Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of this study was to evaluate the relationship between the digestive enzyme activity and the centesimal composition of the contents of the gastrointestinal tract and food habits of four teleost two food habits in summer and winter. Two omnivorous species Pimelodus maculatus and R. quelen and two detritivorous species Hypostomus commersoni and Loricariichthys anus were chosen. Fish were collected with the aid of the trawl during March and July 2013 in São Gonçalo channel, Pelotas - RS. The digestive tract was divided into stomach, anterior and posterior intestine. Stomach was assayed the activity of pepsin and the two portions of the intestine were assayed the activities of trypsin, chymotrypsin and lipase. The protein and lipid content of the contents of each portion of the digestive tract was determined. Digestive enzyme activity is not related to the feeding habits and the centesimal composition of the contents of the gastrointestinal tract. Detritivorous species showed higher activity of alkaline proteases, which may be an adaptation to better utilize the low protein content found in the gastrointestinal tract of these species. / O objetivo desse estudo foi avaliar a relação entre a atividade enzimática digestiva e a composição centesimal do conteúdo do trato gastrintestinal e hábitos alimentares de quatro teleósteos de dois hábitos alimentares no verão e no inverno. Foram escolhidas duas espécies onívoras Rhamdia quelen e Pimelodus maculatus e duas espécies detritívoras Hypostomus commersoni e Loricariichthys anus. Os peixes foram coletados com o auxílio de rede de arrasto nos meses de março e julho de 2013, no canal São Gonçalo, Pelotas RS. O trato digestório foi dividido em estômago, intestino anterior e posterior. No estômago foi ensaiada a atividade da pepsina e nas duas porções do intestino foram ensaiadas as atividades da tripsina, quimotripsina e lipase. Foi determinado o teor proteico e lipídico do conteúdo de cada porção do trato digestório. A atividade enzimática digestiva não está relacionada com o hábito alimentar e a composição centesimal do conteúdo do trato gastrintestinal. Espécies detritívoras apresentaram maior atividade das proteases alcalinas, o que pode ser uma adaptação para utilizar melhor o baixo teor proteico encontrado no conteúdo gastrintestinal dessas espécies.

A semente da Araucaria angustifolia, denominada pinhão, é consumida no Sul e Sudeste do Brasil, como farinha em pratos regionais ou cozida. Há relativamente pouca informação a respeito da composição química e do valor nutricional da semente e de sua farinha. Neste trabalho, a farinha de pinhão, obtida através de diferentes tratamentos térmicos foi avaliada como complemento protéico em um experimento biológico com ratos recém-desmamados. Os animais experimentais consumiram cinco dietas (n=6) com diferentes fontes de proteína: dieta com caseína (CAS), dieta com 80% caseína e 20% (w/w) proteína de farinha de pinhão (PF) sem tratamento térmico (NATPIN), considerando 33.1 ± 1.4 g de proteína/kg desta farinha, dieta com 80% caseína e 20% PF seca a 50°C por 16 horas (PF50), considerando 49.2 ± 0.6 g de proteína/Kg desta farinha, dieta com 80% caseína e 20% PF seca a 80°C por 16 horas (PF80), considerando 50.5 ± 0.8 g de proteína/kg desta farinha e dieta aprotéica (APROT). Os valores de ganho de peso, ingesta de alimento, Coeficiente de Eficácia Alimentar (PER) e Razão Protéica Líquida (NPR) foram similares para as dietas CAS e FP80. O escore químico de aminoácidos corrigido pela digestibilidade protéica (PDCAAS) da PF80 foi o mais alto nas farinhas de pinhão testadas. O escore químico (CS) da farinha de pinhão se mostrou semelhante ao encontrado em outros cereais, sendo a lisina o principal aminoácido limitante, seguida da histidina. Valores mais baixos em todos os parâmetros nutricionais foram encontrados nos animais alimentados com dietas onde foi usada a farinha de pinhão. A farinha de pinhão seca a 80°C por 16 horas mostrou resultados similares nos parâmetros nutricionais ao grupo CAS, e pode ser utilizada, substituindo até 20% de uma proteína de alto valor biológico (AVB) em formulações alimentares. / The seeds of Araucaria angustifolia, namely “pinhão”, are consumed in South and Southeast of Brazil, like flour in regional dishes or