A bothropasina é uma proteína hemorrágica de 48 kDa, pertencente à classe P-III das metaloproteases, isolada a partir do veneno bruto da serpente brasileira Bothrops jararaca, e que possui os domínios adesivos desintegrina (D) e rico em cisteína (C). Neste trabalho, nós apresentamos a estrutura cristalográfica da bothropasina complexada ao inibidor POL647. O domínio catalítico , metaloprotease (M), pode ser dividido em dois subdomínios, dispostos de maneira muito similar aos descritos para essa família de metaloproteases de venenos de serpentes (em inglês \"SVMPs\"), que inclui os sítios de ligação ao zinco e ao cálcio. A cisteína livre, resíduo Cys189, está localizado em um núcleo hidrofóbico e, sendo assim, impossibilitado de fazer pontes dissulfeto ou qualquer outra interação. O domínio D não apresenta estruturas secundárias bem definidas, sendo constituído, majoritariamente, por estruturas desordenadas como \"loops\", porém estabilizados por 7 pontes dissulfeto e por dois íons cálcio. A região do motivo ECD está localizada em um \"loop\" e é estruturalmente relacionado à região RGD das desintegrinas-RGD, derivadas de SVMPs da classe P-II. O motivo ECD é estabilizado pela ponte dissulfeto Cys277-Cys310 (entre os domínios D e C), além de um íon cálcio. A cadeia lateral do Glu276 do motivo ECD está exposta ao solvente. Na bothropasina, a região hiper variada (em inglês HVR), descrita para outras P-III de SVMPs, presente no domínio C, de fato, é bastante conservada quando comparada a outros membros da classe P-III de diversas espécies. Nós propomos que esse subgrupo deva ser referido como PIII-HCR (região altamente conservada) SVMPs. Ainda é proposto que as diferenças estruturais dos domínios D, C ou DC possam estar envolvidas em uma melhor adaptação da estrutura na interação com diferentes alvos, além do reconhecimento e especificidade a um substrato para o domínio M. / Bothropasin is a 48kDa hemorrhagic P-III metalloprotease isolated from the venom of the Brazilian snake Bothrops jararaca, which has the disintegrin (D) and cysteine-rich (C) adhesive domains. We present the crystal structure of the bothropasin complexed with the inhibitor POL647. The catalytic domain, metalloprotease (M), consists of two subdomains in a very similar scaffold to the ones described for other snake venom metalloproteases (SVMPs) including the zinc and calcium binding sites. The free cysteine, residue Cys189, is in a hydrophobic core and it is not available for disulfide bonding or other interactions. The D domain does not have a defined secondary structure, but instead is composed by mostly loops stabilized by seven disulfide bonds and by two calcium ions. The ECD region is in a loop and it is structurally related to the RGD region of RGD-disintegrins, which are derived from P-II SVMPs. The ECD motif is stabilized by the Cys277-Cys310 disulfide bond (between D and C domains) and by one calcium ion. The side chain of the Glu276 of the ECD motif is solvent exposed. In bothropasi, the HVR (hyper-variable region) described for other P-III SVMPs in the C domain in fact presents a well conserved sequence with respect to several other P-III members from different species. We propose that this subset be referred to as PIII-HCR (highly-conserved region) SVMPs. We further propose that the structural differences in the D, C or DC domains may be involved in selecting target binding which in turn could generate substrate diversity or specificity for the M domain.

Submitted by Franciele Moreira (francielemoreyra@gmail.com) on 2018-06-22T20:27:16Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Larissa Córdova Turones - 2018.pdf: 2576144 bytes, checksum: fb628d04d3221c6ac7ccaf79cc3d60ea (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Rejected by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com), reason: on 2018-06-22T20:38:02Z (GMT) / Submitted by Franciele Moreira (francielemoreyra@gmail.com) on 2018-06-22T20:39:29Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Larissa Córdova Turones - 2018.pdf: 2494325 bytes, checksum: 52754820438d7cd88e3dc298a96a898a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-06-27T11:25:24Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Larissa Córdova Turones - 2018.pdf: 2494325 bytes, checksum: 52754820438d7cd88e3dc298a96a898a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-27T11:25:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Larissa Córdova Turones - 2018.pdf: 2494325 bytes, checksum: 52754820438d7cd88e3dc298a96a898a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-05-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The Bj-PRO-7a, a heptapeptide isolated and identified from Bothrops jararaca (Bj) venom, evoke potent therapeutic effects, as antihypertensive effect, natriuretic and diuretic effects, promotion of angiogenisis and vasodilatation. The effects of heptapeptide are independent of Angiotensin Converting Inhibitor (ACE), possibly dependent of Muscarinic Receptors subtype 1 (M1R) activation and oxido nitric pathways. Also, the Bj-PRO-7a actions upon central nervous system still need to be evaluated. Thus, the aims of this study were: i) to assess the effects of acute administration of Bj-PRO-7a upon behavior; ii) to reveal mechanisms involved in the effects of Bj- PRO-7a upon locomotion/exploration, anxiety and depression-like behaviors. For this purpose, adult male Wistar (WT) and Spontaneous Hypertensive Rats (SHRs) (300-380 g) received i.p. injections of Vehicle (NaCl 0.9%), Diazepam (2 mg/kg), Imipramine (15 mg/kg), Bj-PRO-7a (71, 213 or 426 nmol/kg), Pirenzepine (852 nmol/kg), α-metil-DL-tirosina (200 mg/kg) or Chlorpromazine (2 mg/kg) and were placed in the Elevated Plus Maze (EPM), Open Field (OF) and Forced Swimming (FS) tests. The heptapeptide promoted anxiolytic and antidepressantlike effects and increased the locomotion/exploration. These effects of Bj-PRO-7a seem to be strongly dependent on activation of M1R, catecholaminergic paths and dopaminergic receptors. / O Bj-PRO-7a, um heptapeptídeo isolado e identificado no veneno da Bothrops jararaca (Bj), evoca potentes efeitos terapêuticos, tais como o efeito anti-hipertensivo, efeitos natriurético e diurético, promoção da angiogênese e vasodilatação. Os efeitos do hepapeptídeo são independentes da inibição sobre a Enzima Conversora de Angiotensina (ECA), possivelmente dependentes da ativação dos Receptores Muscarínicos de Acetilcolina subtipo 1 (M1Rs) e vias do óxido nítrico. Ademais, as ações do Bj-PRO-7a sobre o sistema nervoso central ainda precisam ser avaliadas. Assim, os objetivos deste estudo foram: i) acessar os efeitos da administração aguda do Bj-PRO-7a sobre o comportamento; ii) revelar os mecanismos envolvidos nos efeitos do Bj-PRO-7a sobre a locomoção/exploração, comportamento tipo-ansiedade e depressão. Para esse propósito, ratos machos adultos Wistar (WT) e Espontaneamente Hipertensos (SHR) (300-380 g) receberam injeções i.p. de Veículo (NaCl 0,9%), Diazepam (2 mg/kg), Imipramina (15 mg/kg), Bj-PRO-7a (71, 213 ou 426 nmol/kg), Pirenzepina (852 nmol/kg), α-metil-DL-tirosina (200 mg/kg) ou Clorpromazina (2 mg/kg) e foram colocados nos testes de Labirinto em Cruz Elevado (LCE); Campo Aberto (CA) e Nado Forçado (NF). O heptapeptídeo promoveu efeito tipo-ansiolítico e antidepressivo e aumentou a locomoção/exploração. Esses efeitos parecem ser fortemente dependentes da ativação dos M1Rs, vias catecolaminérgicas e receptores dopaminérgicos.

Neste trabalho, mostramos que a extração de veneno promove aumento na ativação dos fatores de transcrição NF<font face=\"symbol\">kB e AP-1. Noradrenalina, liberada após extração de veneno, é responsável por esse aumento. A estimulação dos adrenoceptores <font face=\"symbol\">a e <font face=\"symbol\">b estão envolvidos nessa resposta, entretanto, o grau de ativação de AP-1 é alterado dependendo do tempo. Foi verificado dimorfismo sexual na ativação dos fatores de transcrição da glândula de veneno, sendo a ativação de NF<font face=\"symbol\">kB mais rápida nas fêmeas do que nos machos e a ativação de AP-1 maior nas fêmeas. Mostramos ainda que a extração de veneno ativa a glândula de veneno através da estimulação da inervação noradrenérgica. Noradrenalina atuando em adrenoceptores <font face=\"symbol\">a e <font face=\"symbol\">b regula a síntese de proteínas da glândula de veneno e não a síntese de toxinas do veneno. Em conclusão, a estimulação da inervação noradrenérgica desencadeia o ciclo de produção de veneno regulando a síntese de proteínas da glândula que provavelmente são essenciais para sua ativação e posterior produção de veneno, através da ativação de fatores de transcrição. Thesis: Noradrenergic Innervation in activation of venom gland of Bothrops jararaca snake. / In this work we showed that venom extraction increases the activation of transcription factors like NF<font face=\"symbol\">kB and AP-1. Noradrenaline released after venom extraction is responsible for NF<font face=\"symbol\">kB and AP-1 activation. Stimulation of both <font face=\"symbol\">a- and <font face=\"symbol\">b-adrenoceptors is involved in this response, however the increase of AP-1 activation is time dependent. A sexual dimorphism has been verified in NF<font face=\"symbol\">kB and AP-1 activation. Activation of NF<font face=\"symbol\">kB occurs earlier in female than in male snakes and activation of AP-1 is greater in female than in male snakes. We also showed that venom extraction activates venom gland by stimulating noradrenergic innervation. Noradrenaline acting at both <font face=\"symbol\">a- and <font face=\"symbol\">b-adrenoceptors regulates synthesis of protein of the venom gland, but not the toxin of the venom. In conclusion, stimulation of noradrenergic innervation triggers the venom production cycle by regulating synthesis of protein that probably is essential to activate venom gland to produce venom by activating transcription factors.

Na Martinica, os envenenamentos por Bothrops lanceolatus apresentam um quadro clínico trombótico, acompanhado de inflamação local extensa, envolvendo edema, dor e hemorragia limitada. Neste estudo foi mostrado que vários componentes do veneno compartilham similaridades antigênicas com venenos de espécies da América do Sul. O veneno de B. lanceolatus é citotóxico para queratinócitos e células endoteliais, induzindo a produção de citocinas e quimiocinas pro-inflamatórias pelas células. O veneno de B. lanceolatus ativa a cascata do complemento, liberando anafilatoxinas, assim como o complexo terminal do complemento. Ele apresenta uma ação proteolítica sobre os componentes purificados C3, C4, C5, e o inibidor de C1, C1-INH. O veneno também desequilibra o balanço de expressão dos reguladores do complemento na membrana das células endoteliais. Estes dados demonstram que o veneno de B. lanceolatus exibe uma potente ação proinflamatória, pela ativação do sistema complemento e pela sua toxicidade em células endoteliais. / In Martinique envenomations by Bothrops lanceolatus are characterized by a systemic thrombotic syndrome and important local inflammation, involving oedema and pain, but limited haemorrhage. In this study, we show that several components of B. lanceolatus venom share antigenic similarities with South American Bothrops species. Still, B. lanceolatus venom proteases present substrate specificity. The venom is cytotoxic for keratinocytes and endothelial vascular cells, inducing the production of pro-inflammatory cytokines and chemokines. B. lanceolatus venom activates the complement cascade, releasing anaphylatoxins and the terminal complement complex. It also shows a direct proteolytic activity upon the purified complement proteins C3, C4, C5, and the inhibitor of C1, C1-INH. B. lanceolatus venom modified the balance of complement regulators on endothelial cells membrane. In conclusion, B. lanceolatus venom displays important pro-inflammatory properties, as it activates the complement cascade and impacts endothelial cells.

Orientador: Maria Alice da Cruz Hofling / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T07:40:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dourado_DorotyMesquita_D.pdf: 6138629 bytes, checksum: 583afdc02d280fcf5b42546f6eeb5981 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O estudo de substâncias naturais visa não só a caracterização dos seus princípios ativos e efeitos biológicos, mas também a compreensão de fenômenos patofisiológicos que muitas vezes são reproduzidos experimentalmente por essas substâncias. Dentre estas, nos países de clima tropical, os venenos ofídicos merecem importância particular pela riqueza de constituintes farmacologicamente ativos e pela freqüência dos acidentes causados por picada de serpentes venenosas, particularmente abundantes em países tropicais. No Brasil, esses acidentes adquirem relevância em termos de saúde pública porque podem causar graves alterações sistêmicas e no local da picada, sendo o gênero Bothrops responsável por 90% deles. Neste trabalho, as alterações patológicas locais e sistêmicas (mionecrose, edema e hemorragia) induzidas pela injeção intramuscular (i.m.) do veneno de Bothrops moojeni (40 µg/mL, 0,1 ml/100 g do peso do animal) em camundogos foram estudadas histologicamente, através da contagem de capilares e pela imunomarcação do fator de crescimento endotelial de vasos (VEGF) no músculo gastrocnêmio e pelas alterações nos níveis séricos das enzimas creatino kinase (CK), fosfatase ácida (AcPase), fosfatase alcalina (AlkPase), desidrogenase lática (LDH), transaminase oxalo-acética (AST) e da proteína mioglobina ao longo de 3, 12, 24 horas, 3, 7 e 21 dias (n = 5/período) após o envenenamento. Os efeitos de protocolos de irradiação por lasers de baixa potência, HeNe (632,8 nm) e o diodo AsGa (904 nm), ambos com densidade de energia de 4 J/cm², sobre esses parâmetros foram avaliados. A primeira sessão de irradiação foi administrada logo após a injeção i.m. do veneno e depois a cada 24 h, de forma que o número de irradiações feito foi uma, uma, duas, 4, 8 e 22, respectivamente, incididas perpendicularmente no local da injeção por 120 s (HeNe) e 18,3 s (GaAs) de duração de cada sessão. Para as dosagens de LDH, AST e mioglobina o tempo zero, sem irradiação foi acrescentado. Os resultados foram comparados com animais controles, injetados com solução salina estéril (0,9%). Morfologicamente, o veneno produziu imediata série de alterações, a qualidade das quais mostrou-se semelhante das 3 às 24 h (pós-injeção) p.i., porém com aumento do número de células mionecróticas e de infiltrado inflamatório. A fase regenerativa iniciada 3 d p.i., mostrou crescente número de fibras em regeneração, decrescente número de fibras degeneradas e substituição de polimorfos nuclerares por população de macrófagos. Histologicamente, a irradiação pelo HeNe atenuou as alterações iniciais (3 h), porém a do AsGa foi mais efetiva em longo prazo (21 d), induzindo ao maior número de miotubos e à melhor citoarquitetura do tecido. A contagem do número de vasos sangüíneos no local e vizinhanças da lesão, mostrou que o grupo tratado com veneno e não irradiado com laser de baixa energia teve diminuição do número médio de capilares na área afetada, e que a irradiação laser acelerou a neovascularização, sendo o HeNe mais eficaz do que o AsGa. Os resultados também mostraram que o VEGF e seus receptores foram expressos em parte dos neutrófilos, em esparsas células satélites nos períodos iniciais do envenenamento (3 ¿ 24 h), nos capilares das áreas periféricas à lesão, e nos interstícios de fibras em degeneração. A irradiação com HeNe induziu o aparecimento desse marcador nos polimorfonucleares, mas o AsGa aboliu a positividade a eles. O HeNe promoveu a expressão de VEGF nos capilares dos tendões e nas células musculares intactas. Aos 7 d p.i., na região das fibras regenerativas a irradiação com HeNe levou ao aparecimento de positividade em células do interstício semelhantes a fibroblastos, além de marcação em células ¿satélites¿ de miotubos em formação. A irradiação por ambos os lasers induziu também o aparecimento de VEGF positivo nos fibroblastos do tendão que atravessava o músculo, nas camadas média e adventícia de pequenas artérias e veias e nos fusos neuromusculares, além do interstício dos ramos nervosos intramusculares, principalmente nos períodos de 7 e 21 dias. Os resultados da análise das enzimas mostraram que a irradiação pelo laser HeNe reduziu marcadamente a atividade de CK de 3 h até 7 dias, enquanto o laser AsGa de 12 h até 21 dias p.i. A atividade da AcPase aumentou dramaticamente às 12 h p.i., após o que houve um declínio que foi mais acentuado com o laser AsGa. A irradiação com o laser HeNe induziu aumento gradual da atividade de AlkPase até 24 h e então diminuiu-a, ao passo que o laser AsGa causou um extraordinário aumento entre 12 h e 24 h, mantendo diferença signifitiva em relação ao grupo veneno de camundongos não irradiados. A irradiação com HeNe não foi eficaz em diminuir os níveis de LDH, ao invés foi prejudicial elevando os seus níveis em diferentes momentos. Já a irradiação com AsGa foi eficaz em diminuir significativamente os níveis da enzima ao longo de todos os períodos observados. Com relação a AST, a irradiação com HeNe foi eficaz em diminuir os níveis da enzima apenas às 3 h p.i., após o que teve efeitos deletérios. Por outro lado, a irradiação com AsGa não foi eficaz em diminuir os níveis de AST, exceto aos 7 dias, quando houve redução significativa de16,6%. Os níveis elevados de mioglobina sérica causados pelo veneno de B. moojeni, foram diminuídos significativamente com o laser AsGa das 12 h p.i. até os 7 d, ao passo que o HeNe só mostrou eficácia dos 3 aos 7 d p.i. O grupo de camundongos injetados com solução salina não mostrou nenhuma diferença significante em todos os tempos analisados para esses parâmetros. Concluímos que a terapia laser de baixa energia, arsenieto de Gálio aplicada localmente é capaz de alterar o conteúdo sérico de biomarcadores de dano da fibra muscular (CK e mioglobina), como também de marcadores de alterações sistêmicas, como o laser HeNe foi eficaz para aumentar a quantidade de vasos sanguíneos no tecido lesado. A fotoestimulação promovida pela irradiação com laser de baixa energia pode alterar favoravelmente indicadores de alterações locais e sistêmicas causadas por envenenamento por Bothrops moojeni, apontando esse recurso como promissor na recuperação do músculo afetado e nos distúrbios sistêmicos advindos / Abstract: The study of natural substances aims not only characterization of its active principles and biological effects, but also the comprehension of pathophysiologic phenomena that frequently are reproduced experimentally by these substances. Among these substances, snake venoms deserve special importance for the richness of pharmacologically active components and the frequency of accidents caused by venomous snake bites, particularly abundant in tropical countries. In Brazil these accidents acquires relevance in terms of public health because they may cause severe systemic and local alterations, being the Bothrops genus responsible for 90% of them. In this work, the pathologic local and systemic alterations induced by the intramuscular (i.m.) injection of Bothrops moojeni venom (40 µg/mL, 0.1 ml/100 g of animal weight) in mice were studied histologically, by capillary counting, immunolabeling of the vascular endothelial growth factor (VEGF) in the gatrocnemius and by the changes of creatinekinase (CK), acid phosphatase (AcPase), alkaline phosphatase (AlkPase), lactic acid desidrogenase (LDH), transaminase oxaloacética (TGO) and mioglobin serum levels at 3, 12, 24 hours, 3, 7 and 21 days (n = 5/period) after envenoming. The effects of protocols of irradiation using low potency lasers, HeNe (632.8 nm) and GaAs diode (904 nm), both with a energy density of 4 J/cm-2, on these parameters were evaluated. The first section of irradiation was administered soon after the i.m. injection of venom and then at each 24 h interval, in such a way that the number of irradiations done were one, one, two, 4, 8 and 22, respectively, applied perpendicularly right at the injection site during 120 s (HeNe) and 18.3 s (GaAs) duration for each session. For determination of LDH, TGO and mioglobin, a zero time without irradiation was added. The results were compared with control animals, injected with sterile saline (0.9%). Morphologically, the venom produced a immediate series of changes, the quality of which were similar from 3 to 24 h p.i., but with a progressive number of myonecrotic fibers and inflammatory infiltrate. The regenerative phase starting at day 3, showed a crescent number of regenerating and decreasing number of degenerated fibers with polymorphonuclear cells being replaced by macrophages. Histolgically, HeNe irradiation attenuated the first stages of degeneration (3 h), but GaAs¿s was more effective considering the whole period of observations (21 d), leading to the presence of higher number of miotubes and better cytoarchitecture of the tissue. The counting of capillaries at the site and periphery of lesion showed that the venom-injected unirradiated mice had a decrease in the average number of capillaries, and that laser irradiation accelerated the neovascularization, being HeNe more efficient than GaAs. The results also showed that VEGF and its receptors were expressed in a parcel of neutrophils, in sparce satellite cells in the initial periods of the envenoming (3 ¿ 24 h), in capillaries of the periphery of lesion and in the middle of the degenerating fibers. The irradiation with HeNe induced enhancement of VEGF expression in the neutrophils, but the GaAs abolished it. HeNe also promoted VEGF expression in the tendon capillaries and intact skeletal muscles. At 7 d p.i., VEGFlabeled fibroblast-like cells were seen in the regenerative region, as well as ¿satellite¿-like cells around developing miotubes after irradiation with HeNe. The irradiation by both lasers also induced VEGF positivity in tenocytes, in smooth muscle cells of blood vessels, in adventitia layer, in neuromuscular spindle and in the interstices of intramuscular nerves in the periods from 7 to 21 days p.i.. The results from serum enzymes showed that HeNe irradiation reduced markedly CK activity from 3 h to 7 days, whereas GaAs reduced it from 12 h to 21 days p.i.. AcPase activity increased dramatically at 12 h p.i. after which there was decline, which was more accentuated with laser GaAs. HeNe irradiation induced a gradual increase of AlkPase activity until 24 h p.i., followed by decrease, whereas GaAs caused an extraordinary increase between 12-24 h, maintaining a significant difference in comparison to the venom unirradiated mice. The irradiation with HeNe was not efficient in decrease the LDH levels; on the contrary, it was deleterious, elevating their levels. Conversely, the irradiation with GaAs was efficient in decrease significantly the enzyme levels during all observed periods. In regard to TGO, the irradiation with HeNe was efficient in diminishing the enzyme levels in the initial 3 h p.i., after which it was deleterious. On the other hand, irradiation with GaAs was not effective in minimizing AST serum levels, except at day 7 when there was a significant 16.6% reduction. The high mioglobin serum levels induced by B. moojen venom, significantly declined with GaAs from 12 h to 7 d p.i., while HeNe irradiation showed efficacy between 3-7 days p.i. The group of mice injected (I.m.) with sterile saline did not show any significant difference in all periods analyzed for these parameters. We conclude that therapy with low potency laser applied locally is capable of alter the serum content of muscle damage biomarkers (CK and myoglobin), as well markers of systemic alterations. The photostimulation promoted by low energy laser irradiation can alter favorably markers of local and systemic alterations caused by Bothrops moojeni snake envenoming, suggesting this approach as a promising resource for recovery of affected muscle as well as in the resulting systemic disturbances. Key-words: B. moojeni, CK, seric enzymes, morphometry, VEGF, laser irradiation / Doutorado / Histologia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Há muito tempo os venenos de abelhas se tornaram objeto de interesse de muitos cientistas, principalmente os venenos daquelas linhagens do gênero Apis, chamadas abelhas europeias e as conhecidas abelhas africanizadas. O foco no desenvolvimento de terapias eficazes que pudessem prevenir ou frear as reações desencadeadas pelas toxinas dos venenos desses insetos foi o principal estimulador do surgimento dessa grande área da pesquisa, uma vez que esses animais causam um grande número de acidentes em animais e seres humanos e os acidentes podem desencadear graves consequências, inclusive óbito. Sendo assim, desenvolvemos o presente trabalho baseado na caracterização da composição proteica dos venenos de abelhas europeias e africanizadas, na análise quantitativa diferencial entre os venenos e, na investigação de fosforilações e a possível relação das mesmas com as funções biológicas. Reunindo todos os elementos que estavam ao nosso alcance para compor o melhor conjunto de etapas para a realização do estudo proteômico de venenos de abelhas, nós atingimos todos os objetivos propostos. Utilizando uma abordagem baseada em espectrometria de massas, consistindo de análise shotgun seguida de LC-MS/MS realizada em um dos mais modernos espectrômetros de massas, nós fomos capazes de obter resultados extremamente confiáveis e interessantes. Comparando-se o efeito da extensão do gradiente de separação na cromatografia líquida, nós fomos capazes de atingir uma maior cobertura da amostra, uma vez que identificamos um maior número de proteínas após a utilização do gradiente mais longo. A identificação de fosforilações foi favorecida pela combinação de fragmentação por \"Colisão Induzida por Dissociação\" e medidas de massa de alta acurácia realizadas no instrumento LTQ-Orbitrap-Velos. Enquanto apenas 29 proteínas foram identificadas após 120 minutos de separação cromatográfica, um total de 51 proteínas foram identificadas aplicando-se gradiente mais longo. Dentre as 51 proteínas totais, 42 são comuns aos venenos das três abelhas. A comparação em pares mostrou que os venenos das abelhas europeias compartilham 44 proteínas e os venenos das abelhas africanizadas compartilham 43 proteínas tanto com o veneno de A. m. carnica quanto com o de A. m. ligustica. Além disso, nós revelamos que existem diferenças quantitativas entre algumas das proteínas dos venenos, sendo muitas dessas proteínas diferenciais toxinas com funções conhecidamente relevantes. A investigação de fosforilação mostrou que duas toxinas apresentam-se na forma fosforilada: melitina e icarapina. Melitina é considerada a principal toxina de venenos de abelhas, sendo bem conhecida por sua ação altamente tóxica e alergenicidade. Este peptídeo foi identificado com fosforilação ocorrendo no sítio Ser18 em todas as amostras de venenos, enquanto somente no veneno da abelha africanizada foi também identificado com sítio de fosforilação no resíduo de Thr10. Icarapina, também já descrita como um alérgeno do veneno, apresentou sítio de fosforilação no resíduo Ser205. Por fim, nós demonstramos o efeito da fosforilação presente em melitina (Ser18) realizando ensaios de atividade biológica do peptídeo fosforilado e nativo, como: hemólise, lise celular e desgranulação de mastócitos e atividade quimiotáctica. Foi observado que a toxicidade do peptídeo fosforilado é reduzida em comparação ao do peptídeo nativo. Sendo assim, nós podemos concluir que a combinação de metodologias eficientes e a utilização de moderna instrumentação nos levou a resultados surpreendentes, os quais se somam a todo o conhecimento já existente acerca de venenos de abelhas / Honeybee venom toxins disturb the activity of critical cellular processes, triggering immunological, physiological, and neurological responses within victims. Studies on venom toxins have provided invaluable knowledge towards elucidating the molecular and functional details of their biological targets, yet there has been no report of a full proteome/phosphoproteome profile of honeybee venom. In this study, we focused on Apis mellifera honeybee venom characterization, including proteins identification, label-free quantitative analysis and phosphorylation identification. Making use of a MS-based proteomic approach, consisting on in-solution digestion followed by LC-MS/MS analysis, we were able to compare the effect of the liquid chromatography gradient length on the sample coverage, consequently, to identify a higher number of proteins using longer separation gradient of the tryptic peptides. Favorable identification of phosphorylations was achieved by the application of a long separation gradient combined with CID fragmentation and high accuracy mass measurement using an LTQ Orbitrap Velos. Here we report on the comparative shotgun proteomics study of the venoms of two Apis mellifera subspecies, A. m. carnica and A. m. ligustica, and the hybrid known as Africanized honey bee (AHB). We identified 51 proteins in total, with 42 of them being common among the three venoms, including many previously unidentified entries. Performing label-free quantification, we observed that few proteins were found with different relative amounts. Additionally, we revealed the phosphorylation of two proteins in all the samples, with two of them being HBV toxins/allergens: melittin and icarapin. Icarapin was identified as phosphorylated at 205Ser. Melittin was identified as phosphorylated at the 18Ser and 10Thr positions in all venoms, as well. Given these novel findings, we then chose to compare the toxicity of the phosphorylated/unphosphorylated forms of the major venom toxin, melittin, considering the most prominent phosphorylation event, the phosphorylated 18Ser position. We showed that the toxicity is in fact decreased when the peptide is phosphorylated. Based on a combination of efficient methodology and state-of-the-art instrumentation, delineated by our Shotgun-NanoESI-Long Gradient-LTQ Orbitrap Velos analysis, we achieved proteomic coverage far surpassing any previous report. Together, these discoveries pave the way for future phosphovenomic studies

Mudanças ontogenéticas na dieta e na composição do veneno são características freqüentemente observadas em espécies do gênero Bothrops. A serpente Bothrops insularis é endêmica da Ilha da Queimada Grande, litoral Sul de São Paulo, cuja separação do continente ocorreu há aproximadamente 11 000 anos, após a última glaciação ao final do Pleistoceno. Não existem mamíferos na ilha e esta espécie alimenta-se, na fase juvenil, de animais ectotérmicos (artrópodes e anfíbios) e de endotérmicos (aves migratórias) na fase adulta. A população apresenta anormalidades sexuais evidenciadas por machos, fêmeas e intersexos (fêmeas que apresentam hemipênis rudimentares, porém não funcionais). Três filhotes de B. insularis (1 macho e 2 intersexos) nascidos em cativeiro, de uma fêmea intersexo, foram mantidos no Laboratório de Herpetologia do Instituto Butantan, seus venenos extraídos (idades de 10, 15, 20, 24,33 e 41 meses) e liofilizados para utilização em ensaios subseqüentes. Utilizou-se também o veneno da mãe da ninhada e um pool de venenos de exemplares adultos. A análise eletroforética (SDS-PAGE 7,5- 17,5%) evidenciou similaridades entre as amostras de venenos nas diferentes fases de vida dos animais. A análise densitométrica revelou um aumento pronunciado da expressão de uma banda protéica na faixa de massa molecular de 24kDa. O teor protéico dos venenos variou de 618 a 1189 &#61549;g de proteína por mg de veneno. Os resultados experimentais sugerem que fosfolipases A2 e hialuronidases não têm expressão pronunciada na fase adulta dos animais (41 meses). Os venenos foram capazes de hidrolisar as cadeias A&#61537; e B&#61538; do fibrinogênio e promover áreas de lise em placa de fibrina, independentemente da idade analisada. O progressivo aumento de intensidade da atividade hemorrágica e proteólise em zimografia sugere uma regulação da expressão de proteases, sobretudo de metaloproteases (uma característica importante, uma vez que esta espécie apresenta uma alteração ontogenética de dieta, alimentando-se de presas maiores quando os animais se tornam adultos). Por outro lado, a atividade proteolítica sobre a caseína não apresentou um aumento ontogenético significativo. Ensaios com inibidores de proteases, mostraram que EDTA e ortofenantrolina (10 mM) diminuíram expressivamente a atividade gelatinolítica em zimografia, reduziram a área de lise em placa de fibrina e inibiram a clivagem das cadeias A&#61537; e B&#61538;&#61472;do fibrinogênio. Os venenos dos animais jovens (15 meses) mostraram-se mais ativos nos ensaios de coagulação sanguínea (Dose Mínima Coagulante sobre o Plasma e ativação dos fatores X e II da cascata de coagulação sanguínea) em relação ao dos adultos (41 meses). Observou-se uma maior toxicidade dos venenos para abelhas e aves, contudo não foi possível estabelecer diretamente uma relação ontogenética. Para mamíferos (camundongos) os venenos do Intersexo 1 e do Macho (41 meses) apresentaram menores valores de DL50 em relação aos demais. A miotoxicidade das amostras dos venenos mostrou-se acentuada na fase inicial de vida dos animais (15 meses). Foram evidenciadas variações individuais ao longo das análises efetuadas neste trabalho, contudo a variabilidade ontogenética mostrou-se presente na maioria dos ensaios realizados. A seletividade do veneno para presas locais foi demonstrada pela eficácia do veneno para artrópodes e aves, em detrimento a mamíferos. Desta forma, conclui-se que o veneno possui peculiaridades na sua composição que favorecem a alimentação desta serpente em seu habitat insular e, embora haja uma marcante alteração de dieta durante a ontogênese desta espécie, a toxicidade do veneno para os itens alimentares locais é uma característica presente durante toda a vida dos animais. / Ontogenetic changes on diet and venom composition are a common feature among Bothrops species. Bothrops insularis is an endemic snake of Queimada Grande Island, South coast of são Paulo State, which mainland separation has ocurred for about 11 000 years ago, after the last glaciation, at late Pleistocene. There are no mammals on the Island and B .insularis feed on ectothermic preys when young (arthropods and amphibians) and endothermic (migratory birds) when becomes adult. Sexual abnormalities are often verified on B. insularis population with males, females and intersexes existence (females with non-functional rudimentary hemypenis). Three B. insularis siblings (1 male and 2 intersexes) borned on captivity, from an Intersex female, were kept in Herpetology Laboratory on Instituto Butantan. Venoms were extracted (10, 15, 20, 24, 33 and 41 months of animal’s age) and lyophilized for subsequent assays. Offspring’s mother venom and a pool of B. insularis adult venoms were also analyzed as a comparison parameter. Electrophoretic profiles (SDS-PAGE 7,5- 17,5%) showed similar patterns among samples at distinct animal’s ages. Densitometric analysis showed increase of expression of proteic band at 24 kDa of molecular mass range. Protein content varies of 618 up to 1189 &#61549;g of protein per mg of venom. Experimental results suggests that phosfolipases A2 and hyaluronidases do not have an increase on its expression on adult phase (41 months) of B .insularis. Venoms were able to hydrolyze A&#61537; and B&#61538; fibrinogen chains and to promote lysis on fibrin plate, regardless of animal’s age. The increase of haemorrhagic activity and proteolysis on zimography profiles, suggests a regulation of protease expression, mainly of metaloproteases (an important characteristic, since this species has an ontogenetic shift on its diet, feeding on larger preys when becomes adult). On the other hand, proteolytic activity upon casein did not show significative ontogenetic variability. Protease inhibithors assays showed that EDTA and orthophenantrolin (10 mM) expressively reduced gelatinolytic activity on zimography, fibrin plate lysis area, and were able to prevent A&#61537; and B&#61538;&#61472; fibrinogen chains cleavage. Venoms from young animals (15 months) had higher coagulant activity than adult ones (Minimum Coagulant Dose upon human Plasma and activation of blood coagulation cascade factors X and II). Venom toxicity was higher for bees (just-emerged Apis mellifera) and chicks (one day age Bovans white chicks), although a direct relation with ontogeny was not established. Intersex 1 and male venoms (41 months) showed the lower LD50 values for mammals (mice). Prominent myotoxicity was found for young venoms (15 months). Experimental results showed individual variability, and, mainly, a conspicuous ontogenetic variability. Venom selectivity towards local preys was demonstrated by the expressive toxicity upon arthropods and chicks, in comparison to mammals. Our results show that Bothrops insularis venom had peculiarities on its composition that support snake’s diet on its insular habitat and, although a clearly ontogenetic diet change occurs on this species, venom toxicity towards local preys is a characteristic present during all lifetime of this species.

Neste trabalho avaliamos se as Natterinas (NTR), proteínas majoritárias presentes no veneno do peixe peçonhento T. nattereri, são as responsáveis pela a ação inibitória do recrutamento de leucócitos durante a inflamação e os mecanismos moleculares envolvidos neste processo. Utilizando análises de microscopia intravital tratamos os animais com as NTR e 6 h depois induzimos o rolamento de leucócitos com KC, LPS ou agonista de PAR-4 sobre a microcirculação. Os dados mostraram que o tratamento com as NTR inibem o rolamento e a migração de leucócitos induzido pela KC e pelo LPS. Além disso, o efeito inibitório das NTR depende parcialmente da sua atividade proteásica e não está relacionado com a clivagem proteolítica da quimiocina KC ou com a indução de reguladores endógenos como IL-10, corticóides, a enzima HO-1 ou IL-1Ra. O efeito inibitório parece ser dependente da ativação da sinalização TLR/MyD88 e PI3K e das proteínas serina/treonina fosfatases, contribuindo de forma significativa na sobrevida de animais induzidos a endotoxemia por LPS. / In this work we evaluated whether Natterins (NTR) the majority proteins present in the venom of Thalassophryne nattereri venomous fish are responsible for the inhibitory action of leukocyte recruitment during inflammation and the molecular mechanisms involved in this process. Using intravital microscopy analysis we treated the animals with NTR and 6 h after we induced the leukocyte rolling by topical of KC, LPS or agonist of PAR-4 on the microcirculation. The data showed that treatment with NTR inhibited the leukocyte rolling and migration induced by LPS and KC. Moreover, the inhibitory effect of NTR depends partly on its proteinase activity and is not related to the proteolytic cleavage of the chemokine or KC nor with the induction of endogenous regulators such as IL-10, corticoids, the HO-1 or IL-1Ra. The inhibitory effect is dependent on the activation of PI3K and TLR/MyD88 signaling and protein serine/threonine phosphatases, contributing significantly to the survival of animals endotoxemia induced by LPS.

Orientadores: Sergio Marangoni, Luís Alberto Ponce Soto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T20:51:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RomeroVargas_FreyFrancisco_D.pdf: 4482249 bytes, checksum: 951ba98ea20426e2308c178f17a7680d (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Uma nova miotoxina fosfolipase A2 (BtTX-II) foi purificada a partir do veneno total de Bothriopsis taeniata através de dois passos cromatográficos, envolvendo inicialmente cromatografia de exclusão molecular, seguida de HPLC de fase reversa. BtTX-II foi caracterizada bioquimicamente através de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) mostrando uma única banda eletroforética com massa relativa (Mr) de 14000 Da, em condições não reduzidas e reduzidas (DTT 1M). A pureza e massa molecular foram confirmadas por espectrometria de massa (MALDI-Tof MS), a qual determinou uma massa molecular de 13889,98 Da. BtTX-II apresentou atividade catalítica de 12,075 ± 0,138 nmoles/mg/min em presença do substrato cromogênico específico ácido 4-nitro-3-(octanoyloxy) benzoico. Análise de composição de aminoácidos da PLA2 (BtTX-II) corroborou seu caráter básico. A análise dos peptídeos trípticos foi determinada por ESI-QTof-MS/MS espectrometria de massa e as regiões contendo peptídeos internos mostraram semelhança com outras PLA2s miotóxicas botrópicas cataliticamente ativas. BtTX-II, pertencente à classe PLA2 D49, exibiu atividade ótima a pH 8,0 e temperatura de 37 ºC. Na ausência de Ca2+ e na presença de alguns íons divalentes, tais como Mg2+, Mn2+, Zn2+ e Cd2+ (10mM), a atividade fosfolipásica foi significativamente diminuída. Também foi demonstrado o efeito inibitório de crotapotinas crotálicas sobre a atividade PLA2 da BtTX-II. O efeito neurotóxico da BtTX-II foi analisado através de estudos miográficos em preparações neuromusculares "ex vivo", mostrando que BtTX-II induz um leve bloqueio na junção neuromuscular em preparações Biventer cervicis de pintainho. Tais preparações foram utilizadas para o estudo morfológico quantitativo da BtTX-II, o que mostrou uma leve atividade miotóxica "in vitro" com a concentração de 50?g de BtTX-II. O efeito miotóxico também foi avaliado através de ensaios de liberação de creatina kinase plasmática e análise histopatológica do músculo gastrocnêmio de camundongo "in vivo", com estes últimos testes foram observandos maiores mudanças morfológicas quando comparadas aos estudos "in vitro", mostrando estar diretamente relacionada com a liberação de CK. BtTX-II induz miotoxicidade local após injeção intramuscular, mas não produz miotoxicidade sistêmica após injeções intravenosa. O efeito edematogênico foi estudado através do modelo coxim plantar de camundongo e mostrou ser elevado nas primeiras horas após injeções subcutâneas, em todas as concentrações aplicadas (1- 20 ?g). O efeito citotóxico "in vitro" foi caracterizado utilizando uma cultura celular da linhagem de mioblastos/miotubos de músculo esquelético de camundongo. BtTX-II não induz citotoxicidade em mioblastos; mas BtTX-II evidenciou atividade citotóxica em miotubos, em uma concentração padrão de 20 ?g. Nossos resultados sugerem que BtTX-II atua no processo de regeneração muscular em baixas concentrações (10 ?g) durante o período de 28 dias após as injeções intramusculares no gastrocnêmio de camundongo, demonstrando ser apropriado para a análise na regeneração muscular, pois induz necrose e não acarreta lesão do tecido vascular nem nervoso, o que é de suma importância para o processo de regeneração muscular. Isto foi possível pela presença de células satélite envolvidas neste processo junto com o infiltrado inflamatório notório em todos os períodos da regeneração / Abstract: A new miotoxin phospholipase A2 (BtTX-II) was purified from Bothriopsis taeniata crude venom through two steps cromatográficos, involving molecular exclusion chromatography, as first step, and followed by RP-HPLC. BtTX-II, was characterized biochemically through electrophoresis in polyacrylamide gel (SDS-PAGE) showing a single eletrophoretic band, in reduced and not reduced conditions, with relative mass (Mr) of 14000 Da. The purity and molecular mass was confirmed by mass spectrometry mass (Maldi-Tof SM), showed a molecular mass of 13889.98 Da. BtTX-II showed catalytic activity of 12.075 ± 0.138 nmoles/mg/min upon of the specific chromogenic substrate acid 4-nitro-3-(octanoyloxy) benzoic. Analysis of aminoacid composition of PLA2 (BtTX-II) corroborated its basic character. Tryptic peptide analyse were determined for ESI-QTof-MS/MS mass spectrometry and the regions containing internal peptides showed similarity with other miotoxic botropics PLA2s. BtTX-II belonging to the class PLA2 D49 exhibited an optimal activity in pH 8.0 and at 37 ºC. In the absence of Ca2+ and in presence of some divalent íons such Mg2+, Mn2+, Zn2+ and Cd2+ (10mM), the phospholipasic activity was significantly decreased. Also, it was demonstrated the inhibitory effect of crotalics crotapotins upon activity PLA2 of the BtTX-II. The neurotoxic effect of the BtTX-II was analized through myographic studies in neuromuscular preparations "ex vivo", showing that BtTX-II induce a light blockade at the neuromuscular junction on chicken Biventer cervicis preparations. Such preparations were used for quantitatives morphologic studies, were shown a light myotoxic activity "in vitro" at higher concentration. On the other hand, the myotoxic effect was evaluated through release of plasmatic creatine kinase "in vivo" and was carry out histophatologic analyzes mouse gastrocnemius muscle, with these last tests were observed larger morphologic changes when compared to studies "in vitro", showing directly related with the CK liberation. BtTX-II induces local miotoxicity after intramuscular injection, but it did not produce systemic miotoxicity after intravenous injections. The edematogenic effect was studied through the model mouse paw edema and showed to be high in the first hours after subcutaneous injections, in all applied concentrations (1-20 ?g). The cytotoxic effect "in vitro" was characterized using a cell culture of the rodent lineage of myoblasts/myotubes cells. BtTX-II did not induce citotoxicity in skeletal muscle myoblasts; however, BtTX-II showed cytotoxic activity in myotubes, both with a standard concentration of 20 ?g. Our results suggest that BtTX-II act in the process of muscular regeneration in low concentrations (10 ?g) during a period of 28 days after intramuscular injections in the mouse gastrocnemius muscle, This effect was to be appropriate for muscular regeneration analyzes because it induces necroses and it did not carry out lesion of the vascular nor nervous tissue, thus, it is of supreme importance for the process of muscular regeneration. Those results were possible by the presence of satellite cells involved in these processes together with notorious inflammatory infiltrate in every periods of the regeneration / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Estudos prévios demonstraram que as atividades biológicas do veneno da serpente Bothrops jararaca sofrem significantes modificações ontogenéticas. Neste estudo é apresentada uma análise comparativa do proteoma, peptidoma e transcriptoma da glândula de veneno de filhotes e adultos de B. jararaca, correlacionando os resultados obtidos com algumas características funcionais dos venenos. Venenos de 694 filhotes de até duas semanas de idade e 110 adultos, provenientes do Estado de São Paulo foram extraídos e liofilizados para as análises proteômicas/peptidômicas e funcionais. O mRNA de glândulas de veneno de 20 filhotes e 10 adultos foi obtido para a contrução de bibliotecas de cDNA e a análise de Expressed Sequence Tag (ESTs). Demonstramos que a atividade hemorrágica é similar para os venenos de filhotes e adultos, enquanto que o veneno de adultos é discretamente mais letal para camundongos; entretanto, o veneno de filhotes mostrou-se extremamente mais letal para aves, uma característica que pode garantir proteção contra potenciais predadores nas fases iniciais de vida da espécie. A atividade coagulante do veneno de filhotes é cerca de 10 vezes mais alta que aquela verificada para o veneno de adultos e é atribuída sobretudo à atividade de metaloproteinases. Essas diferenças nas atividades funcionais se refletiram nos diferentes perfis verificados por eletroforese bidimensional e identificação de spots de proteínas por digestão tripsínica in-gel seguida de análise por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem, zimografia com gelatina, imunocoloração utilizando anticorpos específicos anti-proteinases, e glicoproteínas com afinidade pela concanavalina -A. A comparação dos venenos por derivatização com tags isóbaros (iTRAQ) e a análise das ESTs revelaram diferenças claras entre os níveis de toxinas presentes nos venenos e as metaloproteinases foram a classe de toxinas mais expressa, além de serem as toxinas cujos perfis estruturais apresentaram maior mudança, como ilustrado pelo quociente PIII/PI, que é maior nos venenos de filhotes. Dimorfismo sexual foi detectado em diversas classes de toxinas no veneno de adultos por análises proteômicas e transcriptômicas e, surpreendentemente, o fator de crescimento de nervo foi detectado apenas no veneno/glândula de veneno de machos. A análise glicoproteômica mostrou que N-glicosilações parecem ser as modificações pós-traducionais mais proeminentes nas toxinas de B. jararaca, e os perfis de N-glicosilação apresentaram-se distintos para as proteínas dos venenos de filhotes e adultos. Entretanto, a composição de N-glicanos não variou entre as amostras, indicando que diferenças na utilização de motivos de N-glicosilação poderiam explicar as diferenças nos níveis de glicosilação observados pelos diferentes perfis eletroforéticos dos venenos. A análise da fração peptídica dos venenos de filhotes e adultos por espectrometria de massas resultou num perfil similar de Peptídeos Potenciadores de Bradicinina (BPPs), que foram detectados em suas formas canônicas e também com novas seqüências, cujas estruturas primárias sugerem um processamento da proteína precursora em sítios até então não descritos. Acreditamos que este seja o estudo mais abrangente sobre a variabilidade do veneno de uma serpente já realizado e os resultados demonstram que há uma relação clara entre as alterações ontogenéticas na dieta e tamanho corporal e o proteoma/peptidoma do veneno desta espécie. / Previous studies have demonstrated that the biological activities displayed by the venom of the snake Bothrops jararaca undergo a significant ontogenetic shift. In this investigation, we performed comparative proteomic, peptidomic and transcriptomic analyses of venoms and venom glands from newborn and adult specimens of B. jararaca and correlated the results with the evaluation of functional venom features. Venoms from 694 two-week old newborns and 110 adults from São Paulo state were milked and lyophilized for functional and proteomic/peptidomic analyses. Additionally, mRNA was obtained from the venom glands of 20 newborns and 10 adults and used for the construction of cDNA libraries and Expressed Sequence Tag (ESTs). We demonstrate that newborn and adult venoms have similar hemorrhagic activities, while the adult venom has a slightly higher lethal activity upon mice; however, the newborn venom is extremely more potent to kill chicks, a feature that might ensure protection against potential predators in early stages of B. jararaca life. Interestingly, the coagulant activity of the newborn venom upon human plasma is ten times higher than that of the adult venom and is contributed mainly by metalloproteinases. Differences in functional activities were clearly reflected in the venom different profiles of two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE) and protein spot identification by in-gel trypsin digestion followed by liquid chromatography and tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), gelatin zimography, immunostaining using specific anti-proteinase antibodies, and concanavalin A-binding proteins. The venom comparison by isobaric tag peptide labeling (iTRAQ) and ESTs analysis revealed clear differences in toxin levels. The metalloproteinases were detected as the toxin class most expressed in the venoms in addition to being the toxins whose structural profile most changed, as illustrated by the ratio P-III/P-I class being higher in newborn venoms. Sexual dimorphism has been detected in various adult venom toxin classes by proteomic and transcriptomic analyses and, interestingly, the nerve growth factor was detected only in the male venom gland/venom. The glycoproteomic analysis showed that N-glycosylation seems to be the most prominent post-translational modification in B. jararaca toxins and the N-glycosylation profiles differed for newborn and adult venom toxins. Nevertheless, the N-glycan composition between the samples did not vary indicating that differences in the utilization of the N-glycosylation motif could be the explanation for the differences in the glycosylation levels indicated by the differential electrophoretic profiles of venom proteins. The analysis of the peptide fraction of newborn and adult venoms by mass spectrometry revealed a similar profile of Bradykinin Potentiating peptides (BPPs), however these were detected in the venoms showing their canonical sequences and also novel sequences corresponding to BPPs processed from their precursor protein at sites so far not described. To the best of our knowledge, this is the most comprehensive study on a snake venom variation and the results clearly demonstrate a relationship between the ontogenetic shift in diet and animal size, and the venom proteome/peptidome in B. jararaca species