxic species, due to it highest numbers through the year. Phytoplankton species that are potentialy toxic still do not appear, however they should be considered dangerous, since the Anchieta city population sewing system go straight either to Beneventes River or to the sea. This research is an under project of sustain musssel culture from RECOS Milenium Project, sponsored by CNPq since 2004

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-06-14Bitstream added on 2014-06-13T19:54:07Z : No. of bitstreams: 1 mendes_drp_me_jabo.pdf: 752950 bytes, checksum: da4434743daf49841f285c3909094a1c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Proteínas inseticidas derivadas de Bacillus thuringiensis (Bt) são os inseticidas biológicos mais amplamente utilizados. O trabalho teve por objetivo avaliação da toxicidade das proteínas de Bt, Cry1Ia e Vip3Aa, expressas em Escherichia coli BL21 (DE3), a fim de verificar a eficiência destas toxinas na mortalidade de Spodoptera frugiperda. Para tanto, empregou-se um par de iniciadores específicos para amplificar o fragmento correspondente ao gene vip3Aa completo contendo 2370 pb. O fragmento obtido foi clonado no vetor pET SUMO e transformado em células de E. coli BL21 (DE3) por choque térmico. A expressão das proteínas Vip3Aa e Cry1Ia previamente clonado, foi induzida por tiogalactopiranosídeo de isopropila (IPTG), e as proteínas recombinantes com peso molecular de, aproximadamente, 100 e 81 KDa respectivamente, foram detectadas por SDS-PAGE e Western Blot. Para avaliação da toxicidade os bioensaios foram realizados com as lagartas de primeiro instar que foram alimentadas com dietas artificiais contendo, na superfície, cinco diferentes concentrações da toxina Cry1Ia e cinco diferentes concentrações da toxina Vip3Aa recombinante. Os bioensaios foram estabelecidos em delineamento inteiramente casualizado, com 16 lagartas por repetição, totalizando 4 repetições por tratamento. A quantificação de lagartas mortas pela ação do B. thuringiensis, foi determinada pela CL50. Os resultados demonstraram a eficiência do sistema bacteriano na expressão das proteínas Vip3Aa e Cry1Ia de B. thuringiensis, resultando em toxinas recombinantes com elevada toxicidade frente às lagartas de S. frugiperda, o que sugere o uso destes genes na obtenção de plantas transgênicas, únicas ou piramidada, resistentes a esta praga / Insecticidal proteins derived from Bacillus thuringiensis (Bt) are the most widely used biological insecticides. The study aimed to evaluate the toxicity of Bt proteins, Cry1Ia Vip3Aa and expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) to verify the efficiency of these toxins on the mortality of Spodoptera frugiperda. For this we used a pair of specific primers to amplify the fragment corresponding to the gene vip3Aa complete containing 2370 bp. The fragment was cloned into pET SUMO vector and transformed into cells of E. coli BL21 (DE3) by heat shock. The expression of proteins Vip3Aa and Cry1Ia previously cloned, was induced by isopropyl tiogalactopiranosídeo (IPTG), and the recombinant proteins with a molecular weight of approximately 100 and 81 kDa respectively, were detected by SDS-PAGE and Western blot. To evaluate the toxicity bioassays were performed with first instar caterpillars that were fed diets containing artificial, in surface, whit five different toxin concentrations of Cry1Ia and five different concentrations of recombinant toxin Vip3Aa. Bioassays were established in a randomized design, with 16 larvae per repetition, totaling four replicates per treatment. The quantification caterpillar dead by the action of B. thuringiensis, was determined by LC50. The results demonstrated the efficiency of the bacterial system in protein expression Vip3Aa Cry1Ia of B. thuringiensis toxins, resulting in recombinants with high toxicity against the larvae of S. frugiperda, suggesting the use of these genes in the production of transgenic plants, single or pyramided resistant to this pest

Orientador : Prof. Dr. Wesley Maurício de Souza / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 13/03/2015 / Inclui referências : fls. 63-69 / Área de concentração: Análises clínicas / Resumo: A Doença Renal Crônica (DRC) atinge todas as faixas etárias e atualmente é considerada um problema de saúde pública, devido ao constante aumento de sua incidência. O acúmulo de substâncias orgânicas, devido ao comprometimento da excreção renal, ocasiona diversos efeitos deletérios como a inflamação, a progressão da aterosclerose e consequente doença cardiovascular, principal causa de morte nesses pacientes. O p-cresol (PC) e seu conjugado p-cresilsulfato (PCS) são toxinas urêmicas que se ligam a proteínas plasmáticas e por isso não são facilmente dialisadas. A presença de tais toxinas pode desencadear a produção de várias moléculas pró-inflamatórias, como a quimiocina monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), primordial nos eventos que precedem a aterosclerose. OAT 1 e OAT 3 (do inglês, organic anion transporter) são transportadores reconhecidamente importantes na excreção renal de xenobióticos através da secreção tubular. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi a investigação in vitro da influência do PC e PCS na produção de MCP-1 e na expressão destes transportadores em células endoteliais humanas. Como modelo experimental foram utilizadas células da linhagem EA.hy926, cultivadas em meio DMEM suplementado com soro fetal bovino (SFB) e antimicrobianos. As células foram submetidas a ensaios com as toxinas nas concentrações normal, urêmica e urêmica máxima, sugeridas pelo European Uremic Toxins Work Group (EUTox). As dosagens de MCP-1 foram realizadas através do ensaio de ELISA direto em sobrenadantes de cultura coletados 0, 3 e 6 horas após os tratamentos. A expressão de OAT 1 OAT 3 foi avaliada através da técnica de Dot Blot, realizada com extratos proteicos de células tratadas com PC e PCS. Estes ensaios foram realizados na presença e ausência do inibidor de transportadores de ânions orgânicos, o Probenecida (Pb). Os resultados obtidos demonstram que a produção de MCP-1 respondeu aos tratamentos de forma dose e tempo dependente, obtendo picos de produção no tempo 6h, na concentração máxima urêmica do PC (646 pg/mL) e na concentração urêmica do PCS (435 pg/mL). No tempo 0h, o Pb suprimiu a produção de MCP-1 consideravelmente em todos os tratamentos, com taxas de inibição de 71%, 66% e 71% nos tratamentos com PC e 58%, 56% e 60% nos tratamentos com PCS na concentração normal, urêmica e urêmica máxima, respectivamente. No tempo 6h foi observada uma taxa de inibição de 37% e 32% nos tratamentos com PC e 36% e 46% nos tratamentos com PCS na concentração urêmica e urêmica máxima, respectivamente. A expressão de OAT 1 nos tratamentos controle, PC e PCS nas concentrações máximas urêmicas foi suprimida por Pb com taxa de inibição de 30%, 23% e 12%, respectivamente. A expressão de OAT 3 nos tratamentos controle, PC e PCS foi suprimida por Pb com taxa de inibição de 45%, 2% e 32%, respectivamente. Como conclusão, os dados obtidos no presente trabalho sugerem que, em células endoteliais humanas, o OAT1 se expressa duas vezes mais que OAT 3. E que, considerando-se a resposta celular relacionada à produção de MCP-1, o OAT 1 tem preferência pelo PC como substrato, enquanto o OAT 3 tem mais afinidade pelo PCS. Palavras chave: doença renal crônica; toxicidade urêmica; p-cresol; p-cresilsulfato; OAT 1; OAT 3; Probenecida; MCP-1. / Abstract: Chronic Kidney Disease (CKD) affects all age and is currently considered a public health problem, due to the constant increase in incidence. The accumulation of organic substances due to the impairment of renal excretion causes many deleterious effects such as inflammation, progression of atherosclerosis and subsequent cardiovascular disease, the mainly cause of death in CKD patients. p-cresol (PC) and its conjugate pcresilsulfato (PCS) are uremic toxins difficult to eliminate by conventional dialysis due to strong bind to plasma proteins. The high presence of such toxins can trigger the production of various proinflammatory molecules such as chemokine monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), which is overriding in the events preceding atherosclerosis. OAT1 and OAT3 (organic anion transporter) are known to be important carriers in the renal excretion of xenobiotics by tubular secretion. Thus, the objective of this study was the in vitro investigation of the PC and PCS influence on the production of MCP-1 and expression of these transporters and on human endothelial cells. As an experimental model, we used the human endothelial cell line EA.hy926 cultured in DMEM supplemented with fetal bovine serum (FBS) and antibiotics. The cells were subjected to tests with the toxins in normal, uremic and maximum uremic concentrations, suggested by the European Uremic Toxins Work Group (EuTox). The levels of MCP-1 were evaluated in culture supernatants collected 0, 3 and 6 hours after treatment through ELISA. The expression of OAT 1 and OAT 3 was evaluated through Dot Blot, performed with protein extracts from cells treated with PC and PCS. These assays were performed in the presence and absence of the organic anion transporters inhibitor Probenecid (Pb). The results shown that the secretion of MCP-1 responded to the treatment in a dose and time dependent pattern, resulting in production peaks at 6h in PC maximum uremic concentration (646 pg/ml) and PCS uremic concentration (435 pg / ml). At 0h, Pb suppressed the production of MCP-1 significantly in all treatments, with inhibition rates of 71%, 66% and 71% in treatments with PC and 58%, 56% and 60% in treatments with PCS on the normal, uremic and maximum uremic concentrations, respectively. At 6h, an inhibition rate of 37% and 32% was observed in treatments with PC and 36% and 46% in treatments with PCS in uremic and maximum uremic concentration, respectively. The expression of the OAT 1 in the control, PC and PCS treatments under uremic maximum concentration was suppressed by Pb with a inhibition rate of 30%, 23% and 12%, respectively. The expression of the OAT 3 in the control, PC and PCS treatments under uremic maximum concentration was suppressed by Pb with a inhibition rate of 45%, 2% and 32%, respectively. As a conclusion, the data of the present study suggest that, in human endothelial cells, OAT1 is expressed two times more than OAT 3. And, considering the cell response related to the production of MCP-1, PC is the substrate for OAT 1 and OAT 3 has more affinity for PCS. Key-words: chronic kidney disease; uremic toxicity; p-cresol; p-cresilsulfate; OAT 1; OAT 3; Probenecid; MCP-1.