baked. There is relatively few information about the chemical composition and nutritional value of the seed and its flour. In this work, “pinhão” flour obtained by different heat treatments was evaluated as an additive in biological experiment for growing rats. Wistar rats were fed five experimental diets (n=6) containing different protein sources: only casein (CAS), diet with 80% casein supplemented with 20% (w/w) “pinhão” flour (PF) protein without heat treatment (NATPIN), considering 33.1 ± 1.4 g of protein/kg of this flour, diet with 80% casein and 20% PF dried at 50°C for 16 hours (PF 50), considering 49.2 ± 0.6 g of protein/kg of this flour and diet with 80% casein and diet with 20% PF dried at 80°C for 16 hours (PF80), considering 50.5 ± 0.8 g of protein/kg of this flour and one aproteic diet (APROT). Values for weight gain, feed ingest, Protein Efficiency Ratio (PER) and Net Protein Ratio (NPR) were similar for diets CAS and PF80, and acoording to this, the Protein Digestibility Corrected Amino acid Score (PDCAAS) of PF80 was the highest of all the “pinhão” flours tested. The Chemical Score (CS) of “pinhão” flour showed similarity to the results found for other cereals, being lysine the limiting amino acid, folowed by histidine. Lowest values for all nutritional parameters were observed for diets complemented with “pinhão” flour. “Pinhão” flour heated at 80°C for 16 hours and used as supplementary in diet had the most similar results in all nutritional parameters to casein-based diets, and can be used as complementary source, substituting until 20% of a high biological value protein in food formulations.

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:53:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:08:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Dissertação (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A dengue à considerada, hoje, a arbovirose mais importante do mundo, tendo distribuiÃÃo e ressurgÃncia em todos os continentes e aumento das Ãreas de incidÃncia devido Ãs mudanÃas climÃticas. Um dos motivos que a torna tÃo importante à ausÃncia de uma vacina eficaz para os quatro sorotipos do vÃrus. Assim, para o controle dessa doenÃa à necessÃrio que haja o combate ao vetor, o mosquito Aedes aegypti. Os atuais programas de combate ao mosquito dispÃem de inseticidas sintÃticos, contudo o surgimento de populaÃÃes resistentes a esses inseticidas representa um entrave ao combate deste mosquito. Desta forma, torna-se necessÃria a busca por novas molÃculas inseticidas ou capazes de potencializar o efeito tÃxico dos inseticidas atuais. Assim, o presente trabalho teve por objetivo a obtenÃÃo de inibidores de tripsina de sementes de Leucaena leucocephala e avaliaÃÃo do potencial inseticida dessas molÃculas sobre as larvas do mosquito Ae. aegypti. Para isso, as proteÃnas presentes nas sementes de L. leucocephala foram extraÃdas, fracionadas e submetidas à cromatografia de afinidade a anidrotripsina acoplada a sepharose 4B, para a obtenÃÃo de uma fraÃÃo rica em inibidores de tripsina denominada sLlTi, a qual foi caracterizada bioquimicamente e utilizada em concentraÃÃo de 0,3 mg/mL nos ensaios de desenvolvimento das larvas do mosquito. A caracterizaÃÃo bioquÃmica do sLlTi permitiu concluir que os inibidores sÃo termorresistentes (a atividade foi mantida apÃs aquecimento por 30 min. a 100 ÂC), apresentam considerÃvel resistÃncia ao agente redutor (DTT), tendo decaimento da sua atividade inibitÃria frente a tripsina apenas quando incubado com 100 mM de DTT por 120 min, o mesmo, tambÃm, à resistente Ãs variaÃÃes de pH na faixa de 2 a 10. Os zimogramas reversos revelaram a presenÃa de bandas proteicas com massa molecular aparente de 20 kDa. Testes biolÃgicos in vitro mostraram que o sLlTi apresenta atividade inibitÃria superior a 90% frente a tripsina e 70% frente ao homogenato intestinal de larvas de Ae. aegypti. ApÃs a realizaÃÃo de eletroforese bidimensional, foi possÃvel a visualizaÃÃo de isoformas com pI entre 4 e 7, aproximadamente. Esses inibidores sÃo capazes de inibir as proteases de larvas de Ae. aegypti in vivo em 56%, causando retardo no desenvolvimento e cerca de 70% de mortalidade. Assim, o sLlTi possui potencial aÃÃo inseticida contra o mosquito vetor da dengue. / Dengue fever is currently the most important arboviral disease in the world, being