O objetivo do trabalho foi estudar uma forma alternativa para o controle do endurecimento dos frutos do maracujazeiro, pela produção de plantas transgênicas contendo o gene da proteína capsidial do Passionfruit woodness virus - PWV. O vetor de expressão foi construído utilizando-se os plasmídeos pCambia 2300 e pCambia 2301, que contêm o gene de seleção nptII, para resistência ao antibiótico canamicina. O plasmídeo pCambia 2301 contém também o gene repórter uidA (GUS). Os plasmídeos foram introduzidos em Agrobacterium tumefaciens, estirpes EHA 105 e LBA 4404, pelo método do choque térmico. Os explantes para transformação genética constituíram-se de discos de folhas jovens (6 mm de diâmetro), das variedades IAC 275 e IAC 277, coletados de plantas mantidas em sob fotoperíodo de 16 h luz, a 27 °C. Os explantes foram inoculados com suspensão bacteriana (5x108 UFC/mL) por 20 min e transferidos para placa de Petri contendo o meio de cultura MS + thidiazuron (TDZ - 0,25 mg/L) + nitrato de prata (AgNO3 - 4 mg/L) + acetoseringona (1 µM/L). O co-cultivo foi realizado à temperatura de 24 °C, em ausência de luz, por um período de 3 dias. Para seleção e regeneração de plantas os explantes foram transferidos para meio de cultura de seleção MS + TDZ (0,25 mg/L) + AgNO3 (4 mg/L) + canamicina (100 mg/L) + cefotaxime (500 mg/L). A incubação foi realizada a 27 °C, em ausência de luz, por um período de 4 - 6 semanas. As gemas adventícias desenvolvidas foram transferidas para o meio de cultura MSM + 10% de água de coco e incubadas sob fotoperíodo de 16 h de luz. A transformação genética foi identificada pelo teste histoquímico GUS e por PCR. Obteve-se um total de 22 plantas PCR positivas. Destas, 8 foram analisadas por Southern blot para confirmação da integração do transgene. A transcrição e expressão do transgene foram analisadas por Northern e Western blot, respectivamente. As plantas transgênicas avaliadas foram multiplicadas e inoculadas com 3 diferentes estirpes do PWV. A linhagem T2 apresentou resistência a infecção dos três isolados utilizados. / The main purpose of this work was to study an alternative way to control the Passionfruit woodiness virus - PWV through the production of transgenic plants which contained the Passionfruit woodness virus coat protein gene. The binary vector was built by using pCambia 2300 and pCambia 2301 plasmids, which contain the selection gene nptII. The pCambia 2301 plasmid also contains the reporter gene uidA (GUS). The plasmids were introduced into Agrobacterium tumefaciens, EHA 105 and LBA 4404 strains, via thermal shock method. The explants for the genetic transformation were young leaf disks (6 mm of diameter) of IAC 275 and IAC 277 varietys, extracted from plants kept under 16 h photoperiod, at 27 °C. The explants were inoculated with a bacterial suspension (5x108 UFC/mL) for 20 min and then transferred to Petri dishes containing cocolture medium MS + thidiazuron (TDZ - 0,25 mg/L) + silver nitrate (AgNO3 - 4 mg/L) + acetosyringone (1 µM/L). The co-culture was performed at 24 °C t, in the dark, for a three-day period. For the selection and regeneration of plants, the explants were transferred to the selection culture medium MS + TDZ (0,25 mg/L) + AgNO3 (4 mg/L) + kanamycin (100 mg/L) + cefotaxime (500 mg/L). The incubation was performed at 27 °C, in dark, for 4 - 6 weeks. The adventitious buds developed were then transferred to the culture medium MSM + 10% coconut water and kept incubated under 16 h photoperiod. The genetic transformation was identified through GUS and PCR tests. There were 22 PCR positive plants. Out of those, 8 were Southern blot analyzed for the confirmation of transgenc integration. The transgene transcription and expression were determined by Northern and Western blot respectively. The transgenic plants were then multiplied and inoculated with 3 different strains of PWV, and the line 2 showed resistance to the three strains used.

