Enhancer regulieren die Transkription ihrer Zielgene und deren Expression. Sie bieten eine Bindestelle für verschiedenste Transkriptionsfaktoren (TF) und RNA Polymerase II (RNAPII) und unterstützen die Gentranskription durch das Zustandekommen von Chromatinkontakten. Zusätzlich transkribiert RNAPII in Enhancer-Regionen kurze, non-polyadenylierte Transkripte, die man Enhancer-RNA (eRNA) nennt. Der Mechanismus der RNAPII-Rekrutierung und –Regulation an Enhancern ist bisher wenig verstanden, insbesondere wie das Vorhandensein von RNAPII-Modifikationen den Chromatinstatus, -faltung sowie die Genaktivierung beeinflusst. In dieser Arbeit wurden verschiedene Ansätze der Enhancer-Bestimmung miteinander verglichen. Während eine klare Bestimmung des besten Ansatzes sich als komplex erwies, konnte gezeigt werden, dass die Bindung von RNAPII an regulatorische Regionen in Zusammenhang mit TF eine universelle Konstante darstellte. Weiterhin wurden der Status der Enhancer-gekoppelten RNAPII-Aktivierung und deren Transkriptionsaktivität untersucht. Als Hauptergebnis ergab sich, dass der RNAPII-Status mit der Enhancer-Aktivität und daraus folgend mit veränderter Transkriptionsaktivität korreliert ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass das Vorhandensein extragenischer RNAPII ein neues Werkzeug zur Identifikation von regulatorischen Regionen ist. Erfolgreich konnten regulatorische Regionen in embryonalen Stammzellen der Maus sowie während der neuronalen Differenzierung vorhergesagt und mittels Enhancer-Aktivität in-vivo bestätigt werden. Dabei zeigte sich, dass im Laufe der der neuronalen Differenzierung extragenische RNAPII-Bindung spezifische Aktivierungsmuster aufweist: ihr Transkriptionslevel wird durch Kinasen feinmaschig reguliert und es werden verschiedene Formen maturierter RNA erzeugt. Zusammenfassend konnte RNAPII als Werkzeug zur Identifikation und Charakterisierung regulatorischer Regionen in verschiedenen Zelltypen ausgemacht werden. Selbst mit minimalen RNAPII-Datensätzen ist es möglich, gleichzeitig regulatorische Regionen zu identifizieren als auch ihren eigenen Aktivierungsstatus sowie den ihrer kodierender Genpromotoren zu bestimmen. / Enhancers regulate transcription of target genes and gene expression. They act as recruitment sites for multiple transcription factors (TFs) and RNA polymerase II (RNAPII) and favour transcription of target genes through chromatin contacts. RNAPII at enhancer regions transcribes short and mostly non-polyadenylated transcripts, called enhancer RNAs (eRNAs). The mechanisms of RNAPII recruitment and regulation at enhancers remain ill understood, in particular how signalling through RNAPII modifications may influence chromatin states, looping and gene activation. In this study, I compare enhancer lists defined with different approaches and find that their relation is very complex. However, I find that RNAPII binding co-occurs with TF binding at regulatory regions, independently of the identification approach used. I characterize the state of RNAPII activation at enhancers and its transcriptional activity. I find that RNAPII state reflects enhancer activation state and correlates with different transcriptional outputs. In addition, I demonstrate that extragenic RNAPII is a novel tool to identify regulatory regions. I successfully identified putative regulatory regions in mESC and during neuronal differentiation, with enhancer activity in vivo. Extragenic RNAPII regions have specific activation patterns during neuronal differentiation, are finely regulated at the transcriptional level by kinases and transcribe differently mature RNAs. In conclusion, I establish RNAPII as a tool to identify and characterise regulatory regions in a cell type of interest. With minimal RNAPII datasets it is possible to simultaneously identify regulatory regions, infer their state of activation, and the state of activation of coding gene promoters.

HOX-Gene sind essentielle Transkriptionsfaktoren (TFs), die den Körperplan, die Struktur und die Organbildung während der Entwicklung bestimmen. Diese komplexen Prozesse werden präzise von in verschachtelter Weise exprimierten HOX-Genen reguliert. In vitro Experimente zeigten jedoch, dass die HOX-DNA-Bindungsdomäne stark konserviert ist und oft ähnliche DNA-Sequenzen bindet. Die niedrige biochemische Bindungsspezifität und die hochspezifischen Funktionen stehen oft im Widerspruch und bilden das Schlussthema des so genannten Hox-Paradoxons. Das Paradox besteht aufgrund der folgenden Hindernisse: hohe Proteinhomologie, unspezifischen Antikörper sowie die verschachtelte HOX-Expressionsmuster. Das Ziel dieser Arbeit war, diese Probleme zu überwinden, die HOX-DNA-Bindung in kontrollierten und physiologischen Umstände zu untersuchen und die Bindung von neun Gliedmaßen-spezifischen posterioren HOXA und -D-TFs zu vergleichen. Zu diesem Zweck wurden neun Hühner-HOX-Gene (HOXA- und HOXD9-13) mit dem FLAG markiert und mittels Viren in Gliedmaßen-mesenchymalen Zellen exprimiert. Somit wurde der Vergleich unter identischen und kontrollierten Bedingungen ermöglicht. Im Einklang mit in vivo Funktionsdaten zeigten die HOX-Bindungsprofile, dass zwei direkte Paraloge (z. B. HOXA10 und D10) häufiger dieselben Regionen binden als zwei Nicht-Paraloge (z. B. HOXA9 und A13). Außerdem, die hier beschriebene HOX-DNA-Bindung unterscheidet sich von in vitro Bindung, was darauf hinweist, dass Kofaktoren für deren biologische Funktion wichtig sind. Zusätzlich ergab sich aus dem Bindungsvergleich, dass es zuvor unbekannte Unterschiede zwischen Bindungsweise von HOX-TFs gibt, die zumindest teilweise auf der Häufigkeit von direkter Bindung und Ko-Bindung mit anderen TFs beruhen. Schließlich wurde mit der Kombination von Genetik, Genomik und Biochemie einen neuen HOX-Kofaktor entdeckt, CTCF, der auf ein mögliches Wechselspiel zwischen der HOX-Zielregulation und der Chromatinarchitektur hindeutet. / HOX genes are essential developmental transcription factors (TFs) that pattern the animal body plan, their structures and organs. To precisely control these very diverse processes HOX genes are expressed in a nested fashion and regulate their targets in a context specific way. However, in vitro experiments indicated that HOX DNA binding domain (Homeodomain) is remarkably rigid and often binds very similar DNA sequences. This discrepancy between high functional specificity and low in vitro biochemical specificity is at the core of a problem termed Hox paradox. This paradox persists due to several biological and technical obstacles; namely high HOX protein homology and lack of sufficiently specific antibodies as well as nested HOX expression pattern. The aim of this study was to address these problems, study HOX-DNA binding in a controlled, Hox-native environment and to compare HOX-DNA binding of nine posterior vertebrate HOXA and HOXD TFs. To do this, nine chicken HOX genes (HOXA9-13 and HOXD9-13) were FLAG-tagged and virally expressed in chicken mesenchymal limb-derived cells enabling comparison of their binding in an identical setup and controlled conditions. HOX binding profiles uncovered two direct paralogues (i.e. HOXA10 and D10) bind more often same regions than two non-paralogues (i.e. HOXA9 and A13) reminiscent of in vivo functional data. Moreover, the here described in vivo HOX-DNA binding differs from in vitro binding, indicating the importance of cofactors and biological context for HOX binding and functional outcome. Additionally, binding comparison uncovered previously unknown differences between binding modes of HOX-TFs that at least partially rely on the abundance of direct binding and co-binding with other TFs. Finally, with combination of genetics, genomics and biochemistry a novel HOX cofactor, CCCTC binding factor (CTCF), was discovered suggesting potential interplay between HOX target regulation and chromatin architecture.

Einige biologische Prozesse sind dosisabhängig, wobei nicht nur die Anwesenheit oder Abwesenheit bestimmter Genprodukte, sondern auch deren spezifische Mengen wichtig sind. Ein Beispiel ist die Dosis-Kompensation für Geschlechtschromosomen bei Säugetieren, die durch X-Chromosomen-Inaktivierung erreicht wird. Dieser Mechanismus ist auf Frauen beschränkt, da sie zwei X-Chromosomen besitzen, im Gegensatz zu Männern mit nur einem X-Chromosom. Dosisabhängigkeit spielt auch bei der Differenzierung pluripotenter Stammzellen eine Rolle. Geringe Schwankungen in der Menge des Pluripotenzfaktors OCT4 (POU5F1) können bestimmen, ob Maus-Embryonale Stammzellen (mESCs) sich in das Trophektoderm oder in meso-endodermale Linien differenzieren. Ebenso ist die Menge des Pluripotenzfaktors NANOG entscheidend für die Steuerung der naiven und vorbereiteten pluripotenten Zustände. Das Verständnis der dosisabhängigen Regulation biologischer Prozesse ist entscheidend, jedoch technisch anspruchsvoll, da es erfordert, die Proteinmenge quantitativ zu modulieren. Hier wurde ein auf Degron- und CRISPR/Cas-basiertes Toolkit, CasTuner, entwickelt, um die endogene Genexpression analog zu steuern. CasTuner basiert auf Cas-abgeleiteten Repressoren, die an eine Degron-Domäne fusioniert sind und durch die Titration der Konzentration eines Liganden gesteuert werden können. CasTuner ermöglicht eine homogene (analoge) Steuerung der Genexpression, im Gegensatz zum KRAB-basierten CRISPRi-System, das eine bimodale (digitale) Repression zeigt. Mit CasTuner wurden die Dosis-Wirkungs-Beziehungen von NANOG und OCT4 mit ihren Zielgenen und dem zellulären Phänotyp gemessen. Schließlich wurde CasTuner eingesetzt, um die dosisabhängige Rolle des X-gebundenen Xist-Aktivators RNF12 und des neu entdeckten Faktors ZIC3 zu untersuchen. Dabei wurde ein modifiziertes Modell für die zufällige X-Chromosomen-Inaktivierung vorgeschlagen. / Certain biological processes are dose-dependent, depending not only on the presence or absence of given gene products but also on their specific. The importance of quantitative regulation of gene expression is illustrated by the need for dosage compensation for sex chromosomes and by the presence of genes whose decreased expression is linked to diseases. The mechanism by which mammals achieve X-dosage compensation, X-chromosome inactivation, is itself dose-dependent, being restricted to females through sensing the two-fold higher dose for X-linked genes in females compared to males. Dose-dependency has been described in the differentiation of pluripotent stem cells into different lineages: small variations in the quantity of the pluripotency factor OCT4 (POU5F1) can determine the differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) into the trophectoderm or meso-endoderm lineages. Similarly, the amount of the pluripotency factor NANOG is critical for the control of naïve and primed pluripotent states. Understanding the principles underlying the dose-dependent regulation of biological processes is crucial, but also technically challenging, since it requires the ability to quantitatively modulate protein abundance. Here, I developed a degron- and CRISPR/Cas-based toolkit, CasTuner, for analogue tuning of endogenous gene expression. CasTuner relies on Cas-derived repressors fused to a degron domain, which can be tuned by titrating the concentration of a ligand. I demonstrate homogenous (analogue) tuning of gene expression across cells, as opposed to the KRAB-based CRISPRi system, which exhibits bimodal (digital) repression. I employ CasTuner to measure the dose-response relationships of NANOG and OCT4 with their target genes and the cellular phenotype. Finally, I apply CasTuner to study the dose-dependent role of the X-linked Xist activator RNF12 and the newly discovered factor ZIC3, and propose a modified model for random X-chromosome inactivation.

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Die Fähigkeit dendritischer Zellen (DC) Immunität zu erzeugen und Antigen-spezifische Toleranz zu induzieren macht DC zu idealen Zielen pharmakologischer Interventionen zur Beeinflussung von Immunreaktionen. NF-kappaB Faktoren sind eine Gruppe von Transkriptionsregulatoren, die für die Entwicklung und Funktion von DC bedeutend sind. Trotz ihrer zentralen Bedeutung für die DC Biologie ist die Identität von NF-kappaB regulierten Genen in DC weitestgehend unbekannt. In der vorliegenden Studie wurde die Hemmung der NF-kappaB Aktivierung durch den IkappaBalpha Super Repressor (IkappaBalpha-SR) und die Analyse der Genexpression durch DNA Microarrays genutzt, um das Repertoire an NF-kappaB regulierten Genen in DC zu ermitteln. Mit diesem Ansatz wurden unter anderem Connexin-43 und Fascin als direkte NF-kappaB regulierte Gene identifiziert. Die Beeinflussung des NF-kappaB Signalwegs wurde als möglicher Weg zur Modifizierung von Immunantworten vorgeschlagen. Es wird vermutet, dass verschiedene immunmoduloratorische Verbindungen wie z.B. Vitamin D3 (VD3) in NF-kappaB vermittelte Immunmechanismen eingreifen. Um die Effekte von VD3 in der Aktivierung von DC zu untersuchen, wurden DNA Microarray Analysen an DC von Mäusen mit mutiertem und wildtyp Vitamin D3 Rezeptor (VDR) durchgeführt und die Beteiligung der VDR vermittelten Repression von NF-kappaB regulierten Genen wie z.B. Connexin-43 untersucht. Die so identifizierten Gene stellen potentielle Ansatzpunkte für die Entwicklung von spezifischeren entzündungshemmenden Medikamenten für die klinische Anwendung dar. / The ability of dendritic cells (DC) to initiate immunity and induce antigen-specific tolerance makes DC ideal targets for pharmacological intervention into immune responses. NF-kappaB factors are a family of transcriptional regulators important for DC development and function. However, the identity of NF-kappaB target genes that are central to DC biology is largely unknown. In the present study, inhibition of the NF-kappaB activation by the IkappaBalpha super repressor (IkappaBalpha-SR) and DNA microarray analysis were used to determine the repertoire of NF-kappaB responsive genes in DC. This approach identified, among others, connexin-43 and fascin as direct NF-kappaB regulated genes. The targeting of the NF-kappaB signalling pathway has been suggested as a useful means to modify immune responses. A number of immunomodulatory compounds, such as vitamin D3 (VD3), are believed to affect NF-kappaB mediated immune mechanisms. Microarray analysis employing vitamin D3 receptor (VDR) mutant and wild-type mice was used to survey the effects of VD3 in DC. In this study, effects of VD3 on the activation of DC are evaluated, and involvement of VDR mediated repression of NF-?B regulated genes, such as connexin-43, is surveyed. Identified genes can be potentially useful targets for the development of more specific anti-inflammatory agents for clinical applications.

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Transkriptionsfaktoren (TFs) empfangen Signale in Signaltransduktionskaskaden und übersetzen diese in eine zelluläre Antwort. Dadurch ermöglichen sie es Zellen, Organen und Organismen sich an verändernde Umgebungsbedingungen anzupassen. In früheren Studien wurde gezeigt, dass viele TFs nach Aktivierung Oszillationen im Zellkern aufweisen. Ein Beispiel dafür ist p53. Als zentrales Protein im Rahmen der zellulären Stressantwort reguliert es nach DNA Schaden die Expression hunderter Zielgene die das Zellschicksal steuern. Anomalien in der Aktivität von p53 stehen im Zusammenhang mit schwerwiegenden Erkrankungen wie der Krebsentstehung. Die Dynamik der Akkumulation von p53 im Zellkern ist abhängig von der Art des DNA Schadens und korreliert mit der resultierenden zellulären Antwort. Obwohl dieser Zusammenhang mehrfach gezeigt wurde, sind die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen jedoch weitgehend unerforscht. Mit der vorliegenden Arbeit soll ein Beitrag zum Verständnis dazu geleistet werden, wie p53 Oszillationen im Zellkern die Transkription von Zielgenen auf Einzelzellebene modulieren. Dazu wurden sieben Zielgene ausgewählt und mittels Einzelmolekül-Fluoreszenz in situ Hybridisierung und mathematischer Analyse charakterisiert. Es werden Ergebnisse der quantitativen, zeitaufgelösten mRNA Expression und der bursting Aktivität von Zielgenpromotoren mit Einzelzell- und Einzelmolekülauflösung dargestellt. Diese Analyse weist darauf hin, dass die Aktivierung von p53 nach DNA Doppelstrangbrüchen primär die Frequenz des stochastischen bursting der untersuchten Zielgene reguliert. Diese können anhand ihrer Promotoraktivität in drei Archetypen eingeteilt werden: anhaltend, transient und pulsierend, die jedoch nicht ausschließlich durch veränderte p53 Menge im Zellkern erklärt werden können. Stattdessen weisen die Ergebnisse darauf hin, dass Veränderungen im Acetylierungszustand der C-terminalen Lysinreste von p53 entscheidend für diese Gen-spezifische Regulation sind. / Transcription factors (TFs) are receiver and compiler of cell signaling, transmitting incoming inputs into cellular responses that enable cells, organs and organisms to respond and adapt to a changing environment. In the past, it has been shown that many TFs exhibit oscillations of nuclear abundance over time when activated. One of these TFs is the tumor suppressor p53, a central hub in the signaling network regulating the cellular stress response, controlling cell fate decisions by changing the expression of hundreds of target genes. Aberrations in p53’s activity are related to severe human malignancies such as cancer. The dynamics of its nuclear accumulation are stimulus dependent and enable the p53 pathway to mediate distinct responses to cellular stress. However, the molecular mechanisms translating such dynamics to altered gene expression remain elusive. In this thesis, I analyzed how oscillations of p53 affect the transcriptional regulation of target genes in single-cells and at individual promoters. I chose a panel of seven targets and employed a combinatorial approach of single-molecule fluorescence in-situ hybridization and mathematical analysis. I present quantitative, time-resolved measurements of target gene mRNA expression and transcriptional bursting activity with single-cell and single-molecule resolution. The resulting data show characteristic principles how p53 nuclear accumulation increases transcriptional bursting upon stimulation and reveal gene-specific modulations. P53 target promoters are regulated by changing the fraction of active promoters, indicating burst frequency regulation. Based on this, genes can be grouped along three archetypes of promoter activity: sustained, transient and pulsatile. These archetypes cannot solely be explained by nuclear p53 levels or promoter binding of total p53. Instead, I provide evidence that the time-varying acetylation state of p53’s C-terminal lysine residues is critical for this gene-specific regulation.

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