Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-05-15Bitstream added on 2014-06-13T20:23:22Z : No. of bitstreams: 1 moreira_rfc_dr_jabo.pdf: 545090 bytes, checksum: 6b6b5062d2bd5f7bc8ff1ca523e6a689 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) / Comon Fund For Comidities, International Cocoa Organization / Vassoura-de-bruxa e podridão de Moniliophthora, causadas pelos fungos Crinipellis perniciosa e Moniliophthora roreri, respectivamente, são as doenças de maior impacto econômico da cultura do cacau e estão presentes na maioria dos países produtores do Continente Americano. Evidências biológicas e moleculares comprovam que estes fitopatógenos estão intimamente relacionados. O uso de resistência genética através de dones resistentes de cacaueiro, é a medida mais eficiente no controle destas doenças. O conhecimento sobre as populações destes fungos é importante na geração de informações para o programa de melhoramento genético do cacau visando resistência. Marcadores moleculares RAPO e SSR foram usados para analisar a estrutura genética de populações destes fitopatógenos. No geral, as populações do Brasil, Equador, Peru e Trinidad agruparam-se de acordo com o país de origem, apresentando maior variabilidade dentro e não entre países, com presença de subpopulações. A população do Brasil apresentou maior diversidade genotípica em comparação com as demais. A transferibilidade de pares de primers SSR de C. perniciosa para M. roreri foi satisfatório. Populações de M. roreri do Equador e Peru apresentaram alta diferenciação genética interpopulacional, sendo que a do Peru apresentou maior variabilidade. / Witches' broom and fresty pod hot, caused by Crinipellis perniciosa and Moniliophthora roreri, are the most important disease of cacao in the American Continent. Biological and molecular data have shown that these pathogen are closely related. Resistance is the most efficient method to control these diseases. Therefore, information about the population structure of these cacao pathogen are important to support the breeding programo Molecular markers such as RAPD and SSR were used to analyzed the genetic structure of C. perniciosa and M. roreri frem the American Continent. Populations of C. perniciosa clustered according to their country of origin, with more variability within than between countries, revealing the presence of subpopulations. C. perniciosa Brazilian populations presented higher genotypic diversity than C. perniciosa from other countries. The transferability of C. perniciosa-SSR to M. roreri was positive. On the contrary, high interpopulation variability was observed between Ecuador and Peru, being M. roreri from Peru much more diverse than Ecuador.

Resumo: Diferentes isolados de Trichoderma (T. stromaticum, T. pseudokoningii, T. harzianum, e T. viride) e um isolado de T. atroviride, T. longibrachiatum, T. virens e T. pilulliferum foram estudados para uso no biocontrole de quatro subgrupos genéticos de Moniliophthora perniciosa, designados como Mp1441, Mp1445, Mp1893 e Mp1916. A associação das características dos isolados de Trichoderma avaliados quanto à velocidade de crescimento micelial, germinação, produção de esporos e produtividade massal de esporos em arroz, além das suas capacidades de antibiose e micoparasitismo a cada subgrupo do patógeno, resultou na determinação do índice denominado Potencial para uso no biocontrole (%PCB) a cada subgrupo de M. perniciosa. Os %PCBs variaram, demonstrando haver variabilidade genética entre os isolados do antagonista quanto às características avaliadas, como também nos níveis de resistência do patógeno. T. harzianum 911 apresentou o melhor %PCB para todos os subgrupos de M. perniciosa, sendo o pior apresentado por T. reesei 1612. Mp1445 foi o subgrupo que apresentou a menor capacidade de supressão aos antagonistas, sendo a maior apresentada por Mp1916. T. harzianum 906 inibiu o crescimento de Mp1916 por metabólitos não voláteis e todos os isolados de Trichoderma avaliados inibiram todos os subgrupos do patógeno pela ação de metabólitos voláteis, variando, porém, os percentuais de inibição entre as espécies e entre isolados da mesma espécie. Mp1445 inibiu o crescimento de T. virens 2007 por metabólitos não voláteis, sendo comprovada, portanto, a possibilidade do patógeno inibir o antagonista. T. harzianum 911 apresentou capacidade de micoparasitismo em placa e em vassouras infectadas individualmente pelos subgrupos do patógeno, além de produzir as enzimas β-1,3-glucanase, quitinase, protease, FPase, CMCase e amilase, tanto em substratos específicos como em cultivos...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Different isolates of Trichoderma (T. stromaticum, T. pseudokoningii, T. harzianum and T. viride) and one isolate of T. atroviride, T. longibrachiatum, T. virens e T. pilulliferum were studied for their usage in biocontrol of four genetic subgroups of Moniliophthora perniciosa named as Mp1441, Mp1445, Mp1893 e Mp1916. The association of the characteristics of the Trichoderma isolates evaluated regarding to velocity of mycelial growth, germination, spores production in Petri dish and mass production of spores in rice, besides their capacities of antibiosis and mycoparasitism to each subgroup of the pathogen, resulted in the determination of the index named Potential to be used in Biocontrol (%PCB) to each subgroup of M. perniciosa. The %PCBs varied, pointing out that there is a genetic variability among the antagonistic isolates regarding to the evaluated characteristics, as well as the levels of the pathogen resistance. T. harzianum 911 showed the best %PCB for all subgroups of M. perniciosa, being the worst presented by T. reesei 1612. Mp1445 was the subgroup that presented the lowest antagonistic suppression capacity, being the highest presented by Mp1916. T. harzianum 906 inhibited the growth of Mp1916 by non-volatile metabolites and all the evaluated isolates of Thrichoderma inhibited all the subgroups through volatile metabolites, varying, although, the percentages of inhibition among the species and among the isolates of the same species. Mp1445 inhibited the growth of T. virens 2007 by non-volatile metabolites, being proved, therefore, the possibility of the pathogen to inhibit the antagonist. T. harzianum 911 presented the mycoparasitism capacity in Petri dishes and in brooms infected indiviadually by the pathogen, besides the production of β-1,3-glucanase, chitinase, protease, FPase, CMCase and amilase, in both specific substrates and in cultivations with dried mycelia... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Sâmia Maria Tauk-Tornisielo / Coorientador: Givaldo Rocha Niella / Banca: Antonio Carlos Monteiro / Banca: Iracema Helena Schoenlein-Crusius / Banca: Sandra Regina Ceccato Antonini / Banca: Carlos Renato Corso / Doutor