O trabalho teve como objetivo otimizar a metodologia de transformação de plantas de Eucalyptus grandis; uma importante espécie florestal amplamente cultivada no Brasil. Foram estudadas a transformação por agrobiobalística de explantes com acúmulo de gemas axilares e do SAAT ('sonication-assisted Agrobacterium mediated transformation'). Ambas as técnicas causam microferimentos nos explantes aumentando a penetração da Agrobacterium nos tecidos vegetais. Na agrobiobalística o explante é submetido ao bombardeamento com micropartículas seguida por inoculação com a bactéria; enquanto que no SAAT o explante é submetido à sonicação por breves períodos de tempo na presença da bactéria. Os experimentos de transformação foram avaliados pela analise da expressão transitória do gene repórter uidA. Os parâmetros estudados na transformação por agrobiobalística foram: pressão de disparo ( pressão do gás hélio), distância de vôo das micropartículas, estabilidade da expressão do gene uidA e temperatura de co-cultivo. As freqüências mais elevadas da expressão da ß-glucuronidase foram observadas utilizando 1350 PSI de gás hélio, 9,5 cm de distância de vôo dos microprojéteis e temperatura de 26ºC durante o co-cultivo. Para otimizar a transformação de explantes com acúmulo de gemas axilares foi realizado um estudo histológico, o qual permitiu constatar que as áreas meristemáticas estão localizadas na superfície do explante. O meristema é formado pela rediferenciação de células da epiderme e das primeiras camadas do parênquima cortical caracterizando sua origem exógena. A localização histológica do produto da expressão do gene repórter uidA mostrou que esta expressão ocorre apenas em células já diferenciadas, não sendo encontrada durante os tratamentos com células meristemáticas. Para realizar os ensaios com SAAT foi selecionado previamente um clone com características favoráveis à transformação: alta taxa de regeneração, susceptibilidade a agentes seletivos e à transformação por Agrobacterium. A maior taxa de plantas que apresentaram atividade da ß-glucuronidase foram observadas utilizando-se 60 segundos de sonicação; tempos superiores a este causaram um comprometimento da regeneração do explante. A sonicação adicional, após a sonicação preliminar do explante, juntamente com a bactéria, melhora a eficiência do processo de transformação. Os resultados demonstram que o uso de SAAT é viável na transformação de eucalipto com Agrobacterium. / The research project aimed the establishment of a method for genetic transformation of Eucalyptus grandis; an important and widely planted forestry tree in Brazil. Two techniques of transformation were tested: agrobiolistic of explants with accumulation of meristematic cells and SAAT ('sonication-assisted Agrobacterium mediated transformation'). Both systems of transformation aim to produce micro wounds in the explants in order to increase the Agrobacterium penetration in the tissues. In the case of agrolistica the explant was previously submitted to micro projectile bombardment, followed by bacteria inoculation. On the other hand in the SAAT technique the explante is submitted to short periods (few seconds) of sonication together with the bacteria. Transformation was evaluated by measuring the expression of the reporter gene uidA which codes the ß-glucuronidase enzyme. Several parameters were tested for agrobiolistic such as, gas pressure (helium), flight distance of micro projectiles, gene expression of the uidA, co-cultivation temperature. The highest values of ß-glucuronidase were observed for 1350 PSI, 9.5 cm from target and 26O C for co-cultivation. A histological analyze was carried out to check it the meristematic tissues were being transformed. The results showed that the meristematic tissues were localized in the surface of the explante. The meristem is formed by the dedifferentiation of epidermal cells and the first layers of the cortical parenchyma indicating its exogenous origin. The histological location of the reporter gene uidA showed that the expression occurs only in cells already differentiated, and not in meristematic cells. For SAAT experiments a clone was previously selected for favorable characteristic of transformation: high rate of regeneration, susceptibility of selective agents and to Agrobacterium transformation. The highest rate of ß-glucuronidase activity were observed for 60 s of sonication; higher sonication time reduced the efficiency of regeneration. Additional sonication, following a preliminary sonication of explante , in the presence of the bacteria, improved the efficiency of transformation. The results provided evidence the SAAT is a viable technique for Eucalyptus transformation via Agrobacterium.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-06-29T11:33:08Z No. of bitstreams: 1 nataliadosanjospinto.pdf: 1701558 bytes, checksum: a1c89a03566132430636ade1b70b0e04 (MD5) / Approved for entry into archive by Diamantino Mayra (mayra.diamantino@ufjf.edu.br) on 2016-07-05T14:36:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 nataliadosanjospinto.pdf: 1701558 bytes, checksum: a1c89a03566132430636ade1b70b0e04 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-05T14:36:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 nataliadosanjospinto.pdf: 1701558 bytes, checksum: a1c89a03566132430636ade1b70b0e04 (MD5) Previous issue date: 2012-08-31 / O morango é produzido e consumido nas mais variadas regiões do mundo, sendo a espécie do grupo de pequenos frutos de maior apreciação e grande retorno econômico. Um dos principais problemas na cultura do morangueiro é a incidência de doenças, que podem aparecer em várias fases do ciclo da cultura, atacando desde as mudas recém plantadas até os frutos na fase final de produção. Devido a susceptibilidade às doenças e pragas, o uso de pesticidas é usual no cultivo de morangos. Nesse sentido, o uso de variedades resistentes a fungos e bactérias pode ser uma importante alternativa visando a melhoria da qualidade dos frutos e um menor custo de produção dos mesmos, uma vez que os consumidores exigem cada vez mais, frutos com menor nível residual de agrotóxicos. No presente estudo, plantas de Nicotiana tabacum foram transformadas com os genes OxDc de Flammulina velutipes e Pg-AMP1 de Psidium guajava com o objetivo de avaliar os efeitos da enzima Oxalato Descarboxilase, produzida pelo gene OxDc, na resistência das plantas a fatores que induzem a morte celular de tecidos infectados pelo fungo Fusarium oxysporum, assim como os efeitos in vitro do extrato bruto contendo o peptídeo Pg-AMP1 extraído das folhas de tabaco contra a bactéria Gram-negativa Xanthomonas fragarie. Experimentos de transformação genética mediada por Agrobacterium permitiram a obtenção de 8 linhagens transgênicas de N. tabacum OxDc e 7 linhagens transgênicas de N. tabacum Pg-AMP1, representando eventos