A infecção por citomegalovírus (CMV) tem efeito duradouro na distribuição dos subtipos de células T, mas pouco se sabe sobre o seu impacto na função celular. Foi realizada uma análise de expressão global gênica em células CD4+ purificadas em 38 recipientes de transplante de células tronco hematopoéticas (HSCT) (mediana de idade 48 anos; variação 20-65 anos) estudados em média cinco anos pós transplante (mediana 4.75 anos; variação 1-20 years). A população estudada incluiu 18 pacientes com GVHD crônico ativo (cGVHD) e 20 pacientes considerados tolerantes. Tolerância foi definida como ausência de sinais e sintomas de cGVHD, assim como ausência de tratamento imunossupressor (IST) por pelo menos 2 meses com seguimento de 1 ano sem tratamento imunossupressor. A expressão gênica foi medida por Illumina bead arrays. O seroestato do CMV foi definido pela sorologia pré transplante (por ELISA). Não havia evidência documentada de reativação do CMV no momento de coleta das amostras estudadas. Doze de 54 genes candidatos associados à função imune foram associados de maneira significativa com CMV+ em pacientes com cGVHD ativo (p<0.05) (PDCD-1; GZMH, IFNG, PRF1, CST7, IL18RAP, ITGAM, CTSW, ITGAL, GBP1, CDKN1B, CXCR4), sendo que somente três genes (CD14; CD86; IER3) foram associados a CMV+ entre os pacientes tolerantes. A expressão de PD-1 significativamente maior em pacientes CMV+ e com cGVHD ativo foi confirmada em uma população independente através de estudos de imunofenotipagem. Os pacientes CMV+/cGVHD ativos tiveram um perfil compatível com ativação de células T efetoras, não sendo detectado com a mesma intensidade em pacientes tolerantes e pacientes CMV-/cGVHD ativos. Tendo como objetivo a latência da infecção, o citomegalovírus tentará evadir-se das tentativas do sistema imune de depuração viral, criando modificações que vão desde mudanças nos subtipos de linfócitos até a remodelação de cromatina por uma série de enzimas e microRNA. O ambiente caracteristicamente inflamatório do cGVHD, a produção aumentada de citocinas, a terapia imunossupressora e a reconstituição imune defeituosa das células T podem aumentar o risco de reativação do CMV, mesmo indetectável, seguido por supra-regulação de genes relacionados à ativação de células T e função efetora. O gene PD-1 pode estar supra-regulado em ativação de células T e função efetora, mas tem papel essencial na prevenção da expansão e função das células T efetoras, sendo um candidato alvo para a prevenção e tratamento do cGVHD. Entender o impacto do CMV na regulação de PD-1 em pacientes com cGVHD seria instrumental na implementação de novas terapias; portanto mais estudos com populações maiores são necessários para entendermos o impacto da imunomodulação secundária à infecção prévia por CMV no funcionamento das células T durante cGVHD. / Cytomegalovirus infection (CMV) is known to have a life-long effect on the distribution of T cell subsets, but little is known about the impact on cell function. We performed a gene expression analysis in purified CD4+ T cells from 38 hematopoietic cell transplant (HCT) recipients (median age 48; range 20-65) studied on average 5 years after HCT (median 4.75; range 1-20 years). The study population included 18 patients with active chronic GVHD (cGVHD) and 20 tolerant (TOL) patients. Tolerance was defined by absence of signs, symptoms of cGVHD and immunosuppressive therapy (IST) for at least 2 months and 1 year follow-up without immunosupressive therapy . Gene expression was measured on Illumina bead arrays. CMV status was defined by pre-transplant recipient CMV serology (by ELISA). There was no recorded evidence of CMV reactivation at the time of study. Twelve of 54 candidate genes associated with immune function and inflammation were found to be associated CMV positive serostatus in cGVHD patients at a significance threshold of p<0.05 (PDCD-1; GZMH, IFNG, PRF1, CST7, IL18RAP, ITGAM, CTSW, ITGAL, GBP1, CDKN1B, CXCR4), but only three genes (CD14; CD86; IER3) were associated with CMV serostatus in TOL patients. The significant higher PD-1 expression on CD4+ cells of CMV+/active cGVHD patients was confirmed by immunophenotype testing in an independent population. CMV+/active cGVHD patients had a profile consistent with T effector cell activation that was not present in TOL and CMV serostatus negative/active cGVHD patients. Pursuing latency, cytomegalovirus will try to evade the immune system attempts of viral clearance creating modifications varying from changes in lymphocyte subsets to chromatin remodeling by several enzymes and microRNA. The chronic GVHD characteristic inflammatory environment, increased cytokine production, immunosuppressive therapy, and impaired T cell immune reconstitution, may increase the risk of CMV reactivation, even if not detectable, followed by up-regulation of genes related to T cell activation and effector function. The PD-1 gene can be up-regulated in T cell activation and effector functions, but it also has an essential role in preventing the expansion and function of effector cells, being a candidate target for the prevention or treatment of chronic GVHD. Understanding the CMV impact on the PD-1 regulation in active cGVHD would be key on the implementation of new therapies.Thus, more studies in larger populations are needed in order to understand CMV previous infection immunomodulation impact in T cell function during chronic GVHD.

