Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2018-04-19T17:29:27Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1046673 bytes, checksum: 303cdb874bd37b4e599895a7138301a8 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-19T17:29:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1046673 bytes, checksum: 303cdb874bd37b4e599895a7138301a8 (MD5) Previous issue date: 2017-07-21 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Recentemente, uma nova camada de defesa antiviral foi caracterizada em Arabidopsis thaliana, que é mediada pelo receptor NIK (NSP-Interacting Kinase) e protege a planta contra begomovirus. Quando a planta é infectada por um vírus, NIK1 oligomeriza com outro receptor imune ou com NIK1 para transfosforilar um ao outro e consequentemente, ativar o domínio cinase de NIK1. NIK1 é capaz de se ligar a proteína ribossomal L10 (RPL10), e é capaz de mediar sua fosforilação e subsequente translocação ao núcleo, onde RPL10 interage com LIMYB (L10-interacting Myb domain-containing protein) para regular negativamente a expressão de genes de proteínas ribossomais, levando a supressão global da tradução. Os mRNAs virais não são capazes de escapar ao mecanismo de regulação de tradução do hospedeiro, aumentando assim a resistência contra begomovirus. A proteína viral NSP interage com NIK1 e inibe sua atividade cinase, aumentando a patogenicidade do begomovírus em seu hospedeiro. Foi demonstrado em trabalhos anteriores que o mutante NIK1-T474D é um excelente alvo para engenharia genética, pois é constitutivamente ativada em linhagens transgênicas. Nesse trabalho, primeiramente foi realizado a reconstrução in silico da via de sinalização antiviral mediada por NIK1 em tomateiro, identificando possíveis componentes homólogos dessa via. Em seguida, foi examinada a possibilidade do duplo mutante T474D-T469A de conferir resistência contra begomovírus em linhagens transgênicas de tomateiro. Além disso, a linhagem transgênica NIK1-T474D-T469A foi transformada com o componente a jusante da via de sinalilzação antiviral, LIMYB de Arabidopsis, e examinamos o efeito da reconstituição dessa via de defesa durante a infecção viral. Os resultado dessa investigação indicam que a expressão de NIK1-T474D/T469A em linhagens transgênicas de tomateiro foi efetiva para suprimir a expressão de genes ribossomais, indicando que o duplo mutante é constitutivamente ativado em tomateiro. Além disso, a expressão de LIMYB em combinação com NIK1-T469A/T474D promoveu um efeito aditivo na repressão dos genes de proteínas ribossomais, possivelmente revelando uma melhorestratégia para obtenção de resistência a begomovírus. Para averiguar essa hipótese, as linhagens transgênicas foram desafiadas com os begomovírus de tomateiro ToYSV e ToSRV e a infecção foi monitorada por meio de sintomatologia e quantificação do DNA viral. Os resultados demonstraram que a expressão de NIK1-T469A/T474D em combinação com LIMYB é potencialmente um alvo melhor para modificar geneticamente genótipos suscetíveis. / Recently, a new layer of antiviral defenses was characterized in Arabidopsis thaliana, which is mediated by the immune receptor NIK (NSP-Interacting Kinase) and protects plants against begomoviruses. Upon virus infection, NIK1 oligomerizes with itself or another immune receptor to transphosphorylate one another and to activate the NIK1 kinase domain. Activated NIK1 mediates the phosphorylation of the ribosomal protein L10 (RPL10) and subsequent translocation to the nucleus, where RPL10 interacts with LIMYB (L10-interacting Myb domain-containing protein) to down-regulate the expression of ribosomal protein genes, leading to global translation suppression. The viral mRNAs are not able to escape this host translation regulatory mechanism enhancing host resistance against begomoviruses. The viral protein NSP interacts with NIK1 and inhibits its kinase activity, increasing the pathogenicity of begomoviruses by their hosts. We have previously demonstrated that the NIK1 mutant T474D is an excellent target for engineering begomovirus resistance because it is constitutively activated in transgenic lines. In this investigation, we first reconstructed in silico the NIK1-mediated antiviral signaling in tomato by identifying the tomato homologs of the components of the signaling pathway. Then, we examined the property of the double mutant T474D-T469A to confer resistance against begomoviruses in tomato transgenic lines. Furthermore, we overexpressed the downstream component of NIK1 antiviral signaling, LIMYB from Arabidopsis, in the T474D-T469A transgenic lines and examined the effect of reconstituting the antiviral pathway on begomovirus infection. Our results indicated that expression of T474D/T469A in transgenic lines was effective to suppress the expression of ribosomal protein genes, indicating that this double mutant is constitutively activated in tomato. Furthermore, expression of LIMYB in combination with T469A/T474D promoted an additive effect in ribosomal protein gene repression, possibly uncovering a better strategy to acquire begomovirus resistance. To examine this hypothesis, we challenged the transgenic lines with the tomato-infecting begomoviruses ToYSV and ToSRV and monitored the infection by symptomatology and quantitation of viral DNA.Our results demonstrated that expression of T469A/T474D in combination with LIMYB holds the potential to be a better target for engineering begomovirus resistance in susceptible genotypes. / Ficha catalográfica com erro: Morais de Ávila, Larissa Gabriela.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-05-11T13:12:34Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1023168 bytes, checksum: 7610c4ff8f179f603533241473b5650d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-11T13:12:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1023168 bytes, checksum: 7610c4ff8f179f603533241473b5650d (MD5) Previous issue date: 2016-07-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O receptor LRR-RLK (Leucine-rich repeat receptor-like kinase), designado NIK1 (NSP-interacting kinases), está envolvido na resposta imunológica em plantas contra Germinivirus. NIK1 foi inicialmente descrito por interagir com a proteína viral NSP (nuclear shuttle protein), proteína que participa do transporte de DNA viral do núcleo para o citoplasma de células infectadas. Com alta similaridade estrutural a NIK1, BAK1 (Brassinosteroid Insensitive Associated Kinase1), também conhecida como SERK3 (Somatic Embryogenesis Receptor Kinase3), é um receptor LRR-RLK de membrana que desempenha um duplo papel em vias de sinalização, podendo atuar como um coreceptor de BRI1 na presença de BR ou mediar respostas de defesa contra patógenos. Na via de crescimento desencadeada por brassinosteróides (BRs), BAK1 interage com BRI1 (Brassinosteroid-insensitive1) na membrana plasmática e ativa a função de cinase desta proteína. Recentemente, através de dados de RNA-seq, foi demonstrado que inativação da função de NIK1 no nocaute nik1 (Salk_060808) induz a expressão de genes envolvidos na resposta a BRs e desenvolvimento, indicando uma possível comunicação cruzada entre a via de sinalização antiviral mediada por NIK1 e vias de sinalização de desenvolvimento. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo avaliar o papel de NIK1 na via de resposta a BRs. Arabidopissis thaliana, linhagem nik1 nocaute, foi transformada com as construções de DNA 35S:BAK-NIK1_GFP e 35S:NIK1-BAK1_GFP, sendo que a expressão dos transgenes e localização subcelular na membrana das proteínas quiméricas foram confirmadas por RT-PCR e microscopia confocal, respectivamente. Análises fenotípicas de plantas expressando as construções quiméricas BAK1-NIK1 e NIK1-BAK1 indicaram deficiência na via de desenvolvimento induzido por BR, uma vez que o fenótipo destas plantas transgênicas se assemelharam muito ao mutante bak1-4, deficiente na sinalização por BR. Além disso, a ativação da via de sinalização por BRs foi avaliada por meio de crescimento de hipocótilo e de análise da expressão de genes marcadores induzidos por brassinolídeo (BL). Em nik1, o tratamento com BL estimulou o crescimento do hipocótilo e induziu genes marcadores associados à sinalização por BR, embora em menor intensidade do que em Col-0, indicando funcionamento da via de desenvolvimento induzida por BR nesta linhagem nocaute. Expressão de ambas as proteínas quiméricas em nik1 mutante, que expressa os genes BAK1 e BRI1 normalmente, restaurou o fenótipo insensível a BL, típico do nocaute bak1-4. Claramente, a expressão dos genes quiméricos interferiu negativamente com a via de sinalização de BR, uma vez que nas linhagens transgênicas, BL não estimulou o alongamento do hipocótilo e tampouco a indução da expressão de genes marcadores associados à via de sinalização de BR. Estes resultados indicam que as proteínas quiméricas atuam como alelos mutantes transdominantes negativos na sinalização por BR. Esta hipótese foi fundamentada pela capacidade de NIK1 de interagir com BAK1, conforme previamente demonstrado, e com o domínio cinase de BRI1, demonstrado nesta investigação por meio de duplo híbrido em leveduras. Embora não se tenha observado uma ativação aumentada da resposta a BR no nocaute nik1, provavelmente devido a redundância funcional da subfamília NIK, os fenótipos resultantes da expressão das proteínas quiméricas, contendo ou o domínio LRR ou o domínio de cinase de NIK1, sugerem que NIK1 atue como um regulador negativo da sinalização por BR. / The LRR-RLK (Leucine-rich repeat receptor-like kinase) NIK1 (NSP-interacting kinase), is known to mediate immune response in plants against Germinivirus. NIK1 was initially described by interacting with the viral protein NSP (Nuclear shuttle protein), a protein that participates in viral DNA transport from the nucleus to the cytoplasm of infected cells. With high structural similarity with NIK1, BAK1 (Brassinosteroid Insensitive-Associated Kinase1), also known as SERK3 (Somatic embryogenesis receptor Kinase3), is a membrane LRR-RLK, which plays a dual role in signaling pathways and may act as a co-receptor of BRI1 in the presence of brassinosteroide (BR) or mediate defense responses against pathogens. In the BR- triggered growth pathway, BAK1 interacts with BRI1 (Brassinosteroid-Insensitive1) in the plasma membrane and activates the kinase function of this protein. Recently, RNA- seq data revealed that inactivation of NIK1 function in the nik1 mutant (Salk_060808), caused an up-regulation of genes involved in response to BRs and development, indicating a possible cross-talk between the NIK1-mediated antiviral signaling pathway and development signaling pathways. The goal of this investigation was to evaluate the role of NIK1 in the BR response pathway. Arabidopissis thaliana, nik1 line, was transformed with the DNA constructs 35S:BAK-NIK1_GFP and 35sNIK1-BAK1_GFP, and the expression of the transgenes and subcellular localization of the chimeric proteins were confirmed by RT-PCR and confocal microscopy, respectively. BAK1- NIK1- and NIK1-BAK1-expressing plants displayed a deficiency in the BR-induced growth pathway, as the phenotypes of these transgenic lines resemble the ones of the BR signaling deficient bak1-4 mutant. Furthermore, the activation of BR signaling was evaluated through brassinolide (BL)-induced hypocotyl growth and gene expression of BR signaling-associated marker genes. BL-induced stimulation of hypocotyl elongation and induction of marker genes were observed in nik1, although to a lesser extent than in Col-0, indicating a functional BR singling in this knockout line. Expression of both chimeric proteins in the nik1 mutant, which harbors BAK1 and BRI1 normal genes, mimicked the BL insensitive phenotype, typical of the bak1-4 knockout. Clearly, the expression of the chimeric genes impacted negatively the BR signaling, as in the transgenic lines, the BL treatment did not stimulated hypocotyl growth or the induction of BR signaling marker genes. These results indicate that the chimeric proteins function as transdominant negative mutant alleles in BR signaling. This hypothesis was substantiated by the capacity of NIK1 to interact with BAK1, as previously demonstrated, and with the BRI1 kinase domain, as demonstrated in the present investigation through a two-hybrid assay in yeast. Although nik1 did not display an enhancement of the BR-induced responses, most likely due to the functional redundancy of the NIK subfamily, the resulting phenotypes of the chimeric genes expression, harboring either the NIK1 LRR or kinase domain, implicate NIK1 as a negative regulator of BR signaling.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-08-29T18:54:49Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 947486 bytes, checksum: 6d7e934deec08032d3a902d1d879ef0a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-29T18:54:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 947486 bytes, checksum: 6d7e934deec08032d3a902d1d879ef0a (MD5) Previous issue date: 2017-02-24 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Vírus que possuem genoma constituído por DNA fita simples circular são amplamente distribuídos na natureza. As constantes descobertas aliadas à grande diversidade genética desses vírus têm ampliado a compreensão sobre a trajetória evolutiva desse grupo. A partir de 2010 um grupo divergente de vírus com genoma de DNA fita simples circular, denominado genomovírus, passou a ser identificado em diversos ambientes (fezes e esgoto) e associados a diferentes organismos (plantas, fungos, humanos, mamíferos, moluscos e insetos). Neste trabalho foram caracterizados dois genomovírus denominados Momordica charantia associated gemycircularvirus (MorGemy) e Euphorbia heterophylla associated gemycircularvirus (EupGemy) encontrados associados às plantas silvestres Momordica charantia e Euphorbia heterophylla respectivamente. Ambos os vírus possuem organização genômica típica dos genomovírus. Ambos os vírus apresentam stem-loop com nanonucleotídeo conservado em todos os genomovírus, sendo a sequência TAATRTTAT (N pode ser A ou G). Entretanto, no isolado MorGemy foi observado uma estrutura em stem-loop extra na possível origem de replicação não presente em outros genomovírus já descritos. Em ambos os vírus foi observada a presença de um íntron, no interior da ORF que codifica a proteína Rep sendo que o íntron observado em EupGemy é maior que o observado em MorGemy. Na proteína Rep foram observados os motivos I, II e III, e os domínios Walker A, B, C e GRS, elementos encontrados tipicamente na proteína Rep dos geminivírus. O SDT (Sequence Demarcation Tool) revelou que MorGemy tem 72% de identidade com Pteropus associated gemycircularvirus 3 e Hypericum associated gemycircularvirus 1. Além disso, o EupGemy mostra 66% de identidade com Odonata asssociated gemycircularvirus 1. A taxa de identidade de nucleotídeos do genoma completo dos vírus isolados neste trabalho com outros genomovírus já descritos, permite classificar esses novos isolados como duas novas espécies. / Viruses that have genomes consisting of simple circular DNA are widely distributed in nature. The constant discoveries allied to the great genetic diversity of these viruses have broadened the understanding of the evolutionary trajectory of this group. In 2010 a divergent group of viruses with a circular ssDNA genome called Genomovírus was identified in several environments (feces and sewage) and associated with different organisms (plants, fungi, humans, mammals, mollusks and insects). In this work, two Genomovíruses found associated with wild plants were characterized. Both virus shows a structure Genomovírus-like. However two interesting facts were observed. The first, a presence a second structure on stem-loop in the MorGemy no related in other Genomovírus. Both virus presents stem-loop with nanonucleotide conserved in all Genomovírus. Being that the sequence TAATRTTAT (N could be A or G). We also observed the presence of a íntron in both genome, inside the ORF’s Rep. The íntron of EufGmey is greater than MorGemy. In the Rep protein were observed the motif I, II and III. Interestingly, also were observed the presence of Motifs Walker A to C and GRS domain. These elementes are found on protein Rep’s Geminivírus. The SDT releaved that MorGemy shows 72% of identity with Pteropus associated gemycircularvirus 3 and Hypericum associated gemycircularvirus 1. In addition EupGemy shows 66% of identity with Odonata associated gemycircularvirus 1. The rate of identity of MorGemy and EupGemy with Genomovírus associate with plants combined with analysis phylogeny are an indicative that these virus can have a possible host-virus relation with plants.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-02-10T15:49:56Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 762019 bytes, checksum: 2e50dd2ab96eb5e71832e134ee743a4e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-10T15:49:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 762019 bytes, checksum: 2e50dd2ab96eb5e71832e134ee743a4e (MD5) Previous issue date: 2016-03-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A família Geminiviridae é composta por vírus com genoma de DNA circular de fita simples, encapsidado por uma única proteína estrutural em partículas icosaédricas geminadas. A família é dividida em sete gêneros com base no tipo de inseto vetor, gama de hospedeiros, organização genômica e relacionamento filogenético. Os vírus pertencentes ao gênero Begomovirus possuem um ou dois componentes genômicos e são transmitidos pela mosca-branca Bemisia tabaci a plantas dicotiledôneas. Os begomovírus infectam naturalmente diversas espécies de plantas não-cultivadas, como Sida spp. e Macroptilium spp. Estes hospedeiros não-cultivados podem abrigar populações virais com uma maior diversidade genética. Entretanto, algumas populações virais parecem estar confinadas em determinadas espécies de plantas não-cultivadas. Com base na observação de plantas não-cultivadas emergindo no campo com sintomas de infecção por begomovírus, aparentemente na ausência do inseto vetor, e em relatos recentes de transmissão de begomovírus via semente em batata-doce, feijoeiro e tomateiro, este estudo teve como objetivo analisar a presença de begomovírus em sementes de Sida acuta e Sida rhombifolia, bem como a transmissão desses vírus via semente. Um total de 39 plantas dessas duas espécies, apresentando sintomas típicos da infecção por begomovírus, foram coletadas em Viçosa, MG, em dezembro de 2013, e transferidas para casa-de-vegetação. A infecção viral foi confirmada em 38 plantas por meio de extração de DNA total de tecido foliar seguido de amplificação por círculo rolante (rolling-circle amplification, RCA). Os produtos da amplificação foram clonados e sequenciados, confirmando-se a infecção pelo Sida yellow mosaic virus (SiYMV) nas plantas de S. rhombifolia e pelo Sida yellow leaf curl virus (SiYLCV) nas plantas de S. acuta. Aproximadamente 320 mil sementes foram coletadas das 38 plantas infectadas. As sementes foram tratadas superficialmente com hipoclorito de sódio ou com ácido sulfúrico e foram maceradas em grupos de 20, 30 ou 200 sementes. O DNA total extraído de aproximadamente 80 mil sementes foi utilizado para detecção viral via RCA, com resultados negativos. DNA total foi extraído também de flores inteiras e de tecidos florais (sépalas, pétalas, estames, estiletes e ovários) das plantas infectadas, e utilizado para detecção viral com resultados positivos em todos os casos. Sementes proveniente das plantas infectadas foram tratadas com ácido sulfúrico, germinadas e 269 plântulas provenientes dessas sementes foram avaliadas para a presença dos vírus via RCA e PCR, com resultados negativos. Em conjunto, os resultados indicam que o SiYMV e o SiYLCV são capazes de infectar os tecidos florais de Sida rhombifolia e de Sida acuta, respectivamente, entretanto não são transmitidos pelas sementes desses hospedeiros. / The family Geminiviridae is comprised of viruses with a circular, single-stranded DNA genome encapsidated by a single structural protein in geminate, icosahedral particles. The family is divided into seven genera base on the type of insect vector, host range, genomic organization and phylogeny. Viruses classified in the genus Begomovirus have one or two genomic components and are transmitted in nature by the whitefly Bemisia tabaci to dicot plants. Begomoviruses naturally infect several non-cultivated hosts, such as Sida spp. and Macroptilium spp. These non-cultivated hosts may harbor viral populations with a high degree of genetic diversity. Nevertheless, some viral populations seem to be confined to certain species of non- cultivated plants. Based on the observation of non-cultivated plants newly emerged in the field already showing symtpoms of begomovirus infection, apparently in the absence of the insect vector, and on recent reports of seed transmission of begomoviruses in sweet potato, bean and tomato, the objective of this study was to analyze the presence of begomoviruses in seeds of Sida acuta and Sida rhombifolia, as well as the transmission of these viruses by seed. A total of 39 plants of these two species, displaying typical symptoms of infection by begomoviruses, were collected in Viçosa, MG, on December 2013, and transferred to a greenhouse. Viral infection was confirmed in 38 of these plants by total DNA extraction followed by rolling- circle amplification (RCA) of complete viral genomes. Amplification products were cloned and sequenced, confirming infection of S. rhombifolia by Sida yellow mosaic virus (SiYMV) and of S. acuta by Sida yellow leaf curl virus (SiYLCV). Approximately 320,000 seeds were collected from the 38 infected plants. The seeds were surface-sterilized with sodium hypochloride or sulphuric acid, and were ground in groups of 20, 30 or 200 seeds. Total DNA extracted from approximately 80,000 seeds was used for viral detection by RCA, with negative results. Total DNA was also extracted from whole flowers and from flower tissues (sepals, petals, stamens, styles and ovaries) from infected plants and used for viral detection, with positive results in all cases. Seeds from infected plants were treated with sulphuric acid, germinated and 269 plantlets from these seeds were evaluated for the presence of virus by RCA and PCR, with negative results. Together, these results indicate that SiYMV and SiYLCV are capable of infecting the flower tissues of Sida rhombifolia and Sida acuta, respectively, however they are not transmitted by seeds in these hosts.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 478603 bytes, checksum: 2f73d62b9c5b69dd70468c095488ebaf (MD5) Previous issue date: 2014-07-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / NIK (NSP-Interacting Kinase) is a receptor-like kinase involved in defense against geminiviruses, which was first identified as a virulence target of the begomovirus transport protein NSP (Nuclear Shuttle Protein). We have previously identified that NIK activation mediates an indirect phosphorylation of the ribosomal protein L10 causing the translocation of the cytosolic protein to the nucleus, where it interacts with LIMYB (L10-interacting Myb domain-containing protein) to regulate genes involved in the translation machinery resulting in a global translation suppression. Constitutive activation of NIK, through ectopic expression of the mutant T474D in Arabidopsis, has been previously shown to induce the plant immune system. In this investigation, we examined further whether activation of the signaling module NIK-RPL10-LIMYB would transduce a typical defense signal that promotes the induction of the plant immune system. However, the current results suggest that the NIK-mediated antiviral signaling does not induces the basal immune system. Firstly, the global variation of gene expression by ectopic expression of the constitutively activated mutant receptor T474D or LIMYB does not cause a gene enrichment in the up-regulated list of typical defense categories, such as response to pathogens, response to virus and virus-induced gene silencing. Secondly and very importantly, quantitative RT-PCR of a representative sample of defense genes confirmed that they are not up-regulated by expression of T474D or LIMYB. In contrary, expression of LIMYB in the transgenic lines caused a down-regulation of the defense genes examined. We have also examined new host targets that interact with NSP. Initially, we used a 12000 Arabidopsis protein expression-based microarray to isolate a t-SNARE-like protein with the capacity to bind NSP in vitro. This interaction NSP-At4g30240 protein was further confirmed by two- hybrid assay in yeast and by bimolecular fluorescence complementation assay in planta. Our results indicate that At4g30240 interacts with NSP in vivo to mediate or facilitate the viral protein transport among cell compartments. / NIK (NSP-Interacting Kinase) é um receptor cinase envolvido na resposta de defesa contra geminivírus, e foi primeiramente identificado como alvo de virulência da proteína de transporte NSP (Nuclear Shuttle Protein) de begomovírus. Previamente, foi identificado que a ativação de NIK medeia a fosforilação indireta da proteína ribossomal L10, promovendo a translocação da proteína citosólica para o núcleo, onde interage com a proteína LIMYB (L10-interacting Myb domain-containing protein), para regular genes envolvidos na maquinaria de tradução da célula, resultando em supressão da tradução global. Foi também demonstrado que a ativação constitutiva de NIK1, através da expressão ectópica do mutante T474D, induz o sistema imune de plantas em Arabidopsis. Nesta investigação, foi analisado em maiores detalhes se a ativação do módulo de sinalização NIK-RPL10-LIMYB também transmitiria um sinal típico de defesa, resultando na indução do sistema imune de plantas. Entretanto, os resultados encontrados sugerem que a via de sinalização antiviral mediada por NIK não transmite o sinal de defesa típico que culmina na ativação de genes relacionados ao sistema imune de plantas. Em primeiro lugar, por meio de estudos de variação global de expressão gênica, induzida por expressão ecotópica do mutante constitutivo T474D ou LIMYB, foi constatado que não houve enriquecimento gênico significativo na lista dos genes regulados positivamente nas categorias de defesa, como resposta de defesa a patógenos, resposta de defesa a vírus e silenciamento gênico induzido por vírus. Além disso, RT- PCR quantitativo de uma amostra representativa dos genes de defesa confirmou que estes genes de defesa não foram regulados positivamente pela expressão de T474D ou LIMYB. Ao contrário, a expressão de LIMYB nas linhagens transgênicas promoveu a regulação negativa dos referidos genes de defesa. Nesta investigação, também se avaliou novos alvos do hospederio que interagem com NSP. Inicialmente, foi isolada, por meio de microarranjos de expressão de 12.000 proteínas de Arabidopsis, uma proteína com características de uma t-SNARE, codificada pelo locus At4g30240 com a capacidade de interagir com NSP in vitro. Esta interação NSP- proteína At4g30240 foi confirmada em ensaios de duplo hibrido em leveduras e por ensaios de complementação de fluorescência bimolecular in planta. Os resultados indicam que At4g30240 interage com NSP in vivo, e pode mediar ou mesmo facilitar o transporte dessa proteína viral entre compartimentos celulares.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-09-19T11:12:48Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1966574 bytes, checksum: 9a74f6b3cb6b04d280008a26f090b161 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-19T11:12:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1966574 bytes, checksum: 9a74f6b3cb6b04d280008a26f090b161 (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A cultura do feijoeiro comum no Brasil, além do imenso valor que representa na cadeia econômica e para milhares de agricultores no país, é fundamental devido à contribuição que possui na segurança alimentar da população. Cultivares com evento de resistência ao Bean golden mosaic virus (begomovirus), vírus responsável por causar uma das doenças que mais afeta a produtividade da cultura no país, foram desenvolvidas após vários anos de pesquisas. Infecções durante testes em campo desses materiais por outro vírus, o Cowpea mild mottle virus (carlavirus), gerou novas preocupações tanto aos pesquisadores envolvidos no projeto do feijoeiro resistente ao mosaico dourado quanto aos produtores que aguardavam a liberação comercial dessas cultivares. Apesar de alguns trabalhos já terem sido desenvolvidos a fim de se avaliar os prejuízos produtivos que o CPMMV causa sobre as isolinhas transgênicas de feijoeiro, assim como sua distribuição, nenhum conhecimento se tem sobre a diversidade desse vírus em feijão comum ou transgênico no Brasil, e poucos trabalhos dessa natureza são encontrados na literatura até hoje. Nesse trabalho, buscou-se avaliar a variabilidade de populações do CPMMV para cada uma de quinze cultivares de feijoeiro comum, sendo dez transgênicas (resistentes ao BGMV) e cinco convencionais, em um campo experimental com ocorrência e transmissão natural do CPMMV. Também foram quantificados os níveis virais em cada cultivar a partir de três repetições. Para cada uma das quinze plantas representando 15 diferentes genótipos de feijoeiro comum, o genoma completo de cinco isolados de CPMMV foi sequenciado pela montagem de sequenciamentos de blocos de PCR. Diferenças foram encontradas na variabilidade dos cinco isolados de CPMMV em plantas transgênicas e em plantas convencionais. Os valores dos descritores de variabilidade π, S, K e Θ foram geralmente maiores nos grupos de isolados de plantas transgênicas. Isso se repetiu para todas as ORF’s virais analisadas. As ORF’s 2, 3 e 4 foram as que tiveram a maior diversidade registrada, enquanto que a diferenças entre os grupos já citados foi mais perceptível nas regiões das ORF’s 2, 5 e 6. Eventos de recombinação foram encontrados na ORF 1 viral, quase sempre ocorrendo em isolados de plantas transgênicas, assim como alguns na ORF 2 e 6. Analisando as sequencias da ORF 1, nota-se que os cinco isolados de cada planta se agrupam e tendem a formar clados próximos a grupos de isolados de genótipos hospedeiros similares, o que pode decorrer da interação entre a replicase viral e a planta. Para a região 3’ do genoma, houve a separação do conjunto de 75 isolados em dois grupos de variantes. A identidade nucleotídica par a par entre isolados de grupos distintos variou entre 75 e 85%. Pelos testes de seleção, existe evidência significativa de que vária populações virais estão sobre processo de seleção não neutra. O acúmulo viral não teve diferença significativa entre plantas transgênicas e convencionais. A quantificação também não revelou diferenças em níveis virais em plantas transgênicas originadas de retrocruzamentos com a cultivar Pérola em comparação aos níveis naquelas retrocruzadas com a cultivar BRS Pontal. Os resultados desse trabalho reforçam resultados anteriores de que dois grupos de estirpes de CPMMV estão distribuídos pelas regiões produtoras brasileiras, provavelmente pela presença em plantas daninhas (onde a variabilidade desse vírus nunca foi analisada) e em hospedeiros cultivados como o próprio feijoeiro. Também comprova a alta variabilidade desse vírus de RNA, principalmente nas novas cultivares de feijoeiro resistente ao mosaico dourado por transgenia. É provável que a presença de BGMV nas cultivares convencionais e consequentemente a infecção mista dos dois vírus tenha algum efeito sobre os valores de variabilidade apresentados nesse estudo. Os mecanismos moleculares dessa interação, porém, não são conhecidos. Os resultados apresentados e o fato de que hospedeiros não cultivados estão distribuídos por grandes áreas de produção e que estes podem atuar como reservatório viral, além da grande distribuição da mosca branca pelo Brasil, fazem com que novos trabalhos com esse patógeno sejam de extrema importância. / The common bean crop in Brazil, besides its economic importance, represents a major source of what is daily consumed by Brazilian population in terms of proteins and carbohydrates, contributing to food security. Cultivars with a transgenic resistance event to Bean golden mosaic virus (begomovirus), a virus that causes one of the most important diseases of common bean, were developed after many years of research. The release of these cultivars immune to BGMV is undergoing difficulties because of the re-emergence of Cowpea mild mottle virus (carlavirus) in common bean, which has raised some concerns for the researchers and the growers. Although works to access the damage potential into different genotypes of these resistant isolines and to investigate the virus distribution are being reported, no study is found evaluating CPMMV molecular characteristics and diversity in transgenic as well as conventional common bean cultivars in Brazil. In fact, there are very few studies of this kind globally. The objective of this work was to evaluate the variability on CPMMV populations from each of the fifteen common bean cultivars, ten transgenic and resistant to BGMV, and five conventional cultivars, from a field experiment with natural CPMMV transmission by whitefly. CPMMV was also quantified on the three plant replicates of each genotype. Five CPMMV isolates were completely sequenced on all fifteen plants with different genotypes, providing 75 full virus genomes after assembly of PCR sequence blocks. Differences in variability were found between those groups of isolates from transgenic plants to those from conventional ones. With the π, S, K, and Θ-W descriptors, we detected a considerable higher CPMMV variability within transgenic plants in comparison to the virus variability within conventional cultivars in most of the cases. This was the case for all analyzed ORF’s. The ORF’s 2, 3 and 4 were the ones with the highest variability in the genome; at ORF’s 2, 5, and 6, the differences in variability mentioned above are most discernible. Recombination events between isolates happening at the ORF 1 region were detected, as well as at ORF 2 and at ORF 6. Mostly of these were between isolates from transgenic plants. The phylogenetic analysis with ORF 1 sequences of all seventy-five isolates reveals the formation of groups based on host genotypes, and that these groups are most likely grouping near a cluster of isolates from a similar host plant genotype. These could be the result of the direct and specific interactions needed between the viral replicase and the plant. The results of phylogenetic analysis and sequence comparisons with the 3’ region of the viral genome (ORF 2-6), divided the 75 isolates of this study into two groups of CPMMV variants. The pairwise nucleotide differences between isolates from distinct groups ranged from 75 to 85%. The selection tests at some ORF’s give significant evidence that some populations are evolving under a non- random process. The viral accumulation on conventional cultivars did not differ statistically to the accumulation at transgenic plants. In addition, there is no evidence of differences between CPMMV levels at transgenic cultivars that have Pérola as the reccurent parent to those that have the BRS Pontal. The results from this work corroborate with previous studies that indicate the existence of two CPMMV strains naturally distributed in Brazilian production areas. It also confirms the expected high variability potential of this RNA virus; the high variability registered on the newly developed BGMV-resistant transgenic common bean cultivars is also troublesome. The presence of BGMV in mixed infections with CPMMV at conventional cultivars is probably influencing the results of CPMMV variability, but the molecular properties of this interaction is still unknown. These results, in addition to the fact that non-cultivated host plants are distributed along major production areas and may act as viral reservoirs and the known widespread of whiteflies in growing regions of Brazil, make further studies with this pathogen of fundamental importance.

Solano-violeta (Solanum violaefolium) é uma ornamental rasteira usada pra cobrir solos de áreas sombreadas. Um vírus que induz manchas anelares nas folhas, tentativamente designado de mancha anular do S. violaefoliumm (S. violaefolium ringspot vírus - SvRSV), transmitido pelo ácaro Brevipalpus phoenicis foi encontrado nesta planta em jardins de Piracicaba, SP. Trata-se de um vírus baciliforme que se acumula no lúmen do retículo endoplasmático induzindo viroplasma citoplasmático, assemelhando-se a outros vírus do tipo citoplasmático, dos transmitidos por ácaros Brevipalpus (Acari: Tenuipalpidea). Este trabalho relata algumas de suas propriedades biológicas e a caracterização molecular parcial. SvRSV foi ser transmitido mecanicamente e pelo B. phoenicis a várias outras espécies botânicas, sempre causando lesões localizadas. Destas, Datura stramonium mostrou-se a melhor como hospedeira experimental. As propriedades físicas do SvRSV in vitro foram: temperatura de inativação - 40-45 ºC; ponto final de diluição - 10-3-10-4; longevidade in vitro- 12 dias. Posteriormente, observou-se também infestação destas plantas por B. obovatus que em ensaios preliminares transmitiu o SvRSV. Em secções ultrafinas, as partículas do SvRSV mostraram-se ligeiramente mais delgadas que as de outros vírus do tipo citoplasmático, transmitidos por Brevipalpus, e por outro lado formavam eventualmente partículas mais longas, às vezes de ca. 1 µm. Como os demais vírus, do tipo citoplasmático, transmitido por Brevipalpus, induz a formação de um viroplasma denso e vacuolado no citoplasma. Em casos favoráveis foram observadas fases do processo de morfogênese por "brotação" a partir do material do viroplasma. Dada sua labilidade não foi possível conseguir sua purificação apesar das inúmeras tentativas, usando diferentes protocolos. Logrou-se a extração de dsRNA a partir de D. stramonium e a partir dele, obter-se dois fragmentos do genoma viral, identificados como parte da proteína de movimento e da replicase, após seu sequenciamento. Foram produzidos pares de "primer" baseado nestas seqüências que amplificaram especificamente, por RT-PCR, fragmentos de DNA de tamanho esperado, a partir do RNA total extraído de lesões foliares de S. violaefolium e D. stramonium infetados. Sondas baseadas nas seqüências obtidas hibridizaram com ss- e dsRNA de lesões de D. stramonium. Ensaios preliminares de RT-PCR e hibridização não resultaram em reação com alguns outros vírus transmitidos por Brevipalpus, do tipo citoplasmático, inclusive o da leprose dos citros (CiLV-C). / Solanum violaefolium is an ornamental Solanaceae, with prostrate, trailing growth cultivated in shaded areas. Plants exhibiting necrotic ringlike spots on the leaves have been found in several gardens and parks at Piracicaba - SP. The ringspot symptoms on the leaves is caused by a vírus, named S. violaefolium ringspot virus (SvRSV), and is transmisible by mite Brevipalpus phoenicis (Acari: Tenuipalpidae). Short bacilliform particles are present within the cisternae of endoplasmic reticulum (ER) and often electron dense viroplasm is present in the cytoplasm, characterist of the cytoplasmatic type of Brevipalpus-borne virus. The present study reports some of its biological properties and partial molecular caracterization. SvRSV is easily transmitted to many plant species either by viruliferous B. phoenicis or mechanically, always causing local lesions. Datura stramonium was proved to be better as experimental host. Its physical properties in vitro were: inactivation thermal point - 40-45 ºC; final diluition point - 10-3-10-4; longevity in vitro - 12 days. Afterwards, its was observed that S. violaefolium plants were infested by B. obovatus that transmitted SvRSV in preliminary assays. Thin sections revealed that SvRSV particles are slightly thinner and sometimes appear very long. In some favorable sections intermediate steps of viral particle morphogenesis by a budding process of the dense material of the viroplasm toward the lumen of ER could be seen. Due to the fragility of the particles, several attempts to purify the virus have failed, despite many protocols tried. It was possible, however, to extract dsRNA from infected tissue of D. stramonium, and two segments of viral genome, respectively with homology to movement protein (mp) and replicase (rep) of some known viruses were obtained. Primers were designed based in these sequences, which amplified by RT-PCR, fragments of DNA of expected size from total RNA extracts from leaves lesions of infected S. violaefolium and D. stramonium. Probes based on obtained sequences hibridizated with ss- and dsRNA from lesions of S. violaefolium and D. stramonium. Preliminary assays of RT-PCR and hybridization did not result in positive reaction with other cytoplasmatic type of Brevipalpus-borne viruses, including citrus leprosis (CiLVC).

Vários fitovírus são capazes de influenciar o comportamento e desenvolvimento biológico de seus insetos vetores de modo a favorecer sua disseminação entre plantas hospedeiras, mas pouco se sabe a respeito dos efeitos de infecções virais sobre moscas-brancas Bemisia tabaci (Genn.), uma vez que se trata de um complexo de espécies, que transmite vírus de diferentes gêneros com distintos modos de transmissão. Considerando-se a importância de B. tabaci como praga e vetora e o grande prejuízo causado a diversos cultivos devido à transmissão de fitovírus, o presente trabalho teve como objetivos: a) Investigar a preferência para pouso e o comportamento arrestante de B. tabaci MEAM 1 (Middle East-Asia Minor 1) em plantas de tomate não infectadas e infectadas com o crinivírus Tomato chlorosis virus (ToCV) transmitido de modo semipersistente, e o begomovírus persistente-circulativo, Tomato severe rugose virus (ToSRV); b) Avaliar os efeitos diretos e indiretos de ToCV sobre o desempenho biológico de B. tabaci MEAM 1 c) Comparar o comportamento alimentar de adultos não-virulíferos de B. tabaci MEAM 1 em plantas de tomate não infectadas e infectadas com ToCV ou ToSRV, utilizando-se a técnica de Electrical Penetration Graph (EPG); d) Correlacionar as atividades estiletares de B. tabaci MED (Mediterranean) com a inoculação de ToCV em tomateiro. Verificou-se que plantas infectadas com ToCV não exercem atração sobre B. tabaci MEAM 1; há efeito direto quando o inseto está virulífero; no entanto, este efeito não parece favorecer a disseminação de ToCV. Já ToSRV exerce efeito direto que favorece sua disseminação, pois insetos virulíferos são mais atraídos por plantas não infectadas. A mosca-branca exibe comportamento arrestante em plantas de tomate sadias, e tende a deixar plantas infectadas com ToCV ou ToSRV, sugerindo que tais vírus reduzem a qualidade nutricional da planta hospedeira. Em relação ao desenvolvimento biológico do inseto, observou-se efeito direto de ToCV apenas de alongamento da duração do primeiro ínstar ninfal, e efeito indireto negativo sobre a viabilidade da fase ninfal, pois apenas 32% das ninfas eclodidas chegaram à fase adulta em plantas infectadas, contrastando com 77% em plantas não infectadas. Nos ensaios de EPG, verificou-se que a infecção de plantas de tomate por ToCV ou ToSRV não influenciou o comportamento alimentar do vetor de modo a favorecer a transmissão desses vírus, pois afetou apenas parâmetros não relacionados às atividades floemáticas. A transmissão de ToCV está principalmente associada à salivação nos elementos de floema (forma de onda E1) (52,2% de plantas infectadas), mas pode ocorrer com baixa frequência antes de E1 (3,5%). Entretanto, há maior eficiência de transmissão quando os indivíduos realizam vários episódios de E1+E2 (ingestão de seiva nos vasos do floema). Os dados obtidos na presente tese ajudam a esclarecer um pouco mais as complexas relações entre B. tabaci e diferentes fitovírus, e como as respostas comportamentais podem variar em função do modo de transmissão. / Several phytoviruses are capable of influencing the behavior and biological development of their insect vectors in order to promote their spread among host plants, but information about the effects of viral infections on whiteflies Bemisia tabaci (Genn.) is not available, since it is a species complex, which transmits vírus belonging to different genus with distinct transmission modes. Considering B. tabaci importance as a pest and a vector and the great damage caused to several crops due to the transmission of phytovirus, the present work had as objectives: a) To investigate the preference for landing and the arrestant behavior of B. tabaci MEAM 1 (Middle East-Asia Minor 1) in non-infected and infected tomato plants with semi-persistent crinivirus, Tomato chlorosis virus (ToCV) and the persistent-circulative begomovirus, Tomato severe rugose virus (ToSRV); b) To evaluate the direct and indirect effects of ToCV on the biological performance of