As aflatoxinas são substâncias naturais que apresentam efeitos tóxicos aos humanos e são reconhecidamente carcinogênicas. Estas substâncias podem estar presentes na dieta humana ou, em casos específicos, no ar respirado. Desta maneira, a exposição humana às aflatoxinas é objeto de muita preocupação. Uma das maneiras mais eficazes de avaliar a exposição humana as aflatoxinas é através da mensuração da presença de biomarcadores da exposição a estas substâncias em fluidos biológicos. Dentre as possibilidades de biomarcadores de exposição às aflatoxinas tem-se que aflatoxina M1 (AFM1), presente na urina e leite humano, é considerada um biomarcador válido. Assim sendo, o objetivo deste trabalho de pesquisa foi avaliar a presença de AFM1 em amostras de urina provenientes de indivíduos residentes na região urbana e rural da cidade de Piracicaba-SP, assim como, de leite de gestantes de Piracicaba e cidades da região. Nos indivíduos doadores de amostras de urina foi levantado também o padrão de ingestão de alimentos com alto risco de conter aflatoxinas, através da aplicação de inquéritos de freqüência alimentar e recordatórios 24 horas. A análise de AFM1 em urina e leite foi realizada por cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE) com detecção por fluorescência. A extração e purificação do extrato foram realizadas com auxílio de colunas de imunoafinidade. No total 69 amostras de urina e 18 de leite foram analisadas. Entre as amostras de urina detectou-se a presença de AFM1 em 54 (78%) das amostras, com concentrações variando de 1,8 até 39,9 pg/mL. Não foi observada diferença estatística entre as concentrações médias detectadas entre urinas de indivíduos da zona urbana e rural, bem como no nível de consumo de produtos de risco. Apesar das concentrações de AFM1 detectadas serem inferiores as concentrações médias reportadas em outros países a freqüência de amostras positivas foi bastante elevada mostrando que as populações estudadas estão sendo expostas às aflatoxinas. Assim, melhores avaliações dos níveis de exposição necessitam ser realizados considerando que a amostragem utilizada foi pontual, pode existir variação de contaminação sazonal com aflatoxinas na dieta e a contaminação é heterogênea dentro no alimento. Não foi observada uma correlação entre o nível do consumo de produtos de risco e as concentrações detectadas em amostras de urina. Apenas uma amostra de leite apresentou contaminação detectada; entretanto, o nível de contaminação estava entre o limite de detecção (LD) e o limite de quantificação (LQ). / Aflatoxins are natural substances that present toxic and carcinogenic effects to humans. These substances may be present in human diet or, in specific cases, in the breathing air. Thus, the human exposition to aflatoxins is object of concern. One of the most effective ways to evaluate human exposition to aflatoxins is to measure the presence of biomarkers in biological fluids. Among the possibilities of aflatoxin presence biomarkers, the aflatoxin M1 (AFM1), present in human urine and milk, is considered a valid biomarker. The objective of this work was to evaluate the presence of AFM1 in urine samples from individuals who live in urban and rural areas in the county of Piracicaba, state of São Paulo, Brazil, and in milk of pregnant women from Piracicaba and neighbor cities. Urine-donor individuals were researched in relation to the ingestion of food with high risk of containing aflatoxins through the application of a food frequency questionnaire and 24-hour recall. The analysis of AFM1 in urine and milk was performed through high-performance liquid chromatography (HPLC) with fluorescence detection. The extract purification and extraction were performed with the aid of immunoaffinity columns. Overall, 69 urine and 18 human breast milk samples were analyzed. Among urine samples, the presence of AFM1 was detected in 54 (78%), with concentrations ranging from 1.8 to 39.9 pg/mL. No statistical difference was observed between average concentrations detected in the urine of individuals from urban and rural areas, as well as the consumption of aflatoxin risky food. Although the AFM1 concentrations detected are lower than those reported for other countries, the frequency of positive samples was quite high, showing that the populations studied are exposed to aflatoxins. Thus, further evaluations on the exposition levels should be performed, and considering that the sampling used in this work was punctual, there may be seasonal contamination variations in diet and the contamination level is heterogeneous within a food. No correlation between the consumption of risky food and concentrations detected in urine samples was observed. Only one milk sample presented detected contamination; however, the contamination level was between the limit of detection (LOD) and the limit of quantification (LOQ).