Made available in DSpace on 2014-07-22T16:59:27Z (GMT). No. of bitstreams: 4 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 69450.pdf: 2409202 bytes, checksum: abdfee4e0aec1730b503aba8f1bb3000 (MD5) 69450.pdf.txt: 208978 bytes, checksum: 6549c0a44ac6d8e45b4998656b86fa86 (MD5) 69450.pdf.jpg: 1330 bytes, checksum: e4f720b175db53a9cb553b3e194b93d6 (MD5) Previous issue date: 2014-05-07 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, Brasil / Em 2011 foram notificados quase 9 milhões de novos casos de tuberculose (TB), culminando em aproximadamente 2 milhões de mortes. A vacina atual contra tuberculose (BCG) apresenta eficácia variável na proteção de adultos contra a tuberculose pulmonar (0% - 80%), com isso destacamos a necessidade de maiores investigações sobre a vacina. A cepa da vacina utilizada no Brasil é a BCG Moreau. Este trabalho incide sobre a caracterização de Rv3405c, um regulador transcricional (repressor) presente em todas as cepas de BCG, porém truncado em BCG Moreau devido à perda da região genômica RD16. Analisamos por RT-PCR a expressão de genes adjacentes a rv3405c em BCG Pasteur e Moreau, comprovando que sua perda funcional afeta a expressão de rv3406, que codifica uma proteína envolvida no metabolismo do enxofre. O aumento da expressão de rv3406 em BCG Moreau pode representar um ganho funcional, devido à perda desse repressor transcricional (Rv3405) A fim de caracterizar melhor a sua função, rv3405c de BCG Pasteur e rv3406 de BCG Moreau foram clonados e expressos em E. coli. O soro policlonal produzido em camundongos imunizados contra a proteína purificada rRv3406 foi utilizado para analisar sua expressão sob diferentes condições de crescimento. Rv3406 é encontrada na fração intracelular e na superfície de BCG Moreau, não tendo sido detectado em BCG Pasteur. Rv3405c recombinante purificada foi usada no ensaio de retardo em gel (EMSA), confirmando a sua capacidade para se ligar a um motivo de DNA conservado, identificado na região intergênica entre rv3405c-rv3406, sugerindo seu papel na regulação destes genes e justificando a expressão constitutiva de rv3406 em BCG Moreau. Além disso, a adição de bile e seus componentes provoca o deslocamento da proteína desfazendo sua interação com DNA. A caracterização de rv3405c e suas funções é importante para uma análise de genômica funcional comparativa entre BCG Moreau e Pasteur. Este trabalho contribui para uma melhor compreensão da vacina brasileira contra a tuberculose / Tuberculosis (TB) was responsible for almost 9 million new cases in 2011, culminating in approximately 2 million deaths. The current approved TB vaccine (BCG) presents variable efficacy in adult protection against pulmonary TB (0%-80%), highlighting the need for further investigations on this vaccine. The vaccine strain used in Brazil is BCG Moreau. This work focuses on the characterization of Rv3405c, a transcriptional regulator (repressor) present in all BCG strains but truncated in BCG Moreau due to the loss of genomic region RD16. We have analysed the expression of adjacent genes in both BCG Moreau and Pasteur by RT-PCR finding that loss of Rv3405c impacts the expression of rv3406, encoding a protein involved in sulfur metabolism. Its increased expression in BCG Moreau may represent a functional gain through the loss of a transcription repressor. In order to better characterize their function, rv3405c from BCG Pasteur and rv3406 from BCG Moreau were cloned and expressed in E. coli. The polyclonal sera produced in mice immunized with purified rRv3406 were used to follow the expression of this protein under different growth conditions. Rv3406 is found in the intracellular fraction and the surface of BCG Moreau, and was not detected in BCG Pasteur. Purified recombinant Rv3405c was used in electrophoretic mobility shift assays (EMSA), confirming its ability to bind a conserved DNA motif identified in the intergenic region between rv3405c-rv3406, suggesting its role in regulating these genes and justifying the constitutive expression of rv3406 in BCG Moreau. Furthermore, the addition of bile and its components is able to displace Rv3405c from DNA. The characterization of rv3405c and its functions is important for the comparative functional genomics analysis of BCG Moreau and Pasteur. This work contributes to a better understanding of the Brazilian vaccine against TB.