widely distributed among the continents and having increased incidence areas due to climate change. One of the reasons that makes it so important is the absence of an effective vaccine against the four virus serotypes. So, to control this disease is necessary to fight the disease vector, the mosquito Aedes aegypti. Nowadays, health programs use synthetic insecticides to control the mosquito populations. However, the emergence of resistant populations to these insecticides is an obstacle to combating this mosquito. Thus, it is necessary to search for new insecticides or molecules capable of enhancing the toxic effect of current insecticides. The present study aimed to obtain trypsin inhibitors from Leucaena leucocephala seeds and evaluate the insecticidal potential of these molecules against Ae. aegypti larvae survival and development. For this, the proteins of L. leucocephala seeds were extracted, fractionated and subjected to anhydrotrypsin affinity chromatography to obtain a trypsin-enriched fraction (called sLlTi), which was biochemically characterized and used at a concentration of 0.3 mg/mL in assays of larvae development. Biochemical characterization of sLlTi concluded that the inhibitors are heat resistant (the activity was retained after heating for 30 min at 100  C), showed considerable resistance to the reducing agent DTT and reduction of their inhibitory activity against trypsin was demonstrated only when incubated with 100 mM DTT for 120 min. The inhibitor is also resistant to pH changes in a range from 2 to 10. The reverse zymograms revealed the presence of protein bands with apparent mass near 20 kDa. Biological testing in vitro showed that the sLlTi showed trypsin inhibitory activity greater than 90% and that sLlTi is also capable to inhibit Ae. aegypti digestive enzymes by 70%. After two-dimensional electrophoresis isoforms with pI ranging from 4 to 7, approximately, were observed. These inhibitors were able to inhibit proteases of Ae. aegypti in vivo by 56%, and was capable to delay the larval development after incubation for 10 days. Thus, sLlTi contains proteins with promising insecticidal action against dengue vector.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / As plantas sintetizam proteÃnas que possuem propriedades antimicrobianas, podendo ser utilizadas em substituiÃÃo aos defensivos quÃmicos no campo e como fonte de novas drogas para o controle de infecÃÃes bacterianas em humanos. Dentre as diversas estruturas vegetais, ÃrgÃos reprodutivos como as flores parecem ser uma fonte promissora de tais molÃculas ativas contra patÃgenos, particularmente se considerado o seu relevante papel fisiolÃgico, o qual deve ser preservado. Nesse contexto, a presente pesquisa experimental teve como objetivos a prospecÃÃo de proteÃnas com aÃÃo antimicrobiana em flores silvestres e posterior purificaÃÃo, caracterizaÃÃo bioquÃmica e avaliaÃÃo da atividade antimicrobiana de um inibidor de tripsina presente em flores de Cassia fistula Linn. (Chuva-de-ouro). O extrato total das flores de C. fistula foi preparado em tampÃo fosfato de sÃdio 50 mM, pH 7,5. Esse extrato apresentou atividade inibitÃria de tripsina (42,41 Â 0,35 UI/mgP) e de papaÃna (27,10 Â 0,23 UI/mgP), alÃm de mostrar a presenÃa de peroxidase (20,0 Â 0,18 UAP/mgP) e quitinase (1,70 Â 0,21 ηkatal/mgP), estando ausentes as atividades hemaglutinante, β-1,3-glucanÃsica, ureÃsica e proteÃsica. O inibidor de tripsina de C. fistula, denominado CfTI, foi purificado do extrato total por fracionamento com Ãcido tricloroacÃtico (2,5%), seguido de cromatografias de afinidade (anidrotripsina-Sepharose-4B) e fase reversa (Vydac C-18TP 522). CfTI Ã uma glicoproteÃna com massa molecular aparente de 22,2 kDa, pI 5,0 e sequÃncia NH2-terminal exibindo alta similaridade com o inibidor de tripsina da soja do tipo Kunitz (SBTI). O inibidor mostrou-se pouco estÃvel ao calor, reduzindo sua atividade inibitÃria para 23,4% quando incubado a 60 ÂC, durante 15 minutos. No entanto, ele se mostrou bastante estÃvel a variaÃÃes no pH. CfTI (100 Âg/mL) retardou o crescimento dos fungos fitopatogÃnicos de importÃncia agrÃcola, Colletotrichum lindemuthianum e Fusarium solani, alÃm de apresentar atividade antibacteriana frente Ãs bactÃrias patogÃnicas ao homem, Staphylococcus aureus e Enterobacter aerogenes. Os resultados obtidos demonstram o