Na tentativa de reduzir o número de ocorrência de acidentes de trânsito, o Brasil adotou leis para restringir o consumo de álcool por motoristas e para garantir que as mesmas sejam cumpridas, o contingente policial conta com teste de etilômetro. Ao realizar o teste, se o resultado for positivo para o uso de etanol, o motorista pode ser encaminhado para uma unidade de saúde para que a coleta de sangue seja realizada, para confirmar a presença de etanol ou de outras drogas caso necessário. Porém, pode haver um longo tempo entre a abordagem do motorista e a realização da coleta de sangue, fazendo com que a concentração de etanol no organismo do motorista se altere, além disso, a coleta de sangue é um método invasivo e é necessária a presença de um profissional especializado para que seja realizada. O presente estudo propõe a utilização da saliva como matriz biológica alternativa para dosagem de etanol em motoristas, uma vez que essa matriz permite a dosagem de etanol e de outras drogas, além de permitir que a análise seja repetida, diferentemente do teste do etilômetro, desde que a cadeia de custódia for preservada. Além disso, a coleta dessa amostra não é invasiva, podendo ser realizada no local da abordagem e sob supervisão (coleta vigiada), sem necessitar de profissional especializado. Para verificar se a variação de etanol ao longo do tempo na saliva é semelhante à do ar exalado e da urina, matrizes já utilizadas na dosagem de etanol em motoristas, foi realizado um experimento de ingestão controlada de bebidas alcoólicas por voluntários sadios de maneira controlada, coletando-se amostras de saliva, urina e ar exalado nos tempos de 10, 30, 60 e 90 min após a ingestão. Na segunda etapa do estudo, foi verificado um possível interferente no teste de Etilômetro e na análise de saliva, uma vez que o limite de etanol permitido por lei atual é muito baixo, fazendo-nos questionar se o uso de produtos comuns ao dia a dia e que contém álcool em sua composição, como o enxaguatório bucal, seria capaz de gerar um resultado falso positivo para a ingestão de bebidas alcoólicas. No experimento de interferência, foram testados os seguintes enxaguatórios bucais: Anapyon®, Listerine Cool Mint®, Listerine Cuidado Total®, Cepacol®, Oral B®, Oral B complete®, e ar exalado e saliva foram coletados nos tempos de 5, 10, 15 e 20 minutos. O etanol em amostras de saliva e urina foi determinado por cromatografia em fase gasosa acoplada a detector de ionização por chama (GC-FID) e as amostras de ar exalado foram analisadas no Etilômetro Alcotest 7410 da Dräger. / In an attempt to reduce the number of traffic accidents, Brazil has adopted laws to restrict ethanol consumption among drivers, and to guarantee the effectiveness of this law, police officers make use of breathalyzers. When the breathalyzer test is performed, the results can indicate alcohol intake, in this case the driver can be routed to a health unit to collect blood, and then ethanol dosage can be made as well as other drugs if necessary. Therefore, a long time can occur between drivers approach and the blood collection, and the concentration of ethanol in blood can be altered. In addition this sample collection is invasive and needs an specialized personnel to be done. The present study proposes the use of saliva as an alternative biological matrix to ethanol dosage in drivers, once this matrix permits not only the dosage of alcohol but as well as other drugs, and this analysis can be repeated, if the chain of custody has been preserved. Besides, saliva has a non invasive way of collection and can be done under supervision and does require specialized personnel. To verify if the range of ethanol concentration in saliva is the same found in urine and breath, matrixes already used to monitor drivers in traffic, an experiment of alcohol intake in a controlled manner was performed, and urine, saliva and breath were collected in 10, 30, 60 and 90 minutes after alcohol intake. In a second stage of this study, a possible interfering in the breathalyzer test and in saliva analysis was investigated, since the limit if ethanol permitted for drivers in now very low, making us wonder whether the use of products like mouthwashes, that contain ethanol in its composition is capable of generate an false positive result for alcohol intake. It was tested the following mouthwashes: Anapyon, Listerine Cool Mint, Listerine Cuidado Total, Cepacol, Oral B , Oral B complete. Breath and saliva were collected in 5, 10, 15 and 20 minutes after the mouthwashes use. The ethanol in saliva and urine was determined using Gas Chromatography with Flame Ionization Detector (GC-FID), and the ethanol in breath was analyzed using Alcotest 7410 breathalyzer by Dräger.

