A otimização de combustíveis nucleares para uso em reatores a água pressurizada pode ser obtida pelo aumento da taxa de queima do combustível. Para isso, no entanto, é necessário levar em conta o aumento na reatividade inicial no reator, causada pelo maior enriquecimento do combustível. Esse problema, por sua vez, pode ser contornado por meio da introdução dos chamados venenos queimáveis diretamente nas pastilhas combustível de UO2. Alguns elementos do grupo das terras-raras possuem propriedades físicas e químicas que os tornam apropriados para esse uso dentro de reatores. Para caracterizar a microestrutura do combustível UO2 utilizado em reatores a água pressurizada dopado de érbio, pastilhas de UO2-Er2O3 foram preparadas, com teor de Er2O3 variando de 1,0 a 9,8 wt%, e analisadas por difração de raios X (DRX) para determinar se houve a formação de solução sólida pelo composto e determinar a variação do parâmetro de rede da solução em função da concentração de érbia. Apesar da análise por DRX ter mostrado que todo o érbio se incorporou à rede de UO2, ela também evidenciou a emergência de uma segunda fase, de estrutura do tipo fluorita, e cuja fração mássica aumenta em função do teor de érbia, enquanto seu parâmetro de rede diminui. Esses resultados são compatíveis com o fenômeno de segregação de defeitos, que consiste na formação de microdomínios segregados da rede principal nos quais há uma concentração maior dos defeitos i.e. são regiões mais ricas em érbio. Assim, a análise por DRX mostrou que houve formação de solução sólida de (U,Er)O2, mas que são necessários ajustes nos parâmetros de sinterização para que seja obtida uma solução monofásica. / Optimization of nuclear fuel for use in pressurized water reactors can be achieved by obtaining higher burnups. This, however, requires the excess reactivity caused by increasing the fuels enrichment to be taken into account, which can be done by introducing burnable absorbers into the UO2 fuel pellets themselves. Some of the rare earth elements have thermal and mechanical properties that make them appropriate for use inside the reactor. In order to characterize the microstructure of erbium-doped UO2 fuel, sintered UO2-Er2O3 pellets were prepared, with Er2O3 content ranging from 1.0 to 9.8wt%, and analyzed by X-ray diffraction to determine whether the composite formed solid solutions and, if so, evaluate the lattice parameter as a function of erbia concentration. While XRD analysis showed the Er2O3 completely dissolved in the UO2 powder, it also evidenced the emergence of a second fluorite-type phase, whose phase fraction increases and lattice parameter decreases with increasing erbia concentration. Analysis of the diffraction patterns showed this emerging phase has the same crystalline structure as the host lattice, but with a smaller lattice parameter. These results are compatible with the phenomenon of defect segregation, which consists in the formation of microdomains with a higher concentration of defects i.e. rare-earth richer regions. Thus, XRD analysis showed the formation of (U,Er)O2 solid solution, but such that there are still adjustments in the sintering parameters that need to be made in order to achieve a single-phase solid solution.

Parasitoides criam condições favoráveis para seu desenvolvimento regulando processos fisiológicos do hospedeiro via a utilização de moléculas produzidas por tecidos maternos ou por tecidos derivados do parasitoide imaturo ou de simbiontes associados (vírus de poliDNA - PDV). Assim, essas moléculas se destacam como uma fonte preciosa para o desenvolvimento de métodos alternativos de controle de pragas. O objetivo desse trabalho foi o de explorar a interação hospedeiro-parasitoide, visando à identificação de moléculas que participem do processo de regulação hospedeira para o desenvolvimento de métodos alternativos de controle de pragas. A busca pela identificação dessas moléculas foi concentrada na interação Diatraea saccharalis (F.) (Lepidoptera: Crambidae) Cotesia flavipes (Cameron) (Hymenoptera: Braconidae) pela avaliação i) do efeito do parasitismo na fisiologia digestiva do hospedeiro e ii) da contribuição da glândula de veneno e do ovário na produção de moléculas bioativas e iii) pela caracterização de transcritos produzidos por teratócitos desse parasitoide. O potencial de aplicação de moléculas derivadas da interação hospedeiro-parasitoide foi verificado pela caracterização da atividade de uma quitinase putativa isolada da associação Heliothis virescens (F.) (Lepidoptera: Noctuidae) Toxoneuron nigriceps (Viereck) (Hymenoptera: Braconidae), via expressão heteróloga e transformação genética de plantas de fumo. Os resultados demonstraram que o parasitismo afeta a utilização do alimento por lagartas parasitadas, reduzindo as taxas de crescimento (RGR), consumo (RCR) e metabólica (RMR) relativas, enquanto aumenta a eficiência de conversão do digerido (ECD). O parasitismo por C. flavipes também aumentou a permanência do alimento no intestino do hospedeiro e a atividade de -amilase, sacarase e trealase em lagartas de D. saccharalis. Análises do transcriptoma da glândula de veneno e do ovário de C. flavipes indicaram a produção de muitas proteínas desconhecidas. Porém, foi possível identificar proteases, um inibidor de proteinase e uma proteína com ação antimicrobiana, produzidas pela glândula de veneno, e uma proteína de expressão precoce (ep1), como produto do ovário de C. flavipes. Dois transcritos isolados de teratócitos de C. flavipes foram putativamente identificados como serpina e fator de inibição da tradução (CfHTIF). Ambos os transcritos foram detectados em teratócitos após cinco dias do parasitismo, sendo que transcritos do CfHTIF também foram observados em hemócitos de hospedeiros parasitados. CfHTIF apresentou alta homologia a proteínas produzidas por PDVs associados a outras espécies de Cotesia, sugerindo a sua origem viral, sendo este o primeiro relato da utilização de teratócitos para a produção de proteínas virais voltadas à regulação hospedeira. A caracterização da atividade da quitinase de teratócitos de T. nigriceps e a avaliação do seu potencial biotecnológico via transgenia de plantas para o controle de lagartas de H. virescens indicou que, apesar dessa quitinase possuir capacidade de ligação à quitina coloidal e cristalina em ensaios in vitro, a mesma não