potencial das flores como fonte diversificada de proteÃnas bioativas, evidenciando o inibidor de tripsina presente em flores de C. fistula, fomentando sua aplicaÃÃo biotecnolÃgica frente a fungos e bactÃrias de relevÃncia para a Agricultura e SaÃde. / Plants synthesize proteins that have antimicrobial properties, which can be used to substitute chemical pesticides in agriculture and as new drugs for the control of bacterial infections in humans. Among the various plant structures, the flowers seem to be a promising source of active molecules against pathogens, particularly if considered its important physiological role, which should be preserved. Therefore, this experimental research aimed at the prospection of novel proteins with antimicrobial activity in wild flowers and to subsequent purification, biochemical characterization and evaluation of antimicrobial activity of a trypsin inhibitor present in flowers of Cassia fistula Linn (the golden shower tree). The total extract of C. fistula flowers was prepared in 50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.5. This extract presented trypsin inhibitory activity (42.41 Â 0.35 IU/mgP) and papain (27.10 Â 0.23 IU/mgP), besides to the presence of peroxidase (20.0 Â 0.18 UAP/mgP) and chitinase (1.70 Â 0.21 ηkatal/mgP). On the other hand, the hemagglutinating, β-1,3-glucanase, protease and urease activities were not detected. The trypsin inhibitor of C. fistula, named CfTI, was purified by fractionating the crude extract with trichloroacetic acid (2.5%) followed by affinity (anidrotripsina-Sepharose-4B) and reverse phase (Vydac C-18TP 522) chromatographies. CfTI is a glycoprotein with an apparent molecular mass of 22.2 kDa, pI 5.0 and NH2-terminal sequence showing high similarity with Kunitz soybean trypsin inhibitor (SBTI). The inhibitor was not stable to heat, and loss 23.4% when incubated at 60 ÂC for 15 minutes. However, it proved to be stable to changes of pH. CfTI (100 Âg/mL) slowed the growth of pathogenic fungi of agricultural importance, Colletotrichum lindemuthianum and Fusarium solani, and also presented antibacterial activity against the human pathogenic bacteria, Staphylococcus aureus and Enterobacter aerogenes. The results demonstrate the potential of the flowers as a source of diverse bioactive proteins, as the trypsin inhibitor present in C. fistula flowers, promoting its biotechnological potential application against fungi and bacteria of relevance to Agriculture and human health.

Orientador: Maria Ligia Rodrigues Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T12:29:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ramos_VanessadaSilveira_M.pdf: 1587017 bytes, checksum: 9b8d97615e6656343053ce2fd7f519ba (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Inibidores de proteinases (IPs) são amplamente distribuídos em animais, microorganismos e plantas. IPs de plantas são geralmente proteínas pequenas que tem sido principalmente descritas como ocorrendo em órgãos de reserva, tais como sementes e tubérculos, mas eles também foram encontrados nas partes aéreas da planta, nas folhas, flores e raízes. O possível papel sugerido para inibidores de proteinase de sementes inclui a função como parte do sistema defensivo da planta contra pragas via inibição de suas enzimas proteolíticas. A atividade dos IPs é devido a sua capacidade de formar complexos estáveis com as proteases alvos, bloqueando, alterando ou prevenindo o acesso ao sítio ativo da enzima. Lepidoptera são insetos que frequentemente atacam uma ampla variedade de culturas, causando alto dano econômico. A. kuehniella é encontrada mundialmente, este inseto ataca grão estocados e produtos de arroz, aveia, centeio, milho e trigo. Neste trabalho, um inibidor purificado das sementes de Plathymenia foliolosa (Mimosoideae) ¿ PFIT foi utilizado em dietas artificiais, e através de bioensaios seu potencial tóxico contra A. kuehniella foi determinado. A ingestão de PFIT resultou em uma redução significativa na sobrevivência e no peso larval (32,3% e 66,1% respectivamente) e também reduziu a viabilidade larval e o peso das pupas (35,7% e 9,1% respectivamente). Os resultados dos experimentos nutricionais realizados com larvas de A. kuehniella apresentaram uma redução na eficiência de conversão do alimento ingerido (ECI) e alimento digerido (ECD), e um aumento