Metodologia proteômica baseada em eletroforese bi-dimensional (2D-PAGE) foi usada para auxiliar no entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na injúria renal induzida pelo flúor (F) e definir biomarcadores potenciais para fluorose. Três grupos de ratos Wistar machos recém-desmamados (21 dias de vida) foram tratados com água de beber contendo 0 (controle), 5 ou 50 ppm F, por 60 dias (n=6/grupo). Durante o período experimental, os animais foram mantidos individualmente me gaiolas metabólicas, a fim de que o consumo de água e ração fosse avaliado, bem como as excreções urinária e fecal de F. Os animais foram mortos e o rim esquerdo e o soro foram coletados para análises histopatológica e de F, respectivamente. Para análise proteômica foram coletados o rim direito e a urina (no dia anterior ao sacrifício, num coquetel contendo inibidores de protease em gelo). Após o isolamento das proteínas, os perfis proteômicos renal e urinário foram examinados usando 2D-PAGE e coloração com azul de Coomassie brilhante. Foi possível detectar uma doseresposta em relação à ingestão e excreção de F, bem como em relação aos níveis de F presentes no soro e nos rins dos animais. As análises histológicas não revelaram danos aos rins induzidos pelo F, com exceção de uma congestão vascular no grupo de 50 ppm F. Para os rins, a análise quantitativa de intensidade (software Image Máster Platinum, alterações de 2 vezes) revelou 30 e 17 proteínas diferencialmente expressas, respectivamente, entre os grupos controle X 50 ppm F e controle X 5 ppm F. Para a urina, 9, 10 e 13 proteínas aumentaram ou diminuíram nos grupos controle X 5 ppm F, 5 ppm F X 50 ppm F e controle X 50 ppm F, respectivamente. Nove proteínas foram identificadas satisfatoriamente por MALDI-TOF TOF MS. As proteínas identificadas estão relacionadas principalmente ao metabolismo, desintoxicação e housekeeping. Esses dados indicam que a análise proteômica de rim e urina de animais tratados com F é capaz de identificar proteínas diferencialmente expressas, mesmo em casos de baixas doses de F. Assim, essa ferramenta pode contribuir para o entendimento dos mecanismos envolvidos na fluorose, apontando proteínas-chave que deveriam ser melhor investigadas, bem como potenciais biomarcadores de toxicidade. / Two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE) based proteomics approach was used to better understand the molecular mechanisms of renal injury induced by fluoride (F) and define potentials biomarkers of fluorosis. Three groups of weanling male Wistar rats (21 days old) were treated with drinking water containing 0 (control), 5, or 50 ppm F for 60 days (n=6/group). During the experimental period, the animals were kept individually in metabolic cages, in order to analyze the water and food consumption, as well as fecal and urinary F excretion. Animals were killed and left kidney and serum were collected for histopathological examination and F analysis, respectively. For proteomic analysis, right kidney and urine (one day before sacrifice, in protease-inhibitors cocktail for 8 hours in ice box) were collected. After protein isolation, renal and urinary proteome profiles were examined using 2D-PAGE and coomassie brilliant blue staining. It was possible to detect a dose-response regarding F intake and F excretion, as well as F levels in serum and kidneys. The histological analysis revealed no damage in kidneys induced by F, except for a vascular congestion in the 50 ppm F group. For kidney, quantitative intensity analysis (Image Master Platinum software, 2-fold changes) revealed 30 and 17 differentially expressed proteins between control X 50 ppm F, and control X 5 ppm F groups, respectively. As for urine, 9, 10 and 13 proteins increased or decreased in control X 5 ppm F, 5 ppm F X 50 ppm F and control X 50 ppm F groups, respectively. Nine proteins were successfully identified by MALDI-TOF TOF MS. The identified proteins are mainly related with metabolism, detoxification and housekeeping. These data indicate that proteomic analysis in kidney and urine of F-treated animals is able to identify differentially expressed proteins, even in cases of low F doses. Thus, this approach can contribute for the understanding of the mechanisms underlying fluorosis, by indicating key-proteins that should be better addressed, as well as potential toxicity biomarkers.

A disfunção tireoidiana durante a gestação cursa com maior morbidade materno-fetal. A deficiência de iodo continua sendo uma causa importante de disfunção tireoidiana. O estado de São Paulo é considerado uma região suficiente em iodo. No entanto, as gestantes são consideradas grupo de risco para deficiência iódica devido a maior necessidade de produção dos hormônios tireoidianos ao longo da gestação. Este trabalho objetiva avaliar a suficiência iódica de gestantes residentes em São Paulo e correlacionar as concentrações de iodo com os valores dos hormônios tireoidianos em cada trimestre de gestação. Métodos: Foi realizado estudo transversal com gestantes em pré-natal de baixo risco nos três trimestres de gestação. Foram analisadas 251 mulheres sem doença tireoidiana prévia ou atual, com autoanticorpos antitireoidianos negativos e que não estavam em uso de polivitamínico contendo iodo. A concentração de iodo urinário foi feita em amostra isolada pelo método Sandell- Kolthoff. As dosagens de TSH, T4, T3, T4 livre (T4L), T3 livre (T3L), tireoglobulina (TG), globulina ligadora da tiroxina (TBG) anticorpo antitireoperoxidase (AntiTPO), antitireoglobulina (AntiTG), estradiol e hCG foram feitas por método eletroquimioluminescente. Ultrassonografia da tireoide foi realizada com aparelho Philips IU-22 e transdutor 7,5-12 mHz. Resultados: Os valores de TSH correspondentes aos percentis 2,5 e 97,5 foram 0,38 uIU/mL e 4,23 uIU/mL, respectivamente. Observou-se valores de TSH > 2,5-3,0 uIU/mL em 13,1% gestantes. Valores de TSH > 4 uIU/mL foi observado em 3,6% dos casos. Os valores de T4T e T3T correspondentes aos percentis 