Made available in DSpace on 2016-04-15T13:05:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 franklyn_acosta_ioc_dout_2015.pdf: 13033375 bytes, checksum: 9f1b37e297e771e874ab4f5d3f7aed83 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A transcrição dirigida pela RNA polimerase II nos tripanossomatídeos produz um RNA precursor que abriga dezenas a centenas de genes que são processados para formar unidades monocistrônicas. Os processos de trans-splicing e poliadenilação vinculados ao processamento do RNA precursor são os responsáveis pela formação dos extremos do mRNA e portanto representam pontos importantes de controle pós-transcricional e de geração de diversidade funcional em termos de regiões não traduzidas (UTRs). O genoma de T. cruzi abriga genes tanto multicópia como de poucas cópias, os quais são importantes para a interação com seus hospedeiros e para realizar processos biológicos fundamentais para a sua sobrevivência. Isto levanta questões relevantes em relação à transcrição e processamento de genes duplicados ou multicópia no T. cruzi. Para acrescentar o conhecimento sobre o processamento de genes de poucas cópias nós estudamos este processo em duas cepas de Trypanosoma cruzi: Y e clone CL-Brener Na cepa Y as formas epimastigota, amastigota e tripomastigota sanguínea da cepa Y foram estudadas usando uma abordagem baseada no pirosequencimento e em CL-Brener usamos RT-PCR, RACE, clonagem e sequenciamento pelo método de Sanger das UTRs para as formas epimastigotas e tripomastigotas metacíclicos. Os resultados indicam que a transcrição e processamento dos transcritos do locus de calmodulina nos estágios estudados de ambas cepas produz formas alternativas predominantes com 5'UTRs longas e 3'UTR curtas. Encontramos também, um marcado desequilíbrio alélico na frequência dos transcritos das cópias de calmodulina nas diferentes formas estudadas de CL-Brener. Finalmente, existe uma aparente frequência assimétrica das isoformas de calmodulina dentro de cada cópia e entre as cópias em todos os estágios de ambas cepas estudadas indicando que possivelmente o controle da abundância dos transcritos exerce um papel importante na regulação da expressão deste gene / The RNA pol II transcription in tripanosomatids produces a RNA precursor harboring ten to hundreds of genes that must be processed to produce monocistronic mRNAs. The trans-splicing and polyadenylation processing of the RNA precursor is responsibles for the mRNA ends formation, important points of post-transcriptional regulation and functional diversity around the UTRs. The T. cruzi genome harbor both multicopy and few copies genes that are important for the interaction with the parasite host and to carry out essential biological process for the T. cruzi survival. This fact rases relevant aspects about the transcription and processing of genes in T. cruzi. To increase the knowledge on the mRNA processing of genes with few copies we studied this process in two strains: Y and CL-Brener clone. We analyzed the final mRNA from the epimastigote, amastigote and blood trypomastigote of Y strain using amplicon pyrosequencing and for the CL-brener epimastigote and metacyclic stage we devised an RT-PCR and RACE to target calmodulin UTRs combined with amplicon cloning and Sanger sequencing. The results point out that the mRNA processing of the transcripts of the calmodulin locus in all T. cruzi stages from studied strains produced mostly calmodulin mRNA bearing long 5'UTR and short 3'UTR. Also, we found a remarkable allelic imbalance in the frequency of the transcripts from calmodulin copies in all stages of CL-Brener. Finally, there was an inter-copy and intra-copy asymmetric frequency of calmodulin mRNA in all stages of the T. cruzi strain studied here indicating that the control of transcript abundance may has an important role in the calmodulin gene expression regulation

Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma flocculare e Mycoplasma hyorhinis são capazes de aderir e colonizar o trato respiratório de suínos. Enquanto a presença de M. flocculare é considerada assintomática, M. hyopneumoniae e M. hyorhynis são relacionados ao desenvolvimento de patologias. M. hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína e M. hyorhynis além dos pulmões pode atingir outros sítios e hospedeiros, estando relacionado a artrites, poliserosites e desenvolvimento de vários tipos de câncer em humanos. Apesar dos avanços tecnológicos na área de genômica, raros são os dados quanto ao papel de M. flocculare no trato respiratório suíno. Além do mais, informações relativas à transcrição gênica nessas espécies são escassas, apesar da importância desses microrganismos. Neste estudo são apresentados os dados da sequência do genoma de uma linhagem de M. flocculare, bem como do genoma de um novo isolado de M. hyopneumoniae. Com estas novas sequências foram realizadas análises de genômica comparativa visando a identificação de características que pudessem explicar os diferentes comportamentos quanto à patogenicidade dessas espécies. Além disso, a análise global dos transcritomas de cada uma das espécies foi realizada e o perfil transcricional entre M. hyopneumoniae, M. flocculare e M. hyorhynis foi analisado comparativamente objetivando identificar características peculiares para cada um dos mapas transcricionais, além de compreender a coordenação do modo de transcrição gênica em Mycoplasma. De um modo geral, as três espécies de Mycoplasma que habitam o trato respiratório suíno possuem grandes semelhanças na composição gênica, assim como na abundância de transcritos. A análise do repertório transcricional, mostra que os genomas são transcritos quase que em sua totalidade, incluindo as regiões intergênicas, nas três espécies. M. hyopneumoniae e M. flocculare apresentam conteúdo gênico e perfil transcricional muito semelhantes. Uma importante diferença encontrada entre estas duas espécies refere-se à presença exclusiva de genes e transcritos de adesinas específicas. M. hyorhynis possui genes e transcritos exclusivos, os quais sabidamente estão relacionados à sua capacidade mutacional, de invasividade e infecção de diferentes sítios. Por fim, a análise comparativa dos genomas, e a obtenção dos mapas transcricionais para M. hyopneumoniae, M. flocculare e M. hyorhynis, foram abordagens que resultaram em um grande número de informações, as quais são importantes para embasamento de futuros estudos de caracterização dos mecanismos moleculares, como os eventos de regulação da transcrição gênica, no gênero Mycoplasma. / Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis and Mycoplasma flocculare are able to adhere and to colonize the swine respiratory tract. While M. flocculare presence is virtually assymptomatic, M. hyopneumoniae and M. hyorhynis infections may cause respiratory disease. M. hyopneumoniae is the causative agent of swine enzootic pneumonia and M. hyorhynis may affect the lungs and other sites in a diversity of hosts and has been related to arthritis, poliserosites and to the development of several types of human cancer. Despite genomics technological advances, there are very few data about the possible role of M. flocculare in the swine respiratory tract. Moreover, little information about gene transcription is available in these species, despite the importance of these microorganisms. In this work the genome sequences of M. flocculare and a new isolate of M. hyopneumoniae are presented. A comparative genomic analyzes was performed to identify possible characteristics that may help to explain the different behaviors of these species in the swine respiratory tracts. Furthermore, a transcriptome map of each species was performed and a comparative transcriptional profile analysis between M. hyopneumoniae, M. flocculare and M. hyorhynis was undertaken to identify the exclusive features for each of the transcriptional maps, in addition to understanding the coordination mode of gene transcription in Mycoplasma. In general, the three Mycoplasma species that inhabit the swine respiratory tract have a similar gene composition as well as the abundance of transcripts. The transcriptome maps showed that most of the predicted genes are transcribed from these Mycoplasma genomes, as well as some intergenic regions. M. hyopneumoniae and M. flocculare present very similar gene content and transcriptional profile. However, an important difference between these two species is related to the exclusive presence of genes and transcripts of some specific adhesins. M. hyorhynis presents exclusive genes and transcripts that have been related to its invasiveness, mutation rate and infection of different sites. Finally, the comparative analysis of the genomes and transcriptional maps between M. hyopneumoniae, M. flocculare and M. hyorhynis have resulted in a large amount of information, which are important for future studies of the molecular characterization, as transcriptional regulation in the Mycoplasma spp.