na digestibilidade aproximada (AD) e no CM (custo metabólico). Para examinar o efeito da proteína sobre o inseto, a atividade das proteinases intestinais das larvas que se alimentaram em dietas livres do inibidor e alimentadas em dieta contendo o inibidor a 0,7% foi comparada através de ensaios enzimáticos e eletroforese em géis de atividade enzimática. As larvas de quarto instar alimentadas em dieta contendo PFIT apresentaram uma diminuição na atividade tríptica do intestino e um aumento na atividade tríptica das fezes, confirmado por ensaios enzimáticos e na eletroforese de atividade. Além disso, a atividade tríptica das larvas que se alimentaram em dieta com PFIT foi sensível à inibição por PFIT. Estes resultados sugerem que PFIT possui efeitos anti-metabólicos quando ingeridos por A. kuehniella / Abstract: Proteinase inhibitors (PIs) are widely distributed in animals, microorganisms, and plants. Plant PIs are generally small proteins that have mainly been described as occurring in storage tissues, such as tubers and seeds, but they have also been found in the aerial parts of plants, in the leaves, flowers and roots. The possible roles suggested for seed proteinase inhibitors include the function as a part of the plant defensive system against pest via inhibition of their proteolytic enzymes. The activity of PIs is due to their capacity to form stable complexes with target proteases, blocking, altering or preventing access to the enzyme active site. Lepidoptera are often insects which attack a wide range of crops, causing damage high economic value. A. kuehniella is found worldwide, this insect attacks stored grains, and products of rice, oat, rye, corn and wheat. In this report, the pure inhibitor from seeds of Plathymenia foliolosa (Mimosoideae) ¿ PFTI was monitoring by an insect bioassay its toxic activity toward A. kuehniella. The chronic ingestion of PFTI did result in a significant reduction in larval survival and weight (32.3% and 66.1% respectively) and also reduced the larval viability and the weight of pupae (35.7% and 9.1% respectively). The results from nutritional experiments realized with A. kuehniella larvae presented a reduction in efficiency of conversion of ingested food (ECI) and digested food (ECD), and an increase in approximate digestibility (AD) and CM (metabolic cost). To examine the protein effects on insect, the midgut proteinases of A. kuehniella larvae reared on artificial PI-free diet and on a diet containing PFTI at 0.7% were compared by using enzymatic assays and polyacrilamide gel electrophoresis. The fourth instar larvae reared on a diet containing PFTI showed a decrease in tryptic activity of gut and increase in tryptic activity of faeces, as confirmed by BApNA as substrate and by activity in gels. In addition, the tryptic activity in PFTI-fed larvae was sensitive to PFTI. These results suggest that PFTI have a potential antimetabolic effect when ingested by A. kuehniella / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

A semente da Araucaria angustifolia, denominada pinhão, é consumida no Sul e Sudeste do Brasil, como farinha em pratos regionais ou cozida. Há relativamente pouca informação a respeito da composição química e do valor nutricional da semente e de sua farinha. Neste trabalho, a farinha de pinhão, obtida através de diferentes tratamentos térmicos foi avaliada como complemento protéico em um experimento biológico com ratos recém-desmamados. Os animais experimentais consumiram cinco dietas (n=6) com diferentes fontes de proteína: dieta com caseína (CAS), dieta com 80% caseína e 20% (w/w) proteína de farinha de pinhão (PF) sem tratamento térmico (NATPIN), considerando 33.1 ± 1.4 g de proteína/kg desta farinha, dieta com 80% caseína e 20% PF seca a 50°C por 16 horas (PF50), considerando 49.2 ± 0.6 g de proteína/Kg desta farinha, dieta com 80% caseína e 20% PF seca a 80°C por 16 horas (PF80), considerando 50.5 ± 0.8 g de proteína/kg desta farinha e dieta aprotéica (APROT). Os valores de ganho de peso, ingesta de alimento, Coeficiente de Eficácia Alimentar (PER) e Razão Protéica Líquida (NPR) foram similares para as dietas CAS e FP80. O escore químico de aminoácidos corrigido pela digestibilidade protéica (PDCAAS) da PF80 foi o mais alto nas farinhas de pinhão testadas. O escore químico (CS) da farinha de pinhão se mostrou