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T16:13:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rincones_Johana_D.pdf: 3507237 bytes, checksum: b5905da7ffa8ea3a869dd3090e9a1d1f (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A Vassoura-de-Bruxa do cacaueiro constitui um patosistema complexo e até o momento não foi estabelecido um plano de controle efetivo na região produtora da Bahia. O objetivo principal deste trabalho foi aprimorar os conhecimentos sobre a interação C. perniciosa-Cacaueiro com informações referentes à: 1) tamanho e organização do genoma através da obtenção do cariótipo molecular do fungo; 2) variabilidade genética deste fitopatógeno a nível cromossômico na região produtora da Bahia; e 3) expressão gênica do fungo em presença de extratos do hospedeiro. O cariótipo molecular foi estabelecido por eletroforese em gel de campo pulsado. Esta mesma metodologia foi utilizada em combinação com análise tipo microsatélites para um estudo de variabilidade a nível cromossômico de 38 isolados provenientes de três biótipos e diferentes regiões geográficas. Para análise da expressão gênica foram seqüenciadas quatro bibliotecas de cDNA do fungo sob diferentes condições de cultivo e em diferentes estágios do desenvolvimento, incluindo uma biblioteca subtrativa obtida por SSH. Como resultados, apresentamos o cariótipo molecular de C. perniciosa e a existência de polimorfismos cromossômicos. A análise dos 38 isolados permitiu observar que o cariótipo do biótipo-C é estável ao longo do tempo e sua variabilidade na região da Bahia é baixa, mostrando assim a fragilidade do programa de melhoramento genético do cacaueiro na Bahia, onde os clones resistentes selecionados no campo foram desafiados contra apenas dois genótipos do patógeno. Com relação à análise da expressão do fungo, obtivemos 1427 unigenes e sua análise por similaridade com as bases de dados permitiu a identificação de diversos mecanismos pelos quais o fungo poderia estar manipulando o metabolismo da planta para seu benefício e em detrimento da produção de cacau. Assim, consideramos que a partir deste trabalho foi possível obter uma maior compreensão dos mecanismos utilizados por C. perniciosa no desenvolvimento da Vassoura-de-Bruxa em cacaueiro e estudos mais aprofundados, baseados nos resultados aqui obtidos, deverão auxiliar no desenvolvimento de estratégias de controle para esta importante doença / Abstract: Witches' broom disease of cocoa is a complex pathosystem that has evaded an efficient control program in the cacao-producing region of Bahia, Brazil. The main goal of this work was to acquire a better understanding of the C. perniciosa-Cacao interaction by providing new data regarding: 1) the size and organization of the fungal genome through molecular karyotyping; 2) the genetic variability of this phytopathogen at the chromosomal level in the cacao-producing region of Bahia; and 3) the gene expression of the fungus in the presence of host extracts. The molecular karyotype was obtained through pulsed-field gel electrophoresis. This same technique was applied in combination with microsatellite PCR analysis of 38 isolates from different biotypes and geographic regions in order to study the chromosomal-level genetic variability of this pathogen. For the gene expression analysis, four cDNA libraries of the fungus grown under different culture conditions and developmental stages, including a subtractive library using SSH, were sequenced and searched for similarities in the public databases. As results, we present the molecular karyotype of C. perniciosa and the existence of chromosome-length polymorphism. The analysis of the 38 isolates showed that the karyotype of the C-biotype is very stable in time and that the variability of the pathogen in Bahia is very low, thus indicating the fragility of the current cacao-breeding program in Bahia, where the resistant cacao clones selected in the field were challenged against only two different genotypes of the pathogen. With regards to the gene expression analysis, we obtained 1427 unigenes and the similarity searches allowed the identification of various mechanisms through which the fungus might be manipulating the metabolism of the plant for its own benefit and in detriment of cocoa production. Therefore, we consider that this work allowed us to acquire a better understanding of the molecular mechanisms used by C. perniciosa during witches' broom development in cacao and more detailed studies, based on the results presented here, might aid in the development of novel control strategies for this important disease / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T06:16:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Scarpari_LeandraMaria_D.pdf: 5130527 bytes, checksum: 37ee3077a3d859fb1da23df8ea1fa70c (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A doença vassoura-de-bruxa, provocada pelo fungo hemibiotrófico Crinipellis perniciosa, é uma das doenças mais importantes do cacaueiro, diminuindo drasticamente a produção e causando grandes prejuízos econômicos. Uma maior compreensão sobre a interação cacaueiro - C. perniciosa e sobre os processos que ocorrem na planta durante a progressão da doença é necessária para estabelecer novas estratégias de controle para a doença. O presente trabalho teve dois objetivos principais: 1) identificar as mudanças bioquímicas que ocorrem no cacaueiro durante o desenvolvimento da doença; 2) identificar os genes diferencialmente expressos no micélio biotrófico do fungo C. perniciosa cultivado in vitro, sendo este micélio o estágio do ciclo de vida do fungo que induz os sintomas da doença. Os resultados da caracterização bioquímica da doença, usando plântulas de cacau infectadas artificialmente, indicaram uma elevação inicial de metabólitos secundários relacionados à defesa da planta, como alcalóides, fenólicos e taninos. Como esses mecanismos não são eficientes para deter a colonização da planta pelo fungo, uma cascata de eventos, provavelmente ativada pelo aumento dos níveis de etileno, eleva os teores de asparagina, de açúcares, malondialdeido (MDA) e glicerol, altera o perfil de ácidos graxos, reduz os níveis de aminoácidos individuais e de pigmentos fotossintéticos, causando a morte da vassoura. O importante avanço do desenvolvimento de um sistema que permite a manutenção in vitro do micélio biotrófico de C. perniciosa, estabelecido recentemente por nosso grupo, permitiu o estudo da expressão gênica diferencial das duas fases miceliais do ciclo de vida do fungo: biotrófica e necrotrófica. Utilizamos a técnica de microarrays de DNA, analisando 2.304 fragmentos de bibliotecas de DNA genômico do Projeto Genoma da Vassoura-de-bruxa, selecionados a partir da similaridade com genes de patogenicidade de outros patógenos. Os resultados mostraram supressão da expressão de genes relacionados ao transporte e metabolismo de hexoses e ao metabolismo de lipídeos no micélio biotrófico do fungo. Já os genes da família do citocromo P450, hidrofobinas, aglutinina, lacase, várias proteases, lipases, álcool oxidase (AOX) e proteínas pol do sistema de retrotransposição de vírus, tiveram sua expressão induzida no micélio biotrófico, sugerindo uma possível participação nos mecanismos de patogenicidade do fungo. Esses resultados representam avanços significativos para as pesquisas sobre o metabolismo do fungo C. perniciosa e sobre as bases moleculares da progressão da doença vassoura-de-bruxa do cacaueiro, e servirão como base para orientar futuras investigações visando o controle da doença / Abstract: Witches¿ broom disease, caused by the hemibiotrophic fungus Crinipellis perniciosa, is one of the most important diseases of cocoa, causing dramatic production and economic losses. A better understanding of the cacao - C. perniciosa interaction and the processes that occur in the plant during disease progression becomes necessary in order to establish novel control strategies for this disease. In view of this, the present work had two main goals: 1) establishment of the biochemical modifications that occur in the host plant during disease development; and 2) identification of differentially expressed genes in in vitro grown biotrophic mycelia of C. perniciosa, which constitutes the fungal life stage that induces disease symptoms. The results of the biochemical characterization of the disease in artificially infected cocoa seedlings indicated an initial increase of secondary metabolites related to plant defenses, such as alkaloids, phenolics, and tannins. Since these mechanisms fail to control plant colonization by the fungus, a cascade of events, probably triggered by the increased levels of ethylene, boosts the contents of asparagine, sugars, malondialdehyde (MDA) and glycerol, alters the profile of fatty acids, lowers the levels of individual amino acids and photosynthetic pigments, and ultimately leads to tissue death. The important technological development of an in vitro system that allows the maintenance of the biotrophic phase of C. perniciosa, which was recently established by our group, allowed the analysis of the differential gene expression between the two mycelial phases of the life cycle of this fungus: the biothophic and the necrotrophic phases. For this study we employed the technique of DNA microarrays, analyzing 2,304 fragments obtained from the genomic DNA libraries of the Witches¿ Broom Genome Project, and which were selected based on their sequence similarity to pathogenicity genes of other pathogens. The results showed suppressed expression of genes related to the metabolism and transport of hexoses and to the metabolism of lipids in the biotrophic mycelia of the fungus. On the other hand, the expression of genes of the cytochrome P450 family, hydrophobins, agglutinin, laccase, several proteases, lipases, alcohol oxidase (AOX), and pol proteins of the viral retrotransposition system were induced in the biotrophic mycelia, thus suggesting their possible participation in fungal mechanisms of pathogenicity. These results represent significant advances to our understanding of the metabolism of C. perniciosa and also regarding the molecular basis underlying the progression of witches¿ broom disease of cocoa, and will be valuable as a basis for future investigations aimed at disease control / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Nelson Horacio Pezoa Garcia / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-12T13:00:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Efraim_Priscilla_D.pdf: 3005113 bytes, checksum: 644805cbb4b729e262d0a9e849b572b8 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Este trabalho buscou contribuir com o Programa Brasileiro de Melhoramento Genético de Cacau por meio do processamento e caracterização dos principais derivados de nove clones estudados e utilizados comercialmente na Bahia por sua resistência à vassoura-de-bruxa: CEPEC 42, EET 397, TSA 654, TSA 656, TSAN 792, TSH 516, TSH 565, TSH 774, TSH 1188 e do cacau Comum, tradicional na região e suscetível à doença. Os frutos foram colhidos em um mesmo período, fermentados simultaneamente em lotes de 50 Kg e secos naturalmente ao sol. As amêndoas obtidas foram quebradas em nibs, que foram torrados em 3 diferentes tempos em forno elétrico rotativo a 150 ºC e moídos até 25 µm para obtenção dos liquors. A análise sensorial de preferência definiu o tempo de torração de cada material. A manteiga de cacau foi obtida por prensagem hidráulica dos liquors. Chocolates amargos foram produzidos pelo método convencional. A caracterização física dos frutos e sementes demonstrou diferenças entre os materiais quanto ao peso total dos frutos e rendimento de sementes com polpa por fruto. O monitoramento de temperatura e pH da massa em fermentação e a avaliação dos teores de umidade, atividade de água, pH, acidez total titulável, açúcares, ácidos orgânicos, proteínas, compostos fenólicos totais e da contagem microbiológica, durante a fermentação e ao término da secagem, demonstraram que a evolução do processo fermentativo foi distinta para cada material. A caracterização da manteiga de cacau quanto à composição em triacilgliceróis e curva de sólidos indicou que os todos os cultivares estudados, exceto o TSH 774, apresentaram melhorias em relação ao cacau Comum. A análise sensorial descritiva quantitativa dos liquors por duas equipes treinadas e de aceitação dos chocolates, por painel não treinado de consumidores, indicaram diferenças entre os materiais para alguns atributos avaliados de acordo com sua ascendência genética, sendo que os materiais descendentes dos grupos Trinitário e Forastero apresentaram maior preferência em relação aos descendentes apenas do grupo Forastero. Apesar das diferenças físicas e químicas verificadas nos liquors e chocolates, observou-se a viabilidade industrial de todos dos materiais estudados. Estudou-se ainda a influência da mistura de 0, 30, 50 e 100% de sementes danificadas pela vassoura-de-bruxa com sementes sadias na fermentação às características de amêndoas, liquors, manteiga e pó de cacau obtidos. Os perfis de temperatura e pH da massa em fermentação, os teores de açúcares e ácidos orgânicos e a análise da fração volátil demonstraram que reações que normalmente ocorrem na fermentação podem ter se iniciado nos frutos, antes da colheita. O teor de polifenóis totais das sementes danificadas foi maior que o de sementes sadias, porém, as perdas na fermentação foram maiores. Os teores de lipídios e proteínas das amêndoas e liquors foram menores quanto maior a proporção de sementes danificadas. A vassoura-de-bruxa não causou alterações nas propriedades físicas e químicas avaliadas nas manteigas de cacau. A análise da fração volátil das sementes, amêndoas e liquors indicou que o aumento do teor de sementes danificadas levou à diminuição ou ausência de importantes alquilpirazinas, indicando que o uso destas, nas porcentagens estudadas, pode prejudicar a qualidade sensorial dos derivados de cacau / Abstract: The aim of this study was to contribute with the Brazilian Genetic Improvement Program of cocoa by processing and characterizing the main cocoa-derived products from nine clones studied and used commercially in Bahia due to their resistance to ¿witches¿ broom¿: CEPEC 42, EET 397, TSA 654, TSA 656, TSAN 792, TSH 516, TSH 565, TSH 774, TSH 1188 and Comum cocoa, traditional in the area and susceptible to the disease. The fruits were harvested in the same period, fermented in 50 kg batches and sun-dried. The cocoa beans obtained were broken into nibs, roasted during 3 different times in a rotative electric oven at 150ºC and milled to 25 µm to obtain the liquors. A preference sensory evaluation defined the specific roasting time for each material. Cocoa butter was obtained by hydraulic pressing of the liquors. Bitter chocolates were produced by the conventional method. The physical characterization of the fruits and seeds demonstrated differences among the materials regarding total weight of the fruits and yield of seeds with pulp per fruit. Temperature and pH monitoring of the mass during fermentation and evaluation of moisture content, water activity, pH, total acidity, sugars, organic acids, proteins, total phenolic compounds and microbiological count during fermentation and at the end of drying demonstrated that the evolution of the fermentation process was different for each material. The triacylglycerol composition and the solid fat content of the cocoa butters from all the cultivars studied, except TSH 774, presented improvements compared to Comum cocoa. The quantitative descriptive analysis of the liquors carried out by two trained panels and the acceptance of the chocolates by an untrained consumer panel indicated differences for some of the parameters evaluated among the materials studied according to their genetic ascendance. The cultivars descending from Trinitario and Forastero groups presented greater preference in relation to the descendants of the Forastero group only. The physical and chemical characterization of the liquors and chocolates demonstrated differences among the materials studied; however, it also showed their industrial viability. The influence of the mixture of 0, 30, 50 and 100% of seeds damaged by ¿witches¿ broom¿ with healthy seeds during the fermentation process on the characteristics of cocoa beans, liquors, cocoa butter and powder was also studied. The temperature and pH profiles of the mass during fermentation, the amounts of sugars and organic acids and the analysis of volatile compounds demonstrated that some reactions that usually occur during fermentation might have been initiated in the fruits before harvesting. The total content of polyphenols in the damaged seeds was higher than in the healthy seeds; however, losses during fermentation were also greater. Lipid and protein contents of cocoa beans and liquors decreased with the increase of the proportion of damaged seeds. ¿Witches¿ broom¿ did not cause changes in the physical and chemical properties evaluated in the cocoa butters. The analysis of the volatile compounds of the seeds, beans and liquors showed that the increase of the content of damaged seeds led to the decrease or absence of the main alkylpyrazines, indicating that their use in the percentages studied may negatively affect the sensory quality of cocoa-derived products / Doutorado / Doutor em Tecnologia de Alimentos

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Jorge Maurício Costa Mondego / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T22:21:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Teixeira_PauloJosePereiraLima_D.pdf: 96794209 bytes, checksum: ecb31f47caf999afd03d8b9da31315f5 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O cacaueiro se destaca como uma das principais culturas perenes na agricultura, sendo economicamente relevante por fornecer a matéria prima para a fabricação do chocolate, um produto que movimenta bilhões de dólares no mercado mundial a cada ano. Apesar de sua importância, o cacaueiro é drasticamente atacado por diversas doenças que diminuem sua produtividade e reduzem a qualidade das amêndoas do cacau. Dentre estas, a vassoura de bruxa, causada pelo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa, é um importante fator limitante da produção cacaueira nas Américas. Utilizando tecnologias de sequenciamento de DNA de nova geração, realizamos uma abrangente análise transcriptômica da vassoura de bruxa neste trabalho. Um banco de dados denominado Atlas Transcriptômico da Vassoura de Bruxa foi construído, o qual compreende aproximadamente 60 bibliotecas de RNA-seq representativas dos mais variados estágios de desenvolvimento, condições de crescimento e respostas a estresse do fungo M. perniciosa sob condições in vitro e in planta. O primeiro capítulo desta tese apresenta uma análise global do Atlas Transcriptômico da vassoura de bruxa. Este conjunto de dados tem suportado uma série de estudos específicos relacionados a variados aspectos da doença, os quais são apresentados e detalhados nos demais capítulos da tese. Notavelmente, uma análise detalhada da interação biotrófica entre o cacaueiro e o fungo M. perniciosa (Capítulo II) revelou a ocorrência de intensa reprogramação transcricional e importantes alterações fisiológicas em plantas infectadas, incluindo a ativação de respostas de defesa ineficientes e a ocorrência de privação de carbono. Curiosamente, um processo de senescência prematura se estabelece no tecido infectado e parece ser um evento central no desenvolvimento da doença, possivelmente disparando o início da fase necrotrófica desta interação planta-patógeno. Ainda, nossos dados também permitiram a identificação de potenciais efetores de virulência em M. perniciosa, como também a caracterização do status metabólico do fungo durante a infecção do cacaueiro. Um modelo detalhado que sumariza os aspectos moleculares da vassoura de bruxa foi elaborado. De maneira geral, o Atlas Transcriptômico da Vassoura de Bruxa representa um importante avanço no estudo desta doença e tem servido como ponto de partida para uma série de estudos adicionais. A utilização destes dados na identificação e caracterização de potenciais fatores de patogenicidade de M. perniciosa (Capítulos III, IV e VI) e de mecanismos de defesa do cacaueiro (Capítulo V) também é apresentada nesta tese / Abstract: Cacao stands out as one of the major perennial crops in the world, being economically relevant as the source of chocolate, a multi-billion dollar product appreciated worldwide. Despite its importance, cacao is seriously affected by several diseases that reduce crop yield and decrease the quality of cocoa beans. Among them, the witches' broom disease (WBD), caused by the basidiomycete Moniliophthora perniciosa, is a major constraint for cacao production in the Americas. Using next generation sequencing technologies, a comprehensive transcriptomic analysis of WBD was performed. We developed a database named "WBD Transcriptome Atlas", which comprises approximately 60 RNA-seq libraries that represent a wide range of developmental stages, growth conditions and stress responses of the fungus, either under in vitro or in planta conditions. The first chapter of this thesis presents a global analysis of the WBD Transcriptome Atlas. This data set has supported a number of specific analyses related to several aspects of WBD, which are presented and detailed in the other chapters of the thesis. Strikingly, a detailed analysis of the biotrophic interaction between M. perniciosa and cacao (Chapter I) revealed the occurrence of intense transcriptional reprogramming and remarkable physiological alterations in infected plants, including the activation of ineffective defense responses and the occurrence of carbon deprivation. Curiously, a premature senescence process is established in infected tissues and appears to be a central event in WBD, possibly triggering the onset of the necrotrophic stage of this plant-pathogen interaction. Additionally, our data also allowed the identification of potential virulence effectors in M. perniciosa, as well as the characterization of the metabolic status of the fungus during cacao infection. A detailed model summarizing the molecular aspects of WBD is presented. Overall, the WBD Transcriptome Atlas represents an important advance in the study of this disease and constitutes a starting point for a number of additional studies. The use of these data in the identification and characterization of potential pathogenicity factors of M. perniciosa (Chapters III, IV and VI) and defense mechanisms of cacao (Chapter V) will also be presented in this thesis / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T10:25:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alvarez_Javier_D.pdf: 13138837 bytes, checksum: 410e11bd8ba7df37c003fae0919eec2e (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A doença vassoura de bruxa do cacaueiro, causada pelo fungo Moniliophthora perniciosa tem sido um dos maiores problemas fitopatológicos do hemisfério sul. O fungo tem uma fase biotrófica longa, pouco comum entre fungos com o estilo de vida hemibiotrófico. Este fato sugere que M. perniciosa deve dispor de importantes mecanismos de evasão do sistema de defesa da planta e que estes teriam um papel fundamental para o sucesso da infecção. Assim sendo, o objetivo deste trabalho é entender os mecanismos de supressão envolvidos na resposta de defesa basal da planta. Especificamente, aqueles mecanismos mediados por hormônios que poderiam influenciar na suscetibilidade da planta ao patógeno durante a invasão do M. perniciosa. Com este fim, foram construídas bibliotecas de RNAseq da interação cacau-M. perniciosa durante o inicio da fase assintomática da doença. As bibliotecas representantes desta interação mostraram expressão diferencial de genes relacionados com a sinalização de auxina, mas não foi observado indução de genes da biossíntese planta. Estes dados sugerem a presença de auxina "exógena" produzida provavelmente pelo patógeno. Adicionalmente, foram encontrados genes relacionados com o ácido jasmônico e etileno. Com o intuito de identificar se M. perniciosa era capaz de secretar um composto com função de auxina, sementes de Arabidopsis thaliana foram crescidas em amostras de sobrenadante do fungo. Estes experimentos mostraram alteração da morfologia das raízes semelhantes à adição de auxina exógena. Amostras de sobrenadantes do fungo foram submetidas às técnicas de RMN, LC MS/MS e GC-MS e mostraram a presença de um composto com estrutura semelhante ao indol-3-acetoácido sendo produzido pelo fungo. Estudos do time course de produção deste composto mostraram que a auxina produzida é rapidamente metabolizada formando diferentes derivados indólicos com provável função na patogênese do fungo. Finalmente, encontramos um novo composto com estrutura parecida à auxina e capacidade de indução de genes de resposta a este hormônio. Este trabalho é o primeiro relato a mostrar o time course da síntese de auxina por M. perniciosa e a indução de respostas de sinalização de auxina nos tecidos de cacau infectados pelo fungo. A intervenção nas vias de síntese de auxina pelo fungo seria um caminho plausível na tentativa por conter a doença vassoura de bruxa / Abstract: The witches' broom disease in Cacao is caused by the fungus Moniliophthora perniciosa has been one of the most important problems phytopathological in the southern hemisphere. The fungus has an unusual long biotrophic phase with the lifestyle hemibiotrofic suggesting that M. perniciosa must have important evasion mechanisms for breaking of the plant defense system and it would have a key role to success in the infection. Therefore, the aim of this work is to understand some of the mechanisms involved in the suppression of basal defense response of the plant. Specifically, hormones-mediated mechanisms that could influence plant susceptibility to pathogens during the infection of M. perniciosa. For this purpose, RNAseq libraries were constructed of the interaction cacao - M. perniciosa during the asymptomatic phase of the disease. Genes related with the auxin and jasmonic acid signaling and ethylene production were differential expressed during the initial stage of the disease. Furthermore, auxin-responsive genes were induced, but not observed induction of plant biosynthesis genes for this hormone. These data suggest presence of auxin "exogenous" probably produced by the pathogen. In order to identify whether M. perniciosa was able to secrete a compound like an auxin, Arabidopsis thaliana seedlings were grown in mediums with supernatant of the fungus. These experiments showed alterations on the roots morphology, similar to the addition of exogenous auxin. Samples of supernatants were subjected to the techniques of NMR, LC-MS/MS and GCMS and showed the presence of a compound with a similar structure of Indole-3- Acetic Acid (IAA) being produced by the fungus. A time course of the production of this compound was examinated by LC-MS/MS and showed that the auxin is produced by M. perniciosa, but is rapidly metabolized forming different indole derivatives, some of them with a probable role in the pathogenesis. Finally, we found a new compound with a structure similar to auxin and with the ability to induce gene response to this hormone / Doutorado / Genetica Vegetal / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Johana Rincones Peres / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T06:30:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barau_JoanGrande_D.pdf: 15458099 bytes, checksum: 72a1f6ed8ef42544b91f989494fb4ce2 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A introdução da doença vassoura de bruxa do cacaueiro no Sul da Bahia representa um dos maiores exemplos da magnitude de impacto sócio econômico que uma fitopatologia pode aflingir a uma região ou país com um predominante perfil agroexportador. Com a execução do projeto genoma do fungo causador da vassoura de bruxa, o Basidiomiceto Moniliopthora perniciosa, uma série de trabalhos de caracterização morfológica, fisiológica e genética da doença foram inciados. Em um primeiro momento, em paralelo com a caracterização das alterações bioquímicas da doença, buscamos entender as diferenças de expressão gênica através de microarranjos de DNA e bibliotecas ESTs comparando as duas fases morfo-genéticas do fungo reproduzidas in vitro. Apesar de esse esforço pioneiro ter permitido a formação de um modelo panorâmico das alterações genéticas do fungo e fornecido importantes diretrizes para a pesquisa futura, ficou claro a necessidade de se explorar em maior detalhe a interação in vivo. Dentre os aspectos importantes investigados, o estudo do metabolismo do glicerol durante a fase biotrófica da interação através de marcadores de expressão mostrou que essa fonte de carbono em potencial pode ter um papel importante no início da infecção e participar da sinalização de stress através da modulação do shuttle mitocondrial de glicerol 3-fosfato. No entanto, a necessidade de se entender melhor o panorama das fontes de carbono disponíveis no apoplasto, o microambiente ocupado pelo fungo nas fases iniciais da interação, nos motivou a caracterizar as alterações nutricionais desse espaço ao longo da doença. Foi possível demonstrar que a vassoura de bruxa quebra o ciclo de carbono normal do apoplasto e que induz o corte da comunicação vascular com as partes sadias da planta ao final da fase biotrófica. Uma correlação entre a sinalização por carbono e a expressão de genes de patogenicidade secundária foi explorada. Com a expansão dos dados de genoma e transcriptoma utilizando sequenciamento de DNA de terceira geração (Illumina e 454 Life Sciences), dezenas de genes-alvo com potencial participação em vias de patogenicidade e desenvolvimento da doença foram identificados. Nesse contexto, dentre as ferramentas para análises de genômica funcional nesse modelo, a inativação ou nocaute de genes por gene targeting e o estudo da atividade de proteínas através de fusões com genes repórteres são essenciais ao teste das hipóteses geradas como fruto da pesquisa genômica da Vassoura-de-bruxa. Transformantes de M. perniciosa carregando uma cópia do gene marcador de autofagia MpATG8 fusionado ao marcador GFP apresentaram um padrão de fluorescência característico da biologia celular de ATG8, permitindo acompanhar o processo de autofagia sob condições de deprivação de nutrientes, demonstrando a possibilidade da aplicação de fusões com repórteres fluorescentes para experimentos de localização subcelular de proteínas desse fitopatógeno. Por fim, uma estratégia baseada na seleção de recombinantes através da técnica split marker em conjunto com um silenciamento transiente do sistema de reparo NHEJ por RNAi foi traçada e executada de modo a obter o nocaute do gene MpKu70, essencial a essa via de reparo, cuja inativação está associada a um aumento da eficiência de recombinação homóloga e gene targeting / Abstract: Cocoa's Witches Broom Disease (WBD) is caused by the hemibiotrophic interaction between the Basidiomycete fungus Moniliopthora perniciosa and plants of Theobroma cacao. One remarkable feature of WBD is its unusual long biotrophic phase in which the fungal growth is restricted to the apoplastic space of plants. We compared differential gene expression between biotrophic and saprotrophic-like hyphae in vitro and proposed based on microarray and EST results that the maintenance of biotrophic-like cultures of M. perniciosa in vitro is subject to Carbon source regulation, especially regarding the use of glycerol as a preferential carbon source for biotrophy. To further gain insight into the carbon source regulation of WBD biotrophic phase in vivo, we characterized glycerol utilization using fungal expression markers during the initial phases of infection. We also characterized the carbon source fluctuations in the apoplast of healthy and infected cocoa seedlings. We showed that healthy cocoa plants possess a rhythmic carbon cycle in the apoplast that is in fine tune with periodical leaf flushing, expansion and photosynthetic maturation. WBD completely disrupts the carbon cycle in the apoplast of infected plants and also arrests leaf photosynthesis at pre sink-to-source transition levels. It was also possible to distinguish two different phases of carbon availability in the apoplast. The two phases correlated with fungal growth rates, the expression of a characterized necrosis inducing gene and the development of a tumor-like callus at the base of infected stems that completely disrupted normal vascular communication between healthy and diseased parts of the plant. A possible correlation between carbon starvation and phase switch from biotrophic to necrotrophic was explored and the evolution of the vascular-disrupting callus was discussed in the view of the tradeoff between the physiological behavior of infected tissues as sinks and the avoidance of nutrient remobilization during infected tissue senescence. Finally, we focused on the development of functional genomic tools for the study of gene function in this pathogen. As a proof-of-concept, we successfully obtained fungal strains expressing the autophagy related gene MpATG8 fused with GFP reporter, in which was possible to visualize the autophagy process in vivo by fluorescence imaging. In addition we also obtained the first successful gene targeting knockout of MpKu70, an M. perniciosa homologous of a gene essential to NHEJ in Eukaryotes. MpKu70 knockouts strains have reported phenotypes of increased homologous recombination, and the M. perniciosa strain may be an important platform for future functional studies of genes important in witches broom disease pathogenesis / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Johana Rincones Pérez / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T12:47:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_BrunoVazde_D.pdf: 5827031 bytes, checksum: c9ff7bf065563150ef6ea14b5630ca52 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O fungo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa é o agente causador da vassoura-de-bruxa do cacaueiro, doença que se tornou um dos principais problemas fitopatológicos do Brasil. O fungo possui duas fases de vida, biotrófica e necrotrófica, as quais estão associadas aos sintomas de vassoura-verde e vassoura-seca, respectivamente, durante a progressão da doença. Em vista dos grandes prejuízos econômicos causados pela vassoura-de-bruxa, foi iniciado o Projeto Genoma Vassoura-de-Bruxa, cujo objetivo é a decodificação genética do fungo com o intuito de identificar genes candidatos que possam estar relacionados ao estabelecimento e à progressão da doença para serem caracterizados. M. perniciosa é capaz de utilizar metanol como fonte única de carbono. Na maioria dos organismos estudados, a enzima metanol oxidase (MOX) é a responsável pelo metabolismo de metanol através do metabolismo peroxissomal, à qual também está associada uma catalase (CAT). Em plantas, uma das principais fontes de metanol é a pectina presente na estrutura da parede celular vegetal. Algumas espécies de fungos fitopatogênicos tem a capacidade de secretar oxalato como produto da enzima oxaloacetato acetilhidrolase (OAH), o qual é capaz de quelar íons cálcio da estrutura das pectinas, deixando-as vulneráveis ao ataque de enzimas que degradam a parede celular vegetal. Dentre essas enzimas, encontra-se a pectina metilesterase (PME), a qual é capaz de desmetilar as pectinas, liberando metanol. Como M. perniciosa possui em seu genoma sequências com similaridade a mox, cat, pme e oah, formulamos uma hipótese, segundo a qual M. perniciosa seria capaz de degradar o metanol proveniente das pectinas, através de um metabolismo peroxissomal, durante sua interação com o cacau na vassoura-de-bruxa. De fato, M. perniciosa é capaz de secretar oxalato, formando cristais de oxalato de cálcio. Nossos resultados sugerem fortemente que M. perniciosa utiliza o metanol proveniente das pectinas durante a vassoura-de-bruxa; no entanto, esse processo se daria através de um metabolismo extracelular, visto que M. perniciosa produz uma MOX e CAT extracelulares, e não através do metabolismo peroxissomal como inicialmente proposto. Além disso, M. perniciosa possui outras catalases, as quais se apresentam diferencialmente expressas nas diferentes fases do ciclo de vida do fungo e em diferentes estágios da progressão da vassoura-de-bruxa. Por fim, apresentamos uma análise preliminar do secretoma de M. perniciosa / Abstract: The hemibiotrophic basidiomycete fungus Moniliophthora perniciosa is the causal agent of Witches' broom disease (WBD) in cacao. M. perniciosa is classified as a hemibiotrophic pathogen and presents two morphologically distinct life phases, biotrophic and necrotrophic, that are correlated with the green broom and dry broom symptoms, respectively, during the progression of WBD. The introduction of WBD in Bahia, the main Brazilian cacao-producing state, reduced the cacao production drastically and Brazil has become a net importer of cacao in order to supply the national chocolate industry. Due to the extreme losses in cacao production, the Witches' Broom Genome Project was initiated to decode the M. perniciosa genome and, based on the data acquired, select genes that could be relevant during the progression of WBD for characterization. M. perniciosa is able to grow in methanol as the sole carbon source. In methylotrophic yeasts and other methanol-degrading organisms, a methanol oxidase (MOX) is the key enzyme in methanol metabolism and it is also related to a catalase (CAT); both MOX and CAT characterize a peroxisomal metabolism. In plants, one of the main sources of methanol is the pectin present in the plant cell walls. Many phytopathogenic fungal species produce