Coorientadora: Profa. Dra. Rose Adele Monteiro / Orientador : Prof. Dr. Luiz Antônio Pereira Neves / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Educação Profissional e Tecnológica, Programa de Pós-Graduação em Bioinformática. Defesa: Curitiba, 27/02/2012 / Bibliografia: fls. 61-64 / Resumo: Atualmente, com as inúmeras tecnológicas disponíveis para sequenciamento de transcritos, o problema consiste no número de ferramentas computacionais para a análise de dados. Neste trabalho apresentamos o desenvolvimento do Genetic Transcript Analyzer (GTA), uma nova ferramenta para comparação de resultados da análise de expressões gênicas por RNA-Seq para diferentes amostras, gerando informações mais ricas a partir de dados brutos no formato BAM ou SAM. O sistema proposto é freeware e foi desenvolvido utilizando a linguagem de programação Java® com auxílio da ferramenta SamTools®, uma biblioteca Java para leitura de arquivos no formato SAM e BAM (Heng li et al, 2009). As validações do sistema deram-se através de entrevistas de satisfação dos usuários e comparações diretas com programas de planilhas eletrônicas e também com comparações descritivas com outros softwares disponíveis que possuam módulos semelhantes ao aqui proposto. O resultado desta pesquisa foi o desenvolvimento de uma solução simples e prática para analisar os resultados de sequenciamentos realizados por máquinas de sequenciamento da nova geração através do método Rna-Seq. / Abstract: Nowadays, with a large number of technological tools available, the bottleneck has moved from collection to data analysis. This paper presents the development of the GTA (Genetic Transcript Analyzer), a new tool for comparing biological samples and analysis of statistical data, comparing their gene expression and generating richer information from the raw data type coming from sorted BAM files. The proposed system is freeware and was designed and built using the Java® language with the tool Samtools®, a Java library for reading files in SAM and BAM files(Heng li et al, 2009) . The system validations are made through user satisfactions interviews and direct comparisons with the program actually used by the professional, the Microsoft Excel and also descriptive comparison with others softwares that can make genetic data comparisons . As result we had developed a new computer software able to analyze the results of the new high output machines that works with Rna-Seq.

Este trabalho trata do processo de digitação para violão da Ciaccona BWV 1004 (original para violino) de Johann Sebastian Bach (1685-1750). O objetivo foi desenvolver uma digitação de mão esquerda capaz de refletir as intenções musicais do presente autor. Para tal, foi estabelecido um modelo de análise, onde a textura musical é dividida e classificada, com base em referenciais teóricos, como: melódica, harmônica, motívica e polifônica. Ao analisar as digitações usadas em transcrições, e compará-las às desta pesquisa, concluímos que se pode ter autonomia para contestar uma digitação grafada, pois ela reflete nada mais que as decisões do seu autor, sejam musicais ou técnicas. A partir disto, podemos deduzir que elas se alteram conforme as nossas próprias decisões. / This work deals with the process of elaborating guitar fingerings for J. S. Bach’s Ciaccona BWV 1004 (original for violin). The aim was to develop a left hand fingering able to reflect the musical intentions of the present author. To this end, a model of analysis was established, in which the musical texture is divided and classified, based on theoretical references, into the following categories: melodic, harmonic, motivic and polyphonic. By analyzing the fingering used on transcriptions, and comparing it with the results of this research, we conclude that we can question a suggested fingering, because it reflects nothing more than the decisions of its author, whether musical or technical. From this we can deduce that they change according to our own decisions.

Este trabalho trata do processo de transcrição da Suíte 20 de J. J Froberger para violão solo. O objetivo geral é descrever o processo de transcrição com base em modelos de transcrição dos séculos XVII e XXI. A partir destas análises foi construído um referencial teórico para aplicação na transcrição da Suíte 20. A identificação dos elementos típicos do chamado stile brisé a partir do referencial foi essencial para o processo de transcrição da suíte 20, que se utilizou de vários procedimentos similares. No anexo deste artigo consta uma edição comparativa da versão original da Suíte 20 com a transcrição, bem como outra edição com a parte do violão solo e sugestões de execução.