Made available in DSpace on 2015-01-26T13:21:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-25Bitstream added on 2015-01-26T13:30:39Z : No. of bitstreams: 1 000795967.pdf: 970728 bytes, checksum: 1a9dc450a114117aa840a96d9f584e0e (MD5) / Nos últimos anos, tem crescido o interesse pela identificação de compostos naturais com potencial medicinal. O isotiocianato de alila (AITC), encontrado em plantas da família Cruciferae e composto majoritário da semente de mostarda, vem sendo avaliado quanto a sua atividade antineoplásica em bexiga devido à sua alta biodisponibilidade na urina a após ingestão. Neste estudo foram investigadas as atividades toxicogenética e toxicogenômica do AITC em linhagens celulares de carcinoma de bexiga com diferentes status do gene TP53 (RT4 – TP53 selvagem / T24 – TP53 mutado). As concentrações de AITC testadas nos ensaios de citotoxicidade, sobrevivência celular e clonogênica foram 0,005, 0,0625, 0,0725, 0,0825, 0,0925, 0,125 e 0,25 μM; nos testes do cometa, micronúcleo, ciclo celular, apoptose, morfologia e expressão gênica (ANLN, BAX, BCL-2, CDK-1, SMAD4, S100P e TP53) foram utilizadas as concentrações de 0,005, 0,0625, 0,0725, 0,0825 e 0,0925 μM. Os resultados mostraram aumento de danos primários no DNA (teste do cometa) para todas as concentrações testadas do AITC na linhagem T24 e para as concentrações mais altas (0,0725, 0,0825 e 0,0925 μM) na linhagem RT4; não foram observados aumentos nas frequências de células micronucleadas em ambas as linhagens. Nas análises de ciclo celular e apoptose foram observadas a parada do ciclo na fase G2/M para a linhagem T24 e altas taxas de apoptose precoce e necrose na linhagem RT4. Com relação à expressão gênica, houve aumento da expressão de S100P e BAX e diminuição da expressão de BCL-2 na linhagem RT4 e aumento da expressão de BCL-2, BAX e ANLN e diminuição da expressão de S100P na T24. Nenhuma alteração foi identificada para os genes SMAD4 e CDK1 nas duas linhagens tratadas com o AITC. Concluindo, o AITC foi capaz de induzir lesões primárias no DNA de células de ambas as linhagens de carcinoma de bexiga, mas que não se refletiram ... / Compounds obtained from fruits, vegetables and essential oils have been widely used to treat many diseases. The allyl isothiocyanate (AITC), also known as mustard essential oil, is found in plants of the cruciferous family and is abundant in the mustard seeds. Due to its high bioavailability in urine, AITC has been considered as a promising antineoplastic agent against bladder cancer. Therefore, the aims of this study were to investigate the toxicogenetic and toxicogenomic effects of AITC in the wild-type (RT4) and in a mutant (T24) TP53 bladder transitional carcinoma cell lines. AITC was tested at concentrations of 0.005, 0.0625, 0.0725, 0.0825, 0.0925, 0.125 and 0.25 μM in the cytotoxicity and cell and clonogenic survival assays; in the comet and micronucleus assays, flow cytometry, apoptosis and gene expression (ANLN, BAX, BCL-2, CDK-1, SMAD4, S100P e TP53) evaluations the concentrations of 0.005; 0.0625; 0.0725; 0.0825 e 0.0925 μM were used. The results showed increased primary DNA damage in T24 (0.005, 0.0625, 0.0725, 0.0825 and 0.0925 μM) and RT4 (0.0725, 0.0825 and 0.0925 μM) cells. However, no significant difference was detected in the frequency of micronucleated cells. A significant increase of cells at sub-G1 phase (0.0625, 0.0725 and 0.0825 μM) and significant decrease at S phase (0.005, 0.0625, 0.0725 and 0.0825 μM) were observed in RT4 cells after AITC treatments. In T24 cells, an increased sub-G1 rate (0.0725 and 0.0825 μM) and cell cycle arrest at G2 phase (0.0625, 0.0725 and 0.0825 μM) were detected. Furthermore, it was observed increased apoptosis and necrosis rates and increase of S100P and BAX and decrease of BCL-2 expression in the wild type TP53 cells. For the mutated TP53 cell line, increased expression of BCL-2, BAX and ANLN and decreased expression S100P were observed. No change was detected for the SMAD4 and CDK-1 genes. In conclusion, AITC was able to reach DNA and induce primary damage in both bladder ...

Submitted by MARIA LAURA VIOLA AUGUSTO (marialauraa@gmail.com) on 2018-06-15T17:16:40Z No. of bitstreams: 1 augusto_mlv_dr_jabo.pdf: 1777889 bytes, checksum: 32d8b34f05ca40dec4ae93cca2a67527 (MD5) / Approved for entry into archive by Neli Silvia Pereira null (nelisps@fcav.unesp.br) on 2018-06-15T18:34:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 augusto_mlv_dr_jabo.pdf: 1777889 bytes, checksum: 32d8b34f05ca40dec4ae93cca2a67527 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-15T18:34:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 augusto_mlv_dr_jabo.pdf: 1777889 bytes, checksum: 32d8b34f05ca40dec4ae93cca2a67527 (MD5) Previous issue date: 2018-05-14 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O controle da broca da cana, Diatraea saccharalis (Fabricius, 1794) (Lepidoptera: Crambidae), pode ser feito pela aplicação de inseticidas químicos, mas o uso dessa tática de manejo pode resultar em danos ambientais e ao homem. De forma alternativa e com efeitos negativos reduzidos, o manejo de D. saccharalis e outros insetos-praga pode ser feito pela utilização do entomopatógeno Bacillus thuringiensis. Além do uso de formulações de B. thuringiensis para o controle de pragas, um ou mais genes que codificam proteínas inseticidas Cry e Vip de B. thuringiensis estão presentes nas plantas transgênicas com resistência a insetos comercialmente disponíveis no Brasil. Apesar de alta adoção, efeitos colaterais reduzidos e eficiência das plantas Bt, o uso desta tecnologia pode resultar na seleção de populações de insetos resistentes às plantas transgênicas. Por isso, a busca por novas proteínas e combinações de proteínas com diferentes modos de ação para retardar a evolução da resistência deve ser constante. Nesse cenário, uma quitinase de B. thuringiensis apresenta potencial para ser incorporada em uma nova geração de plantas transgênicas. Quitinases são enzimas que apresentam domínios catalíticos para hidrólise de quitina e domínios ligantes em quitina (CBD) que podem estar envolvidos com a atividade inseticida. A atividade inseticida das quitinases é relacionada com a desestruturação da membrana peritrófica dos insetos e consequente perda de suas propriedades e funções. Além da descoberta de proteínas inseticidas com diferentes modos de ação, é de interesse que essas apresentem interações positivas com outras proteínas inseticidas. No presente trabalho, duas formas de uma quitinase de B. thuringiensis - ChiΔSP (sem o peptídio sinal) e ChiΔSP.CBD (sem o peptídio sinal e sem o domínio ligante em quitina) - foram produzidas de forma heteróloga em Escherichia coli para avaliações bioquímicas e biológicas sobre D. saccharalis. Ensaios bioquímicos das enzimas ChiΔSP e ChiΔSP.CBD indicam que a atividade quitinolítica sobre quitina coloidal de ChiΔSP (3,07±0,15 U/nmol) foi maior que de ChiΔSP.CBD (1,83±0,06 U/nmol), a ligação de ChiΔSP à quitina coloidal também foi superior à ligação de ChiΔSP.CBD e as maiores atividades (60-100% da atividade total) de ChiΔSP e ChiΔSP.CBD foram detectadas a 30 e 40°C em uma ampla faixa de pH (4,0-9,0). Após estimar a CL50 da proteína Vip3Aa42 sobre lagartas neonatas de D. saccharalis em 352,132 ng/cm2 de dieta, foram avaliadas interações entre Vip3Aa42 e ChiΔSP ou ChiΔSP.CBD. Os resultados indicam que a adição isolada de 2,41 nmol/cm2 de ChiΔSP ou ChiΔSP.CBD não resultou na mortalidade de lagartas de D. saccharalis. A combinação da CL50 de Vip3Aa42 com 2,41 nmol/cm2 de ChiΔSP apresentou efeito sinérgico para mortalidade das lagartas (mortalidade de 90%), mas nenhum efeito (aditivo, sinérgico ou antagônico) foi observado para a combinação da CL50 de Vip3Aa42 com 2,41 nmol/cm2 de ChiΔSP.CBD. A ausência do CBD em ChiΔSP.CBD e consequentes alterações bioquímicas impediu sinergismo de ChiΔSP.CBD com Vip3Aa42 sobre lagartas de D. saccharalis. / Chemical control is applied to manage the sugarcane borer, Diatraea saccharalis (Fabricius, 1794) (Lepidoptera: Crambidae). However, this control tactic may result in great damages to the environment and non-target species, including men. Alternativelly, the use of the entomopathogen Bacillus thuringiensis can be made to manage D. saccharalis and other insect pests with reduced undisarable side effects. Beyond the use of formulations of B. thuringiensis for pest control, one or more genes of insecticidal proteins from B. thuringiensis such as Cry and Vip are incorporated into commercially available transgenic plants with insect resistance in Brazil. Despite of the high adoption rate, reduced side effects, and high efficency, the intensive use of this technology may result in the selection of insect-resistant populations to transgenic plants. For this reason, the search for new genes with different modes of action to delay the evolution of resistance must be constant. In this scenario, a chitinase from B. thuringiensis has potential to be incorporated into a new generation of transgenic plants. Chitinases are enzymes of the family of glycosyl hydrolases which catalyze the hydrolysis of chitin. Chitinases present catalytic domains responsible for the hydrolysis of chitin and chitin-binding domains (CBD), both associated to insecticidal activity. Insecticidal activity of chitinases is related to the disruption of the peritrophic membrane of insects, which results in the loss of properties and functions of this structure. In addition to the discovery of insecticidal proteins with different modes of action, positive interactions with other insecticidal proteins is desirable for pest management. In the present work, two forms of a chitinase of B. thuringiensis - ChiΔSP (without signal peptide) and ChiΔSP.CBD (without signal peptide and without the chitin-binding domain) - were produced by heterologous expression in Escherichia coli for biochemical and biological analyses. Chitinolytic activity of ChiΔSP (3.07 ± 0.15 U/nmol) was higher than that observed for ChiΔSP.CBD (1.83 ± 0.06 U/nmol) towards colloidal chitin. The binding of ChiΔSP to colloidal chitin was also higher than that observed for ChiΔSP.CBD, and the ChiΔSP or ChiΔSP.CBD chitinolytic activity (60-100% of total chitinolytic activity) was detected at 30 and 40°C in a broad pH range (4.0-9.0). After estimating the LC50 of the Vip3Aa42 protein at 352,132 ng/cm2 of diet, interactions between combinations of Vip3Aa42 and ChiΔSP or ChiΔSP.CBD were evaluated. Results indicate that the adition of 2,41 nmol/cm2 of ChiΔSP or ChiΔSP.CBD do not result in larval mortality of D. saccharalis. The combination of the LC50 of Vip3Aa42 with 2,41 nmol/cm2 nmol of ChiΔSP resulted in a synergic effect (mortality of 90%), but no effect (aditive, sinergic or antagonic) was observed when the LC50 of Vip3Aa42 was combined to 2,41 nmol/cm2 nmol of ChiΔSP.CBD. Lack of CBD in ChiΔSP.CBD resulted in biochemical changes in this form of B. thuringiensis chitinase which impacted on the sinergic effect of this protein with Vip3Aa42 against D. saccharalis. / CNPq: 140093/2015-0

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseRSL.pdf: 1529127 bytes, checksum: d548f8e67f0f40c6a182f89594e5db50 (MD5) Previous issue date: 2004-09-15 / Universidade Federal de Minas Gerais / ACL myotoxin (ACLMT) is a Lys49 phospholipase A2-like protein isolated from the venom of the snake Agkistrodon contortrix laticinctus. The aim of this work was to study the effect of ACLMT on water transport in the toad urinary bladder. Water flow through the membrane was measured gravimetrically in bag preparations of the bladder. ACLMT increased the baseline water flow and partially inhibited the water permeability stimulated by arginine-vasopressin (AVP), cyclic AMP, 8-chlorophenylthio-cAMP and forskolin. The effect of ACLMT on baseline water flow was prevented by lanthanum, nifedipine, and trifluoperazine. These results suggest that the effect of ACLMT on baseline water flow could be mediated either by an increase in intracellular calcium or by the activation of the calcium-calmodulin. Colchicine reduced the effect of ACLMT on baseline water permeability. Carbachol has been shown to enhance baseline water flow while inhibiting AVP-stimulated water flow by increase in intracellular calcium. The effects of ACLMT and carbachol on baseline and AVP-stimulated water flow were not additive, suggesting that both agents alter the water transport by a similar mechanism. Lanthanum reduced the inhibitory effect of ACLMT on AVP-stimulated water permeability, suggesting the participation of intracellular calcium in this effect. Indomethacin reduced the effect of ACLMT on forskolinstimulated water flow, suggesting a role for prostaglandin in the effect of ACLMT on AVP-stimulated water permeability. However, the inhibitory effect of ACLMT on AVP-stimulated water flow was enhanced in the presence of trifluoperazine. Similarly, the inhibitory effect of ACLMT on AVP and cAMP-stimulated water flow was enhanced in the presence of colchicine. Therefore, the results of present study suggest that the effects of ACLMT on water permeability could be mediated either by an increase in intracellular calcium or by the activation of the calciumcalmodulin, and also suggests a role additional for prostaglandin in effect of ACLMT on AVP-stimulated water transport. In addition, the effect