B. tabaci MEAM 1 c) To compare the feeding behavior of non-viruliferous B. tabaci MEAM 1 in non-infected and ToCV or ToSRV-infected tomato plants using the Electrical Penetration Graph (EPG) technique; d) Correlate the stylets activities of B. tabaci MED (Mediterranean) with the inoculation of ToCV in tomato. It has been found that ToCV-infected plants do not exert an attraction on B. tabaci MEAM 1; there is a direct effect when the insect is viruliferous, however, this effect does not seem to favor the spread of ToCV. ToSRV has a direct effect that favors its dissemination, as viruliferous insects are more attracted to non-infected plants. The whitefly exhibits an arrestment behavior on non-infected plants, and tends to leave plants infected by ToCV or ToSRV, suggesting that such viruses reduce the nutritional quality of the host plant. In relation to the biological development, we observed a direct effect of ToCV only on the first ninfal instar, and a negative indirect effect on nymphal viability, since only 32% of the initial individuals reached adulthood in ToCV-infected plants contrasting with 77% in non-infected plants. In the EPG tests, it was verified that the infection of tomato plants by ToCV or ToSRV did not influence the feeding behavior of the vector in order to favor the transmission of these viruses, since it affected only parameters not related to the phloem. The transmission of ToCV is mainly associated to salivation in the phloem elements (waveform E1) (52,2% of infected plants), but may occur in a low proportion before E1 (3,5%). However, there is a greater efficiency of transmission when individuals perform several episodes of E1 + E2 (phloem sieve elements). The data obtained in this thesis help to clarify a little more about the complex relationships between B.tabaci and different phytovirus, and how the behavioral responses may vary depending on the mode of transmission.

Este trabalho teve por objetivo selecionar estirpes fracas do Passion fruit woodiness virus (PWV) e avaliar o seu efeito protetor para o controle do endurecimento dos frutos do maracujazeiro. Foram selecionadas seis estirpes fracas do PWV. Três a partir de plantas de elite, encontradas em pomares severamente afetados pelo vírus (F-101, F-102 e F-103) e três a partir de bolhas formadas em folhas de maracujazeiro com mosaico (F-99, F-144 e F-145). O efeito protetor das estirpes fracas foi avaliado em maracujazeiros, em casa de vegetação e em campo. Em casa de vegetação foi observada uma proteção parcial das estirpes F-101, F-102 e F-144, contra a estirpe severa PWV-SP. Em campo, num primeiro experimento, as seis estirpes fracas selecionadas foram avaliadas e aproximadamente 4 meses após o desafio com a estirpe PWV-SP, todas as plantas apresentaram sintomas severos da doença. Diante da proteção parcial em casa de vegetação e da ausência total de proteção no experimento de campo, duas hipóteses foram apresentadas para explicar a intensificação de sintomas em maracujazeiros premunizados e desafiados com a estirpe severa do virus: a) a ocorrência de baixa concentração e/ou distribuição irregular das estirpes fracas nos tecidos das plantas premunizadas permite a infecção e estabelecimento da estirpe severa posteriormente inoculada e b) as estirpes fracas selecionadas são de uma espécie diferente de Potyvirus, serologicamente relacionada com o PWV, mas que não oferecem proteção contra a estirpe severa deste último. A primeira hipótese foi estudada repetindo-se o experimento com maracujazeiros premunizados com as estirpes F-101 e F-144, separadamente, e cultivados em campo sob condições de telado. Antes do desafio, foram feitos estudos quantitativos das estirpes F-101 e F-144, em diferentes folhas das plantas, através do DAS-ELISA indireto. Foi observada uma grande variação na concentração das estirpes fracas nos tecidos de diferentes folhas da mesma planta. Em 68,3 %, de 300 discos foliares, as estirpes fracas não foram detectadas pelos critérios adotados nessa investigação. Mais uma vez todas as plantas premunizadas e desafiadas apresentaram sintomas severos da doença, quatro meses após o desafio. A segunda hipótese foi estudada através de testes de proteção em plantas de crotalária premunizadas com as estirpes F-101 e F-144 e da análise da seqüência de nucleotídeos do gene da capa protéica das estirpes F-101, F-103 e PWV-SP. Nos testes de proteção, todas as plantas premunizadas com as estirpes fracas ficaram protegidas contra a infecção e/ou manifestação dos sintomas causados pela estirpe severa PWV-SP. Estudos quantitativos das estirpes fracas nessa hospedeira revelaram uma maior uniformidade na concentração do vírus nos tecidos foliares. A análise da seqüência de nucleotídeos do gene que codifica a capa protéica, apontaram identidade de 99,7 % entre as estirpes fracas e de 97,5 % destas com a estirpe severa, mostrando tratarem-se de estirpes do mesmo vírus. Esses resultados mostram que a premunização não parece ser uma alternativa adequada para o controle do endurecimento dos frutos do maracujazeiro, devido à falha na proteção. Essa quebra de proteção parece estar relacionada com a baixa concentração e/ou distribuição irregular das estirpes fracas nas folhas do maracujazeiro, que propiciam a existência de sítios de infecção para a estirpe severa posteriormente inoculada. / The main purpose of this work was to select mild strains of Passion fruit woodiness virus (PWV) and to evaluate their protective effect in passion flower (Passiflora edulis f. flavicarpa Deg.) challenged with a severe strain of the virus. Three mild strains were selected from outstanding plants found in orchards severely affected by the virus (F-101, F-102 and F-103) and three others were obtained from blisters formed in passion flower leaves with mosaic (F-99, F-144 and F-145). The protective effect of the mild strains was evaluated in passion flower under greenhouse and field conditions. Plants preimmunized with mild strains F-101, F-102 and F-144, under greenhouse conditions, showed partial protection after challenge inoculation with the severe strain PWV-SP. Total absence of protection was observed in passion flower preimmunized with all six mild strains and challenged with PWV-SP in the first field experiment. Due to these results, two hypotheses were raised to explain the intensification of symptoms in passion flower preimmunized with mild strains and challenged with the severe strain of the virus: a) the occurrence of low concentration and/or irregular distribution of the mild strains in the tissues of the preimmunized plants allow the infection and establishment of the later inoculated severe strain and b) the selected mild strains belong to a different species of Potyvirus, serologically related to PWV, but that do not offer protection against the severe strain of PWV. The first hypothesis was studied in a field experiment with passion flower preimmunized with mild strains F-101 and F-144, separately, and cultivated under screenhouse. Before the challenge inoculation, leaf samples were taken from five leaves of all protected plants and the concentration of the mild strains was estimated by indirect DAS-ELISA. A group of plants was challenged in three expanded leaves of the vine and another group was challenged with viruliferous aphids placed on the tip of the vine. All preimmunized plants showed severe symptoms of the disease, four months after the challenge inoculation. A great variation was observed in the concentration of the mild strains in the tissues of different leaves of the same plant. The ELISA test was not able to detect the mild strains in extracts of 205 out of 300 leaf disks. The second hypothesis was tested with crotalaria plants (Crotalaria juncea L.) preimmunized with mild strains F-101 and F-144 and analysis of the nucleotide sequence of the coat protein gene of the F-101, F-103 and PWV-SP strains. All preimmunized crotalaria plants were protected against the infection and/or manifestation of the symptoms caused by the severe strain PWV-SP. Quantitative studies of the mild strains in crotalaria revealed a larger uniformity in the concentration of the virus in the leaves. The analysis of the nucleotide sequence of the coat protein gene pointed out identity of 99.7% among the mild strains. The severe strain shared 97.5 % identity with both mild strains, showing that they are all strains of the same virus. These results showed that preimmunization does not seem to be an appropriate alternative for the control of the passion fruit woodiness disease in passion flower due to the breakdown in protection. Failure in protection seems to be related to the low concentration and/or irregular distribution of the mild strains in the leaves of the passion flower, which allow the occurrence of infection sites available for superinfection with the severe strain.

Embora desfrute de inegável importância econômica, os citros estão sujeitos a muitos problemas sanitários sendo alguns, limitantes para o cultivo como é o caso das doenças causadas por vírus. A morte súbita dos citros é uma doença relacionada à combinação copa/ porta-enxerto e manifesta sintomas na região da enxertia sobre porta-enxertos intolerantes. Embora sua etiologia não tenha sido determinada, há indicações que a causa da MSC esteja relacionada a uma estirpe do vírus da tristeza dos citros (CTV), a um vírus do gênero Marafivirus, ou a uma associação entre eles. Uma vez que a transformação genética têm sido considerada como uma ferramenta auxiliar a programas de melhoramento de citros, o objetivo deste trabalho foi obter plantas transgênicas de limão \'Cravo\' e laranja \'Valência\' contendo o gene da replicase do Marafivirus e estudar a regeneração e obtenção de plantas in vitro de laranja azeda, via organogênese, visando futuros trabalhos de transformação genética. Experimentos para indução da organogênese in vitro foram realizados avaliando-se citocininas (BAP, TDZ e CIN), em diferentes concentrações, isoladamente ou em combinação com ANA, condições de luminosidade (fotoperíodo de 16 h e escuro por 30 dias), meios de cultivo e explantes (provenientes de plantas germinadas in vitro e de plantas mantidas em estufa). Além disso, avaliou-se o enraizamento dos brotos regenerados. Para a transformação genética, explantes de limão \'Cravo\' e laranja \'Valência\' foram inoculados e co-cultivados com a estirpe EHA 105 de Agrobacterium tumefaciens contendo o gene da replicase do Marafivirus (em seqüência sense e antisense interligadas por um íntron). A construção gênica foi elaborada a partir do plasmídeo pCAMBIA 2201, dirigidas pelo promotor 35S e terminador NOS, contendo ainda o gene de seleção nptII. A transformação foi confirmada por análises de PCR e \'Southern blot\'. A transcrição do gene foi avaliada por RT-PCR e \'northern blot\'. A adição de BAP, combinada ou não com ANA, e em combinações com CIN ao meio de cultivo, assegurou maior formação de gemas adventícias em segmentos de epicótilo de laranja azeda. Entretanto, TDZ não se mostrou favorável a essa resposta, que também é afetada pela ausência de luz. Os explantes provenientes do cultivo in vitro mostraram-se mais favoráveis à resposta organogênica. O enraizamento das brotações de laranja azeda regeneradas foi obtido no meio MT com metade da concentração de sais, sem ou com auxinas. Foi possível obter plantas transgênicas de limão \'Cravo\' e de laranja \'Valência\' contendo o gene da replicase do Marafivirus utilizando-se segmentos internodais como explantes. A análise de \'Southern blot\' confirmou a integração de um a quatro eventos de inserção do transgene no genoma das plantas. A transcrição do gene da replicase do Marafivirus e do gene nptII foi observada por RT-PCR. / In spite of great economic importance, the citrus industry is affected by many phytopathological problems some, limiting its cultivation such as virus-caused diseases. The citrus sudden death disease is related to scion/rootstock combinations and manifests symptoms in the grafting area of intolerant rootstocks. Although its etiology has not been determined, there are indications that the cause of MSC might be related to a strain of the Citrus tristeza virus (CTV), to a virus of the Marafivirus group, or to an association of both viruses. Since the genetic transformation has been considered as an auxiliary tool to programs of citrus improvement, the objectives of this work were to obtain transgenic plants of the Rangpur lime and Valencia sweet orange containing the Marafivirus replicase gene and study the in vitro regeneration of sour orange plants through organogenesis, aiming for future work in genetic transformation. Experiments for induction of in vitro organogenesis were carried out evaluating citocinins (BAP, TDZ and KIN), in different concentrations, separately or in combination with NAA, lighting conditions (photoperiod of 16 hours and darkness for 30 days), cultivation media and explants (coming from in vitro germinated plants and from green house cultivated plants). Besides this, rooting of the regenerated shoots was evaluated. For the genetic transformation, Rangpur lime and Valencia sweet orange explants were inoculated and co-cultivated with the EHA-105 Agrobacterium tumefaciens strain containing the Marafivirus replicase gene (in sense and antisense sequence linked by an intron). The genetic construct used derived from the pCAMBIA 2201 plasmid, driven by the 35S promoter and NOS terminator, containing the selection nptII gene. The genetic transformation was confirmed by PCR and Southern blot analysis. The gene transcription was evaluated by RT-PCR and northern blot. The addition of BAP to the culture medium, combined or not with NAA, and in combinations with KIN, assured a greater formation of adventitious buds in sour orange epicotyl segments. However, TDZ was not favorable to this response, that is also affected by the absence of light. Explants coming from in vitro cultivation were more favorable to the organogenic response. Rooting of sour orange regenerated shoots was obtained in MT medium with half the salt concentration, with or without auxin. It was possible to obtain transgenic Rangpur lime and Valencia sweet orange plants containing the Marafivirus replicase gene using internodal segments as explants. The Southern blot analysis confirmed the integration of one to four copies of the transgene in the plant genome. The transcription of the Marafivirus replicase gene and the nptII gene was observed by RT-PCR.