de transformação distintos. As plantas foram caracterizadas molecular e bioquimicamente a fim de se confirmar a inserção, expressão e funcionalidade dos genes inseridos nas linhagens obtidas tanto para o gene OxDc quanto para o Pg-AMP1. Os testes de resistência ao ácido oxálico mostraram danos menos severos nas linhagens transformadas de X tabaco OxDc do que nas plantas não transformadas. No que se refere à resistência das folhas ao ataque pelo fungo Fusarium Oxysporum, o gene OxDc também se mostrou capaz de conferir resistência às linhagens transgênicas. Através da técnica de Western blot, foi possível detectar a presença do peptídeo Pg-AMP1 no extrato bruto extraído das folhas transformadas de tabaco Pg-AMP1. O bioensaio realizado in vitro utilizando-se o extrato bruto contendo o peptídeo Pg-AMP1 demonstrou a ação bactericida desse peptídeo contra a bactéria fitopatogênica Xanthomonas Fragarie. Em conjunto os resultados indicam a viabilidade da utilização dos genes OxDc e Pg-AMP1 transformação genética de morangueiro visando à redução nos danos causados por fitopatógenos que acometem suas lavouras, assim como a redução no uso de pesticidas. / The strawberry is produced and consumed in a variety of regions in the world, being the group of small fruits’ species of greater appreciation and high economic returns. A major problem in strawberry culture is the disease incidence that can appear in several stages of the cycle, attacking from the newly planted seeding to the fruit in the final stage of production. Due to this susceptibility to diseases and pests, the pesticide use is common in strawberries cultivation. Regarding this, the use of varieties resistant to fungi and bacteria may be a good alternative in order to improve fruit quality and to lower production cost, since consumers are increasingly demanding fruits with a lower level of pesticides. In the present study, Nicotiana tabacum plants were transformed with Flammulina velutipes OxDc gene and Psidium guajava Pg-AMP1 aiming to evaluate the effect of the enzyme Oxalate Decarboxylase produced by the gene OxDc in plant resistance to factors that induce cell death in tissues infected by the fungus Fusarium oxysporum, and the effect of raw extract containing the Pg-AMP1 peptide extracted from tobacco leaves against gram-negative bacterium Xanthomonas fragarie in vitro. Genetic transformation Agrobacterium-mediated experiments allowed the production of 8 transgenic lines N. tabacum OxDc and 7 transgenic lines of N. tabacum Pg-AMP1, representing different transformation events. The plants were biochemically and molecular characterized to confirm the integration, expression and function of the genes inserted in the lines obtained both for the gene OxDc and Pg-AMP1. Tests for resistance to 20 mM oxalic acid had less severe symptoms in OxDc transformed tobacco lines than the non-transformed plants. Concerning the strength of the leaves against Fusarium oxysporum attack, OxDc gene has also shown to confer resistance to the transgenic lines. It was possible to detect the presence of Pg-AMP1 peptide in the raw extract from Pg-AMP1 tobacco leaves through Western blot. Thus, the in vitro bioassay carried out using the raw extract containing the Pg-AMP1 peptide showed bactericidal activity against the phyto-pathogenic bacteria Xanthomonas Fragarie. Together these results XII determine the viability of OxDc and Pg-AMP1 genes in the use of strawberry genetic transformation aiming the reduction in the damage caused by pathogens that attack the crop.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-06-22T12:13:15Z No. of bitstreams: 1 daniellelucianaaurorasoaresdoamaral.pdf: 933775 bytes, checksum: ab2892397c2895f9047b1f683dec1351 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-08-07T19:20:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 daniellelucianaaurorasoaresdoamaral.pdf: 933775 bytes, checksum: ab2892397c2895f9047b1f683dec1351 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-07T19:20:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 daniellelucianaaurorasoaresdoamaral.pdf: 933775 bytes, checksum: ab2892397c2895f9047b1f683dec1351 (MD5) Previous issue date: 2014-03-07 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Desde a domesticação das plantas para a utilização humana, as doenças vêm causando grandes perdas na produção. Fungos fitopatogênicos tais como Sclerotium rolfsii, Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum e Sclerotinia sclerotiorum são capazes de infectar diferentes espécies de plantas. A infecção por estes fungos leva a perdas consideráveis na época da colheita. A fase inicial da infecção envolve a produção e o acúmulo de grande quantidade de ácido oxálico (AO), que parece ser um dos maiores determinantes da patogenicidade. Fusarium oxysporum é a espécie mais comum do gênero e causa murcha vascular em diferentes espécies de plantas. Esse fungo causa perdas severas em muitas lavouras, como algodão, fumo, banana, café, morango e cana de açúcar. Genes que conferem resistência a fitopatógenos tornam-se de importância agronômica como recursos para melhoramento. Dentre esses, destacamos o da enzima oxalato descarboxilase (OXDC), capaz de catalizar a degradação do AO em ácido fórmico e dióxido de carbono, diminuindo a capacidade de infecção do fungo. Na geração T0 de fumo transformado com gene da OXDC, foram obtidas quatro linhagens resistentes ao fungo, estas foram analisadas na T1. O objetivo deste trabalho foi avaliar a segregação do transgene OXDC para a geração T1 de fumo e avaliar se a geração T1 de plantas transformadas é capaz de resistir ao fitopatógeno Fusarium oxysporum. Trinta plantas de cada linhagem T1 de fumo transformado com OXDC foram avaliadas, por PCR, quanto a presença do HPTII. Estas quatro linhagens foram analisadas apresentaram proporção de segregação de 3:1. Uma planta PCR positiva de cada linhagem foi submetida a bioensaios para verificar a resistência ao fungo e ao AO. No ensaio de resistência ao fungo Fusarium oxysporum, este não foi capaz de infectar as linhagens transgênicas, mostrando um aumento da resistência da T1 em relação a T0 quando os resultados foram comparados. Os níveis de expressão do transgene foram avaliados por RT-PCR. As linhagens T1, T4 e T6 mostraram níveis de expressão semelhantes, já a linhagem T2 apresentou menor nível de expressão que as demais linhagens, de maneira que este resultado pode ser correlacionado com menor resistência ao AO. Com base nestes resultados pode-se concluir que a enzima Oxalato Descarboxilase demonstrou ser eficiente no combate ao patógeno Fusarium oxysporum e potencialmente eficiente no combate a outros fungos que também utilizem AO no processo de infecção. / Since the domestication of plants for human use, the diseases are causing major production losses. Pathogenic fungi such as Sclerotium