semelhante ao encontrado em outros cereais, sendo a lisina o principal aminoácido limitante, seguida da histidina. Valores mais baixos em todos os parâmetros nutricionais foram encontrados nos animais alimentados com dietas onde foi usada a farinha de pinhão. A farinha de pinhão seca a 80°C por 16 horas mostrou resultados similares nos parâmetros nutricionais ao grupo CAS, e pode ser utilizada, substituindo até 20% de uma proteína de alto valor biológico (AVB) em formulações alimentares. / The seeds of Araucaria angustifolia, namely “pinhão”, are consumed in South and Southeast of Brazil, like flour in regional dishes or baked. There is relatively few information about the chemical composition and nutritional value of the seed and its flour. In this work, “pinhão” flour obtained by different heat treatments was evaluated as an additive in biological experiment for growing rats. Wistar rats were fed five experimental diets (n=6) containing different protein sources: only casein (CAS), diet with 80% casein supplemented with 20% (w/w) “pinhão” flour (PF) protein without heat treatment (NATPIN), considering 33.1 ± 1.4 g of protein/kg of this flour, diet with 80% casein and 20% PF dried at 50°C for 16 hours (PF 50), considering 49.2 ± 0.6 g of protein/kg of this flour and diet with 80% casein and diet with 20% PF dried at 80°C for 16 hours (PF80), considering 50.5 ± 0.8 g of protein/kg of this flour and one aproteic diet (APROT). Values for weight gain, feed ingest, Protein Efficiency Ratio (PER) and Net Protein Ratio (NPR) were similar for diets CAS and PF80, and acoording to this, the Protein Digestibility Corrected Amino acid Score (PDCAAS) of PF80 was the highest of all the “pinhão” flours tested. The Chemical Score (CS) of “pinhão” flour showed similarity to the results found for other cereals, being lysine the limiting amino acid, folowed by histidine. Lowest values for all nutritional parameters were observed for diets complemented with “pinhão” flour. “Pinhão” flour heated at 80°C for 16 hours and used as supplementary in diet had the most similar results in all nutritional parameters to casein-based diets, and can be used as complementary source, substituting until 20% of a high biological value protein in food formulations.

Orientadores: Maria Lígia Rodrigues Macedo, Ricardo Aparício / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T17:21:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_CaioFernandoRamalhode_M.pdf: 5489630 bytes, checksum: 6240754a8c7ab9bd7931534cadba14a6 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Diversas pesquisas buscam candidatos para o controle alternativo de pragas agrícolas, uma vez conhecidos os malefícios oriundos do emprego de inseticidas químicos nas lavouras. Neste trabalho, um inibidor de tripsina isolado de sementes de Entada acaciifolia (Mimosoideae) - (EATI) foi purificado e caracterizado sob o ponto de vista funcional e estrutural. O inibidor mostrou-se estável a variações térmicas e de pH, alem de apresentar sua atividade inibitória inalterada tanto na forma oxidada quanto na forma reduzida com 100 mM de DTT. Quando submetido a cromatografia liquida de alta eficiência em coluna C-18, EATI foi resolvido em 4 picos, indicando a presença de 4 isoformas, sendo que a isoforma majoritária apresentou uma massa acurada de 19.725 Daltons, revelada através de espectrometria de massa MALDI-TOF. Outras características como a estequiometria de inibição, a constante de inibição (Ki), a analise da composição global de aminoácidos e o sequenciamento N-terminal permitiram classificar EATI como membro da família Kunitz de inibidores de serinoprotease. Estudos de dicroísmo circular revelaram um alto conteúdo de fohas-? e estruturas não ordenadas alem da aparente ausência de ?