of ACLMT on water transport seems be dependent of integrity of microtubules. / ACL miotoxina (ACLMT) é uma fosfolipase A2 miotóxica com um resíduo de lisina na posição 49, isolada do veneno da serpente Agkistrodon contortrix laticinctus. O objetivo do presente trabalho foi estudar o efeito da ACLMT sobre o transporte de água em bexiga de sapo. O fluxo de água através da membrana foi mensurado gravimetricamente por meio da técnica de Bentley (1958), em preparações com a bexiga em forma de lobos. A ACLMT aumentou o fluxo basal de água e diminuiu parcialmente o fluxo de água estimulado pela vasopressina, AMP cíclico, 8-clorofeniltiomonofosfato de adenosina cíclico e forscolina. O efeito da ACLMT sobre o fluxo basal de água foi reduzido na presença de lanthanum, nifedipina e trifluoperazina, sugerindo um papel para o cálcio citossólico e para o complexo cálcio-calmodulina nesse efeito. A colchicina também diminuiu o efeito da ACLMT sobre o fluxo basal de água, sugerindo que a ação da ACLMT é dependente da integridade dos microtúbulos. O lantânio reduziu o efeito inibitório da ACLMT sobre a ação hidrosmótica da vasopressina, sugerindo um papel para o cálcio citossólico nesse efeito. O carbacol é capaz de aumentar o fluxo basal de água e diminuir o fluxo de água estimulado pela vasopressina por meio de um aumento da concentração do cálcio intracelular. Os efeitos da ACLMT e do carbacol sobre o transporte de água não foram aditivos, sugerindo que esses agentes alteram a permeabilidade da membrana por um mecanismo similar. A indometacina reduziu o efeito da ACLMT sobre o fluxo de água estimulado pela forscolina, sugerindo um papel adicional para as prostaglandinas no efeito da ACLMT sobre a ação da vasopressina. Por outro lado, o efeito inibitório da ACLMT sobre a ação hidrosmótica da vasopressina foi potencializado na presença de trifluoperazina. Similarmente, o efeito inibitório da ACLMT sobre a ação hidrosmótica da vasopressina e do AMP cíclico foi potencializado na presença da colchicina. Nossos resultados sugerem que o efeito da ACLMT sobre o transporte de água pode ser mediado pelo aumento no cálcio intracelular e pela ativação do complexo cálcio-calmodulina, sugerindo também um papel adicional para as prostaglandinas no efeito da ACLMT sobre a ação hidrosmótica da vasopressina. Além disso, o efeito da ACLMT sobre o transporte de água parece ser dependente da integridade dos microtúbulos.

Orientador: Caio Antonio Carbonari / Coorientador: Edivaldo Domingues Velini / Banca: Fernando Tadeu de Carvalho / Banca: Marcus Barifouse Matallo / Banca: Cleber Daniel de Goes Maciel / Banca: Elza Alves Corrêa / Resumo: O glufosinate é derivado do fosfinotricina, uma toxina microbiana natural isolada a partir de duas espécies de fungos Streptomyces. Atua inibindo a atividade da enzima glutamina sintetase, que é necessária para a produção do aminoácido glutamina e para a desintoxicação da amônia pela planta. Objetivou-se neste trabalho avaliar a intoxicação e alterações fisiológicas e bioquímicas causadas pelo glufosinate em plantas de soja. O experimento foi conduzido em casa-de-vegetação, no Núcleo de Pesquisas Avançadas em Matologia (Nupam), pertencente à Faculdade de Ciências Agronômicas - FCA/UNESP. Foi utilizado o cultivar de soja Nidera NS 7100 (RR) plantada em vasos de cinco de litros de solo. Foram realizados dois experimentos, sendo o primeiro experimento instalado com os seguintes tratamentos: duas formulações (glufosinate de amônio a 2,5 L p.c. ha-1 e glufosinate de potássio 2,5 L p.c. ha-1), três períodos de coleta de folhas dois, quatro e seis dias após aplicação e um tratamento testemunha sem aplicação. O segundo experimento foi instalado com os seguintes tratamentos: duas formulações (glufosinate de amônio e glufosinate de potássio), três doses de cada produto (0,625 L p.c. ha-1; 1,25 L p.c. ha-1; 2,5 L p.c. ha-1) e um tratamento testemunha sem aplicação. As variáveis analisadas em ambos os experimentos foram, amônia, compostos pertencentes à rota metabólica de ação do glufosinate (glutamato, glutamina, serina, ácido aminolevulênico, glufosinate), análise visual de fitotoxicicidade e ETR (taxa de transporte de elétrons). Para determinação de amônia foram desenvolvidas metodologias de extração para posterior quantificação em espectrofotômetro. Para determinação dos compostos, foram realizados... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The glufosinate is derived from phosphinothricin, a natural microbial toxin isolated from Streptomyces of two species of fungus. Acts inhibits the activity of glutamine synthetase, which is necessary for the production of the amino acid glutamine and for the detoxification of ammonia by the plant. The objective of this study was to evaluate the toxicity and physiological and biochemical changes caused by glufosinate in soybean plants. The experiment was carried out in green-house, in Faculty of Agronomic Sciences at São Paulo State University. We used soybean the cultivar NS 7100 Nidera planted in vases containing 5 liters of soil. Two experiments were carried out, the first experiment set with the following treatments: two formulations (glufosinate ammonium 2.5 L c.p. ha-1 and glufosinate potassium 4 2.5 L c.p. ha-1), three periods of leaf collection two, for and six days after application and a control without application. The second experiment was carried out with the following treatments: two formulations (glufosinate ammonium and glufosinate potassium), three doses of each product (0.625 L c.p. ha-1, 1.25 c.p. ha-1 L, 2.5 L c.p. ha -1) and a control without application. The variables analyzed in both experiments were ammonia, compounds belonging to the metabolic pathway of action of glufosinate (glutamate, glutamine, serine, aminolevulenic acid, glufosinate), visual analysis of plant injury and ETR (electron transport rate). To determine the ammonia were developed extraction methodologies for a quantification in spectrophotometric and for determination of compounds, extraction tests were performed to choose the most appropriate methodology, and development of analytical methods in LC-MS/MS (liquid chromatography and mass spectrometry). Plant injury evaluations were based on visual criteria and ETR measurements are given... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Resumo: Proteínas inseticidas derivadas de Bacillus thuringiensis (Bt) são os inseticidas biológicos mais amplamente utilizados. O trabalho teve por objetivo avaliação da toxicidade das proteínas de Bt, Cry1Ia e Vip3Aa, expressas em Escherichia coli BL21 (DE3), a fim de verificar a eficiência destas toxinas na mortalidade de Spodoptera frugiperda. Para tanto, empregou-se um par de iniciadores específicos para amplificar o fragmento correspondente ao gene vip3Aa completo contendo 2370 pb. O fragmento obtido foi clonado no vetor pET SUMO e transformado em células de E. coli BL21 (DE3) por choque térmico. A expressão das proteínas Vip3Aa e Cry1Ia previamente clonado, foi induzida por tiogalactopiranosídeo de isopropila (IPTG), e as proteínas recombinantes com peso molecular de, aproximadamente, 100 e 81 KDa respectivamente, foram detectadas por SDS-PAGE e Western Blot. Para avaliação da toxicidade os bioensaios foram realizados com as lagartas de primeiro instar que foram alimentadas com dietas artificiais contendo, na superfície, cinco diferentes concentrações da toxina Cry1Ia e cinco diferentes concentrações da toxina Vip3Aa recombinante. Os bioensaios foram estabelecidos em delineamento inteiramente casualizado, com 16 lagartas por repetição, totalizando 4 repetições por tratamento. A quantificação de lagartas mortas pela ação do B. thuringiensis, foi determinada pela CL50. Os resultados demonstraram a eficiência do sistema bacteriano na expressão das proteínas Vip3Aa e Cry1Ia de B. thuringiensis, resultando em toxinas recombinantes com elevada toxicidade frente às lagartas de S. frugiperda, o que sugere o uso destes genes na obtenção de plantas transgênicas, únicas ou piramidada, resistentes a esta praga / Abstract: Insecticidal proteins derived from Bacillus thuringiensis (Bt) are the most widely used biological insecticides. The study aimed to evaluate the toxicity of Bt proteins, Cry1Ia Vip3Aa and expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) to verify the efficiency of these toxins on the mortality of Spodoptera frugiperda. For this we used a pair of specific primers to amplify the fragment corresponding to the gene vip3Aa complete containing 2370 bp. The fragment was cloned into pET SUMO vector and transformed into cells of E. coli BL21 (DE3) by heat shock. The expression of proteins Vip3Aa and Cry1Ia previously cloned, was induced by isopropyl tiogalactopiranosídeo (IPTG), and the recombinant proteins with a molecular weight of approximately 100 and 81 kDa respectively, were detected by SDS-PAGE and Western blot. To evaluate the toxicity bioassays were performed with first instar caterpillars that were fed diets containing artificial, in surface, whit five different toxin concentrations of Cry1Ia and five different concentrations of recombinant toxin Vip3Aa. Bioassays were established in a randomized design, with 16 larvae per repetition, totaling four replicates per treatment. The quantification caterpillar dead by the action of B. thuringiensis, was determined by LC50. The results demonstrated the efficiency of the bacterial system in protein expression Vip3Aa Cry1Ia of B. thuringiensis toxins, resulting in recombinants with high toxicity against the larvae of S. frugiperda, suggesting the use of these genes in the production of transgenic plants, single or pyramided resistant to this pest / Orientador: Janete Apparecida Desidério / Coorientador: Odair Aparecido Fernandes / Banca: Cristina Lacerda Soares Petrarolha Silva / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Mestre