Made available in DSpace on 2016-07-01T13:10:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-11-12. Added 1 bitstream(s) on 2016-07-01T13:14:17Z : No. of bitstreams: 1 000866541.pdf: 1198385 bytes, checksum: 265d4dc3d78da2996e89f94af5e66b2d (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Fundação Paulista Contra a Hanseníase / hanseníase é uma doença de caráter complexa causada pelo Mycobacterium leprae, que é um patógeno intracelular obrigatório com predileção por macrófagos na pele e células de Schwann nos nervos periféricos. O genoma altamente conservado do bacilo sugere que o patógeno não seja o responsável pela variedade de fenótipos clínicos e biológicos observada na doença, atribuindo grande importância aos fatores genéticos do hospedeiro. Estudos de ligação do tipo genome-wide apontaram um locus de susceptibilidade para a doença na região cromossômica 10p13 e o gene GATA3, localizado na região 10p15, é um forte candidato a fazer parte dessa associação devido à sua localização no genoma e ao seu papel na resposta imune. O GATA-3 é um fator de transcrição clássico na diferenciação de células Th2, no entanto, sabe-se hoje que essa proteína possui outras funções importantes para o sistema imune. Nós empregamos a estratégia de estudo de associação do tipo caso-controle em série, utilizando duas amostras populacionais do Brasil com 1.633 indivíduos, para testar sete variantes genéticas do GATA3. Um estudo funcional também foi conduzido para avaliar o efeito dos polimorfismos associados sobre a expressão de GATA-3 e produção de citocinas. O alelo A do polimorfismo rs10905284 foi associado com resistência para a hanseníase em ambas as amostras. Na análise combinando as duas amostras este efeito do alelo A foi confirmado (OR 0,67; IC95%: 0,54-0,84; p=0,0004). A análise funcional mostrou que os indivíduos portadores do genótipo AA expressam altos níveis da proteína GATA-3 nos linfócitos. Portanto, nós confirmamos que o marcador rs10905284 está associado à hanseníase na população brasileira e influencia os níveis de expressão do fator de transcrição GATA-3 / Leprosy outcome is a complex trait and the host-pathogen-environment interaction defines the emergence of the disease. The causative agent of the disease, Mycobacterium leprae, exhibits a conserved genome and could not be accountable for the variety of outcomes observed from exposition, infection and disease. Thus, host genetic risk factors have been successfully associated to leprosy. The 10p13 chromosomal region was linked to leprosy in familial studies and the GATA3 gene is a strong candidate to be part of this association due to its locus and the role that exerts in the immune response. The GATA-3 is a transcription factor involved in the Th2 cell differentiation, however, today it is recognized the ample role of this protein in the immune response. Here, we applied a stepwise strategy to test genetic variants at GATA3 in two case-control samples from Brazil comprising a total of 1,633 individuals. A functional investigation was also conducted to evaluate the effect of the polymorphisms on the GATA-3 protein and the cytokines production. The A allele of rs10905284 marker was associated to leprosy resistance in both samples. In the analysis combining the two samples this effect was reinforced (OR 0,67; CI95%: 0,54-0,84; p=0,0004). The functional analysis showed that individuals carrying AA genotype express higher levels of GATA-3 protein in lymphocytes. So, we confirmed that the rs10905284 is a locus associated to leprosy in the Brazilian population and influences the levels of this transcription factor.

Submitted by NATÁLIA GONÇALVES TAKAHASHI GONÇALVES TAKAHASHI (naty_taka@hotmail.com) on 2017-06-07T16:14:24Z No. of bitstreams: 2 Dissertação_Natália_Gonçalves_Takahashi.pdf: 2126549 bytes, checksum: 2e4e7bc6e6b87efa3e00671b6137371c (MD5) Dissertação_Natália_Gonçalves_Takahashi.docx: 17831 bytes, checksum: 978787158c35816170d4451246ee80c5 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-06-07T16:29:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 takahashi_ng_me_jabo.pdf: 2126549 bytes, checksum: 2e4e7bc6e6b87efa3e00671b6137371c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-07T16:29:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 takahashi_ng_me_jabo.pdf: 2126549 bytes, checksum: 2e4e7bc6e6b87efa3e00671b6137371c (MD5) Previous issue date: 2017-06-05 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A busca pela diversificação de fontes da matriz energética, priorizando fontes renováveis, acarreta no maior consumo de etanol de primeira geração, podendo este ser insuficiente em suprir a necessidade da frota brasileira. Dessa forma, o etanol de segunda geração (E2G) surge como uma alternativa para aumento da produção de combustíveis renováveis. Ele é produzido a partir da fermentação dos resíduos de glicose após a quebra da celulose presente na biomassa vegetal. Contudo, além da celulose, a biomassa vegetal é também composta pela lignina, composto considerado recalcitrante no processo de obtenção deste tipo de etanol. Para transpor este obstáculo, é necessário encontrar maneiras de diminuir a quantidade ou modificar a composição da lignina. Fatores de transcrição (FTs) são alvos altamente promissores para a modificação deste polímero, uma vez que estão envolvidos com a regulação de sua via de biossíntese, bem como, da formação de toda parede celular secundária (PCS). Plantas de arroz transformadas para a superexpressão de AtSHN2 de Arabdopsis, apresentaram uma diminuição na quantidade de lignina e mostraram uma modulação na via de celulose, enquanto que a superexpressão do outro gene SHN de Arabidopsis (AtSHN1) em Arabidopsis apresentou uma modificação na via de biossíntese de cera e cutina. Isto ressalta a necessidade de avaliar os FTs de maneira espécie-específica. Assim sendo, este trabalho vem com o objetivo de ajudar a elucidar os mecanismos de funcionamento do FT SHINE (SHN), considerado um potencial regulador da PCS em gramíneas. Para a caracterização do FT SbSHN em sorgo foi primeiramente realizado um alinhamento de sequências de aminoácidos, contendo as proteínas codificadas pelos dois genes SHN em sorgo (SbSHN1 – Sb04g006970 e SbSHN2 – Sb10g023600) com outras sequências SHN disponíveis na literatura. Em seguida foi gerada uma árvore filogenética contendo todos esses mesmos SHN. Após isso, foi realizada a clonagem do FT SbSHN1 em vetor comercial pENTR/D-TOPO (Invitrogen), após verificação, a sequência foi recombinada com vetores de destino. Primeiramente, com o vetor pDEST15 para a expressão heteróloga da proteína SHN em E. coli.. De maneira complementar foi produzido um peptídeo sintético para reconhecimento da proteína SbSHN (anticorpo antiSHN). Posteriormente foi produzido um vetor contendo a sequencia de SHN em fusão com GFP, que foi utilizado para agroinfiltração de folhas de N. benthamiana, a fim de observar a localização subcelular do FT SbSHN. Para determinação da expressão através de qPCR em sorgo foram utilizados a folha, dividida em base e ponta, e a inflorescência, imatura e madura. Além disso, foi realizada a imunoprecipitação de cromatina (ChIP) das inflorescências imaturas e maduras de sorgo, com posterior análise inicial por ChIPqPCR para validação de alguns alvos de SbSHN. Como resultados, através da expressão heteróloga foi produzida uma proteína com massa de aproximadamente 52kDa (massa da proteína SHN adicionada de cauda GST), que foi reconhecida pelo anticorpo antSHN produzido. Foi confirmada a presença do FT SbSHN no núcleo celular, através de observação das folhas transformadas por agroinfiltração. As inflorescências imaturas de sorgo apresentaram maior expressão tanto de SbSHN1 quanto de SbSHN2. Com a técnica de ChIPqPCR foi possível validar in vivo os alvos SbNAC91 (Sb07g001550), SbNAC115 (Sb10g000460), SbMYB87 (Sb07g024970) e SbMYB60 (Sb04g031110) do FT SbSHN em sorgo. Em uma perspectiva de longo prazo, acredita-se que o conhecimento obtido a partir destes estudos não só fornecerão informações importantes sobre a função dos reguladores SHN em todo o reino vegetal, mas também fornecer uma poderosa ferramenta para a engenharia metabólica de compostos fenólicos e lignina por meio de melhoramento convencional ou abordagens transgênicas, impactando diretamente sobre a produção de E2G. / The search for alternative sources of the energy, prioritizing renewable sources, increase the consumption of first generation ethanol, which could not be enough to supply the needs of the Brazilian flex fuel car fleet. In this scenario, second generation ethanol (E2G) appears as an alternative to increase production of renewable fuels. E2G it is produced from the fermentation of glucose residues after breaking the cellulose present in the plant biomass. However, adhered to the cellulose is lignin, a compound considered recalcitrant in the process of obtaining this type of ethanol. To overcome this obstacle, it is necessary to find ways to decrease the amount or modify the lignin composition. Transcription factors (TFs) are highly promising targets for the modification of this polymer, since they are involved in the regulation of its biosynthesis pathway, as well as the formation of the whole secondary cell wall (PCS). Rice plants transformed for the overexpression of AtSHN2 from Arabidopsis showed a decrease in the amount of lignin and a modulation of cellulose pathway whereas the overexpression of another gene of SHN (AtSHN1) in Arabidopsis showed a modification in the biosynthesis pathway of wax and cutin. This highlights the need to evaluate TFs in a species-specific manner. Basing on this, the present work has the objective of helping to elucidate the mode of action of TF SHINE (SHN), considered a potential regulator of PCS in grasses. Aiming to characterize SbSHN TF in sorghum, initially an alignment was performed using amino acid sequence of proteins encoded by the two SHN genes in sorghum (SbSHN1 - Sb04g006970 and SbSHN2 - Sb10g023600) with other SHN sequences available in the literature. Then a phylogenetic tree containing all these SHN sequences was generated. After that, the SbSHN1 FT was cloned into commercial vector pENTR / D-TOPO (Invitrogen) and later used to recombinate in different destination vectors using gateway system. First, the vector pDEST15 was used for the production of heterologous expression in E. coli. Complementary, a synthetic peptide was produced for recognition of the SbSHN protein (antiSHN antibody). In parallel, the vector pK7WGF2 was used to obtain SHN phusioned to GFP. This vector was transientilly expressed in leaves of N. benthamiana in order to observe the subcellular location of SbSHN TF. Complementary, to determine the expression through qPCR, sorghum leaves, were splitted in base and tip, and the inflorescence, in immature and mature developmental stages, were used. In addition, chromatin immunoprecipitation (ChIP) of immature and mature sorghum inflorescences was performed, with initial analysis by ChIPqPCR for validation of some SbSHN targets. As results, through heterologous expression, a protein with mass of approximately 52kDa (mass of the SHN protein added with GST tail) was obtained, which was recognized by the antiSHN antibody produced. The presence of SbSHN TF in the cell nucleus was confirmed by observation of the transformed leaves by agroleakage. The immature inflorescences of sorghum presented higher expression level of both SbSHN1 and SbSHN2 genes. With the ChIPqPCR technique it was possible to validate in vivo some SHN targets such as: SbNAC91 (Sb07g001550), SbNAC115 (Sb10g000460), SbMYB87 (Sb07g024970) and SbMYB60 (Sb04g031110) in sorghum. In a long-term perspective, we believe that the knowledge gained from these studies will not only provide important information about the function of SHN as a master regulators throughout the plant kingdom, but also provide a powerful tool for the metabolic engineering of phenolic compounds and lignin using conventional breeding or transgenic approaches, directly impacting the production of E2G.

Orientador: Ana Carla Pereira Latini / Coorientador: Vânia Nieto Brito de Souza / Banca: Carlos Magno Castelo Branco Fortaleza / Banca: Milton Ozório Moraes / Resumo: hanseníase é uma doença de caráter complexa causada pelo Mycobacterium leprae, que é um patógeno intracelular obrigatório com predileção por macrófagos na pele e células de Schwann nos nervos periféricos. O genoma altamente conservado do bacilo sugere que o patógeno não seja o responsável pela variedade de fenótipos clínicos e biológicos observada na doença, atribuindo grande importância aos fatores genéticos do hospedeiro. Estudos de ligação do tipo genome-wide apontaram um locus de susceptibilidade para a doença na região cromossômica 10p13 e o gene GATA3, localizado na região 10p15, é um forte candidato a fazer parte dessa associação devido à sua localização no genoma e ao seu papel na resposta imune. O GATA-3 é um fator de transcrição clássico na diferenciação de células Th2, no entanto, sabe-se hoje que essa proteína possui outras funções importantes para o sistema imune. Nós empregamos a estratégia de estudo de associação do tipo caso-controle em série, utilizando duas amostras populacionais do Brasil com 1.633 indivíduos, para testar sete variantes genéticas do GATA3. Um estudo funcional também foi conduzido para avaliar o efeito dos polimorfismos associados sobre a expressão de GATA-3 e produção de citocinas. O alelo A do polimorfismo rs10905284 foi associado com resistência para a hanseníase em ambas as amostras. Na análise combinando as duas amostras este efeito do alelo A foi confirmado (OR 0,67; IC95%: 0,54-0,84; p=0,0004). A análise funcional mostrou que os indivíduos portadores do genótipo AA expressam altos níveis da proteína GATA-3 nos linfócitos. Portanto, nós confirmamos que o marcador rs10905284 está associado à hanseníase na população brasileira e influencia os níveis de expressão do fator de transcrição GATA-3 / Abstract: Leprosy outcome is a complex trait and the host-pathogen-environment interaction defines the emergence of the disease. The causative agent of the disease, Mycobacterium leprae, exhibits a conserved genome and could not be accountable for the variety of outcomes observed from exposition, infection and disease. Thus, host genetic risk factors have been successfully associated to leprosy. The 10p13 chromosomal region was linked to leprosy in familial studies and the GATA3 gene is a strong candidate to be part of this association due to its locus and the role that exerts in the immune response. The GATA-3 is a transcription factor involved in the Th2 cell differentiation, however, today it is recognized the ample role of this protein in the immune response. Here, we applied a stepwise strategy to test genetic variants at GATA3 in two case-control samples from Brazil comprising a total of 1,633 individuals. A functional investigation was also conducted to evaluate the effect of the polymorphisms on the GATA-3 protein and the cytokines production. The A allele of rs10905284 marker was associated to leprosy resistance in both samples. In the analysis combining the two samples this effect was reinforced (OR 0,67; CI95%: 0,54-0,84; p=0,0004). The functional analysis showed that individuals carrying AA genotype express higher levels of GATA-3 protein in lymphocytes. So, we confirmed that the rs10905284 is a locus associated to leprosy in the Brazilian population and influences the levels of this transcription factor. / Mestre