2,5 e 97,5 foram 7,8 ug/dL e 16,1 ?g/dL; 122 ng/dL e 249 ng/dL, respectivamente. Os valores de T4l e T3l correspondentes aos percentis 2,5 e 97,5 foram 0,76 ng/dL e 1,42 ng/dL; 0,21 ng/dL e 0,36 ng/dL, respectivamente. Houve aumento significativo na relação T3:T4 ao longo dos trimestres e, em 8% das amostras, essa relação estava acima do valor de referência para gestantes. As dosagens de iodúria não apresentaram diferenças estatísticas entre os três trimestres da gestação. As medianas foram 135ug/L, 153ug/L e 140ug/L, respectivamente. Encontramos iodúria < 150ug/L em 52,2% das gestantes. Comparando o grupo com iodúria < 150ug/L (deficiente em iodo) e o grupo com iodúria entre 150-250ug/L (suficiente em iodo), observou-se diferença significativa nos valores de TSH e de T3 nas gestantes do 2o Trimestre (média de TSH = 2,24 uIU/mL e TSH = 1,78 uIU/mL e média de T3 = 196 ng/dL e T3 = 181 ng/dL entre o grupo deficiente e suficiente, respectivamente). Não houve diferenças significativas entre os valores de TG e o volume tireoidiano ao longo dos trimestres. Conclusão: A frequência de hipotireoidismo subclínico variou de 3,6% a 13,1%, dependendo dos critérios adotados. Não foi possível estabelecer a frequência de hipotiroxinemia materna, devido à ausência de valores de corte de T4l estabelecido na nossa população. Foi encontrada deficiência iódica em 52,2% das gestantes avaliadas. Embora estas gestantes apresentem deficiência leve de iodo, foram necessários mecanismos adaptativos para equilibrar a função tireoidiana materna com possível produção preferencial de T3, aumento da relação T3:T4 e valores mais elevados de TSH. Conclui-se que, embora esta seja uma região suficiente em iodo, as mulheres poderiam se beneficiar com a suplementação deste nutriente durante a gestação / Thyroid dysfunction in pregnancy is associated with increased rate of obstetrical and neonatal adverse outcomes. Iodine deficiency continues to be a major cause of thyroid dysfunction. The state of São Paulo is considered a sufficient iodine region. However, pregnant women are considered a risk group for iodine deficiency due to an increased demand for production of thyroid hormones throughout pregnancy. This study aims to evaluate the iodine sufficiency of pregnant women in São Paulo and to correlate iodine concentrations with thyroid parameters in each trimester of gestation. Methods: A cross-sectional study was carried out with low-risk pregnant women in the three trimesters of gestation. We analyzed 251 women without history of thyroid disease, with negative antithyroid autoantibodies (anti TPO and anti TG) and who were not taking iodine supplementation. The urinary iodine concentration (UIC) was measured by the Sandell-Kolthoff digestion method in casual morning urine samples. Serum TSH, T4, T3, free T4 (FT4), free T3 (FT3), thyroglobulin (TG), TBG, anti-TPO, anti-TG, estradiol and hCG were measured by the electrochemiluminescence method. Thyroid ultrasound was performed with Philips IU-22 and 7.5-12 mHz transducer. RESULTS: The TSH values corresponding to the 2.5 and 97.5 percentiles were 0.38 IU/mL and 4.23 IU/mL, respectively. TSH levels > 2.5-3.0 IU/mL were observed in 13.1% pregnant women. TSH values > 4 IU/mL were observed in 3.6% of the cases. The T4T and T3T values corresponding to the 2.5 and 97.5 percentiles were 7.8 ug/dL and 16.1 ug/dL; 122 ng/dL and 249 ng/dL, respectively. The FT4 and FT3 values corresponding to the 2.5 and 97.5 percentiles were 0.76 ng/dL and 1.42 ng/dL; 0.21 ng/dL and 0.36 ng/dL, respectively. There was a significant increase in the T3:T4 ratio over the trimesters and in 8% of the samples it was above the reference value for pregnant women. The dosages of UIC did not present statistical differences between the three trimesters of gestation. The medians were 135 ug/L, 153 ug/L and 140 ug/L, respectively. We found UIC < 150 ?g/L in 52.2% of pregnant women. Comparing the group with UIC < 150 ?g/L (iodine deficient) and the group with UIC between 150-250 ug/L (sufficient in iodine), a significant difference was observed in TSH and T3 values in the 2nd trimester (TSH = 2.24 IU/mL and TSH = 1.78 IU/mL and mean T3 = 196 ng/dL and T3 = 181 ng/dL between the deficient and sufficient groups, respectively). There were no significant differences between TG values and thyroid volume over the trimesters. Conclusion: The subclinical hypothyroidism frequency ranged from 3.6% to 13.1%, depending on the adopted criteria. It was not possible to establish frequency of maternal hypothyroxinemia, due to the absence of FT4 cutoff established in our population. Iodine deficiency was found in 52.2% of pregnant women evaluated. Although these pregnant women presented mild iodine deficiency, adaptive mechanisms were necessary to balance thyroid function with possible preferential production of T3, increase in T3:T4 ratio and higher values of TSH. It is concluded that although this is an iodine sufficient region, women could benefit from supplementation of this nutrient during pregnancy

Um grupo especial de indivíduos transplantados renais mantém a função do enxerto estável após a total retirada da terapia imunossupressora, alcançando um estado imunológico chamado de Tolerância operacional. Ainda não há marcadores moleculares e celulares que discriminem a tolerância no transplante humano, e os seus mecanismos estão sendo investigados. O perfil de peptídeos presentes na urina pode trazer informações importantes sobre o estado fisiopatológico renal. Nós investigamos se a tolerância operacional apresenta um perfil diferencial de peptídeos urinários, potencialmente, relevante para diagnóstico deste estado imunológico, assim como para a compreensão de seus mecanismos. Realizamos análises qualitativas do extrato de peptídeos da urina de indivíduos dos diferentes grupos do estudo: saudáveis (SA, n=6), tolerantes operacionais (TO, n=5), rejeição crônica (RC, n=8) e estável sob terapia imunossupressora convencional (EST, n=5), utilizando a abordagem proteômica de Shotgun. Identificamos um total de 15283 diferentes peptídeos em todos os grupos, correspondentes a 646 proteínas distintas, distribuídas nos diferentes grupos: TO = 189, RC = 296, EST = 205 e no grupo SA 219 proteínas. Observamos proteínas exclusivas dos diferentes grupos: TO teve 87 proteínas exclusivas, RC 168, EST 106 e SA 108 proteínas. Apesar das proteínas exclusivas não terem sido compartilhadas por todos os indivíduos do mesmo grupo, a totalidade dos indivíduos de cada grupo apresentou várias dessas proteínas (cada indivíduo apresentou em média 15% das proteínas exclusivas de seu grupo). Das 646 proteínas identificadas, apenas 2,3% foram classificadas pelo Gene ontology como relacionadas ao sistema imune e os compartimentos celulares mais frequentes foram: núcleo 36% e citoplasma 23%. Destacamos algumas proteínas relacionadas à resposta imune, exclusivas de alguns grupos, como no grupo TO, a C-C motif chemokine 24 (CCL24) e Endothelin-1 e no grupo RC, a beta 2 microglobulina. Essas moléculas podem ter relevância nos mecanismos imunológicos desses estados clínicos. A abordagem proteômica aplicada neste trabalho permitiu a identificação de um perfil diferencial de peptídeos na urina de cada grupo diferente de estudo. Os peptídeos urinários diferenciais e suas respectivas proteínas podem ter relevância funcional ou como biomarcadores - em relação ao estado fisiológico e às diferentes evoluções clínicas no transplante renal / A special group of renal transplant recipients maintain stable graft function after the complete withdrawal of immunosuppression, achieving a state called operational tolerance. To date, there are no cellular or molecular biomarkers to discriminate human transplantation tolerance and the underlying mechanisms are being investigated. The profile of urinary peptides may provide important information about different renal physiopathological statuses. We investigated whether operational tolerance displays a differential urinary peptide profile, potentially relevant as biomarkers or for the understanding of mechanisms involved in tolerance. We performed qualitative analysis of peptide urinary extracts in individuals from different study groups: healthy (HI, n=6), operational tolerance (OT, n=5), chronic rejection (CR, n=8) e stable under conventional immunosuppression (Sta, n=5), using Shotgun proteomics. Altogether, we identified 15283 different peptides, corresponding to 646 distinct proteins, distributed in all groups: OT = 189, CR = 296, Sta = 205, and 219 proteins in HI. Several proteins were exclusively detected in specific groups: OT showed 87 exclusive proteins, CR 168, Sta 106 and HI 108 proteins. Although the exclusive proteins were not shared by all individuals from that specific group, all individuals from each group presented several of the group-exclusive proteins (each individual presented an average of 15% of the proteins exclusive to his group). Of the 646 proteins identified, only 2.3% were classified in Gene Ontology as related to the immune system and the most frequent cellular compartments were: 36% from nucleus and 23% cytoplasmic. Of notice, some proteins related to the immune response were also group-exclusive, such as, in OT, a C-C motif chemokine 24 (CCL24) and Endothelin-1, and beta 2 microglobulin in CR. These proteins may display relevant roles in the mechanisms involved in these clinical statuses. In conclusion, the proteomic approach used in this study allowed the identification of a differential urinary peptide profile in each different study groups. The differential urinary peptides and their corresponding proteins may display a relevant role functional or as biomarkers - in the state of homeostasis and in different clinical outcomes in renal transplantation

Os Poliomavírus JC e BK são os mais importantes integrantes da família Polyomaviridae, gênero Orthopolyomavirus, devido ao seu grau de patogenicidade no homem. O poliomavírus humano JC (JCV) foi isolado a partir de fragmento do cérebro de um paciente com linfoma de Hodgkin e leucoencefalopatia multifocal progressiva por Padgett e colaboradores. Já o poliomavírus humano BK foi isolado em 1971 por Gardner e colaboradores a partir da semeadura da urina de um paciente, submetido a transplante renal, em cultura de células da linhagem VERO Poucos são os dados sobre os poliomavírus humanos JC e BK em indivíduos sadios no mundo e no Brasil. Além disso, as formas de excreção e transmissão destes vírus ainda não estão completamente elucidadas. Este estudo teve como objetivos principais determinar a incidência, a dinâmica de excreção e a caracterização genotípica dos poliomavírus JC e BK em amostras sequenciais de urina de indivíduos sadios. Como objetivo secundário, foram analisados filogeneticamente os subtipos dos vírus encontrados. Foram incluídos 71 indivíduos de ambos os sexos, com idades variando entre 21 e 65 anos e destes foram coletadas amostras mensais de urina durante 6 meses. Todas as amostras do estudo foram submetidas a um teste de PCR em tempo real, que amplifica um fragmento do gene que codifica o antígeno T, e a um PCR convencional que amplifica um fragmento do gene da proteína VP1 do vírus. Ao final do período de 6 meses de acompanhamento a incidência de excreção urinária dos poliomavírus JCV e BKV na população estudada foi de 53,52% e 64,79% respectivamente. O perfil de excreção do JCV mostrou-se continuo em 42% dos casos , intermitente em 8% e esporádico em 50% dos casos. Analisando o perfil de excreção do BKV, em 80% dos casos mostrou-se esporádico, em 17% intermitente e em 3% dos casos contínuo. Posteriormente, as amostras positivas foram sequenciadas e analisadas filogeneticamente observando-se que os genótipos mais prevalentes do JCV foram o 1, subtipo 1B e 3, seguidos dos genótipos 1, subtipo 1A e 4. Com relação ao BKV, o genótipo 1, subtipo 1A foi o mais prevalente, seguido do 4 e do 1, subtipo 1B. / The Polyomavirus JC and BK are the most important members of Polyomaviridae family, genus Orthopolyomavirus, due to their degree of pathogenicity in humans. The human polyomavirus JC (JCV) was isolated from a fragment of the brain of a patient with Hodgkin\'s lymphoma and progressive multifocal leukoencephalopathy by Padgett et al. On the other hand the human polyomavirus BK was also isolated in 1971 by Gardner et al from the urine of a patient who underwent renal transplantation in VERO cell line. There are few data on human polyomavirus JC and BK in healthy individuals on the world and in Brazil. Moreover the forms of excretion and transmission of these viruses are not yet fully elucidated. This study aimed to determine the incidence, the dynamics of excretion, and the molecular characterization of polyomavirus JC and BK in serial samples of urine of healthy individuals. A secondary objective was to analyze phylogenetically the subtypes of the viruses found during the study. Were included 71 patients of both genders, aged from 21 to 65 yearsold. Urine samples were collected every month for six months. All samples in the study were screened by a real time PCR which amplifies a fragment of the T antigen gene, and to a conventional PCR that amplifies a fragment of the gene of VP1 protein of the virus. At the end of 6 months of follow-up, the incidence of urinary excretion of polyomaviruses BKV and JCV in the study population was 53.52% and 64.79% respectively The profile of excretion of JCV was continuous in 42% of cases, intermittent in 8% and sporadic in 50% of cases. The profile of excretion of BKV was shown to be sporadic in 80% of cases, intermittent in 17% and continuous in only 3% of cases. Subsequently, the positive samples were sequenced and analyzed phylogenetically showing that the more prevalent genotypes were JCV 1, subtype 1b and 3, followed by genotype 1, subtypes 1a and 4. Regarding the BKV genotype 1 subtype 1a was the most prevalent, followed by 4 and 1, subtype 1b.

A microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME) é uma técnica de preparo de amostra baseada no equilíbrio de distribuição do analito entre a fase doadora (amostra) e a fase aceptora (solvente orgânico) em um sistema ternário de solventes. Foi desenvolvida em 2006 por Rezaee e colaboradores para a determinação de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos em amostras de água e por ser uma técnica muito recente,ainda é pouca explorada para o preparo de amostras biológicas. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a DLLME como técnica para a extração da oxibutinina (OXY), fármaco usado para o tratamento da incontinência urinária, e da N-desetiloxibutinina (DEO), seu principal metabólito ativo, em amostras de urina. A análise da OXY e DEO foi realizada por eletroforese capilar (CE), utilizando um capilar de sílica fundida de 50 ?m de diâmetro interno, com comprimento efetivo de 36,5 cm, trietilamina 50 mmol/L, pH 3 como solução de eletrólito, tensão de30 kV, temperatura de 30°C e detecção em 204 nm. Nestas condições o tempo de migração da DEO foi de 7,12 min e da OXY foi de 7,42 min, com resolução de 3,1. O procedimento utilizado para preparo da amostra foi baseado na DLLME, utilizando 5 mL de urina,na qual foi adicionado 2,5% de NaCle cujo pH foi ajustado para 11. O solvente para a extração consistiu de uma mistura de 140 ?L de tetracloreto de carbono (solvente extrator) e 260 ?L de acetonitrila (solvente dispersor), que permaneceram em contato com a amostra pordois minutos. A avaliação das características de desempenho analítico apresentou faixa linear de 90-300 ng/mL para a OXY e 187,5-750ng/mL para a DEO. A recuperação absoluta foi de 71,4 e 60,9% e o limite de quantificação foi de 90 e 187,5 ng/mL para a OXY e DEO, respectivamente. Os estudos de precisão e exatidão apresentaram coeficientes de variação e erros relativos inferiores a 15% e as amostras foram estáveis nos estudos de estabilidade. Portanto, foi possível desenvolver um método rápido, fácil e confiável para analisar e quantificar a OXY e a DEO em amostras de urina por CE, usando a DLLME como técnica de preparo de amostra. / The dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) is a sample preparation technique based on the equilibrium distribution between an extraction solvent and a sample solution in a ternary solvent system. It was developed by Rezaee and co-workers in 2006 for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in water samples. Until now, for being a very recent technique it was little explored for the analysis of drugs in biological fluids. Therefore, the aim of this work was to evaluate the DLLME as an extraction technique for oxybutynin (OXY), a drug used to treat urinary incontinence, and N-desethyloxybutynin (DEO), its main active metabolite in urine samples. The OXY and DEO\'s analysis was performed by capillary electrophoresis (CE) using a 50 ?m ID fused-silica capillary with an effective length of 36.5 cm with a photodiode array detector set at 204 nm. It made use of triethylamine 50 mmol/L pH 3 as background electrolyte, voltage of +30 kV and temperature of 30°C. Under these conditions the migration time were 7.12 minutes for DEO and 7.42 minutes for OXY, with a resolution of 3.1. The sample preparation procedure was based on DLLME and used 5 mL of urine samples whichionic strength was increased by the addition of 2.5% NaCland pH were adjusted to 11. The extraction mixture consisted of 140 ?L of carbon tetrachloride (extraction solvent) and 260 ?L of acetonitrile (disperser solvent), which remained in contact with the sample for two minutes. The analytical performance\'s evaluation presented linear range of 90-300 ng/mL for OXY and 187.5-750ng/mL for DEO. The absolute recovery were 71.4 and 60.9% and the limit of quantification were 90.0 and 187.5 ng/mL for OXY and DEO, respectively. The accuracy and precision studies showed coefficients of variation and errors below 15% and the samples were stable at stability studies. Therefore, it was possible to develop a fast, reliable and easy method to analyze and quantify OXY and DEO in urine samples by CE, using DLLME as a sample preparation technique.

by Lai Wai Kai. / Thesis (M.Sc.)--Chinese University of Hong Kong, 1996. / Includes bibliographical references (leaves 70-74). / Acknowledgement --- p.iv / Abstract --- p.v / Figures and Tables --- p.vii / Abbreviations used in this study --- p.ix / Contents / Chapter 1. --- Introduction --- p.1 / Chapter 1.1 --- Biochemistry of cobalamin --- p.2 / Chapter 1.1.1 --- Biological functions of cobalamin --- p.2 / Chapter 1.1.2 --- Causes of cobalamin deficiency --- p.4 / Chapter 1.1.3 --- Significances of cobalamin deficiency --- p.7 / Chapter 1.1.4 --- Assessment of cobalamin deficiency --- p.8 / Chapter 1.2 --- Biochemistry of Methylmalonic acid (MMA) --- p.10 / Chapter 1.2.1 --- Elevation of MMA in biological fluids --- p.11 / Chapter 1.2.2 --- Significances of measurement of MMA --- p.11 / Chapter 1.2.3 --- Methods of measurement of urinary MMA --- p.13 / Chapter 2. --- Objectives of this project --- p.16 / Chapter 3. --- Materials and Methods / Chapter 3.1 --- Study subjects --- p.18 / Chapter 3.2 --- Sample collection --- p.18 / Chapter 3.3 --- Biochemical and haematological analysis --- p.18 / Chapter 3.4 --- Measurement of urinary creatinine concentration --- p.19 / Chapter 3.5 --- Measurement of serum cobalamin concentration --- p.20. / Chapter 3.6 --- GC-MS determination of urinary MMA --- p.21 / Chapter 3.7 --- Statistical analysis --- p.24 / Chapter 4. --- Results / Chapter 4.1 --- Clinical features of subjects --- p.28 / Chapter 4.2 --- General blood analysis --- p.28 / Chapter 4.3 --- Serum cobalamin analysis --- p.30 / Chapter 4.4 --- Urinary MMA analysis --- p.33 / Chapter 4.5 --- Relationship between urinary MMA excretion and age --- p.53 / Chapter 4.6 --- Relationship between urinary MMA excretion and serum cobalamin concentrations --- p.53 / Chapter 5. --- Discussions / Chapter 5.1 --- Serum cobalamin analysis --- p.62 / Chapter 5.2 --- Urinary MMA analysis --- p.62 / Chapter 5.3 --- Relationship between urinary MMA excretion and age --- p.66 / Chapter 5.4 --- Relationship between urinary MMA excretion and serum cobalamin concentration --- p.66 / Chapter 5.5 --- Relationship between urinary MMA excretion and diet --- p.68 / Chapter 6. --- Conclusions --- p.69 / Chapter 7. --- References --- p.70

Nenhuma medição é realizada com perfeição absoluta, uma vez que todos os valores encontrados são aproximações do valor real e todas as medidas, independente de sua finalidade ou qualidade, possuem uma incerteza. A incerteza de medição é um parâmetro associado ao resultado, que caracteriza a dispersão em torno dos seus valores. O conceito de incerteza de medição já é adotado em laboratórios de calibração e também muito aplicado na área de engenharia; no entanto em análises toxicológicas esta abordagem ainda é recente e há poucos relatos na literatura científica. Portanto, este trabalho teve como objetivo o estudo da incerteza de medição em análises toxicológicas confirmatórias de substâncias psicoativas - anfetaminas (anfetamina e metanfetamina), ácido 11-nor-&#916;9-tetraidrocanabinol carboxílico (THC-COOH) e benzoilecgonina - em urina, detectados pela técnica de cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS). A microextração em fase líquida (LPME) mostrou-se eficaz na determinação de THC-COOH, e após a completa validação, o método desenvolvido foi aplicado na quantificação de amostras de urina de referência provenientes do National Institute of Standards and Technology (NIST) dos Estados Unidos da América (SRM1507b - NIST). As principais contribuições para a incerteza do método foram a concentração do analito, a acurácia, seguidos da precisão e do volume de amostra. A incerteza combinada obtida foi equivalente a 8%. A LPME também apresentou-se eficiente para a extração das anfetaminas e a incerteza combinada obtida por este método foi 2,1%. No método de detecção de benzoilecgonina, a principal fonte de incerteza foi a acurácia do método e o resultado da incerteza combinada da análise de uma urina de referência (SRM1508a - NIST) foi 4,8%. Todos os valores de incerteza de medição encontrados em nosso estudo estão de acordo com as normas e referências internacionais e também são condizentes com os valores estipulados pela NIST nos laudos de análise das amostras de referência. / Neither measurement is made with absolute perfection, once all the values are approximations of the actual value and all measures, independent of its purpose or quality, have an uncertainty. Measurement uncertainty is a parameter associated with the result, which characterizes the dispersion around their values. The concept of measurement uncertainty is already used in calibration laboratories and also widely applied in engineering, however, in toxicological analysis, this approach is recent and there are few reports in the scientific literature. Therefore, this work aimed to study the measurement uncertainty in confirmatory toxicological analysis of psychoactive drugs - amphetamines (amphetamine and methamphetamine), acid 11-nor-&#916;9-tetrahydrocannabinol carboxylic acid (THC - COOH) and benzoylecgonine - in urine detected by the technique of gas chromatography-mass spectrometry (GC- MS). The liquid phase microextraction (LPME) was effective in the determination of THC-COOH, and after complete validation, the method was applied to the quantification of urine samples of reference from the National Institute of Standards and Technology (NIST) of United States of America (SRM1507b - NIST). The main contributions to the uncertainty of the method were the analyte concentration, accuracy, followed by the precision and the sample volume. The combined uncertainty obtained was equivalent to 8%. The LPME also presented efficient for the extraction of amphetamine and combined uncertainty obtained by this method was 2.1%. In the method of detection of benzoylecgonine, the main source of uncertainty was the accuracy of the method and the result of the combined uncertainty of the analysis of a urine reference (SRM1508a - NIST) was 4.8%. All values of measurement uncertainty found in our study are in accordance with international standards and references and are also consistent with the values stipulated by certificate of analysis of NIST reference samples.

Neste trabalho desenvolvemos um procedimento simples para a separação de nanoesferas ocas de carbono (do inglês Carbon Spherical Shells ou CSS) em diâmetros entre 400 e 500 nm utilizando centrifugação corroborado pelas análises realizadas na microscopia eletrônica de varredura e de transmissão. A análise de sua composição química, realizada através da técnica de fotoelétrons excitados por raios X, indicou que as CSS são constituídas de 79% de carbono e 21% de oxigênio em sua superfície, apresentando grupos funcionais carbonila e hidroxila. Plataformas sensoriais distintas foram obtidas formando filmes homogêneos das CSS sobre o eletrodo de carbonno vítreo GCE (do inglês glassy carbon electrode ou GCE). Como resultado dos experimentos eletroanalíticos, observou-se o aumento da sensitividade do eletrodo GCE/CSS de acordo com a diminuição do diâmetro (500 até 400 nm) das CSS. As plataformas sensoriais GCE/CSS com 400 nm de diâmetro apresentaram maior sensitividade (0.02 &mu;A µmol L-1) com um limite detecção de 0.2 &mu;mol L-1. Os eletrodos GCE/CSS foram estáveis, apresentando pequena interferência de espécies concomitantes presentes na amostra e seu desempenho na quantificação de paracetamol em suor mostrou-se estatisticamente equivalente ao método padrão baseado em cromatografia líquida. / We applied a simple strategy, based upon centrifugation, to separate carbon spherical shells (CSS), in sizes varying from 400 to 500 nm, which is shown by the micrographs obtained in the Scanning and Transmission Electron microscopy analysis. In their surface, carbonyl and hydroxyl groups were present, constituting a composition of 21% of oxygen and 79% of carbon. The CSS were casted on a glassy carbon electrode\'s (GCE) surface, forming a thin film, and the resulting platform was used as a sensor. A trend was observed in the results obtained by the electroanalytical experiments: as the size of the CSS were reduced, the sensibility of the GCE/CSS platform towards paracetamol detection increased. The best attained result, namely the platform with the GCE and the 400 nm diameter CSS, have shown promising results, achieving sensitivity\'s value of 0.02 &mu;A &mu;mol-1 L. The proposed sensors were stable, displaying little interference from another species coexisting in the samples, and its performance towards paracetamol detection were statistically identical to the standard method for paracetamol detection based upon liquid chromatography.