Orientador: Daysy Maria Fávero Salvadori / Coorientador: Glenda Nicioli da Silva / Banca: Luis Fernando Barbisan / Banca: Denise Crispim Tavares / Resumo: Nos últimos anos, tem crescido o interesse pela identificação de compostos naturais com potencial medicinal. O isotiocianato de alila (AITC), encontrado em plantas da família Cruciferae e composto majoritário da semente de mostarda, vem sendo avaliado quanto a sua atividade antineoplásica em bexiga devido à sua alta biodisponibilidade na urina a após ingestão. Neste estudo foram investigadas as atividades toxicogenética e toxicogenômica do AITC em linhagens celulares de carcinoma de bexiga com diferentes status do gene TP53 (RT4 - TP53 selvagem / T24 - TP53 mutado). As concentrações de AITC testadas nos ensaios de citotoxicidade, sobrevivência celular e clonogênica foram 0,005, 0,0625, 0,0725, 0,0825, 0,0925, 0,125 e 0,25 μM; nos testes do cometa, micronúcleo, ciclo celular, apoptose, morfologia e expressão gênica (ANLN, BAX, BCL-2, CDK-1, SMAD4, S100P e TP53) foram utilizadas as concentrações de 0,005, 0,0625, 0,0725, 0,0825 e 0,0925 μM. Os resultados mostraram aumento de danos primários no DNA (teste do cometa) para todas as concentrações testadas do AITC na linhagem T24 e para as concentrações mais altas (0,0725, 0,0825 e 0,0925 μM) na linhagem RT4; não foram observados aumentos nas frequências de células micronucleadas em ambas as linhagens. Nas análises de ciclo celular e apoptose foram observadas a parada do ciclo na fase G2/M para a linhagem T24 e altas taxas de apoptose precoce e necrose na linhagem RT4. Com relação à expressão gênica, houve aumento da expressão de S100P e BAX e diminuição da expressão de BCL-2 na linhagem RT4 e aumento da expressão de BCL-2, BAX e ANLN e diminuição da expressão de S100P na T24. Nenhuma alteração foi identificada para os genes SMAD4 e CDK1 nas duas linhagens tratadas com o AITC. Concluindo, o AITC foi capaz de induzir lesões primárias no DNA de células de ambas as linhagens de carcinoma de bexiga, mas que não se refletiram ... / Abstract: Compounds obtained from fruits, vegetables and essential oils have been widely used to treat many diseases. The allyl isothiocyanate (AITC), also known as mustard essential oil, is found in plants of the cruciferous family and is abundant in the mustard seeds. Due to its high bioavailability in urine, AITC has been considered as a promising antineoplastic agent against bladder cancer. Therefore, the aims of this study were to investigate the toxicogenetic and toxicogenomic effects of AITC in the wild-type (RT4) and in a mutant (T24) TP53 bladder transitional carcinoma cell lines. AITC was tested at concentrations of 0.005, 0.0625, 0.0725, 0.0825, 0.0925, 0.125 and 0.25 μM in the cytotoxicity and cell and clonogenic survival assays; in the comet and micronucleus assays, flow cytometry, apoptosis and gene expression (ANLN, BAX, BCL-2, CDK-1, SMAD4, S100P e TP53) evaluations the concentrations of 0.005; 0.0625; 0.0725; 0.0825 e 0.0925 μM were used. The results showed increased primary DNA damage in T24 (0.005, 0.0625, 0.0725, 0.0825 and 0.0925 μM) and RT4 (0.0725, 0.0825 and 0.0925 μM) cells. However, no significant difference was detected in the frequency of micronucleated cells. A significant increase of cells at sub-G1 phase (0.0625, 0.0725 and 0.0825 μM) and significant decrease at S phase (0.005, 0.0625, 0.0725 and 0.0825 μM) were observed in RT4 cells after AITC treatments. In T24 cells, an increased sub-G1 rate (0.0725 and 0.0825 μM) and cell cycle arrest at G2 phase (0.0625, 0.0725 and 0.0825 μM) were detected. Furthermore, it was observed increased apoptosis and necrosis rates and increase of S100P and BAX and decrease of BCL-2 expression in the wild type TP53 cells. For the mutated TP53 cell line, increased expression of BCL-2, BAX and ANLN and decreased expression S100P were observed. No change was detected for the SMAD4 and CDK-1 genes. In conclusion, AITC was able to reach DNA and induce primary damage in both bladder ... / Mestre