-helices, padrão comum a esta classe de proteínas. A incubação em 1 mM de DTT resultou em perturbações em sua cadeia polipeptídica, corroborando os ensaios in vitro. EATI foi resistente a desnaturação por uréia, característica relatada para outros inibidores vegetais. O inibidor apresentou uma interessante atividade inibitória in vitro contra as proteases de diversos insetos-praga. De acordo com estes resultados, apontamos EATI como uma ferramenta promissora no combate a pragas agrícolas / Abstract: Several studies seeking alternative candidates for the control of agricultural pests, once known harm from the use of chemical insecticides in crops. In this work, a trypsin inhibitor isolated from Entada acaciifolia seeds (Mimosoideae) - (EATI) was purified and characterized from the point of view unctional and structural. The inhibitor was stable to thermal heat and pH range, in addition to its inhibitory activity unchanged in both the oxidized and in reduced form with 100 mM DTT. When subjected to high performance liquid chromatography on C-18 column, EATI was resolved in four peaks, indicating the presence of four isoforms, with the major isoform showing an accurate mass of 19,725 Daltons, as revealed by MALDI-TOF mass spectrometry. Other characteristic such as stoichiometry of inhibition, the dissociation constant (Ki), the analysis of global amino acid composition and N-terminal sequencing allowed to classify EATI as member of the Kunitz family of serine protease inhibitors. Circular dichroism studies revealed a high content of ?- sheets and unordered structures beyond the apparent absence of ?-helix, typical of this class of proteins. Incubation in 1 mM DTT resulted in small perturbations in their polypeptide chain, corroborate the in vitro assays. EATI was resistant to denaturation by urea, a characteristic reported for other plant inhibitors. The inhibitor presented an interesting inhibitory activity in vitro against the proteases of several insect pests. According to these results, we focused EATI as a promising tool in the fight against agricultural pests / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:53:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:08:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / As serino proteases participam de diversos processos fisiológicos (tal como o de coagulação) e patológicos. Essas enzimas estão amplamente distribuídas entre as espécies, são também toxinas dos venenos de serpentes, sendo denominadas SVSPs (snake venom serine proteases). Essas SVSPs são multifuncionais e contêm uma tríade catalítica formada pelos aminoácidos HDS. Algumas SVSPs são comercialmente disponíveis, sendo indicadas para o tratamento de infarto do miocárdio, tromboses e embolia pulmonar. No veneno de Crotalus durissus terrificus estão descritas até o momento, apenas duas SVSPs sendo que a mais estudada é a giroxina que representa cerca de 2,5% do veneno total. No presente estudo foi reportado a clonagem de sete serino proteases amplificadas a partir de uma biblioteca de cDNA de glândula de veneno de um único espécime adulto de Crotalus durissus terrificus. Estes clones foram analisados com relação à organização do cDNA, estrutura e prováveis funções. A construção do modelo tridimensional da giroxina permitiu verificar as similaridades com tripsina, trombina e outras SVSPs. A glicosilação e a presença de muitas pontes dissulfetos dificultam a obtenção das SVSP recombinantes na forma solúvel e com atividade, por expressão em E.coli. Assim, neste trabalho foi abordada a expressão em células de mamífero (que realiza as modificações pós-traducionais) com resultados promissores. Para tanto, o peptídeo sinal de Igk, a seqüência madura e a região 3 UTR da giroxina foram clonados no vetor pED, originando um novo vetor (pED-Giro). Este vetor carrega o peptídeo sinal de Igk, o que possibilitou a secreção da giroxina para o meio de cultura. O vetor pED-Giro foi transfectado em células CHO DXB11 dhfr e COS-7. A giroxina foi detectada no extrato total das células COS-7 por western blot e, em seguida, purificada do meio de cultura com coluna de afinidade (Benzamidina Sepharose) e demonstrado sua integridade pelo ensaio de atividade esterásica. / Dissertação (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Orientador: Maria Ligia Rodrigues Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T03:11:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kubo_CarlosEduardoGavira_M.pdf: 1973367 bytes, checksum: afd46afbc30805315577f477defd25c7 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: As plantas sintetizam inibidores de proteinases (IPs) como um dos mecanismos de defesa contra o ataque de insetos-praga e patógenos. Os IPs são polipeptídios hábeis em se ligar às enzimas proteolíticas localizadas no intestino médio dos insetos, impedindo sua atividade proteolítica por inibição competitiva. Esse processo leva a uma redução