demonstra qualquer atividade quitinolítica. Avaliações de plantas de fumo transformadas com o Tnchi não indicaram qualquer efeito deletério ao desenvolvimento de lagartas de H. virescens. Apesar da ausência de atividade quitinolítica, essa quitinase apresentou atividade antimicrobiana. A possibilidade de exploração dessa proteína na produção de plantas de interesse econômico é discutida. / Parasitoids regulate their hosts physiological processes in order to produce suitable conditions for their own development by employing molecules produced by maternal tissues, the immature parasitoid and derived tissues, and associated simbionts (polidnavirus PDV). These molecules represent, therefore, an untapped resource of new molecules for the development of alternative pest control methods. Our objective was to exploit the hostparasitoid interactions aiming at the identification of molecules involved in host regulation for their use in the development of alternative strategies for pest control. The search for new molecules was concentrated on the interaction Diatraea saccharalis (F.) (Lepidoptera: Crambidae) Cotesia flavipes (Cameron) (Hymenoptera: Braconidae) by assessing i) the effects of parasitization on the host digestive physiology and ii) the contribution of the venom gland and ovary in producing regulatory molecules, and by iii) the characterization of cDNAs isolated from teratocytes of C. flavipes. The potential application of molecules from hostparasitoid associations was verified by characterizing the activity of a putative chitinase isolated from the interaction Heliothis virescens (F.) (Lepidoptera: Noctuidae) Toxoneuron nigriceps (Viereck) (Hymenoptera: Braconidae) using recombinant proteins and geneticallymodified tobacco plants. Data obtained demonstrated parasitized larvae had reduced relative growth (RGR), consumption (RCR) and metabolic (RMR) rates, while an increased efficiency in the conversion of the digested food (ECD) was obtained as compared to unparasitized larvae. Larvae parasitized by C. flavipes retained the food in the gut for a longer period and had higher activities for -amylase, sacarase and trehalase if compared to control larvae. Analysis of the transcriptome of the venom gland and ovary of C. flavipes predicted a large number of unknown proteins. Nevertheless, several proteases, a protease inhibitor and an antimicrobial protein from the venom gland, and an early-expressed protein (ep1), with a putative role in the process of host regulation from the ovaries, were identified. Two cDNAs isolated from teratocytes of C. flavipes were putatively identified as a serpin and an eukaryote translation inhibitory factor (CfHTIF). Both were detected in teratocytes from day 5 of parasitism and onwards, with the CfHTIF being also detected in hemocytes of parasitized hosts. Comparative analysis of the CfHTIF indicated it is highly homologous to host translation inhibitory factors produced by PDVs associated with other species of Cotesia, indicating its possible viral origin and suggesting this to be the first record of teratocytes as a source of PDV-derived proteins for host regulation. The characterization of the activity from the chitinase isolated from teratocytes of T. nigreceps (Tnchi) and the evaluation of its biotechnological potential via plant transgenesis to control larvae of H. virescens indicated this chitinase can bind to colloidal and crystalline chitins in in vitro assays, but it does not display chitinolytic activity. Assays with transformed tobacco plants expressing Tnchi did not result in any effect to H. virescens larval development and survival. Although Tnchi did not have any chitinolytic activity, it did show to have an antimicrobial effect. The possible exploitation of this protein for production of economically-important plants is dicussed.

A resistência aos antibióticos adquirida por micro-organismos patogênicos é um problema de saúde mundial e, por isso, o desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos vem sendo amplamente estimulado. Sabendo que muitos peptídeos bioativos correspondem a fragmentos peptídicos de proteínas e/ou seus análogos, este trabalho teve o objetivo de desenvolver novos peptídeos antimicrobianos (AMPs) a partir das sequências aminoacídicas e das estruturas 3D de proteínas possivelmente envolvidas na atividade antimicrobiana de venenos de serpentes pouco estudados. As etapas iniciais seguidas foram: a) escolher uma fosfolipase A2 (PLA2) de veneno de serpente peruana do gênero Bothrops da família Viperidae com sequência de aminoácidos conhecida e modelar por homologia a sua estrutura 3D; b) verificar atividade antimicrobiana em venenos de serpentes peruanas dos gêneros Bothrops e Bothriopsis da família Viperidae, selecionar um veneno ativo, fracioná-lo para isolar proteínas provavelmente envolvidas nessa atividade, tripsinizar as proteínas isoladas, sequenciar os fragmentos trípticos para identificá-las, localizar esses fragmentos em sequências aminoacídicas de proteínas com estruturas 3D disponíveis correlatas às proteínas isoladas/identificadas em classe, função e fonte natural. Em seguida, foram escolhidos fragmentos peptídicos da PLA2 (item a) e das proteínas isoladas do veneno ativo (item b) e/ou desenhados análogos que apresentassem características exibidas por AMPs conhecidos. Os peptídeos desenhados foram sintetizados, purificados, caracterizados e testados em suas atividades antimicrobianas. Os modelos estruturais 3D da PLA2 de Bothrops pictus e quatro peptídeos (PLA2-1 a -4) amidados derivados dela foram obtidos, sendo o PLA2-1 ativo frente a Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Candida krusei e Candida parapsilosis (MICs de 6,25-200 µmol.mL-1). Dos três venenos de serpentes peruanas testados, Bothrops taeniatta, Bothrops barnetti e Bothriopsis oligolepis, os dois últimos inibiram o crescimento de S. aureus (MICs 0,78-50 µmol.mL-1), mas apenas B. oligolepis demonstrou espectro de ação amplo. O seu fracionamento sequencial, acompanhado de ensaios de inibição do crescimento de S. aureus, gerou frações ativas relativamente homogêneas que, tripsinizadas e os fragmentos trípticos sequenciados, continham metalo-peptidases do tipo III, serino-peptidase ou lectinas do tipo C. A verificação de atividade enzimática e de coagulação sanguínea nessas frações confirmaram as naturezas das proteínas isoladas. Dos três peptídeos amidados (Bo-Ser1, Bo-Met1 e Bo-Lec1) desenhados a partir de suas estruturas, um deles foi ativo frente às leveduras C. albicans, C. krusei e C. parapsilosis (Bo-Met1; MIC de 6,25 - 200 µmol.mL-1). Pela primeira vez, foi demonstrado que: a) os venenos das serpentes peruanas B. barnetti e B. oligolepis apresentam ação antimicrobiana, sendo o último de espectro amplo; b) que as proteínas acima citadas, que incluem uma serino-peptidase, estão envolvidas com essa propriedade do veneno de B. oligolepis; c) que as sequências aminoacídicas e modelo 3D de uma PLA2 ácida e de proteínas presentes nos venenos das serpentes peruanas B. pictus e Bothriopsis oligolepis podem funcionar como fontes naturais para o desenvolvimento de novos AMPs de ação potente em micro-organismos de interesse clínico e científico. / Resistance to antibiotics obtained by pathogenic microorganisms is a global health problem, so the search for new antimicrobial agents has been encouraged. Knowing that many protein fragments and analogues are bioactive peptides, the aim of this work was to develop new antimicrobial peptides (AMPs) based on the amino acid sequences and 3D structures of proteins apparently involved in the antimicrobial activity of snake venoms very little or not studied so far. The first steps taken were: a) selection of a phospholipase A2 (PLA2) present in the venom from a Peruvian Bothrops sp. belonging to the family Viperidae, whose amino acid sequence was known, to model by homology its 3D structure; b) detection of antimicrobial activity in venoms from other Peruvian Viperidae Bothrops and Bothriopsis snakes, selection of an active venom, fractionation of it for isolation of proteins possibly involved in the antimicrobial activity, trypsinization of the isolated proteins, sequencing of the tryptic fragments for protein identification, location of such fragments in the amino acid sequences and 3D structures of proteins directly related in class, function and natural source to the isolated proteins. Then, peptide fragments from the chosen PLA2 (item a) and from the isolated proteins (item b) that presented structural features found in the known AMPs were selected and/or their analogues were designed. Finally, synthesis, purification and characterization of the peptides with AMP potential, (viii) verification on whether or not they display antimicrobial activity. The 3D-structure models of Bothrops pictus PLA2 and four amidated peptides (PLA2-1 to -4) derived from it were obtained, being PLA2-1 active against Gram negative bacteria Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa as well as the yeasts Candida albicans, Candida krusei and Candida parapsilosis (MICs de 6.25-200 µmol.mL-1). Among the three Peruvian snake venoms tested Bothrops taeniatta, Bothrops barnetti and Bothriopsis oligolepis, the last two inhibited the growth of S. aureus (MICs 0.78-50 µmol.mL-1) and B. oligolepis presented a wide spectrum of bacterial action. Sequential fractionation followed by S. aureus growth inhibition assays of the main fractions led to active relatively homogeneous ones. Their trypsinization and sequencing of the tryptic fragments indicated that they contained metalloproteinases type III, serine-proteinase or lectins type CTL. Enzymatic activity and blood coagulation assays confirmed the nature of the isolated proteins. From the three amidated peptides (Bo-Ser1, Bo-Met1 e Bo-Lec1) derived from them, Bo-Met1 showed to be active against C. albicans, C. krusei e C. parapsilosis (MIC 6,25 - 200 µmol.mL-1). In summary, for the first time, it was demonstrated that: a) the venoms of the Peruvian snakes B. barnetti and B. oligolepis display antimicrobial activity, being the last of wide spectrum of action, b) the proteins isolated from B. oligolepis snake venom, including a serine-peptidase, are involved in the antimicrobial activity of the B. oligolepis snake venom, c) the amino acid sequences and 3D structures of acidic PLA2 and of other proteins found in the venoms of the Peruvian B. pictus e Bothriopsis oligolepis snakes can be used as safe and natural sources for the development of new AMPs potent against microorganisms of clinical and scientific interest.

Os efeitos da MT-I, uma fosfolipase A2 isolada do veneno de Bothrops asper (VBa), foram avaliados em mastócitos (MC) em cultura, quanto à: i) desgranulação e liberação de prostaglandina E2 (PGE2); ii) papel da atividade catalítica na desgranulação; iii) papel da PLD, PLC, cPLA2, iPLA2, PI3K, MAPK, PKC, PTK, ERK1/2, Junk, Gαi, Gαq e do cálcio na desgranulação; iv) expressão gênica de citocinas Th1 e Th2, e v) alterações ultraestruturais em MC. Os resultados mostraram que a MT-I, em concentrações não citotóxicas, causou a desgranulação de MC. Este efeito foi parcialmente dependente da atividade catalítica e dependente da cPLA2, PLC, PLD e PI3K, mas não da iPLA2, ERK1/2, p38MAPK, PKC, MEK, Junk, Gαi e Gαq. O cálcio intra e extracelular (CRAC e LTCC) estão envolvidos neste efeito da MT-I. Ainda, a MT-I induziu a síntese e liberação da PGE2, expressão de genes de citocinas Th1 e Th2, aumento do número de vesículas citoplasmáticas e de endocitose dependente de clatrina. O VBa também causou a desgranulação de MC sugerindo que a MT-I é relevante para este efeito. / The effects of Myotoxin-I (MT-I), a phospholipase A2 (PLA2) from Bothrops asper venom (BaV) in cultured mast cells (MC) were evaluated focusing: i) degranulation and prostaglandin E2 (PGE2) release; ii) role of PLA2 catalytic activity in degranulation; iii) role of PLD and PLC, cPLA2 and iPLA2, PI3K, MAPK, PKC, PTK, ERK1/2, Junk, Gαi and Gαq protein and calcium in degranulation; iv) gene expression of Th1 and Th2 cytokines, and v) MC ultrastructural alterations. Results showed that MT-I, at non-cytotoxic concentrations, caused MC degranulation. This effect was partially dependent on its catalytic activity and dependent on cPLA2, PLC, PLD and PI3K, but not iPLA2, ERK1/2, p38MAPK, PKC, MEK, Junk, Gαi nor Gαq. Both intra and extracellular calcium (CRAC and LTCC) are involved in MT-I-induced degranulation. Furthermore, MT-I induced synthesis and release of PGE2, gene expression of Th1 and Th2 cytokines, increased numbers of cytoplasmic vesicles and clathrin-dependent endocytosis. BaV also caused MC degranulation suggesting that MT-I is relevant for this effect.

Neste estudo foram avaliados os efeitos da subunidade CB (FLA2 isolada do veneno da serpente C. d. terrificus) em células endoteliais quanto: 1) síntese de PGI2 e mecanismos e 2) mecanismos inibitórios sobre moléculas de adesão. Os resultados mostraram que a liberação de PGI2 induzida pela CB depende de COX-1, PGIS, cFLA2, ERK1/2, mas não de COX-2, NF-kB, p38, JNK, iFLA2, receptor IP, AC ou PKA. Em adição, a CB aumentou os níveis de PGIS, mas não de COX-1 ou COX-2. Ainda, a CB inibiu a expressão de ICAM-1 e VCAM-1, mas não de PECAM-1, induzidas pelo LPS. Em relação aos mecanismos da ação inibitória da CB, foi demonstrado que o PPAR-α e -β/δ, IP, AC, PKA e a PGI2 são relevantes para inibição de ICAM-1, mas não de VCAM-1, induzida pelo LPS. Além disso, a CB inibiu a expressão gênica de ICAM-1, VCAM-1, TNF-α e IL-6, induzida pelo LPS. Este estudo evidenciou importantes vias na ação inibitória da FLA2 crotálica, em um evento fundamental da resposta inflamatória e trouxe a melhor compreensão das atividades biológicas desencadeadas por esta FLA2 em células endoteliais. / In this study the effect of CB, a phospholipase A2 (PLA2) isolated from Crotalus durissus terrificus snake venom, in cultured endothelial cells was investigated, with focus on: i) biosynthesis of prostacyclin (PGI2) and related mechanisms, and ii) inhibitory mechanisms on expression of ICAM-1, VCAM-1 and PECAM-1 adhesion molecules. Results showed that COX-1, PGI2 synthase (PGIS), cPLA2, ERK1/2 and MEK1/2, but not COX-2, NF-kB, p38, JNK, iPLA2, IP receptor, cyclase adenylate nor PKA, are involved CB-induced PGI2 biosynthesis. In addition, CB up-regulated PGIS, but not COX-1 nor COX-2 protein levels. Moreover, CB was able to inhibit LPS-induced ICAM-1 and VCAM-1, but not PECAM-1 protein expression. PPAR-α and -β/δ, IP receptor, cyclase adenylate, PKA and PGI2, but not PPAR-γ, are essential for CB-induced inhibition of ICAM-1. Furthermore, CB inhibited LPS-induced gene expression of ICAM-1, VCAM-1, TNF-α and IL-6. Inhibition of these cytokines by CB may be related to down regulation of both VCAM-1 and ICAM-1 seen in endothelial cells incubated with this venom PLA2.

O envenenamento por aranhas Loxosceles é caracterizado pelo desenvolvimento de dermonecrose. A expressão de metaloproteases induzidas pelas esfingomielinases do veneno pode estar envolvida no loxoscelismo cutâneo. Os resultados mostraram que o veneno de Loxosceles laeta e a proteína recombinante SMase I foram capazes de: induzir a expressão de metaloproteases (MMP-2, MMP-7 e MMP-9); diminuir a expressão de alguns marcadores de superfície e causar morte celular. A indução de MMP-7, como produto da ação do veneno e da SMase I de L. laeta, não foi reportada em outras espécies do gênero. O uso de inibidores de metaloproteases, como a tetraciclina, impediu a morte celular e reduziu a expressão de MMPs. A galardina, um composto que inibe metaloproteases da família das adamlisinas e das MMPs, evitou a clivagem dos marcadores MCP, 2-microglobulina, MHCI, EPCR em queratinócitos humanos tratados. Os resultados revelam que a inibição das metaloproteases de matriz extracelular e da família das adamlisinas pode ser uma alternativa eficaz no tratamento do loxoscelismo cutâneo. / The envenomation by Loxosceles spider characterized by the development of dermonecrosis. Metalloproteinases expression, induced by venom sphingomyelinases, may be involved in cutaneous loxoscelism. The results showed that Loxosceles laeta venom and the recombinant protein SMase I were able to: induce the expression of matrix metalloproteinases (MMP-2, MMP-7 e MMP-9); reduce the expression of some surface markers and cause cell death. The induction of MMP-7, as a product of venom and SMase I action, has not been reported for other genus species. The use of metalloproteinase inhibitors, such as tetracycline, prevented cell death and reduced MMPs expression. Galardin, a compound that inhibits metalloproteinases from the adamlisins family and MMPs, avoided the cleavage of MCP, 2-microglobulin, MHCI and EPCR on the surface of the treated human keratinocytes. These data indicate that inhibition of metalloproteinases can be an effective alternative on the cutaneous loxoscelism treatment.

De uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno da cobra coral brasileira Micrurus corallinus foi isolada uma seqüência denominada NXH8. Esta seqüência de cDNA apresenta similaridade estrutural com a família de toxinas de serpentes em 'três dígitos' ricas em pontes dissulfeto. A subclasse melhor conhecida nesta família, são as alfa neurotoxinas. Uma outra seqüência distinta, denominada NXH1 e suas isoformas NXH3 e NXH7, foram isoladas anteriormente. Pertencem à mesma família de toxinas e estão presentes na mesma biblioteca. Alguns resultados da caracterização de NXH1, são utilizados neste estudo, em comparação com NXH8. Algumas características estruturais tornam a seqüência NXH8 diferente da classe usual das alfa neurotoxinas, vindo a constituir possivelmente uma nova subclasse da família. A proteína NXH8 foi expressa em diversos vetores de expressão em Escherichia coli. A proteína recombinante, expressa pelo vetor pRSET C - NXH8 foi utilizada para imunizar camundongos. O soro contra NXH8, assim como o soro anti - elapídico do Instituto Butantan, reconhece a toxina recombinante em ELISA e Western blot. O soro anti - NXH8 detecta apenas uma banda do veneno de M. corallinus em Western blot, mas apresenta reatividade cruzada com componentes do veneno de alguns elapídeos neotropicais e do velho mundo. Em contraste, dados anteriores demonstraram que o soro anti - NXH1 é específico para um componente único do veneno de M. corallinus. O veneno de M. corallinus tem alfa neurotoxinas que bloqueiam o receptor pós - sináptico nicotínico de acetilcolina nas membranas do músculo esquelético de ratos. O soro anti - NXH8 é capaz de impedir a ligação de componentes do veneno bruto a esses receptores. Já o soro contra NXH1 não apresenta a mesma capacidade inibitória. Isto indica que NXH8 tem afinidade pelo receptor nicotínico muscular de acetilcolina, ou que NXH8 compartilha de um epítopo neutralizante presente também nas alfa neurotoxinas do veneno da cobra coral M. corallinus. / A cDNA sequence encoding a putative new toxin, NXH8, was isolated from the cDNA library constructed from the venom gland of the Brazilian coral snake, Micrurus corallinus. This sequence shows a structural similarity with the snake toxin family known as 'three-fingered' toxins, a family of toxins with approximately 60 to 70 amino acids and usually 4 to 5 disulfide bonds. Irrespective of whether these proteins are functionally different, their amino acid sequences can be readily aligned, using 8 half-cystines as conserved elements, suggesting the presence of common structural features. The best known subclass of three-finger-type toxins are the curaremimetic toxins, also called alpha-neurotoxins, found in most venoms from Elapid and Sea snakes. Another toxin with a distinct sequence, known as NXH1 and its isoforms NXH3 and NXH7 had been previously isolated. They belong to the same family of toxins and were characterized from the same cDNA library. In the present study, a comparative biochemical, pharmacological and structural analyses of NXH1 and NXH8 were described. Few structural characteristics of NXH8 seem to indicate that it differs from the usual class of alpha – neurotoxins, belonging, possibly, to a new subclass of 'three-finger' toxins. The NXH8 protein was expressed in various E. coli expression vectors and the resulted recombinant toxin from pRSETC-NXH8 plasmid was used as a "toxoid" for mice immunization. The anti - NXH8 sera, as well as the anti – elapid sera from the Butantan Institute, recognized the recombinant toxin by both ELISA and Western blot assays. In contrast to the claim that anti - NXH1 sera is specific to one component of M. corallinus’s venom, the anti – NXH8 sera show cross reactivity to venom of some Neotropical and Old World elapids. The M. corallinus's venom contains alpha – toxins, which inhibit post-synaptic nicotinic acetylcholine receptor of neonatal rat skeletal muscle membrane. The anti - NXH8 serum was capable of blocking the binding of the components of the crude venom to these receptors. In contrast, the anti – NXH1 serum did not show this inhibitory effect. This indicates that either NXH8 presents affinity for muscular nicotinic acetylcholine receptor or it shares a neutralizing epitope also present in M. corallinus’s alpha – neurotoxins.

Orientadores: Sergio Marangoni, Luis Alberto Ponce Soto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T22:19:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 VilcaQuispe_Augusto_D.pdf: 3256672 bytes, checksum: 5fbbaf997230230025e7a3945d3d9410 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: No presente trabalho duas novas serinoproteases com atividade trombina-simile, nomeadas TLBbz e TLBro isoladas a partir de Bothrops brazili e Bothrops roedingeri respectivamente, foram purificadas em um único passo cromatográfico por HPLC de fase reversa com um alto grau de pureza e homogeneidade molecular, sem perda da atividade biológica. Ambas serinoproteases foram caracterizadas fisico-quimicamente, revelando uma massa molecular relativa de TLBbz = 35,13 KDa e TLBro = 20,24 KDa por SDS-PAGE. Ambas apresentaram atividade proteolítica perante o substrato cromogenico DL-Ba?NA. Os estudos da atividade cinética mostraram que as serinoproteases tiveram um comportamento michaeliano frente ao substrato DL-Ba?NA, apresentando uma Vmax = 1,89 nmoles ?-NA/Lt/min e KM = 0,853 mM para TLBbz; e Vmax = 0,0432 nmoles ?-NA/Lt/min e KM = 0,039 mM para TLBro. Ambas serinoproteases apresentam uma atividade ótima em torno de 38 oC e pH 8,0; sendo inibidas pela ação do fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) e outros inibidores, através dos quais a atividade trombina-simile foi reduzida em mais dos 50 % (TLBbz = 86.2 % and TLBro = 42.6 %). Ambas TLBbz e TLBro possuem caráter acido ao apresentar um elevado numero de aminoácidos ácidos, assim como uma boa quantidade em numero de aminoácidos hidrofóbicos, o que garante a estabilidade conformacional da proteína. A presença de 12 cisteinas sugere a possível formação de 6 pontes dissulfeto. TLBbz e TLBro evidenciaram uma atividade fibrinogenolitica frente ao fibrinogenio bovino hidrolisando a cadeia alfa (?) e beta (?), comportando-se como uma trombina-simile tipo AB no caso da TLBro e tipo B, por hidrolizar a cadeia beta (?), no caso da TLBbz. Finalmente, estudos da atividade biológica indicam a propriedade de induzir agregação plaquetaria e esse efeito e inibido pela presença de PMSF / Abstract: In this work, two new serine proteases with thrombin-like activity called TLBbz and TLBro from Bothrops brazili and Bothrops roedingeri respectively were purified in a single chromatographic step by reverse phase HPLC with a high degree of purity and molecular homogeneity without loss of biological activity. Both serine proteases have been characterized physico-chemically, showing a relative molecular mass of TLBbz = 35.13 and TLBro = 20.24 kDa by SDS-PAGE. On the other hand, showed a proteolytic activity towards the chromogenic substrate DL-Ba?NA. The studies of the kinetic activity showed that serine proteases have a michaelian behavior when tested with the substrate DL-Ba?NA, with a Vmax = 1.89 nmoles ?- NA/Lt/min and KM = 0.853 mM for TLBbz, and Vmax = 0.0432 nmoles ?-NA/Lt/min and KM = 0.039 mM for TLBro. Both serine proteases have an optimal activity around 38 °C and pH 8,0; and were inhibited by the action of phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and other inhibitors, whereby the thrombin-like activity was reduced in more than 50 % (TLBbz = 86.2 % and TLBro = 42.6 %). Both TLBbz and TLBro have acidic character by presenting a large number of aminoacids acids and a good amount of hydrophobic amino acids, which ensures the conformational stability of the protein. The presence of 12 cysteines suggests the possible formation of six disulfide bridges. TLBbz and TLBro showed a fibrinogenolytic activity against the bovine fibrinogen and hidrolise alpha (?) and beta (?) chain, behaving as a thrombin-like AB types in the case of TLBro and hydrolyzing the beta chain (?) behaving as a thrombin-like B types in the case of TLBbz. Finally, studies of biological activity indicate the ability to induce platelet aggregation and this effect is inhibited by the presence of PMSF / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Sergio Marangoni, Luís Alberto Ponce Soto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T22:23:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ValerianoZapana_JoseAntonio_M.pdf: 9614816 bytes, checksum: f7fe976f2fbaf3eab37af937d9930859 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: No presente trabalho, uma nova serinoprotease com atividade trombina "like" do veneno de Bothrops andianus (TLBan), serpente dos Andes do Perú, foi isolada mediante duas etapas: cromatografia de exclusão molecular G-75 e cromatografia líquida em HPLC de fase reversa; com um alto grau de pureza e homogeneidade molecular. Através da eletroforese em SDS-PAGE a TLBan mostrou ter uma massa relativa de 29 kDa sob condições redutoras e 26 kDa em condições não redutoras que foi confirmada com exatidão pela espectrometria de massa MALDI-TOF com uma massa molecular de 25 835,65 Da, após de ser submetida à glicosilação com a PNGase F e a neuraminidase, a massa relativa de TLBan diminuiu a 22 kDa e 25 kDa, respectivamente. Os estudos da atividade cinética mostraram que a serinoprotease com atividade trombina "like" possui um comportamento michaeliano frente ao substrato DL-BApNA, registrando as constantes cinéticas de Vmax = 5.4 x 10-1 nmoles p-NA/min e Km = 7.9 x 10-1 mM apresentou ser estável entre 25 ºC e 60 ºC e na faixa de pH entre 4 e 10. Na presença de diferentes íons (Mg2+, Ca2+, Mn2+, Cd2+ e Zn2+) e inibidores (PMSF, EDTA e SBTI), sua atividade proteolítica e fibrinogenolítica foi mantida, com exceção para os íons Cd2+, Zn2+ e inibidor PMSF. TLBan foi capaz de evidenciar sua atividade fibrinogenolítica frente ao fibrinogênio bovino, hidrolisado a cadeia alfa ('alfa') e beta ('beta'), comportando-se como uma trombina "like" de tipo venobim AB, apresentou um IC de 144,93 s-1, uma dose mínima coagulante (DMC) de 1,33 ± 0,25 ?g/mL e induz á agregação plaquetária. A caracterização estrutural de TLBan foi determinada por sua massa molecular via espectrometria de massa. A análise estrutural da sequência foi deduzida utilizando a base de dados: http://www.expasy.ch/sprot/, com a ajuda da sequência dos peptídeos trípticos, mostrando uma alta homologia seqüêncial dos aminoácidos com outras serinoproteases de veneno de serpente. Sua cadeia polipeptídica da TLBan mostrou a presença da tríade catalítica nas posições de His (44), Asp (90) e Ser (185). A reprodutibilidade da atividade biológica por meio dos efeitos farmacológicos só é possível com a utilização de frações quimicamente homogêneas para manter a integridade da molécula. Essas frações são obtidas com metodologias de alta eficiência: HPLC e espectrometria de massa. Os resultados podem ser associados com sua atividade biológica, eliminando a subjetividade causada pelo veneno ou frações impuras. Este tipo de abordagem será aplicado para pautar os estudos bioquímicos, estrutura-função, fisiológico e farmacológico; pode ainda revelar mecanismos desconhecidos na relação estrutura-função da serinoprotease com atividade trombina "like" do veneno de serpente. No caso da serpente Bothrops andianus, são valorizados os estudos devido ao fato de não haver trabalhos realizados, provavelmente pelo fato de tratar-se de uma espécie ainda não estudada, mas que tem interesse para o campo científico no campo da venômica / Resumo: No presente trabalho, uma nova serinoprotease com atividade trombina "like" do veneno de Bothrops andianus (TLBan), serpente dos Andes do Perú, foi isolada mediante duas etapas: cromatografia de exclusão molecular G-75 e cromatografia líquida em HPLC de fase reversa; com um alto grau de pureza e homogeneidade molecular. Através da eletroforese em SDS-PAGE a TLBan mostrou ter uma massa relativa de 29 kDa sob condições redutoras e 26 kDa em condições não redutoras que foi confirmada com exatidão pela espectrometria de massa MALDI-TOF com uma massa molecular de 25 835,65 Da, após de ser submetida à glicosilação com a PNGase F e a neuraminidase, a massa relativa de TLBan diminuiu a 22 kDa e 25 kDa, respectivamente. Os estudos da atividade cinética mostraram que a serinoprotease com atividade trombina "like" possui um comportamento michaeliano frente ao substrato DL-BApNA, registrando as constantes cinéticas de Vmax = 5.4 x 10-1 nmoles p-NA/min e Km = 7.9 x 10-1 mM apresentou ser estável entre 25 ºC e 60 ºC e na faixa de pH entre 4 e 10. Na presença de diferentes íons (Mg2+, Ca2+, Mn2+, Cd2+ e Zn2+) e inibidores (PMSF, EDTA e SBTI), sua atividade proteolítica e fibrinogenolítica foi mantida, com exceção para os íons Cd2+, Zn2+ e inibidor PMSF. TLBan foi capaz de evidenciar sua atividade fibrinogenolítica frente ao fibrinogênio bovino, hidrolisado a cadeia alfa ('alfa') e beta ('beta'), comportando-se como uma trombina "like" de tipo venobim AB, apresentou um IC de 144,93 s-1, uma dose mínima coagulante (DMC) de 1,33 ± 0,25 ?g/mL e induz á agregação plaquetária. A caracterização estrutural de TLBan foi determinada por sua massa molecular via espectrometria de massa. A análise estrutural da sequência foi deduzida utilizando a base de dados: http://www.expasy.ch/sprot/, com a ajuda da sequência dos peptídeos trípticos, mostrando uma alta homologia seqüêncial dos aminoácidos com outras serinoproteases de veneno de serpente. Sua cadeia polipeptídica da TLBan mostrou a presença da tríade catalítica nas posições de His (44), Asp (90) e Ser (185). A reprodutibilidade da atividade biológica por meio dos efeitos farmacológicos só é possível com a utilização de frações quimicamente homogêneas para manter a integridade da molécula. Essas frações são obtidas com metodologias de alta eficiência: HPLC e espectrometria de massa. Os resultados podem ser associados com sua atividade biológica, eliminando a subjetividade causada pelo veneno ou frações impuras. Este tipo de abordagem será aplicado para pautar os estudos bioquímicos, estrutura-função, fisiológico e farmacológico; pode ainda revelar mecanismos desconhecidos na relação estrutura-função da serinoprotease com atividade trombina "like" do veneno de serpente. No caso da serpente Bothrops andianus, são valorizados os estudos devido ao fato de não haver trabalhos realizados, provavelmente pelo fato de tratar-se de uma espécie ainda não estudada, mas que tem interesse para o campo científico no campo da venômica / Abstract: In this word, a new serine protease with thrombin "like" activity the venom of Bothrops andianus (TLBan), snake of the Andes of Peru, was isolated by two steps: molecular exclusion chromatography G-75 and liquid chromatography in reversed-phase HPLC; with a high degree of purity and molecular homegenidade. Through of electrophoresis on SDS-PAGE shows the TLBan have a relative mass of 29 kDa under reducing conditions and 26 kDa in reducing conditions that was not confirmed for precision by mass spectrometry MALDI-TOF, with a molecular mass of 25 835.65 Da after when was sometida a desglycosilation with PNGase F and neuraminidase, The TLBan relative mass decreased 22 kDa and 25 kDa, respectively. The kinetic studies of the activity showed that the serine protease thrombin "like" activity features a opposite behavior michaeliano substrate DL-BApNA, recording the kinetic constants of Vmax = 5.4 x 10-1 nmol p-NA/min and Km = 7.9 x 10 -1 mM had to be stable between 25 ° C and 60 ° C and at pH between 4 and 10. In the presence of different ions (Mg2 +, Ca2 +, Mn2 +, Cd2 + and Zn2 +) and inhibitors (PMSF, EDTA and SBTI), its proteolytic activity and fibrinogenolítica was maintained, except for the ions Cd2 +, Zn2 + and inhibitor PMSF. TLBan was able to enhance its activity against the fibrinogen fibrinogenolítica veal, hydrolyzing the alpha cha thrombin "like" type venobim AB, presented a CI of 144.93 s-1, a minimum coagulant dose (DMC) of 1.33 ± 0.25 mg / mL and induces platelet aggregation. The structural characterization of TLBan was determined by its molecular mass via mass spectrometry. Structural analysis of the sequence was deduced using the database: http://www.expasy.ch/sprot/, with the help of the sequence of tryptic peptides, showing a high homology with other amino acid sequence of the serine protease from snake venom. Its polypeptide chain TLBan showed the presence of a catalytic triad in positions His (44), Asp (90) and Ser (185). The reproducibility of the biological activity through the pharmacological effects is only possible with the use of chemically homogeneous fractions to maintain the integrity of the molecule. These fractions are obtained with high efficiency methods: HPLC and mass spectrometry. The results may be associated with its biological activity, eliminating the subjectivity caused by poison or impure fractions. This approach will be applied to govern the biochemical studies, structure-function, physiological and pharmacological, may also reveal unknown mechanisms in the structure-function relationship of serine protease with thrombin "like" activity from snake venom. In the case of the snake Bothrops andianus, studies are valued due to the fact that there is no work done, probably because this is a species not yet studied, but that is of interest to the scientific field of venom / Abstract: In this word, a new serine protease with thrombin "like" activity the venom of Bothrops andianus (TLBan), snake of the Andes of Peru, was isolated by two steps: molecular exclusion chromatography G-75 and liquid chromatography in reversed-phase HPLC; with a high degree of purity and molecular homegenidade. Through of electrophoresis on SDS-PAGE shows the TLBan have a relative mass of 29 kDa under reducing conditions and 26 kDa in reducing conditions that was not confirmed for precision by mass spectrometry MALDI-TOF, with a molecular mass of 25 835.65 Da after when was sometida a desglycosilation with PNGase F and neuraminidase, The TLBan relative mass decreased 22 kDa and 25 kDa, respectively. The kinetic studies of the activity showed that the serine protease thrombin "like" activity features a opposite behavior michaeliano substrate DL-BApNA, recording the kinetic constants of Vmax = 5.4 x 10-1 nmol p-NA/min and Km = 7.9 x 10 -1 mM had to be stable between 25 ° C and 60 ° C and at pH between 4 and 10. In the presence of different ions (Mg2 +, Ca2 +, Mn2 +, Cd2 + and Zn2 +) and inhibitors (PMSF, EDTA and SBTI), its proteolytic activity and fibrinogenolítica was maintained, except for the ions Cd2 +, Zn2 + and inhibitor PMSF. TLBan was able to enhance its activity against the fibrinogen fibrinogenolítica veal, hydrolyzing the alpha cha thrombin "like" type venobim AB, presented a CI of 144.93 s-1, a minimum coagulant dose (DMC) of 1.33 ± 0.25 mg / mL and induces platelet aggregation. The structural characterization of TLBan was determined by its molecular mass via mass spectrometry. Structural analysis of the sequence was deduced using the database: http://www.expasy.ch/sprot/, with the help of the sequence of tryptic peptides, showing a high homology with other amino acid sequence of the serine protease from snake venom. Its polypeptide chain TLBan showed the presence of a catalytic triad in positions His (44), Asp (90) and Ser (185). The reproducibility of the biological activity through the pharmacological effects is only possible with the use of chemically homogeneous fractions to maintain the integrity of the molecule. These fractions are obtained with high efficiency methods: HPLC and mass spectrometry. The results may be associated with its biological activity, eliminating the subjectivity caused by poison or impure fractions. This approach will be applied to govern the biochemical studies, structure-function, physiological and pharmacological, may also reveal unknown mechanisms in the structure-function relationship of serine protease with thrombin "like" activity from snake venom. In the case of the snake Bothrops andianus, studies are valued due to the fact that there is no work done, probably because this is a species not yet studied, but that is of interest to the scientific field of venom / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Maria Alice da Cruz-Höfling / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T16:36:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Soares_EdileneSiqueira_M.pdf: 11448561 bytes, checksum: 00aace7be2d8fec579aea2fd4166f813 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Neste trabalho investigamos a permeabilização da barreira hematoencefálica (BHE) pela peçonha da aranha Phoneutria nigriventer (PNV) através da via transcelular no cerebelo de ratos. As cavéolas foram analisadas nas células endoteliais pela expressão de proteínas associadas à sua formação (caveolina-1, Cav-1 e dinamina-2, Din2) e internalização (caveolina-1 fosforilada, pCav-1 e quinase da família Src, SKF), e nos astrócitos com avaliação da caveolina-3 (Cav-3) e da conexina-43 (Cx43) (formadora de junções comunicantes). A ação do PNV sobre o endotélio também foi avaliada pela ativação (acoplamento) ou inativação (desacoplamento) da enzima eNOS, produtora de óxido nítrico (NO). As estruturas que compõe a BHE foram avaliadas através de microscopia eletrônica de transmissão. Inicialmente, o estudo de Cav-1 contemplou sua localização, expressão gênica e proteica após o envenenamento em diferentes idades, ratos neonatos eram mais suceptíveis ao envenenamento do que ratos adultos. Após PNV, a imunomarcação para Cav-1 foi mais evidente na camada granular e molecular e em neurônios de Purkinje. A expressão Cav-1 e Din2 (foramdoras das vesículas e seu gargalo, respectivamente) aumentou em períodos de envenenamento agudo (1 h), de recuperação (5 h) e na ausência de sinais clínicos (24 h); em contrapartida SKF e pCav-1 envolvidas na internalização caveolar foram superexpressas em períodos opostos (às 2 h e 72 h). O PNV induziu aumento da metaloproteinase-9 da matriz (MMP9), importante mediadora de quebra da BHE e aumentou a formação e o tráfego de vesículas no endótelio após envenenamento. A análise de eNOS revelou desacoplamento (aumento de monômeros) nos períodos de envenenamento agudo (1-2 h) com progressivo retorno e super-expressão de dímeros (re-acoplamento) às 72 h; essas alterações foram relacionadas à ação do PNV sobre os níveis intracelulares de cálcio investigado pelo aumento na expressão de calmodulina e confimado pela localização de calbindina-D28. Os dados revelam a interferência do PNV sobre a homeostase endotelial e função vascular ao afetar o sistema eNOS/NO, importante controlador do tônus vascular. Nos astrócitos, as cavéolas são formadas por Cav-3 e sua superexpressão é associada a doenças neurológicas. O PNV aumentou significativamente os níveis basais de Cav-3 em astrócitos GFAP positivos (astrogliose reativa) em períodos de aumento de Cx43 (às 1, 5 e 24 h), e na vigência de edema citotóxico nos pés astrocitários e alterações nos contatos sinápticos axo-dendríticos e axo-somáticos. Em conjunto os resultados revelam que: (a) a quebra da via transcelular da BHE pelo PNV tem aumento da endocitose via cavéolas; (b) componentes da unidade neurovascular, como endotélio, astrócitos e neurônios estão intimamente envolvidos; (c) no endotélio, os efeitos são mediados pelo sistema eNOS/NO; (d) a SKF ativa o sistema endocítico e de transporte vesicular; (e) nos astrócitos, a dinamica expressão de Cx43 e Cav-3 e o retorno aos níveis basais em paralelo com a ausência de sinais de intoxicação nos animais (72 h) dá evidências de que ambas as proteínas interagem na resposta astrocitária. Os dados permitem sugerir que a presença de peptídeos neurotóxicos no veneno de Phoneutria nigriventer estão no centro dos efeitos aqui relatados / Abstract: In this work, we investigated the blood-brain barrier (BBB) permeabilization induced by Phoneutria nigriventer venom (PNV) in the transcellular route of rats¿ cerebellum. Caveolae was analyzed in endothelial cells accessing the expression of proteins involved in caveolae formation (caveolin-1, Cav-1 and dynamin-2, Dyn2) and internalization (phosphorylated Caveolin-1, pCav-1 and Src kinase family, SKF), in astrocytes caveolae role were evaluated with caveolin-3 (Cav-3) and connexin-43 (Cx43) (gap-junction main protein). PNV action on the endothelium was also investigated through activation (coupling) or inactivation (uncoupling) of eNOS enzyme, responsible for nitric oxide (NO) production. BBB components were evaluated using transmission electron microcopy. Initially, Cav-1 study addressed its localization along with Cav-1 protein and gene expression after envenoming in different age animals, neonate rats were more susceptible to envenoming than adult rats. After PNV, Cav-1 labeling was intense in granular and molecular layers and in Purkinje neurons. Cav-1 and Dyn2 (responsible for caveolae vesicles formation and scission, respectively) expression increased in periods of acute envenomation (1 h), recovery (5 h) and in the absence of clinical signals (24 h); in opposition SKF and pCav-1 involved in caveolae internalization were overexpress in opposite periods (at 2 h and 72 h). PNV induced increases in matrix metaloproteinases-9 (MMP9) an important BBB breakdown mediator, and increases in vesicles formation and traffic in the endothelium after envenoming. The study of eNOS activity revealed uncoupling (increasing in eNOS monomers) in acute periods after envenomation (1 h and 2 h) and progressive return followed by overexpression of dimers (re-coupling) at 72 h; those alterations were related to PNV action on calcium intracellular levels confirmed by Calmodulin increased expression and confirmed using Calbindin-D28 localization. Data revealed PNV interference on endothelial homeostasis and vascular function once affects the eNOS/NO system, an important vascular tonus controller. In astrocytes, caveolae are formed by Cav-3 and its overexpression is related to neurological disorders. PNV increased the basal levels of Cav-3 in GFAP-positive astrocytes (reactive astrogliosis) in the same periods as increased Cx43 (at 1, 5 e 24 h), during cytotoxic edema in astrocytes end-feet and alterations in axo-dendrites and axo-somatic synaptic contacts. Together, the results revealed that: (a) the BBB breakdown in transcellular route by PNV involves upregulation of caveolae endocytosis (b) the neurovascular unit components such as the endothelium, astrocytes and neurons are intimal involved (c) in the endothelium the effects are mediated by the eNOS/NO system and (d) SKF activates endocytic system and vesicular transport; (e) in the astrocytes, Cx43 and Cav-3 dynamic expression and their return to basal level in parallel with the absence of toxic signals in the animals (72 h) provides evidence that both protein interacts in astrocytes response. The data allows us to suggest that the neurotoxic peptides presented in Phoneutria nigriventer venom are in the center of the effects reported here / Mestrado / Biologia Tecidual / Mestra em Biologia Celular e Estrutural