rolfsii, Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum and Fusarium oxysporum are capable of infecting various plant species. Infection by these fungi leads to considerable losses at harvest. The initial phase of the infection involves the production and accumulation of large amounts of oxalic acid (OA), which seems to be one of the biggest determinants of pathogenicity. Fusarium oxysporum is the most common species of the genus and causes vascular wilt in different plant species. This fungus causes severe losses in many crops such as cotton, tobacco, bananas, coffee, strawberry and sugar cane. Genes that confer resistance to pathogens become of agronomic importance as resources for improvement. Among these we highlight the enzyme oxalate decarboxylase (OXDC) capable of catalyzing the degradation of OA in formic acid and carbon dioxide, decreasing the infectivity of the fungus. In the T0 generation of tobacco transformed with OXDC gene four resistant fungal strains were obtained, they were analyzed in T1. The objective of this study was to evaluate the segregation of the transgene OXDC for T1 generation of smoke and assess whether the T1 generation of transformed plants are able to resist the pathogen Fusarium oxysporum. Thirty T1 plants of each line of tobacco transformed with OXDC were evaluated by PCR for the presence of HPTII. These four strains were analyzed showed a segregation ratio of 3:1. A positive PCR plant of each strain was subjected to bioassays to verify resistance to the fungus and the OA. In the test of resistance to the fungus Fusarium oxysporum, this was not able to infect the transgenic lines , showing an increase of the resistance of T1 relative to T0 when the results were compared. The levels of transgene expression were assessed by RT-PCR. T1, T4 and T6 strains showed similar levels of expression, the T2 strain showed lower expression level than other strains , so that this result can be correlated with lower resistance to OA. Based on these results it can be concluded that the enzyme Oxalate Descarboxylase demonstrated to be effective in combating the pathogen Fusarium oxysporum and potentially efficient against other fungi which also use OA in the infection process.

A transformação genética está se tornando uma importante ferramenta, dentro dos programas de melhoramento genético de citros, e uma alternativa para contornar barreiras naturais da espécie, que dificultam o desenvolvimento de novas variedades pelo melhoramento convencional. Entretanto, os protocolos utilizados para transformação genética de citros têm resultado num baixo número de plantas transgênicas. Com o objetivo de estudar fatores que possam influenciar o processo de transformação genética de citros via Agrobacterium tumefaciens analisou-se o efeito do uso de acetoseringona em diferentes etapas do processo, as condições de incubação dos explantes durante e após o período de co-cultivo e o tipo de corte do explante. Foram utilizados segmentos de epicótilo de plântulas germinadas in vitro da variedade de laranja doce ‘Hamlin’ (Citrus sinensis L. Osbeck.) e da variedade citrange ‘Carrizo’ (C. sinensis x Poncirus trifoliata Raf.), inoculados com a estirpe EHA 105 de A. tumefaciens, contendo o plasmídeo p35SGUSINT, com o gene de seleção que codifica a enzima neomicina fosfotransferase II (nptII) e o gene repórter uidA que codifica a enzima b-glucuronidase (gus). O protocolo básico para transformação genética foi com a inoculação dos explantes por 20 minutos, com o período de co-cultivo de 3 dias em me io de cultura suplementado com acetoseringona (100 mM) e transferidos para meio de cultura de seleção, constituído de meio de cultura EME, suplementado com BAP (1mg L -1 ), canamicina (100 mg L -1 ) e cefotaxime (500 mg L -1 ). As avaliações foram realizadas após 5-6 semanas de incubação, determinando-se o número de explantes com gemas adventícias, o número de gemas adventícias gus + e calculando-se a eficiência de transformação genética, definida pela relação entre o número de gemas gus + regeneradas e o número de explantes inoculados. Pelos resultados obtidos pôde-se observar uma maior eficiência de transformação genética para a variedade citrange ‘Carrizo’; e que a eficiência da transformação genética aumentou, principalmente para a variedade de laranja doce 'Hamlin', quando a incubação do material durante o período de co-cultivo foi feita sob temperaturas inferiores a 27 °C. A suplementação do meio de cultura de co-cultivo com acetoseringona depende do pH deste meio de cultura. A utilização de explantes seccionados longitudinalmente não se mostrou favorável devido ao crescimento excessivo da bactéria na superfície do explante. / Genetic transformation is an important biotechnological tool in citrus genetic breeding programs, and an alternative to overcome natural barriers to the development of new varieties, by conventional breeding. However, the protocols used for citrus genetic transformation have resulted in a low number of transgenic plants. Therefore, this research evaluated some factors that might influence citrus genetic transformation process via Agrobacterium tumefaciens, such as: the addition of acetosyringone in different steps of the process, the explant incubation conditions during and after the period of co-cultivation, and the explant type cut. Epicotyl segments from seedlings of 'Hamlin' sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck) and ‘Carrizo’ citrange (C. sinensis L. Osbeck x Poncirus trifoliata Raf.) were inoculated with EHA 105 strain of A. tumefaciens harboring the binary plasmid p35SGUSINT containing the selection gene for neomicyn phosphotransferase II (nptII) and the reporter gene uidA for b-glucuronidase (GUS). The basic protocol for genetic transformation included the explant inoculation for 20 minutes, and 3 days of co-cultivation in the culture medium supplemented with acetosyringone (100 mM). The epicotyl segments were transferred to selection culture medium, EME culture medium supplemented with BAP (1 mg L -1 ), kanamycin (100 mg L -1 ) and cefotaxime (500 mg L -1 ). The evaluations were done after 5-6 weeks of incubation, determining the number of explants with shoots, the number of gus + shoots, and calculating the genetic transformation efficiency, defined by the relation between the number of gus + shoots and the number of inoculated explants. The highest genetic transformation efficiency was observed in 'Carrizo' citrange. An increase of genetic transformation efficiency, mainly for the 'Hamlin' sweet orange occurred when the segments were incubated under temperatures below 27 o C. The supplementation of the co-cultivation culture medium with acetosyringone depends on pH value of itself. The use of explant sectioned did not favor transformation, probably due to the excessive bacterial growth on explant surface.

O melhoramento genético das plantas cítricas, pelos métodos tradicionais, é dificultado por uma série de características da biologia de reprodução da espécie. Assim a utilização de técnicas modernas de biotecnologia, como a cultura de tecidos, a manipulação genética e a biologia molecular, têm se mostrado atrativas para o melhoramento genético da cultura. O objetivo deste trabalho é avaliar a transformação genética em variedades de laranja doce (Citrus sinensis) usando o gene xylA como gene de seleção. O trabalho foi realizado com a estirpe EHA 101 de Agrobacterium tumefaciens, contendo o plasmídeo pNOV1457, com o gene xylA. Os isolados da bactéria foram mantidos em meio de cultura YEP suplementado com os antibióticos (ácido nalidíxico, canamicina e estreptomicina). Segmentos de epicótilo foram incubados, por um período de 20 minutos, com a suspensão bacteriana. Após a inoculação, os segmentos foram secos em papel toalha estéril, e incubados em placa de petri (100 x 15 mm) contendo o meio de cultura EME + BAP (1 mg.L-1), em ausência de luz, à temperatura de 24 C, por um período de 3 dias, com acetoseringona e sem acetoseringona durante o cocultivo. Após o co-cultivo, os explantes foram transferidos para meio de cultura de seleção e regeneração, constituído do meio de cultura EME + BAP (1 mg.L-1) + cefotaxime (500 mg.L-1) + xilose (15 mg.L-1). A transformação genética foi confirmada pela detecção do gene xylA nas plantas regeneradas por PCR. A extração do DNA foi feita pelo método de Dellaporta et al. (1983) e as reações de PCR foram conduzidas em termociclador PTC-100 (MJ Research) utilizandose "primers" específicos para detecção do gene xylA. Analisando os dados obtidos verificou-se que foram obtidas plantas transgênicas, utilizando-se o sistema xylA/xilose, de 3 variedades de laranja doce Hamlin, Valência e Natal, com uma eficiência de transformação genética variando de 1 - 3%, em função do experimento e da variedade. A atividade da enzima xilose isomerase foi confirmada pelo teste clorofenol vermelho. Esse trabalho concluiu que é possível a regeneração de plantas transgênicas de variedades de laranja doce utilizando-se o sistema de seleção positiva xylA/xilose. / The genetic improvement of the citric plants, by traditional methods, is made difficult by a series species biology reproduction characteristics. The use of modern biotechnology techniques, as tissue culture, the genetic manipulation and molecular biology, have shown attractive for the culture genetic improvement. The objective of this work was to evaluate the genetic transformation in varieties of sweet orange (Citrus sinensis) using the gene xylA as selection gene. The work was carried out with the EHA 101 Agrobacterium tumefaciens, containing the plasmid pNOV1457, whith the gene xylA. The bacterium was culture in YEP media supplemented with antibiotics (nalidixic acid, kanamicyn e streptomycin). Epicotyl segments were incubated, for 20 min, with the bacterial suspension. After inoculation, the segments were dry in a sterile paper, and incubated in a petri dish (100 x 15mm) containing the medium EME + BAP (1 mg.L-1), in dark, at the temperature of 24 °C, for a period of 3 days, with and without acetoseryngone during the co-culture period. After the co-culture, the explants were transferred to culture medium of selection and regeneration, consisting of medium EME + BAP (1 mg.L-1) + cefotaxime (500 mg.L-1) + xylose (15 mg.L-1). The genetic transformation was confirmed by the gene detection by PCR. The DNA extraction was done by Dellaporta et al. (1983). PCR reactions were done in a thermal cycler PTC-100 (MJ Research) using specific "primers" for gene xylA detection. The enzyme xilose isomerase activity was confirmed by the red clorofenol test. It is possible to regenerate sweet orange transgenic plants using the positive select system based on xylA gene, of 3 sweer orange varieties Hamlin, Valencia and Natal, with a genetic transformation efficiency of 1-3%.

A utilização de técnicas biotecnológicas como a transformação genética, tem auxiliado os programas de melhoramento de plantas perenes. Essa técnica já é utilizada em citros com sucesso, principalmente para obtenção de plantas tolerantes a doenças. O presente trabalho teve três objetivos: 1.transformação genética do porta-enxerto limão ‘Cravo’ com o gene bacteriopsina (bO), relacionado com ativação de mecanismos de defesa da planta como morte programada de células e produção de ácido salicílico, com o intuito de aumentar a resistência a gomose de Phytophthora; 2. transformação genética das principais variedades copas de laranja doce (‘Hamlin’, ‘Valência’, ‘Natal’ e ‘Pêra’) com o gene da cecropina. Esse gene possui atividade antibacteriana, tornando-se possível fonte de resistência a cancro cítrico e clorose variegada dos citros e; 3. avaliar a viabilidade da utilização de um promotor específico de xilema em citros. As transformações foram efetuadas pelo sistema indireto via Agrobacterium tumefaciens, utilizando segmentos juvenis de epicótilo. Testes moleculares foram realizados e confirmaram a inserção dos genes descritos acima. No caso do limão ‘Cravo’ duas plantas foram regeneradas. Na transformação das variedades copa com o gene da cecropina, diferentes taxas de eficiência foram observadas, sendo que melhores resultados foram obtidos para laranja ‘Valência (3,3-4,5 %) e laranja ‘Hamlin’ (2,5-3,0 %) em comparação com laranja ‘Natal’ (1,6-2,0 %) e laranja ‘Pêra’ (0,5 %). Plantas de laranja ‘Valência’ também foram transformadas com o promotor da fenilalamina amônia-liase. Além das transformações, dois bioensaios foram instalados: um com as plantas de limão ‘Cravo’, visando avaliar resistência a gomose de Phytophthora e outro, com laranja ‘Valência’ transformada com o gene da cecropina. No primeiro caso, propagaram-se por enxertia plantas transgênicas de limão ‘Cravo’ e, após seis meses fez-se a inoculação com Phytophtora nicotianae, que consistiu na introdução de agulha contaminada com propágulos do patógeno, numa altura de 10 cm acima da região da enxertia. Vinte e cinco dias após aferiu-se o comprimento e área das lesões, bem como observou-se a presença de goma. Comparando-se o desempenho das duas linhagens transgênicas com o limão ‘Cravo’ não transformado, uma delas apresentou menor área a lesão. Já para as plantas com o gene cecropina um ensaio com folha destacada foi realizado, em que as mesmas foram perfuradas com auxílio de uma agulha e, posteriormente, pulverizadas com uma suspensão da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri e, mantidas em tubo de centrífuga (50 mL), onde os pecíolos permaneciam em contato com água estérial (2 mL). Avaliou-se o período necessário para o aparecimento das primeiras lesões e o tamanho das lesões após quinze dias. Uma planta transgênica apresentou maior resistência perante a testemunha. Nas plantas transformadas com o promotor da fenilalamina amônia-liase, testes para observar a expressão do gene GUS foram realizados e comprovaram a capacidade desse promotor em direcionar os genes para a região dos vasos condutores. Os resultados obtidos nesse trabalho são pioneiros em citros, utilizando os genes bO, cecropina e o promotor PAL. / Application of modern biotechnology techniques, as genetic transformation, has helped breeding programs of perennial plant species. This technique is already successfully used in citrus in several countries, mostly to the production of more disease-tolerant plants. Present work had three objectives as it follows: 1. genetic transformation of Rangpur lime rootstock with the bacterio-opsin(bO) gene, related to the activation of plant defense mechanisms such as programmed cell death and salicylic acid production, towards the increase of the tolerance to Phytophthora gummosis; 2. genetic transformation of main sweet orange scion varieties (Hamlin, Valência, Natal and Pêra) with cecropin gene. This gene products present antibacterial activity, becoming a possible source for citrus canker and variegated chlorosis tolerance and. 3. to test the viability of the use of a xylem-specific promoter (phenylalanine ammonia lyase) in citrus. Transformations were performed by direct system via Agrobacterium tumefaciens, using juvenile citrus epicotyl segments, which showed to be feasible in citrus, once transgenic plants were obtained for all proposed genes. Molecular tests were conduced and confirmed the insertion of the genes described above. In the case of Rangpur lime two plants were regenerated; in the transformation of canopy varieties with cecropin gene, different efficiency rates were observed, and the best results were obtained for Valencia sweet orange (3.3-4.5 %) and Hamlin sweet orange (2.5-3.0 %), compared to Natal sweet orange (1.6-2.0 %) and Pêra sweet orange (0.5 %). Plants of Valência variety were also transformed with the phenylalanine ammonia lyase promoter, resulting in 15 diverse transformation events. Beyond transformations, two bioessays were installed: one with Rangpur lime plants, aiming to evaluate tolerance to gummosis caused by Phytophthora, and another with Valência sweet orange transformed with cecropin gene. In the first case Rangpur lime transgenic plants were propagated through grafting and, after six months, were inoculated with Phytophtora, by introducing a contaminated needle containing the pathogen propagules, at 10 cm above the grafting region; 25 days later the experiment evaluation was conduced, consisting on measuring the lenght and area of lesions, as well as on the observation of gum. Comparing the performance of Rangpur lime transgenic lines with that of a non-transformed Rangpur lime, one plant presented higher tolerance to gummosis. Although, for the cecropin-gene plants, it was conduced an essay with destached leaves, where these were punched by a needle and then sprayed with a bacterial suspension of Xanthomonas axonopodis pv. citri; they were kept in centrifuge tubes (50 mL), where petioles mantained contact with sterile water (2 mL). After 15 days, the necessary period to the first lesions appearance and their size were evaluated. One transgenic plant showed a higher tolerance in comparison to control. In plants transformed with phenylalanine ammonia lyase promoter, tests to observe gus gene expression were performed and comproved its ability to promote and direct gene activity to conductive vessels. This work results are the first in citrus using bO and cecropin genes, and PAL promoter.

A transformação genética pode contribuir substancialmente para o melhoramento genético do feijão, permitindo a introdução de genes que contribuam para o aumento da produtividade e estabilidade da produção. A metodologia de transformação genética de feijão (Phaseolus vulgaris), ora disponível (biobalística em embriões) apresenta baixa eficiência, o que dificulta o seu uso em pesquisas envolvendo a transferência de genes e não permite seu uso de forma ampla em programas de melhoramento genético da cultura. Um método efetivo e reprodutível de regeneração de plantas, a partir de células ou tecidos, é essencial em estudos de genética e melhoramento envolvendo a transferência de genes pela engenharia genética. Os métodos de transformação somente terão sucesso se tivermos previamente estabelecido um protocolo eficiente de regeneração de plantas a partir de tecidos potencialmente transformáveis. O objetivo principal deste trabalho é o desenvolvimento de um protocolo de transformação genética de feijão via Agrobacterium. O primeiro passo no desenvolvimento deste protocolo foi o estabelecimento de um sistema eficiente de regeneração de plantas a partir de calos. O passo seguinte foi o estabelecimento de metodologia da transformação de calos via Agrobacterium. / The genetic transformation can contribute substantially with the bean (Phaseolus vulgaris L.) breeding, allowing the introduction of genes to improve productivity and its stability. The transformation methodology of bean, now available (biolistic in embryos), is not efficient, which prevents its use in bean breeding programs. A reproducible and effective method of plant regeneration, from cells or tissues is essential in genetics studies and plant breeding, involving the genetic engineering. The transformation methods will only work if we can previously establish an efficient plant regeneration protocol from tissues with potential for transformation. The aim of this work was to develop an efficient transformation protocol of bean via Agrobacterium. The first step was to establish an efficient system of plant regeneration from callus, followed by the establishment of a transformation methodology via Agrobacterium.

O melhoramento genético das plantas cítricas, pelos métodos tradicionais, é dificultado por uma série de características da biologia de reprodução da espécie. Assim a utilização de técnicas modernas de biotecnologia, como a cultura de tecidos, a manipulação genética e a biologia molecular, têm se mostrado atrativas para o melhoramento genético da cultura. O objetivo deste trabalho é avaliar a transformação genética em variedades de laranja doce (Citrus sinensis) usando o gene xylA como gene de seleção. O trabalho foi realizado com a estirpe EHA 101 de Agrobacterium tumefaciens, contendo o plasmídeo pNOV1457, com o gene xylA. Os isolados da bactéria foram mantidos em meio de cultura YEP suplementado com os antibióticos (ácido nalidíxico, canamicina e estreptomicina). Segmentos de epicótilo foram incubados, por um período de 20 minutos, com a suspensão bacteriana. Após a inoculação, os segmentos foram secos em papel toalha estéril, e incubados em placa de petri (100 x 15 mm) contendo o meio de cultura EME + BAP (1 mg.L-1), em ausência de luz, à temperatura de 24 C, por um período de 3 dias, com acetoseringona e sem acetoseringona durante o cocultivo. Após o co-cultivo, os explantes foram transferidos para meio de cultura de seleção e regeneração, constituído do meio de cultura EME + BAP (1 mg.L-1) + cefotaxime (500 mg.L-1) + xilose (15 mg.L-1). A transformação genética foi confirmada pela detecção do gene xylA nas plantas regeneradas por PCR. A extração do DNA foi feita pelo método de Dellaporta et al. (1983) e as reações de PCR foram conduzidas em termociclador PTC-100 (MJ Research) utilizandose "primers" específicos para detecção do gene xylA. Analisando os dados obtidos verificou-se que foram obtidas plantas transgênicas, utilizando-se o sistema xylA/xilose, de 3 variedades de laranja doce Hamlin, Valência e Natal, com uma eficiência de transformação genética variando de 1 - 3%, em função do experimento e da variedade. A atividade da enzima xilose isomerase foi confirmada pelo teste clorofenol vermelho. Esse trabalho concluiu que é possível a regeneração de plantas transgênicas de variedades de laranja doce utilizando-se o sistema de seleção positiva xylA/xilose. / The genetic improvement of the citric plants, by traditional methods, is made difficult by a series species biology reproduction characteristics. The use of modern biotechnology techniques, as tissue culture, the genetic manipulation and molecular biology, have shown attractive for the culture genetic improvement. The objective of this work was to evaluate the genetic transformation in varieties of sweet orange (Citrus sinensis) using the gene xylA as selection gene. The work was carried out with the EHA 101 Agrobacterium tumefaciens, containing the plasmid pNOV1457, whith the gene xylA. The bacterium was culture in YEP media supplemented with antibiotics (nalidixic acid, kanamicyn e streptomycin). Epicotyl segments were incubated, for 20 min, with the bacterial suspension. After inoculation, the segments were dry in a sterile paper, and incubated in a petri dish (100 x 15mm) containing the medium EME + BAP (1 mg.L-1), in dark, at the temperature of 24 °C, for a period of 3 days, with and without acetoseryngone during the co-culture period. After the co-culture, the explants were transferred to culture medium of selection and regeneration, consisting of medium EME + BAP (1 mg.L-1) + cefotaxime (500 mg.L-1) + xylose (15 mg.L-1). The genetic transformation was confirmed by the gene detection by PCR. The DNA extraction was done by Dellaporta et al. (1983). PCR reactions were done in a thermal cycler PTC-100 (MJ Research) using specific "primers" for gene xylA detection. The enzyme xilose isomerase activity was confirmed by the red clorofenol test. It is possible to regenerate sweet orange transgenic plants using the positive select system based on xylA gene, of 3 sweer orange varieties Hamlin, Valencia and Natal, with a genetic transformation efficiency of 1-3%.

A utilização de técnicas biotecnológicas como a transformação genética, tem auxiliado os programas de melhoramento de plantas perenes. Essa técnica já é utilizada em citros com sucesso, principalmente para obtenção de plantas tolerantes a doenças. O presente trabalho teve três objetivos: 1.transformação genética do porta-enxerto limão ‘Cravo’ com o gene bacteriopsina (bO), relacionado com ativação de mecanismos de defesa da planta como morte programada de células e produção de ácido salicílico, com o intuito de aumentar a resistência a gomose de Phytophthora; 2. transformação genética das principais variedades copas de laranja doce (‘Hamlin’, ‘Valência’, ‘Natal’ e ‘Pêra’) com o gene da cecropina. Esse gene possui atividade antibacteriana, tornando-se possível fonte de resistência a cancro cítrico e clorose variegada dos citros e; 3. avaliar a viabilidade da utilização de um promotor específico de xilema em citros. As transformações foram efetuadas pelo sistema indireto via Agrobacterium tumefaciens, utilizando segmentos juvenis de epicótilo. Testes moleculares foram realizados e confirmaram a inserção dos genes descritos acima. No caso do limão ‘Cravo’ duas plantas foram regeneradas. Na transformação das variedades copa com o gene da cecropina, diferentes taxas de eficiência foram observadas, sendo que melhores resultados foram obtidos para laranja ‘Valência (3,3-4,5 %) e laranja ‘Hamlin’ (2,5-3,0 %) em comparação com laranja ‘Natal’ (1,6-2,0 %) e laranja ‘Pêra’ (0,5 %). Plantas de laranja ‘Valência’ também foram transformadas com o promotor da fenilalamina amônia-liase. Além das transformações, dois bioensaios foram instalados: um com as plantas de limão ‘Cravo’, visando avaliar resistência a gomose de Phytophthora e outro, com laranja ‘Valência’ transformada com o gene da cecropina. No primeiro caso, propagaram-se por enxertia plantas transgênicas de limão ‘Cravo’ e, após seis meses fez-se a inoculação com Phytophtora nicotianae, que consistiu na introdução de agulha contaminada com propágulos do patógeno, numa altura de 10 cm acima da região da enxertia. Vinte e cinco dias após aferiu-se o comprimento e área das lesões, bem como observou-se a presença de goma. Comparando-se o desempenho das duas linhagens transgênicas com o limão ‘Cravo’ não transformado, uma delas apresentou menor área a lesão. Já para as plantas com o gene cecropina um ensaio com folha destacada foi realizado, em que as mesmas foram perfuradas com auxílio de uma agulha e, posteriormente, pulverizadas com uma suspensão da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri e, mantidas em tubo de centrífuga (50 mL), onde os pecíolos permaneciam em contato com água estérial (2 mL). Avaliou-se o período necessário para o aparecimento das primeiras lesões e o tamanho das lesões após quinze dias. Uma planta transgênica apresentou maior resistência perante a testemunha. Nas plantas transformadas com o promotor da fenilalamina amônia-liase, testes para observar a expressão do gene GUS foram realizados e comprovaram a capacidade desse promotor em direcionar os genes para a região dos vasos condutores. Os resultados obtidos nesse trabalho são pioneiros em citros, utilizando os genes bO, cecropina e o promotor PAL. / Application of modern biotechnology techniques, as genetic transformation, has helped breeding programs of perennial plant species. This technique is already successfully used in citrus in several countries, mostly to the production of more disease-tolerant plants. Present work had three objectives as it follows: 1. genetic transformation of Rangpur lime rootstock with the bacterio-opsin(bO) gene, related to the activation of plant defense mechanisms such as programmed cell death and salicylic acid production, towards the increase of the tolerance to Phytophthora gummosis; 2. genetic transformation of main sweet orange scion varieties (Hamlin, Valência, Natal and Pêra) with cecropin gene. This gene products present antibacterial activity, becoming a possible source for citrus canker and variegated chlorosis tolerance and. 3. to test the viability of the use of a xylem-specific promoter (phenylalanine ammonia lyase) in citrus. Transformations were performed by direct system via Agrobacterium tumefaciens, using juvenile citrus epicotyl segments, which showed to be feasible in citrus, once transgenic plants were obtained for all proposed genes. Molecular tests were conduced and confirmed the insertion of the genes described above. In the case of Rangpur lime two plants were regenerated; in the transformation of canopy varieties with cecropin gene, different efficiency rates were observed, and the best results were obtained for Valencia sweet orange (3.3-4.5 %) and Hamlin sweet orange (2.5-3.0 %), compared to Natal sweet orange (1.6-2.0 %) and Pêra sweet orange (0.5 %). Plants of Valência variety were also transformed with the phenylalanine ammonia lyase promoter, resulting in 15 diverse transformation events. Beyond transformations, two bioessays were installed: one with Rangpur lime plants, aiming to evaluate tolerance to gummosis caused by Phytophthora, and another with Valência sweet orange transformed with cecropin gene. In the first case Rangpur lime transgenic plants were propagated through grafting and, after six months, were inoculated with Phytophtora, by introducing a contaminated needle containing the pathogen propagules, at 10 cm above the grafting region; 25 days later the experiment evaluation was conduced, consisting on measuring the lenght and area of lesions, as well as on the observation of gum. Comparing the performance of Rangpur lime transgenic lines with that of a non-transformed Rangpur lime, one plant presented higher tolerance to gummosis. Although, for the cecropin-gene plants, it was conduced an essay with destached leaves, where these were punched by a needle and then sprayed with a bacterial suspension of Xanthomonas axonopodis pv. citri; they were kept in centrifuge tubes (50 mL), where petioles mantained contact with sterile water (2 mL). After 15 days, the necessary period to the first lesions appearance and their size were evaluated. One transgenic plant showed a higher tolerance in comparison to control. In plants transformed with phenylalanine ammonia lyase promoter, tests to observe gus gene expression were performed and comproved its ability to promote and direct gene activity to conductive vessels. This work results are the first in citrus using bO and cecropin genes, and PAL promoter.