da disponibilidade de aminoácidos para a síntese protéica, e desta maneira, a uma redução no crescimento e desenvolvimento por parte do inseto. Portanto, os IPs são considerados fatores anti-metabólicos. Heliothis virescens (Fabr., 1781) (Lepidoptera: Noctuidae) é uma mariposa, cujas larvas atacam principalmente culturas em campo como: alfafa, algodão, soja e fumo. Entretanto, ocasionalmente podem atacar também culturas como couve, alface, ervilha, pimentão, guandu, abóbora e tomate. Neste trabalho, um inibidor purificado das sementes de Adenanthera pavonina L. (Mimosaceae) ¿ ApTI foi utilizado em dietas artificiais, e através de bioensaios seu potencial inseticida contra H. virescens foi determinado. A inibição in vitro de proteinases do inseto por ApTI sugerem que o inibidor possua efeitos anti-metabólicos quando ingeridos pelas larvas . Entretanto, a ingestão de ApTI não resultou em uma redução significativa no crescimento e desenvolvimento do inseto. Não sendo observadas diferenças na mortalidade larval, no ganho de peso e no tempo de desenvolvimento larval e pupal. A fim de estudar a adaptação das lagartas à presença do inibidor, a atividade das proteinases intestinais das larvas que se alimentaram em dietas livres do inibidor e alimentadas em dieta contendo o inibidor a 0,4% foi comparada através de ensaios enzimáticos e eletroforese em géis de atividade enzimática. As larvas de quarto instar alimentadas em dieta contendo ApTI apresentaram um aumento de cerca de duas vezes na atividade tríptica, confirmado por ensaios enzimáticos e na eletroforese de atividade. Além disso, a atividade tríptica das larvas que se alimentaram em dieta com ApTI é menos sensível a inibição por ApTI, indicando que novas enzimas mais resistentes ao inibidor foram produzidas. Estes resultados sugerem que as larvas de H. virescens foram capazes de se adaptarem fisiologicamente ao inibidor pela superprodução de enzimas do tipo tripsina existente e pela produção de um novo tipo de enzima do tipo tripsina que é menos susceptível a ação inibitória de ApTI / Abstract: Proteinase inhibitor proteins (PIs) are one of the defensive chemicals produced by plants against pests and pathogens. PIs are polypeptides that are able to bind to insect midgut proteolytic enzymes, rendering them inactive by competitive inhibition. This process leads to a limitation of essential amino acids in protein synthesis, and thus, to reduction in growth and development. Therefore, PIs are known as antinutritional factors. The tobacco budworm, Heliothis virescens (Fabr., 1781) (Lepidoptera: Noctuidae) is a polyphagous insect larvae that is principally a field crop pest, attacking such crops as alfalfa, cotton, soybean and tobacco. However, it sometimes attacks such vegetables as cabbage, lettuce, pea, pepper, pigeon pea, squash, and tomato, especially when cotton or other favored crops are abundant. In this report, the pure inhibitor from seeds of Adenanthera pavonina L. (Mimosaceae) ¿ ApTI was monitoring by an insect bioassay its insecticidal activity toward H. virescens. The in vitro inhibitions of proteinases activities by ApTI suggest that ApTI would have a potential antimetabolic effect when ingested by insect larvae. However, chronic ingestion of ApTI did not result in a significant reduction of growth and development of tobacco budworm. No differences in larval mortality, weight gain, larval and pupal developmental time were observed. To study this adaptation, the midgut proteinases of H. virescens larvae reared on artificial PI-free diet and on a diet containing ApTI at 0.4% were compared by using enzymatic assays and polyacrilamide gel electrophoresis. The fourth instar larvae reared on a diet containing ApTI showed a 2-fold increase in tryptic activity, as confirmed by BApNA as substrate and by activity in gels. In addition, the tryptic activity in ApTI-fed larvae was less sensitive to ApTI, indicating that novel proteolytic form resistant to ApTI was induced in larvae reared on a diet containing this inhibitor. These results suggest that H. virescens larvae were able to physiologically adapt to inhibitor by overproduction of an existing trypsin-like enzyme and production of a new type of trypsin-like enzyme that is less susceptible to inhibitory action of ApTI / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular