Orientador: Edvaldo Aparecido Amaral da Silva / Coorientador: Peter Edwin Toorop / Banca: João Nakagawa / Banca: Juliana Pereira Bravo / Banca: Maria Marcia Pereira Sartori / Resumo: Sementes de diferentes espécies, armazenadas na mesma condição em bancos de germoplasma, apresentam respostas distintas quanto à perda de sua viabilidade. Atualmente, somente o teste de germinação é usado para avaliar a qualidade fisiológica de sementes em bancos de germoplasma e outros métodos ainda são necessários para prever a longevidade de sementes. A espécie Astronium fraxinifolium Schott é uma árvore das regiões da Amazônia, Cerrado e Caatinga, ameaçada de extinção, que apresenta sementes não dormentes e que germinam rapidamente. O objetivo do presente trabalho foi estudar a longevidade de sementes de A. fraxinifolium, coletadas em diversos locais de duas regiões geográficas distintas e avaliar o transcriptoma. Sementes de dez acessos de A. fraxinifolium, sendo seis coletados no estado de Goiás (GO) e quatro em Minas Gerais (MG) foram avaliados. Foram realizados pré-testes para determinar a melhor temperatura para germinação e o tempo para iniciar a protrusão da radícula. Testes de envelhecimento, condutividade elétrica, teor de malonaldeído e análise do transcriptoma foram realizados. A temperatura ótima de germinação foi de 30° C e os primeiros eventos de protrusão radicular ocorreram após 20 horas de embebição. Sementes coletadas em Goiás apresentaram maior viabilidade e longevidade após os testes de envelhecimento para todas as condições testadas e os acessos GO 6 e MG 2 apresentaram, respectivamente, a maior e menor longevidade após o envelhecimento. ... / Abstract:Seeds of different species stored under the same conditions differently lose their viability. Currently, the physiological quality of seeds stored in genebanks is evaluated only by the germination test and other methods are still needed to predict seed viability.The species Astronium fraxinifolium Schott is a tree in the Amazonian regions, Cerrado and Caatinga, which presents seeds that are non-dormant and which germinate rapidly. The goal of this work was to study the longevity of seeds A. fraxinifolium collected at several sites from two different geographic regions, and assess the transcriptome. For that, seeds from ten accessions of A. fraxinifolium were collected (six in the state of Goiás (GO) and four in Minas Gerais (MG) and evaluated. Pre-tests were performed to determine the optimal germination temperature and the onset of the radicle protrusion. Aging tests, electrical conductivity, malonaldehyde content and transcriptome analysis were performed. The optimal germination temperature was 30o C and the first radicle protrusion events occurred after 20 hours of imbibition. Seeds collected in Goiás displayed higher viability and longevity after aging in all tested conditions and seeds from accessions GO 6 and MG 2 showed, respectively, the highest and lowest longevity indexes after aging. The electrical conductivity test was not adequate to evaluate the longevity of the accessions and the assessment of the malonaldehyde content was considered a promising test to assess the longevity of A. fraxinifolium seeds. RNASeq analysis was performed to evaluate the transcripts of embryonic axes of seeds of the GO 6 and MG 2 accessions, with aged and unaged seeds. Differentially expressed genes were related to RNA transcription processes, kinases, ubiquitin, starch metabolism, microtubules, membrane components, polymerase, and transport of carbohydrates and zinc... / Doutor

Orientador: Fausto Foresti / Resumo: Os estudos em citogenética de peixes Neotropicais têm se expandido de modo considerável nos últimos anos, principalmente devido à incorporação de novas técnicas de obtenção e interpretação de dados cariomórficos. O presente estudo se inseriu no programa geral de estudos de Citogenética e Genética Molecular de Peixes Neotropicais que vem sendo desenvolvido no Laboratório de Biologia e Genética de Peixes (IBB/UNESP/Botucatu). Foram analisadas citogeneticamente, com relação aos aspectos estrutural e molecular cinco espécies de peixes da ordem dos Siluriformes, tendo como foco especial as espécies mais representativas da família Heptapteridae, sendo Rhamdia quelen, Pimelodella avanhadavae, Cetopsorhamida iheringi, Heptapterus mustelinus e Imparfinis mirin encontrados nos componentes das bacias hidrográficas dos rios Grande, Tietê e Paranapanema, no Estado de São Paulo, além de espécimes de Pimelodella elongata, provenientes do Rio Dos Bocas (03°16'07.6"S 079°44'14.8"W) Province El Oro, Equador. As análises de citogenética clássica envolveram a aplicação das técnicas de coloração por Giemsa para a caracterização do número diploide das espécies, que mostrou variação entre 2n=46 a 2n=58 cromossomos e o bandamento C para a localização de regiões heterocromáticas, além de técnicas de citogenética molecular com produção de sondas e mapeamento dos genes de DNAr 5S e 18S e mapeamento físico de 4 sequências de microssatélites ((CA)15, (GA)15, (CG)15 e (TTA)10). Além disso, foi realizado a... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Pitanga (Eugenia uniflora L.) é uma árvore arbustiva com frutas semelhantes à cereja, que cresce em diferentes tipos de vegetação e ecossistemas como consequência da sua alta capacidade de adaptação a diferentes condições de solo e clima. Esta espécie é de particular interesse econômico devido às suas propriedades medicinais, que são atribuídas aos metabólitos especializados presentes em suas folhas e frutos. Entre os metabólitos, os terpenóides são os mais abundantes dos óleos essenciais que são encontrados nas folhas. A diversidade de terpenos observada em Myrtaceae é determinada pela atividade de diferentes membros das famílias das terpeno sintases e oxidosqualeno ciclases. Por outro lado, os miRNAs são pequenos RNAs endógenos que desempenham papéis regulatórios essenciais no crescimento das plantas, desenvolvimento e resposta ao estresse. Por esta razão, estudos extensivos de miRNAs foram realizados em plantas modelos e outras plantas de importância econômica nos últimos anos. Portanto, o objetivo deste estudo é gerar recursos genômicos para E. uniflora utilizando sequenciamento de nova geração e ferramentas de bioinformática para a identificação de miRNAs conservados e novos, bem como os genes envolvidos na sínteses dos terpenóides. No capítulo 3, bibliotecas de pequenos RNA e RNA-seq foram construídas a partir de folhas de pitanga para identificar miRNAs maduros e pre-miRNAs, respectivamente. De 14.489.131 leituras limpas de pequenos RNA, foram obtidos 1.852.722 sequências de miRNAs maduros que representam 45 famílias conservadas e que foram identificadas em outras espécies de plantas. Análises posteriores, usando contigs montados a partir do RNA-seq, permitiu a predição das estruturas secundárias de 42 pre-miRNAs: 25 conservados e 17 novos. Alvos potenciais foram previstos para os miRNAs maduros mais abundantes nos pre-miRNAs, identificados com base na homologia de sequências. Além disso, a expressão de 27 pre-miRNAs foi validada utilizando ensaios de RT-PCR em diferentes indivíduos de pitanga. Este estudo é o primeiro de identificação em grande escala de miRNAs e seus alvos potenciais de uma espécie da família Myrtaceae, e proporciona mais informação sobre a conservação evolutiva dos vias regulatórias dos miRNAs em plantas com destaques para os miRNAs específicos da pitanga. No capítulo 4, a biblioteca de RNA-seq sequenciada anteriormente foi utilizada para identificar os genes potencialmente envolvidos na via da biossíntese dos terpenos e diversidade dos terpenóides a partir da montagem de novo e a anotação do transcriptoma de E. uniflora. No total, foram identificados 72.742 unigenes com um comprimento médio de 1.048 pb. Destes, 43.631 e 36.289 unigenes foram anotadas com as bases de dados das proteínas não redundantes do NCBI e Swiss-Prot, respectivamente. A ontologia gênica categorizou as sequências em 53 grupos funcionais. A análise das vias metabólicas com KEGG revelou 8.625 unigenes designados a 141 vias metabólicas e 40 unigenes preditos como associados com a biossíntese de terpenóides. Por outro lado, foram identificados quatro genes putativos de terpeno sintases (TPS), de comprimento completo, envolvidos na biossíntese de monoterpenos e sesquiterpenos, e três genes putativos de oxidosqualeno ciclases (OSC), de comprimente completo, envolvidos na biossíntese de triterpenos. Além disso, a expressão destes genes foi validada em diferentes tecidos de E. uniflora. A futura caracterização bioquímica dos diferentes TPS e OSC descritos aqui determinará especificamente o tipo de terpenóide sintetizado em condições ambientais específicas. Os dados produzidos neste estudo servirão como referência para estudos genéticos sobre os mecanismos moleculares que são responsáveis pela composição química dos óleos essenciais em E. uniflora e os aspectos fisiológicos da capacidade de adaptação desta espécie a diferentes habitats. / Pitanga (Eugenia uniflora L.) is a shrubby tree with edible cherry-like fruits that grows in different vegetation types and ecosystems as a consequence of its high adaptability to different soils and climate conditions. This species is of particular interest due to its medicinal properties that are attributed to specialized metabolites present in their leaves and fruits with potential pharmacological benefits. Among these metabolites, the terpenoids are the most abundant in the essential oils found in the leaves. The terpene diversity observed in Myrtaceae is determined by the activity of different members of the terpene synthase and oxidosqualene cyclase families. Furthermore, miRNAs are endogenous small RNAs that play essential regulatory roles in plant growth, development and stress response. For this reason, extensive studies of miRNAs have been performed in model plants and other plants of economic importance in the last years. Therefore, the aim of this study is to generate genomic resources for E. uniflora using next generation sequencing and bioinformatics tools to identify conserved and new miRNAs, and to identify the genes involved in the synthesis of terpenoids. In chapter 3, small RNA and RNA-seq libraries were constructed from leaves to identify mature miRNAs and pre-miRNAs, respectively. From 14.489.131 small RNA clean reads we obtained 1.852.722 mature miRNA sequences, representing 45 conserved families that have been identified in other plant species. Further analysis using assembled contigs from RNA-seq allowed the prediction of secondary structures of 42 pre-miRNAs: 25 conserved and 17 novel. Potential targets were predicted for the most abundant mature miRNAs, which were identified in pre-miRNAs based on sequence homology. In addition, the expression of 27 identified pre-miRNAs was validated using RTPCR assays in different individuals of pitanga. In chapter 4, the previously sequenced RNA-seq library was de novo assembled followed by annotation of the E. uniflora transcriptome and used to identify the genes potentially involved in the terpene biosynthesis pathway and terpenoid diversity. In total, we identified 72.742 unigenes with a mean length of 1.048 bp. Of these, 43.631 and 36.289 unigenes were annotated with the NCBI non-redundant protein and Swiss-Prot databases, respectively. The gene ontology categorized the sequences into 53 functional groups. A metabolic pathway analysis with KEGG revealed 8.625 unigenes assigned to 141 metabolic pathways and 40 unigenes predicted to be associated with the biosynthesis of terpenoids. Furthermore, we identified four putative full-length terpene synthase (TPS) genes involved in sesquiterpenes and monoterpenes biosynthesis, and three putative full-length oxidosqualene cyclase (OSC) genes involved in the triterpenes biosynthesis. In addition, expression of these genes was validated in different E. uniflora tissues. Future biochemical characterization of the different TPS and OSC described here will determine the type of terpenoid specifically synthesized in specific environmental conditions. The data produced in this study will serve as a reference for genetic studies about the molecular mechanisms behind the chemical composition of the essential oils in E. uniflora and about the physiologic aspects of the capacity of adaptation of this specie to different habitats.

Pitanga (Eugenia uniflora L.) é uma árvore arbustiva com frutas semelhantes à cereja, que cresce em diferentes tipos de vegetação e ecossistemas como consequência da sua alta capacidade de adaptação a diferentes condições de solo e clima. Esta espécie é de particular interesse econômico devido às suas propriedades medicinais, que são atribuídas aos metabólitos especializados presentes em suas folhas e frutos. Entre os metabólitos, os terpenóides são os mais abundantes dos óleos essenciais que são encontrados nas folhas. A diversidade de terpenos observada em Myrtaceae é determinada pela atividade de diferentes membros das famílias das terpeno sintases e oxidosqualeno ciclases. Por outro lado, os miRNAs são pequenos RNAs endógenos que desempenham papéis regulatórios essenciais no crescimento das plantas, desenvolvimento e resposta ao estresse. Por esta razão, estudos extensivos de miRNAs foram realizados em plantas modelos e outras plantas de importância econômica nos últimos anos. Portanto, o objetivo deste estudo é gerar recursos genômicos para E. uniflora utilizando sequenciamento de nova geração e ferramentas de bioinformática para a identificação de miRNAs conservados e novos, bem como os genes envolvidos na sínteses dos terpenóides. No capítulo 3, bibliotecas de pequenos RNA e RNA-seq foram construídas a partir de folhas de pitanga para identificar miRNAs maduros e pre-miRNAs, respectivamente. De 14.489.131 leituras limpas de pequenos RNA, foram obtidos 1.852.722 sequências de miRNAs maduros que representam 45 famílias conservadas e que foram identificadas em outras espécies de plantas. Análises posteriores, usando contigs montados a partir do RNA-seq, permitiu a predição das estruturas secundárias de 42 pre-miRNAs: 25 conservados e 17 novos. Alvos potenciais foram previstos para os miRNAs maduros mais abundantes nos pre-miRNAs, identificados com base na homologia de sequências. Além disso, a expressão de 27 pre-miRNAs foi validada utilizando ensaios de RT-PCR em diferentes indivíduos de pitanga. Este estudo é o primeiro de identificação em grande escala de miRNAs e seus alvos potenciais de uma espécie da família Myrtaceae, e proporciona mais informação sobre a conservação evolutiva dos vias regulatórias dos miRNAs em plantas com destaques para os miRNAs específicos da pitanga. No capítulo 4, a biblioteca de RNA-seq sequenciada anteriormente foi utilizada para identificar os genes potencialmente envolvidos na via da biossíntese dos terpenos e diversidade dos terpenóides a partir da montagem de novo e a anotação do transcriptoma de E. uniflora. No total, foram identificados 72.742 unigenes com um comprimento médio de 1.048 pb. Destes, 43.631 e 36.289 unigenes foram anotadas com as bases de dados das proteínas não redundantes do NCBI e Swiss-Prot, respectivamente. A ontologia gênica categorizou as sequências em 53 grupos funcionais. A análise das vias metabólicas com KEGG revelou 8.625 unigenes designados a 141 vias metabólicas e 40 unigenes preditos como associados com a biossíntese de terpenóides. Por outro lado, foram identificados quatro genes putativos de terpeno sintases (TPS), de comprimento completo, envolvidos na biossíntese de monoterpenos e sesquiterpenos, e três genes putativos de oxidosqualeno ciclases (OSC), de comprimente completo, envolvidos na biossíntese de triterpenos. Além disso, a expressão destes genes foi validada em diferentes tecidos de E. uniflora. A futura caracterização bioquímica dos diferentes TPS e OSC descritos aqui determinará especificamente o tipo de terpenóide sintetizado em condições ambientais específicas. Os dados produzidos neste estudo servirão como referência para estudos genéticos sobre os mecanismos moleculares que são responsáveis pela composição química dos óleos essenciais em E. uniflora e os aspectos fisiológicos da capacidade de adaptação desta espécie a diferentes habitats. / Pitanga (Eugenia uniflora L.) is a shrubby tree with edible cherry-like fruits that grows in different vegetation types and ecosystems as a consequence of its high adaptability to different soils and climate conditions. This species is of particular interest due to its medicinal properties that are attributed to specialized metabolites present in their leaves and fruits with potential pharmacological benefits. Among these metabolites, the terpenoids are the most abundant in the essential oils found in the leaves. The terpene diversity observed in Myrtaceae is determined by the activity of different members of the terpene synthase and oxidosqualene cyclase families. Furthermore, miRNAs are endogenous small RNAs that play essential regulatory roles in plant growth, development and stress response. For this reason, extensive studies of miRNAs have been performed in model plants and other plants of economic importance in the last years. Therefore, the aim of this study is to generate genomic resources for E. uniflora using next generation sequencing and bioinformatics tools to identify conserved and new miRNAs, and to identify the genes involved in the synthesis of terpenoids. In chapter 3, small RNA and RNA-seq libraries were constructed from leaves to identify mature miRNAs and pre-miRNAs, respectively. From 14.489.131 small RNA clean reads we obtained 1.852.722 mature miRNA sequences, representing 45 conserved families that have been identified in other plant species. Further analysis using assembled contigs from RNA-seq allowed the prediction of secondary structures of 42 pre-miRNAs: 25 conserved and 17 novel. Potential targets were predicted for the most abundant mature miRNAs, which were identified in pre-miRNAs based on sequence homology. In addition, the expression of 27 identified pre-miRNAs was validated using RTPCR assays in different individuals of pitanga. In chapter 4, the previously sequenced RNA-seq library was de novo assembled followed by annotation of the E. uniflora transcriptome and used to identify the genes potentially involved in the terpene biosynthesis pathway and terpenoid diversity. In total, we identified 72.742 unigenes with a mean length of 1.048 bp. Of these, 43.631 and 36.289 unigenes were annotated with the NCBI non-redundant protein and Swiss-Prot databases, respectively. The gene ontology categorized the sequences into 53 functional groups. A metabolic pathway analysis with KEGG revealed 8.625 unigenes assigned to 141 metabolic pathways and 40 unigenes predicted to be associated with the biosynthesis of terpenoids. Furthermore, we identified four putative full-length terpene synthase (TPS) genes involved in sesquiterpenes and monoterpenes biosynthesis, and three putative full-length oxidosqualene cyclase (OSC) genes involved in the triterpenes biosynthesis. In addition, expression of these genes was validated in different E. uniflora tissues. Future biochemical characterization of the different TPS and OSC described here will determine the type of terpenoid specifically synthesized in specific environmental conditions. The data produced in this study will serve as a reference for genetic studies about the molecular mechanisms behind the chemical composition of the essential oils in E. uniflora and about the physiologic aspects of the capacity of adaptation of this specie to different habitats.

Somos conscientes de que existen claras diferencias en la organización del material hereditario en todos los organismos y que puede alterarse en escalas de tiempo relativamente cortas. En otras palabras, nos referimos a la evolución de la arquitectura del genoma y predecirla es particularmente difícil, debido a la falta de conocimiento de algunos de sus principios fundamentales. Sí poseemos información sobre las tasas de mutación y recombinación, el papel de la deriva genética o la distribución de los efectos mutacionales. Sin embargo, la información sobre la topografía de los paisajes adaptativos sigue siendo escasa y no sabemos cómo puede condicionar la evolución del virus. Los paisajes adaptativos son un concepto fundamental en biología evolutiva que trata de discernir el número de vías mutacionales accesibles para alcanzar picos de eficacia (es decir, soluciones adaptativas). Durante mucho tiempo, los paisajes fueron sólo construcciones teóricas, pero actualmente pueden caracterizarse las propiedades de los paisajes empíricos gracias a la aportación de información precisa sobre los distintos genotipos. En relación a dicha aportación, uno de los parámetros más importantes es la eficacia viral, que se ha convertido en un cálculo estándar en virología y es esencial para evaluar el potencial evolutivo de un genotipo. Básicamente, define la ventaja (o desventaja) de un genotipo dado con respecto a uno de referencia. Por lo general, las poblaciones de virus se componen de una mezcla de genotipos cuya abundancia en la población depende de las diferencias de eficacia, las interacciones entre genotipos y la deriva genética. Pero, ¿cuántos picos de eficacia puede poseer un paisaje adaptativo? ¿Serían los mismos en otras condiciones ambientales? ¿Es equitativa la contribución de la adaptación, la historia y el azar en el proceso evolutivo? ¿Hasta qué punto son relevantes las interacciones epistáticas para determinar la rugosidad del paisaje adaptativo? ¿Y la regulación de los genes del huésped durante la infección? ¿Podemos identificar los genes del mismo cuya expresión depende de la eficacia viral? Para contestar a éstas y muchas otras preguntas, hemos dividido los resultados de esta tesis en cuatro capítulos. La primera parte tratará de mostrar cómo se mueven las poblaciones virales en un paisaje de eficacia rugoso y si lo hacen eficientemente. También se evaluará si pueden escapar de la cuenca de atracción de un pico de eficacia óptima local. Para ello, partiendo de un conjunto de virus situados a distintas distancias del óptimo local, observaremos si la evolución recompensa mantenerse en el óptimo o premia la exploración de regiones distantes del paisaje. En cualquier caso, determinaremos la contribución de la adaptación, la contingencia histórica y el azar. En la segunda parte compararemos las topografías de los paisajes de dos huéspedes, original y alternativo, en busca de similitudes y diferencias. Así, analizaremos si se producen ganancias o pérdidas de eficacia en distintas condiciones y observaremos si destaca algún tipo de interacción epistática. Además, trataremos de realizar un ejercicio de valoración global para esclarecer si son más importantes los detalles macroscópicos del paisaje o los microscópicos. El propósito del tercer capítulo se aleja del tema principal para tratar de evaluar in vivo las diferencias de eficacia entre componentes subclonales de una población. Para hacerlo, trataremos de aislar centenares de subclones biológicos individuales de una población viral mediante ensayos de infectividad en un huésped alternativo, en el que el virus objeto de estudio produce lesiones locales. Por último, habiendo analizado en profundidad los paisajes de eficacia, ahondaremos en el estudio de las diferencias entre genotipos virales a nivel de la respuesta molecular del huésped a la infección. Para tal objetivo, compararemos los transcrip / We are aware that there are clear differences in the organisation of hereditary material in all organisms and that it can be altered at relatively short timescales. Predicting the evolution of genome architecture is particularly difficult, due to a lack of knowledge of some of its fundamental principles. We have information about mutation and recombination rates, the role of genetic drift, or the distribution of mutational effects. However, information about the topography of adaptive landscapes remains scarce and we do not know how it can condition the evolution of the virus. Adaptive landscapes are a fundamental concept in evolutionary biology that seeks to discern the number of mutational pathways accessible to achieve fitness peaks (i.e., adaptive solutions). For a long time, landscapes were only theoretical constructions, but today the properties of empirical landscapes can be characterized thanks to the contribution of precise information on the different genotypes. One of the most important parameters in relation to this contribution is viral fitness, which has become a standard parameter in virology and is essential for assessing the evolutionary potential of a genotype. Basically, it defines the advantage (or disadvantage) of a given genotype over a reference genotype. In general, virus populations are composed of a mixture of genotypes whose abundance in the population depends on differences in fitness, interactions between genotypes and genetic drift. But how many fitness peaks can have an adaptive landscape? Would they be the same in other environmental conditions? Is equal the contribution of adaptation, history and chance in the evolutionary process? To what extent are epistatic interactions relevant to determining the roughness of the adaptive landscape? What about regulation of host genes during infection? Can we identify the host genes whose expression depends on viral fitness? To answer these and many other questions, we have divided the results of this thesis into four chapters. The first part of the work will try to show how viral populations move in a rugged fitness landscape and if they do so efficiently. It will also be evaluated whether they can escape from the catchment area of a local peak of maximum fitness. To this end, starting from a set of genotypes of the virus, which are located at different distances from the local optimum in a very rugged landscape, we will observe whether evolution rewards staying in the local optimum or, on the other way, rewards the exploration of the landscape. In either case, we will determine the contribution of adaptation, historical contingency and fortuitous events. The second part will focus on the properties of the landscapes of two hosts, the original and an alternative one, in search of similarities and differences. Thus, we will analyze if there are gains or losses in fitness under different conditions and we will look if any epistatic interaction is highlighted. Furthermore, without forgetting all the other characteristics that define a fitness landscape, we will try to carry out a global valuation exercise to clarify whether macroscopic or microscopic details of the landscape are more important. The purpose of the third chapter momentarily moves away from the main theme of this thesis, empirical fitness landscapes, to try to assess in vivo the differences in fitness between subclonal components of a population. To do this, we will attempt to isolate hundreds of individual biological subclones of a viral population through infectivity assays in an alternative host, where the virus produces local lesions. Finally, having thoroughly analyzed the empirical fitness landscapes, we will study the differences between viral genotypes at the level of molecular response in infected hosts. For this purpose, we will study the profiles of plants infected with seven viral genotypes, which will differ in their fitness. / Som conscients que hi ha clares diferències en l'organització del material hereditari en tots els organismes i que pot alterar-se en escales de temps relativament curtes. Ens referim a l'evolució de l'arquitectura del genoma i predir-la és particularment difícil, a causa de la falta de coneixement d'alguns dels seus principis fonamentals. Sí que posseïm informació sobre les taxes de mutació i recombinació, el paper de la deriva genètica o la distribució dels efectes de les mutacions. No obstant això, la informació sobre la topografia dels paisatges adaptatius continua sent escassa i no coneguem com pot condicionar l'evolució del virus. Els paisatges adaptatius són un concepte fonamental en biologia evolutiva que tracta de aclarir el nombre de vies mutacionals accessibles per a arribar als pics d'eficàcia (és a dir, solucions adaptatives). Durant molt de temps, els paisatges van ser només construccions teòriques, però ara poden caracteritzar-se les propietats dels paisatges empírics gràcies a l'aportació d'informació precisa dels distints genotips. En relació a la dita aportació, un dels paràmetres més importants és l'eficàcia viral, que s'ha convertit en un càlcul estàndard en virologia i és essencial per a avaluar el potencial evolutiu d'un genotip. Bàsicament, definix l'avantatge (o desavantatge) d'un genotip respecte a un de referència. Generalment, les poblacions de virus es componen d'una mescla de genotips l'abundància dels quals en la població depén de les diferències d'eficàcia, les interaccions entre genotips i la deriva genètica. Però, quants pics d'eficàcia pot posseir un paisatge adaptatiu? Serien els mateixos en altres condicions ambientals? És equitativa la contribució de l'adaptació, la història i l'atzar en el procés evolutiu? Fins a quin punt són rellevants les interaccions epistàtiques per a determinar la rugositat del paisatge adaptatiu? I la regulació dels gens de l'hoste durant la infecció? Podem identificar els gens de l'hoste l'expressió dels quals depén de l'eficàcia viral? Pertanyen a la mateixa classe funcional? Per a contestar a aquestes i moltes altres preguntes, hem dividit els resultats d'esta tesi en quatre capítols. La primera part tractarà de mostrar com es mouen les poblacions virals en un paisatge d'eficàcia rugós i si ho fan eficientment. També s'avaluarà si poden escapar de la conca d'atracció d'un pic d'eficàcia òptima local. Per a aixó, partint d'un conjunt de virus que se situen a distintes distàncies de l'òptim, observarem si l'evolució recompensa mantindre's en l'òptim local o, al contrari, premia l'exploració de regions distants del paisatge. En tot cas, determinarem la contribució de l'adaptació, la contingència històrica i esdeveniments fortuïts. En la segona part compararem les topografies dels paisatges de dos hostes, original i alternatiu, a la cerca de similituds i diferències. Així, analitzarem si es produïxen guanys o pèrdues d'eficàcia en distintes condicions i observarem si destaca algun tipus d'interacció epistática. A més, sense oblidar-nos de totes les altres característiques que definixen un paisatge d'eficàcia, tractarem de realitzar un exercici de valoració global per a aclarir si són més importants els detalls macroscòpics del paisatge o els microscòpics. El propòsit del tercer capítol s'allunya del tema principal per a tractar d'avaluar in vivo les diferències d'eficàcia entre components subclonals d'una població. Per a fer-ho, tractarem d'aïllar centenars de subclons biològics individuals d'una població viral per mitjà d'assajos d'infectividad en un hoste alternatiu, en el que el virus objecte d'estudi produïx lesions locals. Finalment, després d'analitzar en profunditat els paisatges d'eficàcia, aprofundirem en l'estudi de les diferències entre genotips virals a nivell de la resposta molecular de l'hoste a la infecció. Per a tal objectiu, compararem els transcri / Cervera Benet, H. (2018). Epistasia multidimensional y la rugosidad de los paisajes adaptativos y factores del huésped que determinan la eficacia viral [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/98665 / TESIS

Os insetos são capazes de sobreviver em diversos ecossistemas do planeta e, mesmo estando constantemente expostos à ameaça de infecção microbiana, permanecem livres de infecções na maior parte do tempo. Essa capacidade de sobrevivência aliada à larga distribuição dos insetos em regiões totalmente diferentes tem estimulado a pesquisa de novos agentes terapêuticos nesta classe devido à descoberta de diversos componentes de mecanismos inespecíficos de combate à infecção, sendo possível sua aplicação no controle de diversas doenças. Todavia, apesar de um grande número de moléculas de defesa ter sido identificado a partir de vários insetos, pouca informação sobre suas aplicações está disponível. Desta forma, o presente trabalho elucida o perfil transcriptômico geral e dos genes de defesa do tegumento de Podalia orsilochus durante sua fase larval. Como consequência, os transcritos e os dados obtidos permitirão o auxílio em pesquisas posteriores, seja para comparação, citação, conhecimento biológico e das respostas de defesa ou das relações de filogenia do animal. / The insects are able to survive in diverse ecosystems on earth, and even being constantly exposed to the threat of microbial infections, remain free of infection for most of the time. This survivability combined with the wide distribution of insects in totally different regions has stimulated the search for new therapeutic agents in this class due to the discovery of several components of nonspecific mechanisms to fight infection, and possible implementation in the control of various diseases. However, despite a large number of defense molecules have been identified from various insects, little information is available on their applications. Thus, this paper elucidates the general transcriptomic profile and integument of defense gene Podalia orsilochus during their larval stage. As a result, the transcripts and the data obtained will aid in further research, to compare, reference, biological knowledge and defense or animal phylogeny relationships.

Diversos estudos elucidaram mecanismos envolvidos com a organogênese in vitro, porém pouco é conhecido a respeito da fase de aquisição de competência, fundamental para que a regeneração ocorra. Alguns genes já foram identificados por interferirem na fase de aquisição de competência em tomateiro (Solanum lycopersicum), mas ainda existem diversas lacunas a serem esclarecidas. Para investigar a expressão de genes e o controle hormonal na fase de aquisição de competência, foram utilizados os mutantes de tomateiro, sob o background genético da cultivar Micro-Tom (MT), MT-Rg1 e MT-pro (procera), os quais afetam positiva ou negativamente a organogênese in vitro, respectivamente. Embora a resposta constitutiva a giberelina no mutante MT-pro seja conhecida, a identidade molecular do gene RG1 permanece indefinida. O mutante MT-Rg1 apresenta aumento tanto na formação de gemas caulinares quanto de raízes e reduz o tempo necessário para a indução desses órgãos, devido à diminuição do período para a aquisição de competência. A partir do estabelecimento das fases de aquisição de competência e indução da organogênese in vitro para MT e MT-Rg1, foram identificados genes diferencialmente expressos entre estes genótipos. Entre estes genes, CELL DIVISION CYCLE ASSOCIATED 7 e LACCASE 1A estão regulados positivamente em MT-Rg1 e todos estão fortemente relacionados à fase de aquisição de competência, e a alterações na proliferação de células do protoxilema durante o início da organogênese. Por outro lado, a resposta constitutiva à giberelina no mutante MT-pro reduz a formação de gemas caulinares e raízes e aumenta a formação de calos in vitro, sem afetar o tempo requerido para a indução de gemas caulinares e raízes. De forma oposta a MT-Rg1, o gene CDCA7 apresenta expressão reduzida durante a fase de aquisição de competência em MT-pro, diminuindo o número de células do protoxilema em divisão. Outro fator importante para a divisão celular no mutante MT-pro é o aumento da expressão do gene WUS, causando um aumento da proliferação das stem cells, que são células indiferenciadas relacionadas à formação de novos órgãos. Esta proliferação celular inadequada, somada a uma alteração desfavorável na homeostase das citocininas, justifica o efeito negativo do alelo pro na formação de gemas caulinares, o que permitiu a criação de um novo modelo para organogênese in vitro / Several studies have enabled the discovery of mechanisms to achieve in vitro organogenesis; however, little is known about the phase of acquisition of competence, essential for regeneration. A few genes have been identified to interfere in the acquisition of the competence phase in tomato (Solanum lycopersicum), but there are still many gaps to be filled. We have used the mutants, under the genetic background of the Micro-Tom cultivar, MT-Rg1 and MT-pro (procera), which positively or negatively affect in vitro organogenesis, respectively, to investigate gene expression and the hormonal control in the phase of acquisition of competence. Despite the fact that the constitutive gibberellin response in the procera mutant is well-established, the molecular identity of RG1 gene remains unknown. The MT-Rg1 mutant presents an increase in the formation of both shoot and roots and a reduced period for the induction of these organs, because of the reduced time required for acquisition of competence.We searched for the identity of differentially expressed genes between MT and MT-Rg1 after the establishment of the competence acquisition phase and organogenesis induction stages. Among those genes, CDCA7 and LAC1A are upregulated in MT-Rg1 and these genes appear to be strongly related with the acquisition of competence phase and changes in proliferation of protoxylem cells during early organogenesis. The constitutive response to gibberellin in the MT-pro mutant decreases the formation of shoot and roots and increase in vitro calli formation, without reducing the induction phase of shoots and roots. Unlike MT-Rg1, MT-pro reduces the CDCA7L expression during the acquisition of competence phase, causing a reduction of the protoxylem dividing cells. Another important factor for cell division in MT-pro mutant is the increased expression of the WUS gene, leading to an abnormal proliferation of stem cells. Thereby, this abnormal cell proliferation, in addition to an unfavorable change in the cytokinin homeostasis, justify the negative effect of the pro allele in the shoot formation, which enabled the proposal of a new model for in vitro organogenesis

Bibliotecas de produtos naturais são fontes de moléculas com ações farmacológicas, com diversas aplicações biotecnológicas. Estes compostos apresentam alta especificidade para o alvo, resultante de longo processo de seleção natural, sendo interessantes como ferramentas de estudo e princípios ativos. Porém, apesar da riqueza de estruturas presentes em tais secreções, as dificuldades em obter moléculas puras em grandes quantidades, o alto custo e o tempo de purificação, tornam-se barreiras para seu uso. Assim, cada vez mais, as técnicas ômicas são usadas como uma alternativa para produção destas toxinas obtidas em maior escala. A transcriptômica, técnica que consiste na produção de biblioteca de cDNA a partir do RNA obtido da de organismo, tecido ou célula de interesse, é altamente relevante, já que identifica o material proteico que é realmente transcrito a partir do RNA obtido em determinado tempo e situação. Sapos ainda são animais pouco estudados, quando comparados a outros animais peçonhentos e venenosos, e um dos fatores responsáveis por isso é o baixo rendimento na purificação de toxinas de seu veneno. A fim de se identificar componentes presentes nas secreções do sapo R. schneideri, foi, primeiramente, realizada extração de RNA poli A+ das secreções recém obtidas das glândulas mucosas e das secreções armazenadas por 2 anos no laboratório. A secreção armazenada há dois anos revelou qualidade e quantidade mais apropriadas para o estudo e foi, portanto, usada como material de partida para a construção do transcriptoma por metodologia tradicional. Este transcriptoma resultou em 6 clones com boa qualidade, sendo que um deles, Rs02, apresentou similaridade com a região do pró peptídeo da odorranaina. Uma vez que este transcriptoma não revelou resultados satisfatórios devido à sua baixa eficiência e visando maximizar o conhecimento sobre a secreção, um novo transcriptoma foi construído usando sequenciamento de nova geração, com sequenciador Illumina e RNA total extraído do tegumento contendo glândulas mucosas de um espécime como material de partida. O novo transcriptoma resultou em aproximadamente 131 milhões de reads brutos. Os reads foram filtrados de modo que apenas aqueles com boa qualidade (Q>20) fossem submetidos à montagem de novo. Esta etapa resultou em aproximadamente 130 milhões de reads, com média de 68 pb. Os reads foram então agrupados em contigs usando o programa SOAPdenovo2-Trans e submetidos a diversas abordagens de anotação funcional. Foram encontrados cDNAs codificantes de diversos peptídeos e proteínas com potencial aplicação biotecnológica. Além da abordagem ômica, ensaios de caracterização bioquímica, como atividade enzimática, cromatografia e eletroforese, auxiliaram a detecção de protease sem relatos prévios em secreções de sapo, uma fosfolipase A2, bem como lectina e galectina. Adicionalmente, através do transcriptoma foram identificadas cobatoxinas, mucinas e ficolinas. Portanto, este trabalho foi pioneiro no entendimento molecular do veneno da glândula mucosa de R. schneideri por métodos de vanguarda e análises bioquímicas. / Natural products libraries are known as medicine molecules sources once these molecules have a high target specificity inherited from the long natural evolutionary process. Thereby, animal, plant and microorganisms\' secretions are very important to biotechnological applications. However, despite the large number of molecules that can be found in these secretions, the difficulty on obtainment enough purification yield, high cost and long purification time, besides the small secretion amount provided by the studied organism, are factors that make this kind of study even harsher. These are the reasons why omic studies are becoming an alternative to produce these toxins in a larger scale, which allow new researches. Transcriptome is a technique that consists on the production of cDNA libraries from the secretion or gland RNA, using the transcriptase reverse enzyme, which results in a holistic poison understanding. Toads are animals that are still not widely studied, if we compare them with other venomous animals, mainly because of the insufficient purification yield. Thus, the mucous gland transcriptome from Rhinella schneideri poison, a toad that is widely found in Brazilian territory, has a great relevance on the elucidation and possibility to use several kind of molecules, especially because this gland produces unknown molecules. Thereof, aiming to unravel this poison molecules, we first compared the RNA yield from fresh and two years stored mucous gland secretion. The stored secretion has shown more suitable RNA, which was used to construct a Sanger sequencing transcriptome. It resulted in 6 clones and one of them had a good hit with odorranain pro-peptide region. In order to increase the knowledge about the secretion, we turned to Next Generation Sequencing transcriptome using Illumina technologies and one specimen integument as raw material. The new transcriptome resulted in approximately 131 million raw reads. These reads were filtered so that only those with good quality (Q>20) were used to perform the assembling. The latter step resulted in approximately 130 million reads with 68 bp average length. The reads were grouped into contigs using the assembler. Then, the resulting contigs were submitted to different functional annotation approaches. We unraveled cDNAs encoding peptides and protein with biotechnological application. Besides the omic approach, assays for biochemical characterization including chromatography, electrophoresis and proteolytic assays complemented the identification of a protease for the first time in toad secretions, phospholipase A2, as much as lectins and galectins. Thus, the transcriptome also allowed the identification of cobatoxins, mucins and ficolins. Therefore, this is the first work about the molecular composition of Rhinella schneideri mucous gland poison through avant-garde methodology and biochemical anaylsis.

Orientador: Edvaldo Aparecido Amaral da Silva / Coorientador: Olivier Leprince / Banca : Henk W.M Hilhorst / Banca: José Márcio Rocha Faria / Banca: Julia Buitink / Banca: Olivier H.L.Leprince / Resumo: Soja é uma das mais culturas oleaginosas usadas para alimentação animal e humana bem como para uma larga aplicação industrial. Dada a sua capacidade de fixar nitrogênio atmsférico, é fundamental para o desenvolvimento de uma agricultura sustentável. Produzir sementes altamente vigorosas é a chave para aumentar a eficiência da produção da cultura. Longevidade de semente é a capacidade de sobreviver no estado seco por períodos prolongados e representa uma importante característica de qualidade da semente. Nesta pesquisa o objetivo foi obter insights sobre processos moleculares que regulam a aquisição de longevidade em sementes de soja. Com o sequenciamento de nova geração da Illumina, o RNA foi sequenciado a partir de sete estágios diferentes durante a aquisição de longevidade, gerando entre 14 e 38 milhões de reads. Estes reads foram alinhados com os modelos de genes de Glycine max Wm82.a2.v1 preditos no genoma de soja. Transcritos diferencialmente expressos (DET) foram correlacionados com o aumento da longevidade. Análise de enriquecimento da ontologia do gene daqueles DET revelaram uma siginificante sobre representação de termos associados com resposta a estresse e processamento e modificação de RNA. Processo biológico fotossíntese foi relacionado à baixa longevidade. Heat Shock Factors (HSF) e vários fatores de transcrição associados com resposta a estresse biótico (WRKY e NFXL1) são genes candidatos com possíveis papéis na longevidade de semente e merecem uma caracterizaçã... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Soybean is one of the most important oil crop species used for food and feed as well as a range of industrial applications. However, producing highly vigorous seeds is a key lever to increase crop production efficiency. Low physiological seed quality, which is more prone to occur under tropical environment, leads to poor stand establishment and decreased in yields. Seed longevity is the ability to survive the dry state for prolonged periods of time and represents an important trait for seed quality. Here, the objective was to obtain insights into the mechanisms regulating the progressive acquisition of longevity. Using Illumina high-throughput sequencing, RNA was sequenced from seven different stages during the acquisition of longevity, generating between 14 and 38 million of reads. These reads were aligned to the Glycine max Wm82.a2.v1 gene model. Differentially expressed transcripts (DET) were correlated with the increase in seed longevity. Transcriptome and GO enrichment analyses of these DET revealed a significant over-representation of terms associated with response to stress and RNA processing and modification. Photosynthesis biological process was related to low seed longevity. HSF and several TF associated with biotic defense (WRKY3 and NLFX1) are candidate genes whose putative role in seed longevity deserve further characterization. We also performed the determination of the content of non-reducing soluble sugars, and we observed that the accumulation of non-reducin... (Complete abstract click electronic access below) / Résumé: Le soja est l'une des plus importantes espèces de cultures d'huile utilisée aussi bien en nourriture que dans diverses gammes d'applications industrielles. C'est pourquoi produire des graines vigoureuses est un levier essentiel pour augmenter efficacement de la production de la récolte. La qualité de graine physiologiquement faible, qui est plus à même de se produire sous un environnement tropical, mène à un pauvre établissement des plantes ainsi qu'à une diminution du rendement. La longévité d'une graine est la capacité de celle-ci à survivre à la sécheresse durant de longues périodes et représente une caractéristique importante sur la qualité d'une graine. Ici, l'objectif était d'obtenir une idée sur les mécanismes en régulant l'acquisition progressive de la longévité. En utilisant le séquençage à haut-débit, ARN a été séquencé en sept différentes étapes durant l'acquisition de longévité, générant entre 14 et 38 millions de reads. Ces reads ont été alignés sur les modeles de gene de Glycine max Wm82.a2.v1. Les transcripts différentiellement exprimés (DET) sont corrélée avec l'augmentation de la longévité de la graine. L'analise d'enrichissement via GO de ces DET ont révélé une importante surreprésentation des termes associés à la réponse au stress et traitement et modification de l'ARN. Le processu biologique Photosynthèse était liée à une faible longévité des semences. HSF (heat shock factor) et plusieurs facteurs de transcription associés à la défense biotique (WRKY 3 et ... (Résumé complet accès életronique ci-dessous) / Doutor

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O objetivo desta dissertação foi estudar o transcriptoma de uma cultivar brasileira de arroz caracterizada como tolerante ao excesso de ferro (BRS Querência). Para isso, as plantas foram submetida à condição de estresse (300 mg L-1 Fe+2) no estádio V3 por 24 horas, o RNA das folhas foram extraídos e sequenciados pelo tecnologia de RNA-Seq. Tal estudo foi dividido nos seguintes capítulos: I) Lidando com o metabolismo de ferro no arroz: a partir do melhoramento visando a tolerância ao estresse até a biofortificação (Artigo de revisão submetido à revista Genetics and Molecular Biology); II) Perfil transcricional do amplo-genoma de arroz revela novos genes envolvidos na tolerância ao excesso de ferro (Artigo com provável submissão à revista The Plant Genome); III) Resposta ao estresse de plantas: o papel de splicing alternativo (Artigo com provável submissão à revista Genome); IV) A busca por arroz mais tolerante: como altas concentrações de ferro afetam o splicing alternativo? (Artigo aceito na revista Transcriptomics: Open Access). O estudo possibilitou a identificação de vários genes diferencialmente expressos, dentre esses pode-se destacar a ativação de genes que codificam para as proteínas responsáveis pela homeostase de ferro (transporte e armazenagem), para as proteínas de choque térmico e as proteínas do fotossistema II. Além disso, temos em destaque a repressão dos genes que codificam proteínas do metabolismo hormonal e de sinalização. A análise do splicing alternativo proporcionou a identificação da mudança do perfil de splicing na célula sobre a condição de estresse, tendo uma redução tanto da quantidade dos sítios de junção quanto do número de eventos. Os resultados obtidos representam um importante passo para o entendimento das estratégias de tolerância desempenhada por esta cultivar, auxiliando na identificação de possíveis genes alvos para serem utilizados pelos programas de melhoramento genético. / Iron (Fe) is an essential nutrient for the growth and development of plants. However, the availability of this element varies due to ground conditions and cropping system. Either the excessive absorption or the deficiency of this element may cause toxicity in plants leading to a loss of the productivity. In Rio Grande do Sul, problems from the excess of iron have been reported, and the use of tolerant cultivars becomes an important strategy to address this issue. Thus, the more information regarding the mechanisms that confer this tolerance in plants is known, the easier their application in breeding programs becomes. The aim of this work was to study the transcriptome of a Brazilian rice cultivar characterized as tolerant to excess of iron (BRS Querência). For this, the plants were submitted to stress conditions (300 mg L-1 Fe+2) in the V3 stage for 24 hours, the RNA of the leaves was extracted and sequenced by RNA-Seq technology. Such a study was divided into the following chapters: I) Dealing with iron metabolism in rice: from breeding aiming at stress tolerance to biofortification (Review article submitted to the Genetics and Molecular Biology); II) Genome-wide transcriptional profile of rice reveals new genes involved in tolerance to iron (Article probable submission to the The Plant Genome); III) Stress response of plants: the role of alternative splicing (Review article probable submission to the Genome); IV) The search for more tolerant rice: how high concentrations of iron affect the alternative splicing? (Article accepted by Transcriptomics: Open Access). The study enabled the identification of several differentially expressed genes. Among these, we highlight the activation of genes encoding proteins responsible for iron homeostasis (transport and storage) the heat shock proteins and proteins of photosystem II. Furthermore, we have highlighted the repression of genes encoding the hormone metabolism and signaling proteins. The alternative splicing analysis provided the identification of a profile change in the cell on stress condition, having reduction in the quantity of the junction sites as well as in the number of events. The results represent an important step in the understanding of tolerance strategies performed by this cultivar, assisting in the identification of potential target genes for use by breeding programs.