oxalate, a product of the enzyme oxaloacetate acetyl hydrolase (OAH), which removes calcium ions bound to pectin to produce calcium oxalate crystals, thus exposing the host cell walls to plant cell wall-degrading enzymes (PCWD) of fungal origin. One of the main PCWDs is pectin methylesterase (PME), an enzyme that removes the methyl ester radicals from esterified pectin, releasing methanol. As M. perniciosa possesses mox, cat, oah and pme on its genome, we hypothesized that M. perniciosa would utilize a peroxisomal metabolism to metabolize the methanol released from the pectin demethylation in WBD. Indeed, M. perniciosa secretes oxalate, thus producing calcium oxalate crystals. Our data strongly suggest that M. perniciosa able to utilize the methanol released from pectin demethylation; however, this metabolism is probably extracellular due to the presence of secreted MOX and CAT. Moreover, M. perniciosa possesses other cats, which are differentially expressed in vitro and in planta. Finally, we present a preliminary analysis of M. perniciosa secretome / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Maria Carolina Scatolin do Rio / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T23:38:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Teixeira_GleidsonSilva_D.pdf: 5340667 bytes, checksum: a5eb7198bd79e4c57ea6ac55d5742b85 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A Vassoura-de-bruxa, causada pelo fungo hemibiotrofico Moniliophthora perniciosa, e uma das principais doenças que acometem o cacaueiro (Theobroma cacao L.). Durante a fase biotrófica, o patôgeno coloniza o espaço intercelular e estimula a formação de ramos hipertróficos denominados vassoura verde. No estagio avançado da doença, o fungo passa a colonizar também o interior das células e observa-se a morte do tecido originando a vassoura seca. A semelhança destes sintomas aos observados em outras fitopatologias sugere um desequilíbrio hormonal em resposta a infecção. Neste contexto, este trabalho apresenta um estudo integrado dos genes relacionados a diferentes hormônios vegetais e uma caracterização dos genes relacionados às citocininas. A possível participação dos hormônios no estabelecimento e na progressão da Vassoura-de-bruxa do cacaueiro e discutida. Dados de RNA-seq foram gerados durante as diferentes fases da interação. Em seguida, genes diferencialmente expressos foram classificados de acordo com a terminologia do Gene Ontology. Além disso, a capacidade de biossíntese de citocininas pelo fungo M. perniciosa foi avaliada através do teste de complementação utilizando a levedura TM128 sln1?. Em paralelo, foi realizada uma caracterização detalhada dos genes que constituem o mecanismo de percepção de citocininas em cacau, sistema denominado two-component. Genes relacionados às respostas hormonais e de defesa foram os mais representados entre o grupo de diferencialmente expressos. Durante a fase assintomática, e observada a indução de genes relacionados a auxinas e etileno. Por outro lado, no estagio avançado, foram identificados genes relacionados à degradação de citocininas e as respostas de defesa mediadas por acido salicílico e jasmonato/etileno. Paralelamente, foi identificado no M. perniciosa um gene para a síntese de citocininas, entretanto, a funcionalidade deste não foi confirmada. Em T. cacau, a arquitetura do sistema two-component e similar a encontrada em Arabidopsis sp., porem, nenhuma alteração significativa na expressão dos genes que constituem este sistema foi identificada. Por essa razão, não foi possível estabelecer uma relação clara entre as citocininas e os sintomas da Vassoura-de-bruxa. Contudo, o padrão de expressão de genes relacionados à homeostase de auxinas, sugere uma regulação negativa das respostas de defesa contra patogenos biotroficos durante fase inicial da doença / Abstract: The Witches' Broom disease, caused by the hemibiotrophic fungus Moniliophthora perniciosa, is the major disease affecting cacao (Theobroma cacao L.). During its biotrophic phase, the pathogen colonizes the intercellular space and stimulates the formation of hypertrophic branches called green broom. In the advanced stage of the disease, the fungus starts also to colonize the interior of the cells and it is noted the death of tissue originating the dry broom. The similarity of these symptoms to those observed in other plant diseases suggests a hormonal imbalance in response to the infection. In this context, this work presents an integrated study of plant hormone-related genes and a characterization of cytokinin-related genes. The possible participation of these genes in the establishment and progression of Witches' Broom in cacao is discussed. RNA-seq data regarding different phases of the interaction were generated. After this, differentially expressed genes were classified according to Gene Ontology terminology. Furthermore, the ability of cytokinin biosynthesis by M. perniciosa was assessed by a complementation test using the yeast TM128 sln1?. In parallel, we performed a detailed characterization of genes that constitute the mechanism of perception of cytokinins in cacao, the two-component system. For these, the gene expression values have been accessed through the previously generated RNA-seq data. Defense and hormone-related genes were the most represented among the differentially expressed genes. During asymptomatic phase, we observe the induction of auxin and ethylene-related genes. During the symptomatic stage, genes related to the degradation of cytokinins and defense responses mediated by salicylic acid and jasmonate/ethylene was identified. Simultaneously, a putative gene for the synthesis of cytokinins was identified in M. perniciosa genome; however, the participation of this gene in cytokinin synthesis was not confirmed. In T. cocoa, the architecture of two-component system is similar to that one found in Arabidopsis sp.; however, no significant change in the expression of genes that constitute this system was identified. For this reason, it was not possible to establish a clear relationship between cytokinins and the symptoms of the Witches' Broom disease. Moreover, the expression pattern of homeostasis auxin-related genes suggests a negative regulation of defense responses against biotrophic pathogens during the initial stage of the disease / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular