As raias são peixes peçonhentos e estão frequentemente associadas a acidentes em seres humanos, principalmente na região Norte do Brasil, favorecidos pelo hábito desses peixes de permanecerem no fundo de águas rasas e pela contínua utilização humana dos rios. Os ferrões das raias causam lesões dolorosas, edema, necrose, e o muco que recobre toda a extensão do corpo desses peixes pode aumentar a gravidade desses ferimentos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta imunológica induzida pelo muco de Paratrygon aiereba nativo ou irradiado por raios gama de 60Co em modelos animais. Foram realizados ensaios imunoenzimáticos e Western blotting para verificar a resposta humoral e reatividade cruzada dos soros provenientes de camundongos Swiss e coelhos New Zealand previamente imunizados contra o veneno, muco nativo ou irradiado. A indução da produção de anticorpos in vitro, as subclasses de IgG e a quantificação de citocinas foram analisados. Além de realizados ensaios de soroneutralização da atividade edematogênica in vitro e in vivo e de viabilidade celular. Os dados foram analisados estatisticamente por meio de análise de variância. O protocolo de imunização possibilitou a obtenção de soros com títulos satisfatórios de anticorpos policlonais. O muco e veneno de P. aiereba são imunogênicos e apresentam reatividade antigênica. O muco nativo ou irradiado induziu a produção de anticorpos IgG e esses reconheceram antígenos presentes no muco de outras espécies de raias. Células esplênicas de animais imunizados contra o muco irradiado produziram IFN-γ, TNF- α e IL-10 e também foi observada a produção sérica de TNF-α (grupo imunizado contra o muco irradiado) e de IL-6 e IL-17 (grupo imunizado contra o muco nativo). O soro anti-muco irradiado reduziu a atividade edematogênica in vitro, ao contrária da in vivo que não foi neutralizada. Os resultados corroboram o uso da radiação ionizante, com produção de anticorpos altamente responsivos e melhor resposta imune, além de comprovar que o muco de Paratrygon aiereba foi capaz de estimular resposta imune adaptativa celular e humoral. / Freshwater stingrays are venomous animals, frequently associated with accidents in northern Brazil where the shallow waters and the human use of the rivers favour close proximity between the fish and potential victims. Ray stings induce painful lesions, edema, necrosis, and the mucus that covers the body of these fishes may increase the severity of the wounds. The aim of this work was to evaluate the immune response induced by native or 60Co Paratrygon aiereba mucus in animal models. Enzyme linked immunosorbent assays and western blots were performed to compare humoral immune response as well as cross reactivity using antibodies raised in mice or rabbits against venom or mucus, the latter either in its native or irradiated form. Antibody production in vitro, immunoglobulins subclasses and cytokines production were evaluated. Immunization resulted in good levels of antibodies. Interestingly, both the mucus and the venom share many cross reactive components. Furthermore, antibodies raised against native mucus or its irradiated counterpart were cross-reactive against the mucus of other stingray species. Splenic cells from mice immunized with irradiated mucus secreted IFN-γ, TNF-α and IL-10. The serum raised against irradiated mucus reduced edematogenic activity in vitro, but not in vivo, when the venom and the serum are injected separately. Our results corroborate the potential of ionizing radiation as a detoxifying agent for immunogens, with production of high antibody titers and, that the highly abundant mucus of freshwater stingrays contains basically the same repertoire of antigens as the venom, inducing the synthesis of high levels of neutralizing antibodies.

Há muito tempo os venenos de abelhas se tornaram objeto de interesse de muitos cientistas, principalmente os venenos daquelas linhagens do gênero Apis, chamadas abelhas europeias e as conhecidas abelhas africanizadas. O foco no desenvolvimento de terapias eficazes que pudessem prevenir ou frear as reações desencadeadas pelas toxinas dos venenos desses insetos foi o principal estimulador do surgimento dessa grande área da pesquisa, uma vez que esses animais causam um grande número de acidentes em animais e seres humanos e os acidentes podem desencadear graves consequências, inclusive óbito. Sendo assim, desenvolvemos o presente trabalho baseado na caracterização da composição proteica dos venenos de abelhas europeias e africanizadas, na análise quantitativa diferencial entre os venenos e, na investigação de fosforilações e a possível relação das mesmas com as funções biológicas. Reunindo todos os elementos que estavam ao nosso alcance para compor o melhor conjunto de etapas para a realização do estudo proteômico de venenos de abelhas, nós atingimos todos os objetivos propostos. Utilizando uma abordagem baseada em espectrometria de massas, consistindo de análise shotgun seguida de LC-MS/MS realizada em um dos mais modernos espectrômetros de massas, nós fomos capazes de obter resultados extremamente confiáveis e interessantes. Comparando-se o efeito da extensão do gradiente de separação na cromatografia líquida, nós fomos capazes de atingir uma maior cobertura da amostra, uma vez que identificamos um maior número de proteínas após a utilização do gradiente mais longo. A identificação de fosforilações foi favorecida pela combinação de fragmentação por \"Colisão Induzida por Dissociação\" e medidas de massa de alta acurácia realizadas no instrumento LTQ-Orbitrap-Velos. Enquanto apenas 29 proteínas foram identificadas após 120 minutos de separação cromatográfica, um total de 51 proteínas foram identificadas aplicando-se gradiente mais longo. Dentre as 51 proteínas totais, 42 são comuns aos venenos das três abelhas. A comparação em pares mostrou que os venenos das abelhas europeias compartilham 44 proteínas e os venenos das abelhas africanizadas compartilham 43 proteínas tanto com o veneno de A. m. carnica quanto com o de A. m. ligustica. Além disso, nós revelamos que existem diferenças quantitativas entre algumas das proteínas dos venenos, sendo muitas dessas proteínas diferenciais toxinas com funções conhecidamente relevantes. A investigação de fosforilação mostrou que duas toxinas apresentam-se na forma fosforilada: melitina e icarapina. Melitina é considerada a principal toxina de venenos de abelhas, sendo bem conhecida por sua ação altamente tóxica e alergenicidade. Este peptídeo foi identificado com fosforilação ocorrendo no sítio Ser18 em todas as amostras de venenos, enquanto somente no veneno da abelha africanizada foi também identificado com sítio de fosforilação no resíduo de Thr10. Icarapina, também já descrita como um alérgeno do veneno, apresentou sítio de fosforilação no resíduo Ser205. Por fim, nós demonstramos o efeito da fosforilação presente em melitina (Ser18) realizando ensaios de atividade biológica do peptídeo fosforilado e nativo, como: hemólise, lise celular e desgranulação de mastócitos e atividade quimiotáctica. Foi observado que a toxicidade do peptídeo fosforilado é reduzida em comparação ao do peptídeo nativo. Sendo assim, nós podemos concluir que a combinação de metodologias eficientes e a utilização de moderna instrumentação nos levou a resultados surpreendentes, os quais se somam a todo o conhecimento já existente acerca de venenos de abelhas / Honeybee venom toxins disturb the activity of critical cellular processes, triggering immunological, physiological, and neurological responses within victims. Studies on venom toxins have provided invaluable knowledge towards elucidating the molecular and functional details of their biological targets, yet there has been no report of a full proteome/phosphoproteome profile of honeybee venom. In this study, we focused on Apis mellifera honeybee venom characterization, including proteins identification, label-free quantitative analysis and phosphorylation identification. Making use of a MS-based proteomic approach, consisting on in-solution digestion followed by LC-MS/MS analysis, we were able to compare the effect of the liquid chromatography gradient length on the sample coverage, consequently, to identify a higher number of proteins using longer separation gradient of the tryptic peptides. Favorable identification of phosphorylations was achieved by the application of a long separation gradient combined with CID fragmentation and high accuracy mass measurement using an LTQ Orbitrap Velos. Here we report on the comparative shotgun proteomics study of the venoms of two Apis mellifera subspecies, A. m. carnica and A. m. ligustica, and the hybrid known as Africanized honey bee (AHB). We identified 51 proteins in total, with 42 of them being common among the three venoms, including many previously unidentified entries. Performing label-free quantification, we observed that few proteins were found with different relative amounts. Additionally, we revealed the phosphorylation of two proteins in all the samples, with two of them being HBV toxins/allergens: melittin and icarapin. Icarapin was identified as phosphorylated at 205Ser. Melittin was identified as phosphorylated at the 18Ser and 10Thr positions in all venoms, as well. Given these novel findings, we then chose to compare the toxicity of the phosphorylated/unphosphorylated forms of the major venom toxin, melittin, considering the most prominent phosphorylation event, the phosphorylated 18Ser position. We showed that the toxicity is in fact decreased when the peptide is phosphorylated. Based on a combination of efficient methodology and state-of-the-art instrumentation, delineated by our Shotgun-NanoESI-Long Gradient-LTQ Orbitrap Velos analysis, we achieved proteomic coverage far surpassing any previous report. Together, these discoveries pave the way for future phosphovenomic studies

A bothropasina é uma proteína hemorrágica de 48 kDa, pertencente à classe P-III das metaloproteases, isolada a partir do veneno bruto da serpente brasileira Bothrops jararaca, e que possui os domínios adesivos desintegrina (D) e rico em cisteína (C). Neste trabalho, nós apresentamos a estrutura cristalográfica da bothropasina complexada ao inibidor POL647. O domínio catalítico , metaloprotease (M), pode ser dividido em dois subdomínios, dispostos de maneira muito similar aos descritos para essa família de metaloproteases de venenos de serpentes (em inglês \"SVMPs\"), que inclui os sítios de ligação ao zinco e ao cálcio. A cisteína livre, resíduo Cys189, está localizado em um núcleo hidrofóbico e, sendo assim, impossibilitado de fazer pontes dissulfeto ou qualquer outra interação. O domínio D não apresenta estruturas secundárias bem definidas, sendo constituído, majoritariamente, por estruturas desordenadas como \"loops\", porém estabilizados por 7 pontes dissulfeto e por dois íons cálcio. A região do motivo ECD está localizada em um \"loop\" e é estruturalmente relacionado à região RGD das desintegrinas-RGD, derivadas de SVMPs da classe P-II. O motivo ECD é estabilizado pela ponte dissulfeto Cys277-Cys310 (entre os domínios D e C), além de um íon cálcio. A cadeia lateral do Glu276 do motivo ECD está exposta ao solvente. Na bothropasina, a região hiper variada (em inglês HVR), descrita para outras P-III de SVMPs, presente no domínio C, de fato, é bastante conservada quando comparada a outros membros da classe P-III de diversas espécies. Nós propomos que esse subgrupo deva ser referido como PIII-HCR (região altamente conservada) SVMPs. Ainda é proposto que as diferenças estruturais dos domínios D, C ou DC possam estar envolvidas em uma melhor adaptação da estrutura na interação com diferentes alvos, além do reconhecimento e especificidade a um substrato para o domínio M. / Bothropasin is a 48kDa hemorrhagic P-III metalloprotease isolated from the venom of the Brazilian snake Bothrops jararaca, which has the disintegrin (D) and cysteine-rich (C) adhesive domains. We present the crystal structure of the bothropasin complexed with the inhibitor POL647. The catalytic domain, metalloprotease (M), consists of two subdomains in a very similar scaffold to the ones described for other snake venom metalloproteases (SVMPs) including the zinc and calcium binding sites. The free cysteine, residue Cys189, is in a hydrophobic core and it is not available for disulfide bonding or other interactions. The D domain does not have a defined secondary structure, but instead is composed by mostly loops stabilized by seven disulfide bonds and by two calcium ions. The ECD region is in a loop and it is structurally related to the RGD region of RGD-disintegrins, which are derived from P-II SVMPs. The ECD motif is stabilized by the Cys277-Cys310 disulfide bond (between D and C domains) and by one calcium ion. The side chain of the Glu276 of the ECD motif is solvent exposed. In bothropasi, the HVR (hyper-variable region) described for other P-III SVMPs in the C domain in fact presents a well conserved sequence with respect to several other P-III members from different species. We propose that this subset be referred to as PIII-HCR (highly-conserved region) SVMPs. We further propose that the structural differences in the D, C or DC domains may be involved in selecting target binding which in turn could generate substrate diversity or specificity for the M domain.

Orientador: Benedito Barravieira / Coorientador: João Pessoa Araújo Júnior / Banca: Reinaldo José da Silva / Banca: Francisco Luis Franco / Resumo: / Abstract: / Mestre

Orientador: Marcos Hikari Toyama / Resumo: Os acidentes ofídicos foram recentemente incorporados na lista de doenças tropicais negligenciadas pela Organização Mundial de Saúde (OMS). No Brasil, uma parcela significativa destes acidentes (10%) é ocasionada pela serpente Crotalus durissus terrificus (Cdt), popularmente conhecida como cascavel. Dentre os componentes do veneno, a fosfolipase A2 secretória (sPLA2) representa aproximadamente 35% da massa do veneno seco. A Cdt sPLA2 responde pela atividade mais importante e clinicamente significativa que inicia com o processo inflamatório logo após o contato com a peçonha. Quando não tratada, a peçonha pode fazer com que o indivíduo sofra com insuficiência renal aguda, a qual não é neutralizada em curto espaço de tempo, nem mesmo pelo antiveneno específico. O processo inflamatório em diversas doenças humanas, está altamente relacionado com a formação de altas quantidades de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (EROs e ERNs), conhecido como explosão oxidativa/nitrosativa. Este processo é combatido por moléculas de baixo peso molecular como (vitaminas D e E, e glutationa), como também por enzimas antioxidantes, como a catalase (Cat), superóxido dismutase (Sod) e peroxirredoxinas (Prx). Já foi demonstrado que as sPLA2 humanas compartilham grande similaridades bioquímicas e farmacológicas com seus homólogos de serpentes e são capazes de induzir a formação de EROs e ERNs em células de mamíferos, mas nenhum estudo até o presente momento abordou de forma sistemática danos em... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Snake envenomation have recently been added to the list of tropical neglected diseases by the World Health Organization (WHO). In Brazil, a significant portion of ophidian accidents (~ 10%) is caused by the Crotalus durissus terrificus (Cdt) snake, popularly known as rattlesnake. Among the components of the venom, secretory phospholipase A2 (sPLA2) accounts for approximately 35% of the mass of the dry venom. Cdt sPLA2 accounts for the most important clinical damages and to the ingflammmatory proccess. When untreated, venomation can cause acute renal failure, which is not neutralized in a short time, not even by the specific antivenom. The inflammatory process, which is very well characterized in several human diseases, is highly related to the formation of high amounts of reactive oxygen and nitrogen species (ROS and RNS), known as oxidative / nitrosative burst. This process is counteracted by low molecular weight molecules such as vitamins D and E and glutathione, as well as antioxidant enzymes such as peroxiredoxins (Prx). human sPLA2 share high biochemical and pharmacological similarities with their snake homologs and are able to induce the formation of ROS and RNS in mammalian cells, but no study to date has systematically addressed damage to biomolecules carried out by ROS and RNS and the expression of peroxiredoxins in response to sPLA2 administration of snakes. We have recently shown that the administration of polyphenolic extracts of Laguncularia racemosais able to in... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:51:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-06-13Bitstream added on 2014-08-13T17:59:43Z : No. of bitstreams: 1 000775857.pdf: 960836 bytes, checksum: 8e683a2cad5b9e5d051eb153e3f065d0 (MD5) / As características migratórias e defensivas das abelhas Apis mellifera africanizadas e seu contato com a população podem ocasionar acidentes, em que o tratamento muitas vezes é ineficiente, ressaltando a necessidade do desenvolvimento de um soro antiveneno eficaz e abrangente. Para isso, os fatores que podem resultar em possíveis alterações qualitativas na apitoxina precisam ser avaliados, como é o caso da fonte alimentar das abelhas. Neste estudo verificamos diferenças nas médias da quantidade e intensidade dos picos estudados gerados pela análise da apitoxina por CLAE/FR, proveniente de colmeias mantidas em diferentes recursos florais. A alimentação proveniente da florada de Citrus sp., gerou picos correspondentes a apamina, fosfolipase, isoforma da fosfolipase e melitina com maiores intensidade e maior quantidade total de picos (44); porém, duas amostras não apresentaram a isoforma da melitina, fato este que pode estar associado a genética do enxame. Diferentemente, as abelhas mantidas em vegetação de Eucalyptus sp. apresentaram a apitoxina com menores intensidades para os picos correspondentes a estes compostos, e menor quantidade total de picos (33). A apitoxina das abelhas mantidas em vegetação silvestre associada à alimentação artificial teve a maior intensidade do pico correspondente a isoforma da melitina e aquela proveniente apenas da vegetação silvestre não apresentou picos dominantes. Estas variações sugerem a influência da alimentação na composição da apitoxina, porém as pesquisas precisam ser aprofundadas considerando diferentes recursos florais disponíveis em outras regiões. Estas informações podem contribuir para o futuro desenvolvimento de um soro antiveneno representativo, específico e seguro para o tratamento de ferroadas de abelhas. / The migratory and highly defensive behavior of the africanized honeybees and their close contact with human populations can result in accidents, where treatment is often inefficient, emphasizing the need for the development of an effective honeybee antivenom. For this, the factors that may cause possible qualitative changes in apitoxin need to be evaluated, such as the food source of bees. In this study we verify differences in the mean number and intensity of the studied peaks generated by the HPLC/RF analysis of apitoxin, from hives kept in different floral sources. The feed from the flowering of Citrus sp., generated peaks corresponding to apamin, phospholipase, melittin and phospholipase isoform with higher intensity and higher total amount of peaks, but two samples not presented melittin isoform, a fact that can be associated to the genetic hive. Differently, the bees maintained in the area of Eucalyptus sp. showed the apitoxin with lower intensities for the peaks corresponding to these compounds, and also lower the total amount of peaks. The apitoxin of bees maintained in wild vegetation associated with artificial feeding had the highest peak intensity corresponding to melittin isoform and that originates from wild vegetation showed no dominant peaks. This variations suggest the diet influence in the composition of apitoxin, however the researches need to be deepened considering different floral resources available in other regions. This information can contribute to the future development of a representative, specific and safe antivenom for the treatment of bee’s stings.

As raias são peixes peçonhentos e estão frequentemente associadas a acidentes em seres humanos, principalmente na região Norte do Brasil, favorecidos pelo hábito desses peixes de permanecerem no fundo de águas rasas e pela contínua utilização humana dos rios. Os ferrões das raias causam lesões dolorosas, edema, necrose, e o muco que recobre toda a extensão do corpo desses peixes pode aumentar a gravidade desses ferimentos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta imunológica induzida pelo muco de Paratrygon aiereba nativo ou irradiado por raios gama de 60Co em modelos animais. Foram realizados ensaios imunoenzimáticos e Western blotting para verificar a resposta humoral e reatividade cruzada dos soros provenientes de camundongos Swiss e coelhos New Zealand previamente imunizados contra o veneno, muco nativo ou irradiado. A indução da produção de anticorpos in vitro, as subclasses de IgG e a quantificação de citocinas foram analisados. Além de realizados ensaios de soroneutralização da atividade edematogênica in vitro e in vivo e de viabilidade celular. Os dados foram analisados estatisticamente por meio de análise de variância. O protocolo de imunização possibilitou a obtenção de soros com títulos satisfatórios de anticorpos policlonais. O muco e veneno de P. aiereba são imunogênicos e apresentam reatividade antigênica. O muco nativo ou irradiado induziu a produção de anticorpos IgG e esses reconheceram antígenos presentes no muco de outras espécies de raias. Células esplênicas de animais imunizados contra o muco irradiado produziram IFN-γ, TNF- α e IL-10 e também foi observada a produção sérica de TNF-α (grupo imunizado contra o muco irradiado) e de IL-6 e IL-17 (grupo imunizado contra o muco nativo). O soro anti-muco irradiado reduziu a atividade edematogênica in vitro, ao contrária da in vivo que não foi neutralizada. Os resultados corroboram o uso da radiação ionizante, com produção de anticorpos altamente responsivos e melhor resposta imune, além de comprovar que o muco de Paratrygon aiereba foi capaz de estimular resposta imune adaptativa celular e humoral. / Freshwater stingrays are venomous animals, frequently associated with accidents in northern Brazil where the shallow waters and the human use of the rivers favour close proximity between the fish and potential victims. Ray stings induce painful lesions, edema, necrosis, and the mucus that covers the body of these fishes may increase the severity of the wounds. The aim of this work was to evaluate the immune response induced by native or 60Co Paratrygon aiereba mucus in animal models. Enzyme linked immunosorbent assays and western blots were performed to compare humoral immune response as well as cross reactivity using antibodies raised in mice or rabbits against venom or mucus, the latter either in its native or irradiated form. Antibody production in vitro, immunoglobulins subclasses and cytokines production were evaluated. Immunization resulted in good levels of antibodies. Interestingly, both the mucus and the venom share many cross reactive components. Furthermore, antibodies raised against native mucus or its irradiated counterpart were cross-reactive against the mucus of other stingray species. Splenic cells from mice immunized with irradiated mucus secreted IFN-γ, TNF-α and IL-10. The serum raised against irradiated mucus reduced edematogenic activity in vitro, but not in vivo, when the venom and the serum are injected separately. Our results corroborate the potential of ionizing radiation as a detoxifying agent for immunogens, with production of high antibody titers and, that the highly abundant mucus of freshwater stingrays contains basically the same repertoire of antigens as the venom, inducing the synthesis of high levels of neutralizing antibodies.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-09-10Bitstream added on 2014-06-13T18:20:27Z : No. of bitstreams: 1 gasparotto_vpo_me_botfm.pdf: 823732 bytes, checksum: 72bbebb42d3239b78a28393a5aa3b0b7 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O estudo avaliou a viabilidade in vitro do biomaterial “Selante de Fibrina derivado de veneno de serpente” (SF), como arcabouço para células tronco mesenquimais (CTMs) de ratos. O SF é um material caracterizado como adesivo biológico, e foi produzido e fornecido pelo Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos, CEVAP, Brasil. As CTMs foram coletadas a partir da medula óssea de fêmures e tíbias de ratos e foram caracterizadas por meio de citometria de fluxo com auxilio de marcadores positivos: CD 44 e CD 90 (CTMs) e marcador negativo: CD 34 (células tronco hematopoiéticas). Cultivos foram induzidos para diferenciarem-se em linhagens específicas (osteogênico, condrogênico e adipogênico). Para avaliação do crescimento in vitro e a viabilidade celular em conjunto ao biomaterial foram utilizadas microscopia óptica de luz invertida, microscopia de fluorescência e microscopia eletrônica de varredura e transmissão. O SF em contato com as CTMs não induziu a diferenciação espontânea para as linhagens osteogênica, condrogênica e adipogênica. As diferentes técnicas de avaliação microscópica utilizadas mostraram que o SF foi capaz de realizar a captura e manutenção das CTMs e houve interação das células com o interior e superfície do biomaterial. Portanto, a coleta, o cultivo e a caracterização das CTMs de ratos foram possíveis. O SF mostrou-se eficiente como arcabouço biológico e interagiu com as células tronco mesenquimais mantendo-as viáveis, oferecendo-se como uma ferramenta de uso clínico-cirúrgico alternativa para processos regenerativos visando terapias mais eficientes / This study evaluated the in vitro viability of biomaterial Fibrin Sealant (FS) derived from snake venom as a scaffold for rat mesenchymal stem cells (MSCs). The FS is characterized as a biological adhesive material, and is produced and was supplied by the Center for the Study of Venoms and Venomous Animals, CEVAP, Brazil. MSCs were collected from the bone marrow of femurs and tibias of rat and were characterized using flow cytometry with CD 44 and CD 90 positive markers (MSC) and CD34 negative marker (mononuclear stem cells). Cultivations were induced to differentiate into specific cell lineage (osteogenic, chondrogenic and adipogenic). To evaluate the in vitro growth and cell viability with the biomaterial were used inverted light optical microscopy, fluorescence microscopy and scanning electron microscopy and transmission. The SF did not cause the spontaneous differentiation in contact with MSCs to osteogenic, chondrogenic and adipogenic lineage. Different microscopy techniques showed that the SF was able to accomplish the capture and maintenance of MSCs and there was interaction with the cell interior and surface of the biomaterial. Finally, the collection, cultivation and characterization of rat MSCs were possible. The SF was effective as a biological scaffold and interacted with the MSCs keeping them viable offering itself as a tool for clinical and surgical alternative providing clinical and surgical therapies more efficient for regenerative processes

Submitted by Rolando Ié null (rolandoye@yahoo.com.br) on 2018-04-04T17:57:27Z No. of bitstreams: 1 Dissert_Ie_Rolando_Final[3220].pdf: 2455707 bytes, checksum: 3f68750eb72fdc030f1392cc3293f665 (MD5) / Rejected by Disleide Silvia Valerio Gounella null (disleide@clp.unesp.br), reason: Boa tarde. Fazer as seguintes modificações: - Alterar o título do arquivo para o nome do trabalho, ou seja, o arquivo deverá ter o título da dissertação; - Incluir a folha de aprovação com data e assinada pela banca; - Acertar a formatação da ficha catalográfica; - Corrigir a palavras chave "veneno serpente" que estão separadas, para "venenos de serpentes" como consta no seu trabalho. Qualquer dúvida, entre em contato. abs. Disleide Silvia Valerio Gounella Bibliotecária CLP - São Vicente Fone: (13)3569-7154 Mailto: disleide@clp.unesp.br skype: disleidesilviavaleriogounella on 2018-04-04T19:13:48Z (GMT) / Submitted by Rolando Ié null (rolandoye@yahoo.com.br) on 2018-04-11T17:36:23Z No. of bitstreams: 1 Avaliação da ação protetora de extratos de Laguncularia racemosa na evolução da atividade farmacológica de sPLA2 Danos moleculares e resposta antioxidante durante o processo inflamatório..pdf: 3375211 bytes, checksum: 47ae3733003877ba3ff44a4417474111 (MD5) / Approved for entry into archive by Disleide Silvia Valerio Gounella null (disleide@clp.unesp.br) on 2018-04-11T18:09:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ie_r_me_svic.pdf: 2864379 bytes, checksum: 0b7eb6759926f7f64a9bfde5500083ea (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-11T18:09:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ie_r_me_svic.pdf: 2864379 bytes, checksum: 0b7eb6759926f7f64a9bfde5500083ea (MD5) Previous issue date: 2018-02-22 / Outra / Os acidentes ofídicos foram recentemente incorporados na lista de doenças tropicais negligenciadas pela Organização Mundial de Saúde (OMS). No Brasil, uma parcela significativa destes acidentes (10%) é ocasionada pela serpente Crotalus durissus terrificus (Cdt), popularmente conhecida como cascavel. Dentre os componentes do veneno, a fosfolipase A2 secretória (sPLA2) representa aproximadamente 35% da massa do veneno seco. A Cdt sPLA2 responde pela atividade mais importante e clinicamente significativa que inicia com o processo inflamatório logo após o contato com a peçonha. Quando não tratada, a peçonha pode fazer com que o indivíduo sofra com insuficiência renal aguda, a qual não é neutralizada em curto espaço de tempo, nem mesmo pelo antiveneno específico. O processo inflamatório em diversas doenças humanas, está altamente relacionado com a formação de altas quantidades de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (EROs e ERNs), conhecido como explosão oxidativa/nitrosativa. Este processo é combatido por moléculas de baixo peso molecular como (vitaminas D e E, e glutationa), como também por enzimas antioxidantes, como a catalase (Cat), superóxido dismutase (Sod) e peroxirredoxinas (Prx). Já foi demonstrado que as sPLA2 humanas compartilham grande similaridades bioquímicas e farmacológicas com seus homólogos de serpentes e são capazes de induzir a formação de EROs e ERNs em células de mamíferos, mas nenhum estudo até o presente momento abordou de forma sistemática danos em biomoléculas efetuados por EROs e ERNse a expressão de proteínas antioxidantes em resposta a administração de sPLA2 de serpentes. Recentemente demonstramos que a administração de extratos de Laguncularia racemosa (mangue branco) capazes de inibir a ação da trombina, entretanto não foram efetuadas avaliações se a aplicação do extrato de L. racemosa frente a Cdt sPLA2. Também e importante salientar que apesar de existir inúmeros trabalhos de caracterização bioquímica, farmacológica e estrutural de sPLA2 de serpentes até o presente momento poucos trabalhos tiveram como objetivo sua produção de forma recombinante. Este ponto é importante pois a manipulação gênica destas proteínas, através de mutações sitio dirigidas, podem auxiliar a identificar resíduos envolvidos na catálise, levando a uma melhor compreensão dos mecanismos funcionais, abrindo caminho para novas abordagens terapêuticas para o tratamento do envenenamento por serpentes. Adicionalmente, a enzima sPLA2 de origem animal é utilizada em processos biotecnológicos e possui importância econômica. Este trabalho teve dois grandes objetivos: 1) investigar a existência de danos oxidativos, a expressão de proteínas antioxidantes em resposta a administração de sPLA2 de Crotalus durissus terrificus (Cdt sPLA2), bem com avaliar possíveis efeitos protetores da administração de extratos butanólico e de acetato de etila extraídos de folhas de L. racemosa após a inoculação da Cdt sPLA2 na fase tardia da edemaciação; 2) Obtenção de sPLA2 recombinante de Cdt (Cdt sPLA2r) visando fornecer subsídios para sua manipulação genética e maior entendimento de seu funcionamento. Com relação ao primeiro objetivo nossos resultados indicam que os extratos de L. racemosa não são capazes de inibir o processo de edemaciação induzido por Cdt sPLA2. A investigação de processos indicadores de estresse oxidativo como oxidação de sulfidrilas, carbonilação proteica e peroxidação lipídica não idicaram a existência de estresse oxidativo na fase tardia do processo de edemaciação ocasionado por Cdt sPLA2. Tambem avaliamos os níveis de expressão e modificação das proteínas antioxidantes Sod, Cat e Prx2 por western blot, e os resultados também revelaram que os níveis da enzima foram muito similares independente da administração de Cdt sPLA2 ou Cdt sPLA2 com extratos de L. racemosa. Em conjunto os resultados indicam fortemente que não ocorre estresse oxidativo na fase tardia do processo da edemaciação por Cdt sPLA2.No caso do segundo objetivo foi possível clonar, expressar e purificar a enzima recombinante Cdt sPLA2 (Cdt sPLA2r). Análises da atividade de fosfolipase revelaram que Cdt sPLA2r possuipadrão de atividade Michaeliana ao passo que a enzima purificada do veneno possui perfil alostérico. Adicionalmente a velocidade inicial (V0) de Cdt sPLA2r(10.8 × 10-1 µM/s) foi maior que para a enzima nativa (7.1 × 10-1 µM/s). A expressão de Cdt sPLA2r abre caminhos para investigações envolvendo mutações sítio dirigidas para melhor entendimento da enzima, a qual também possui importância biotecnológica. Em conjunto os resultados apresentados neste trabalho representam avanços na compreensão do processo de toxicológico envolvido na ação de Cdt sPLA2 e de sua expressão recombinante. / Snake envenomation have recently been added to the list of tropical neglected diseases by the World Health Organization (WHO). In Brazil, a significant portion of ophidian accidents (~ 10%) is caused by the Crotalus durissus terrificus (Cdt) snake, popularly known as rattlesnake. Among the components of the venom, secretory phospholipase A2 (sPLA2) accounts for approximately 35% of the mass of the dry venom. Cdt sPLA2 accounts for the most important clinical damages and to the ingflammmatory proccess. When untreated, venomation can cause acute renal failure, which is not neutralized in a short time, not even by the specific antivenom. The inflammatory process, which is very well characterized in several human diseases, is highly related to the formation of high amounts of reactive oxygen and nitrogen species (ROS and RNS), known as oxidative / nitrosative burst. This process is counteracted by low molecular weight molecules such as vitamins D and E and glutathione, as well as antioxidant enzymes such as peroxiredoxins (Prx). human sPLA2 share high biochemical and pharmacological similarities with their snake homologs and are able to induce the formation of ROS and RNS in mammalian cells, but no study to date has systematically addressed damage to biomolecules carried out by ROS and RNS and the expression of peroxiredoxins in response to sPLA2 administration of snakes. We have recently shown that the administration of polyphenolic extracts of Laguncularia racemosais able to inhibit the action of thrombin, however, were not evaluated the action of L. racemosa extractsadministration combat the deleterious effects of the Cdt sPLA2. It is also important to point out that although there are numerous biochemical, pharmacological and structural characterizations of sPLA2 from snakes, at the presene, few studies have aimed at its production by recombinant techniques. This is very important since the genetic manipulation of these proteins through site-directed mutations can help identify residues involved in catalysis, leading to a better understanding of the functional mechanisms, which may in future be reflected in new therapeutic approaches. Additionally, these enzymes are used in biotechnological processes.This work had two main objectives: 1) to investigate the existence of oxidative damages, the expression of antioxidant proteins in response to sPLA2 administration of Crotalus durissus terrificus (Cdt sPLA2), and to evaluate possible protective effects of the administration of butanolic and acetate extracts of ethylene extracted from L. racemosa leaves after inoculation of the Cdt sPLA2 at the late stage of edema; 2) the production of recombinant Cdt sPLA2 (Cdt sPLA2r) to provide subsidies for its genetic manipulation aiming a better understanding of molecular aspects of the enzyme function as also its applicability in biotechnological processes. Regarding the first objective, our results indicate that extracts of L. racemosawere not able to inhibit the process of the edema induced by Cdt sPLA2. The investigation of oxidative stress markers such as sulfhydryl oxidation, protein carbonylation and lipid peroxidation did not identify the existence of oxidative stress in the late phase of the edemaprocess caused by Cdt sPLA2. We also evaluated levels of expression and modification of the antioxidant proteins Sod, Cat and Prx2 by western blot, and the results also revealed that enzyme levels were very similar regardless of the administration of Cdt sPLA2 or Cdt sPLA2 with extracts of L. racemosa. Together the results strongly indicate that oxidative stress does not occur in the late phase of the edema caused by Cdt sPLA2. In the case of the latter objectives it was possible to clone, express and purify the recombinant enzyme Cdt sPLA2 (Cdt sPLA2r). Analysis of the phospholipase activity revealed that Cdt sPLA2r has a Michaelian environment activity whereas the enzyme purified from the venom has an allosteric profile. In addition, the initial velocity (V0) of the Cdt sPLA2r (10.8 × 10-1 μM / s) was higher than for the native enzyme (7.1 × 10-1 μM / s). The expression of Cdt sPLA2r opens pathways for investigations involving site directed mutations to a better understanding of the enzyme, which also has biotechnological importance. Together the results presented in this work represent advances in the understanding of the toxicological process involved in the action of Cdt sPLA2 and its recombinant expression.

Orientador: Ricardo de Oliveira Orsi / Coorientador: Rui Seabra Ferreira Junior / Banca: Daniel Nicodemo / Banca: Nabor Veiga / Resumo: As características migratórias e defensivas das abelhas Apis mellifera africanizadas e seu contato com a população podem ocasionar acidentes, em que o tratamento muitas vezes é ineficiente, ressaltando a necessidade do desenvolvimento de um soro antiveneno eficaz e abrangente. Para isso, os fatores que podem resultar em possíveis alterações qualitativas na apitoxina precisam ser avaliados, como é o caso da fonte alimentar das abelhas. Neste estudo verificamos diferenças nas médias da quantidade e intensidade dos picos estudados gerados pela análise da apitoxina por CLAE/FR, proveniente de colmeias mantidas em diferentes recursos florais. A alimentação proveniente da florada de Citrus sp., gerou picos correspondentes a apamina, fosfolipase, isoforma da fosfolipase e melitina com maiores intensidade e maior quantidade total de picos (44); porém, duas amostras não apresentaram a isoforma da melitina, fato este que pode estar associado a genética do enxame. Diferentemente, as abelhas mantidas em vegetação de Eucalyptus sp. apresentaram a apitoxina com menores intensidades para os picos correspondentes a estes compostos, e menor quantidade total de picos (33). A apitoxina das abelhas mantidas em vegetação silvestre associada à alimentação artificial teve a maior intensidade do pico correspondente a isoforma da melitina e aquela proveniente apenas da vegetação silvestre não apresentou picos dominantes. Estas variações sugerem a influência da alimentação na composição da apitoxina, porém as pesquisas precisam ser aprofundadas considerando diferentes recursos florais disponíveis em outras regiões. Estas informações podem contribuir para o futuro desenvolvimento de um soro antiveneno representativo, específico e seguro para o tratamento de ferroadas de abelhas. / Abstract: The migratory and highly defensive behavior of the africanized honeybees and their close contact with human populations can result in accidents, where treatment is often inefficient, emphasizing the need for the development of an effective honeybee antivenom. For this, the factors that may cause possible qualitative changes in apitoxin need to be evaluated, such as the food source of bees. In this study we verify differences in the mean number and intensity of the studied peaks generated by the HPLC/RF analysis of apitoxin, from hives kept in different floral sources. The feed from the flowering of Citrus sp., generated peaks corresponding to apamin, phospholipase, melittin and phospholipase isoform with higher intensity and higher total amount of peaks, but two samples not presented melittin isoform, a fact that can be associated to the genetic hive. Differently, the bees maintained in the area of Eucalyptus sp. showed the apitoxin with lower intensities for the peaks corresponding to these compounds, and also lower the total amount of peaks. The apitoxin of bees maintained in wild vegetation associated with artificial feeding had the highest peak intensity corresponding to melittin isoform and that originates from wild vegetation showed no dominant peaks. This variations suggest the diet influence in the composition of apitoxin, however the researches need to be deepened considering different floral resources available in other regions. This information can contribute to the future development of a representative, specific and safe antivenom for the treatment of bee's stings. / Mestre