FREITAS, Carlos Iberê Alves. Estudo sobre a atividade antimicrobiana de substâncias extraídas e purificadas de secreções da pele de anfíbios. 2003. 180 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2003. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-05-25T12:10:48Z No. of bitstreams: 1 2003_tese_ciafreitas.pdf: 2906725 bytes, checksum: f4ff474e79b3031ede3b89ce587206e5 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-05-30T14:16:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2003_tese_ciafreitas.pdf: 2906725 bytes, checksum: f4ff474e79b3031ede3b89ce587206e5 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-30T14:16:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2003_tese_ciafreitas.pdf: 2906725 bytes, checksum: f4ff474e79b3031ede3b89ce587206e5 (MD5) Previous issue date: 2003 / A emergência de mocroorganismos resistente a multidrogas, tais como Staphylococcus aureus as resistentes a meticilina, Enterococcus resistente a vancomicina, e Mycobacterium tuberculosis resistente a drogas, tem incitado esforçospara desenvolver e pesquisar novas classes de antibióticos que possam ter utilidade clínica. Nos últimos anos, uma variedade de antibióticos de baixo peso molecular têm sido isolados de diversas espécies animais. Estes agentes incluem peptídeos, lipídios, e alcalóides, exibem atividade antibiótica contra micróbios do meio ambiente e considera-se que desempenhem um papel na imunidade inata. Compostos com largo espectro de atividade antimicrobiana que são sintetizados pelas glândulas granulares presentes na pele de anuras (rãs e sapos) têm recebido uma crescente atenção como agentes terapêuticos em potencial. Nós relatamos aqui a descoberta de um antibiótico esteroidal de atividade de largo espectro, bufadienolídeos, chamados hellebrigenin, telocinobufagin, marinobufagin e bufalin de Bufo schneideri, um sapo Brasileiro, com atividade inibitória diferenciada contra sete microorganismos e nenhuma atividade contra Pseudomonas aeruginosa. A secreção da pele do sapo foi obtida porcompressão manual das glândulas paracnemis e tibial. Tr~e peptídeos com estruta possivelmente relacionada com uma potente atividade inibitória para bactéria gram positiva, Staphylococcus aureus e uma potente proteína com forte atividade antimicrobiana contra Pseudomonas aeruginosa (MIC = 9,64 microg/ml) foi isolada com secreções da pele de Leptodactylus pentadactylus estimuladas por adrenalina obtidas por injeção subcutânea de 500 micro l (100 microg/ml) e caracterizada. Os bufadienolídeos foram obtidos com separação em CLAE de fase reversa sendo executado utilizando-se uma coluna C-18 (15 micro m, 100 Ao, Shim-pack PREP 250 mm x 25 mm) com um gradiente de 0-40 % de acetonitrila/água e 0,05 % de ácido trifluoroacético. Análise de NMR de alta resolução das amostras purificadas por aplicação de seqüência de pulsos modernos tais como 1H, 1H-COSY e NOESY, e determinação da correlação heteronuclear dos carbono-hidrogênio ligados diretamente 1H, 13C-COSY (HETCOR) e via detecção do hidrogênio inversa (HMQC), bem como o seqüenciamento a longa distância, COLOC e HMBC, permitindo assim sua identificação como um esteróide do tipo bufodienolídeo. A proteína de L. pentadactylus foi purificada por cromatografia em Sephacryl S-400 (460 mm x 6 mm) eluída com um tampão (Tris – HCl 0,05 N) e sua pureza foi avaliada poreletroforese em condições desnayurantes e não desnaturantes.A proteína total foi determinada pelo método de Bradford usando albumina soro bovina como padrão. O isolamento dos peptídeos foi efetuado usando-se o exsudato liofilizado e redissolvendo em água bidestilada/TFA 0,05 % (20:1; P:V) e corrido numa coluna C18 de fase reversa em CLAE (15 micro m, 100 Ao, Shim-pack PREP 250 mm x 25 mm) eluída com um gradiente linear de 5 - 80% em 103 min num fluxo de 5 ml/min com acetonitrila/água e ácido trifluoroacético 0.05 %. A atividade antimicrobiana de todas as amostras foi monitorada pelos métodos de Bauer – Kirby e placa de microdiluição padrãousando Escherichia coli ATCC 25922, Enterobacter aerogenes ATCC 1304, Klebsiella pneumoniae ATCC 10031, Salmonella choleraesus choleraesus var typhi ATCC 6534, Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6538 P e Pseudomonas aeruginosa HUWC 1. No primeiro método, cada placa com agar Müeller –Hinton após promover incubação por 24 h a 35 °C. As zonas claras na superfície do agar foram tomadas como indicativoda atividade antibacteriana. O diâmetro destas foram mensuradas e a atividade foi expressa em área das zonas claras (mm2). As incubações com os microorganismos foram feitas em caldo de B.H.I. por diferentes tempos até 24 h a 35°C e estimada a influência da desnaturação na atividade das amostras protéicas. Após incubação, na absorbância de 492 nm cada poço foi determinado usando-se um Detector Shimadzu UV – VS modelo SPD - 10A VP. A mínima concentração inibitória (MICs) se possível foi determinada pelo método da microdiluição padrão. Todos os procedimentos foram executados de acordo com os manuais de instrução do Comitê National de Padronização para Laboratórios Clínicos (Wayne, PA, USA). A hemólise induzida por amostras foi determinada por incubação de uma suspensão 5% (v/v) de hemácias humanas dos tipos antigênicos A e O, rato e caprinos em tampão fosfato - salina com quantidades apropriadas das amostras a 37 ºC até 24 h. O sobrenadante foi mensurado em densidade optical a 541 nm. Esta foi comparada a uma suspensão tratada com detergente a 0,1 % com agitação enérgica e definido o % de hemólise. Todos os compostos manifestaram moderado ou nenhuma atividade hemolítica. A proteína de L. pentadactylus apresentou uma concentração hemolítica mínima de 2,09 x 10-4, 1,34x10-2, 1,07x10-1 e 1,34x10-2 microgramas para rato, caprino, tipos antigênicos humanos A e O humanos respectivamente. Sob refrigeração estes valores decrescem. Para analisar interrelação entre a assimetria e mecanismos, estimativa de parâmetros cinéticos foram obtidos pelos modelos matemáticos de equações de Gompertz e regressão não linear, ANOVA e teste de comparação múltipla de Tukey.

MARTINS, René Duarte. Efeitos renais e vasculares do extrato bruto da anêmona marinha Bunodosoma caissarum e sua fração fosfolipase A2 : estudo dos mediadores envolvidos. 2008. 242 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2008. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-10-01T13:36:35Z No. of bitstreams: 1 2008_tese_rdmartins.pdf: 2488941 bytes, checksum: 48aedf1ec35acc89a4e97decf2688bd1 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-10-01T16:28:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_tese_rdmartins.pdf: 2488941 bytes, checksum: 48aedf1ec35acc89a4e97decf2688bd1 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-01T16:28:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_tese_rdmartins.pdf: 2488941 bytes, checksum: 48aedf1ec35acc89a4e97decf2688bd1 (MD5) Previous issue date: 2008 / Sea anemones contain a variety of biological active compounds including some potent toxins. For this reason, many investigators have focused their studies in these proteins, isolated from sea anemones, such as Bunodosoma caissarum. The aim of this work was to study the mechanism of functional alterations produced by the crude extract and the PLA2 fraction of B. caissarum in the isolated rat kidney and arteriolar mesenteric bed. Isolated kidneys from Wistar rats, weighing 250-300g, were perfused with Krebs-Henseileit solution containing 6% of bovine serum albumin for 120 min. B. caissarum crude extract (BcE) and PLA2 were added to the system 30 min after the beginning of each experiment (internal control) and Tezosentan (TZN) and Indomethacin (IND) were administered in the initial period of each experiment (T=0min). The mesenteric bed, kept warmed at 37°C, was perfused with Krebs solution at a constant flow, (4mL/min) but with a variable perfusion pressure, measured for 80 min. mRNA expression of TNF-α, IL-1β, rennin and adenosine receptors (A1, A2a, A2b and A3) was evaluated by PCR using 18S mRNA as reference gene. The data were analyzed by Student’s t-test (p<0.05). BcE altered kidney function increasing perfusion pressure (PP), renal vascular resistance (RVR), urinary flow (UF), glomerular filtration rate (GFR) and sodium, potassium and chloride excretion, especially with the intermediary concentração. Tezosentan inhibited these effects only partially. However, indomethacin presented a blockage more expressive that TZN. The PLA2 of B. caissarum showed a higher increase of PP at 60 minutes (Control= 104,17±3,72; PLA2(0,1) = 130,9±5,6*; PLA2(0,3) = 165,1±12,6*; PLA2(1,0) = 142,3±9,6*, *p<0,5) and increased RVR, UF, GFR, sodium, potassium and chloride excretion and urinary osmolarity, with descrease of Na+, K+ and Cl- distal transports.. The blockage of IND was more expressive on the smallest PLA2 concentração and TZN showed a modest effect, blocking more efficiently the intermediary concentração. Neither BcE, nor PLA2 altered the basal perfusion pressure of the isolated arteriolar mesenteric bed. PLA2 increased the gene expression of TNF-α (Control = 1,00 ± 0,00 vs. PLA2 = 1,116 ± 0,033*, com p<0,0001)and upnregulated the expression of adenosine receptors A2a (Control = 1,0 ± 0,01 vs. PLA2 = 1,238 ± 0,043*, com p<0,0001). These results suggest that BcE and PLA2 exert significative actions in the isolated perfusion kidney, without vascular effects in the arteriolar mesenteric bed. COX-2 and endothelin appear to be important mediators of the effects of BcE and PLA2. In addition, adenosine is also involved in the mechanism of action of B. caissarum. / Anêmonas marinhas contêm uma variedade de compostos biologicamente ativos incluindo potentes toxinas. Por esta razão, muitos investigadores têm centrado seus estudos nestas proteínas, isoladas de anêmonas marinhas, como Bunodosoma caissarum. O objetivo deste trabalho foi estudar o mecanismo das alterações funcionais produzidas pelo extrato bruto e da fração PLA2 de B. caissarum em rim isolado de rato e leito vascular mesentérico. Rins isolados de ratos Wistar, pesando 250-300g, foram perfundidos durante 120 min com solução de Krebs-Henseileit contendo 6% de albumina bovina. O extrato bruto de B. caissarum (BcE) e PLA2 foram adicionados ao sistema, em diferentes concentrações, 30 minutos após o início de cada experimento (controle interno) e Tezosentan (TZN) e Indometacina (IND) foram administrados no período inicial de cada experimento (T = 0 min). O leito vascular mesentérico, mantido aquecido a 37 ° C, foi perfundido com solução de Krebs em um fluxo constante (4mL/min) e a pressão medida por 80 min. A expressão de mRNA TNF-α, IL-1 β, renina e receptores de adenosina (A1, A2a, A2b e A3) foi avaliada por PCR utilizando como referência o mRNA do gene 18S. Os dados foram analisados por teste t de Student (p <0,05). BcE alterou a função renal elevando a pressão de perfusão (PP), a resistência vascular renal (RVR), fluxo urinário (UF), taxa de filtração glomerular (TFG) e excreção de sódio, de potássio e cloreto, especialmente com a concentração intermediária. Tezosentan inibiu estes efeitos apenas parcialmente. No entanto, indometacina apresentou um bloqueio mais expressivo que TZN. A PLA2 de B. caissarum elevou a pressão de perfusão (PP) já aos 60 minutos (controle = 104,17 ± 3,72; PLA2 (0,1) = 130,9 ± 5,6 *; PLA2 (0,3) = 165,1 ± 12,6 *; PLA2 (1,0) = 142,3 ± 9,6 *, *p <0,5), revelando também elevações de RVR , UF, TFG, excreção de eletrólitos e osmolaridade urinária, com diminuição dos transportes distais de Na+, K+ e Cl-. O bloqueio com IND foi mais expressivo sobre a menor concentração de PLA2, enquanto TZN mostrou um efeito discreto. BcE e PLA2 não alteraram a pressão de perfusão basal do leito vascular mesentérico. PLA2 aumentou a expressão relativa de TNFα (C = 1,00 ± 0,00 vs. PLA2 = 1,116 ± 0,033*, com p<0,0001) e do receptor de adenosina A2a (C = 1,0 ± 0,01 vs. PLA2 = 1,238 ± 0,043*, com p<0,0001).Estes resultados sugerem que BcE e PLA2 exercem ações significativas na perfusão de rim isolado, sem efeitos vasculares diretos no leito mesentérico. COX-2 e endotelina parecem ser importantes mediadores dos efeitos da BcE e PLA2. Além disso, adenosina também parece estar envolvida no mecanismo de ação da PLA2 de Bunodosoma caissarum.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2012. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-06-27T10:47:04Z No. of bitstreams: 1 2012_JimmyAlexanderGuerreroVargas.pdf: 12143766 bytes, checksum: 4d41b23c8e319089c94ffd4a35e9f009 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-06-27T10:47:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_JimmyAlexanderGuerreroVargas.pdf: 12143766 bytes, checksum: 4d41b23c8e319089c94ffd4a35e9f009 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-27T10:47:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_JimmyAlexanderGuerreroVargas.pdf: 12143766 bytes, checksum: 4d41b23c8e319089c94ffd4a35e9f009 (MD5) / Tityus pachyurus é uma das espécies causadoras de escorpionismo grave na Colômbia e pouco se conhece sobre as toxinas que constituem sua peçonha. O presente projeto teve como objetivo principal identificar novas toxinas moduladoras de canais para Na+ na peçonha de T. pachyurus. Pela construção da biblioteca de cDNA da glândula peçonhenta de um escorpião T. pachyurus se identificarem 5 novas toxinas putativas da família dos peptídeos com atividade em canais para Na+ e por similaridade na estrutura primária dos peptídeos maduros, 3 foram classificados como alfa-NaScTxs - Tpa4, Tpa5 e Tpa6 - e dois como beta- NaScTxs - Tpa7 e Tpa8 -, sendo que a toxina Tpa8 é o primeiro registro de uma beta toxina anti-inseto excitatória na peçonha de escorpiões do Novo Mundo. Essas NaScTxs foram usadas na construção de uma árvore filogenética incluindo NaScTxs do escorpião T. obscurus e de outras identificadas em escorpiões do gênero Tityus e depositadas nos bancos de dados públicos de proteínas. A análise filogenética coincide com a distribuição geográfica dos escorpiões do gênero Tityus divididos nas espécies que ocorrem ao norte do rio Amazonas e naquelas que habitam ao sul do rio Amazonas. A peçonha bruta de T. pachyurus, submetida a fracionamento por RPHPLC usando uma coluna C18, resultou em 55 frações cromatográficas. As três frações mais abundantes foram submetidas a recromatografias e os peptídeos puros obtidos foram seqüenciados por espectrometria de massa (MS). Três seqüências parciais que correspondem a três novas NaScTxs foram obtidas: Tpa9 com 7061,87 Da, Tpa10 com 6994,36 Da e Tpa11 com 7167,23 Da. Essas novas toxinas (500 nM) foram testadas em canais de sódio expressos em células HEK. Tpa9 reduziu em 20% as correntes de Na" em hNavU, como as (3NaScTx.Tpa10 apresentou efeito em hNav1.1, hNav1.2, hNav1.3 e hNav1.6 como as aNaScTx e a Tpa11 em hNav1.2, hNav1.3 e hNav1.6. A Tpa2, uma (3NaScTx previamente identificada na mesma espécie de escorpião, modificou as correntes de sódio em hNav1.2, hNav1.3 e hNav1.6. Essas quatro toxinas foram administradas em camundongos via i.p., indicando que Tpa2 e Tpa10 causam escorpionismo classe II (x2= 8,0; p-valor = 0,005) e degeneração vacuolar e infiltrado inflamatório no fígado (x2= 4,4; p-valor = 0,035). _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Although Tityus pachyurus is the scorpion species which is responsible for the most dangerous cases of scorpionism in Colombia, little is known about its venom toxins. This project aimed to identify new toxins having Na+ channels as molecular targets in the venom of T. pachyurus. By means of the library construction of the cDNA venomous gland of a scorpion T. pachyurus, five new putative toxins from NaScTx peptide family were identified and by the primary structure of the mature peptides, three of them were classified as alpha-NaScTxs - Tpa4, Tpa5 and Tpa6 - and two as beta-NaScTxs - the Tpa7 and Tpa8. The last one is the first anti-insect excitatory beta-class toxin describedfor a New World scorpion. These five toxins, together with others NaScTxs described for Tityus species were used to construct a phylogenetic tree. Phylogenetic analysis indicated a marked geographic separation between toxins presented in scorpions occurring in the North of the Amazon River and those presented in the scorpions inhabiting the South of the Amazon River. The crude venom of T. pachyurus after being fractionated by RP-HPLC, using a C18 column, resulted in 55 chromatografic fractions. The three most abundant fractions were submitted to further fractioning and the purified peptides were sequenced by mass spectrometry (MS). Three NaScTxs partial sequences were described: Tpa9 with 7061.87 Da, Tpa10 with 6994.36 Da and Tpa11 with 7167, 23 Da. These new toxins (500 nM) were tested on Na+-channels expressed in HEK cells. Tpa9 reduced on 20% the Na+ currents in hNavl.1, similarly as the (3NaScTxs; Tpa10 acted on hNav1.1, hNavl .2, hNav1.3 and hNav1.6 as aNaScTxs, and Tpa11 had effect on hNavl .2, hNavl .3, and hNavl .6. The Tpa2, a (3-toxin previously identified, modified the currents in hNavl.2, hNavl.3 and hNavl .6. These four toxins were injected into mice showing that Tpa2 and Tpa10 caused class II scorpionism (x2 = 8.0, p = 0.005) and vacuolar degeneration and inflammatory infiltration in the liver (x2 = 4.4, p-value = 0.035).

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Ciências Fisiológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-09-24T14:55:14Z No. of bitstreams: 1 2012_NatielaBeatrizdeOliveira.pdf: 3826943 bytes, checksum: bc95f23eec5132d04ee27298fb70b59f (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-10-02T12:25:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_NatielaBeatrizdeOliveira.pdf: 3826943 bytes, checksum: bc95f23eec5132d04ee27298fb70b59f (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-02T12:25:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_NatielaBeatrizdeOliveira.pdf: 3826943 bytes, checksum: bc95f23eec5132d04ee27298fb70b59f (MD5) / O escorpião da espécie Tityus mattagrassensis Borelli (1901). pertence à família Buthidae, e é endêmico do cerrado brasileiro, sendo encontrado em todo o Centro Oeste, Bahia e Norte de Minas Gerais. As espécies da família Buthidae são as principais responsáveis pelos acidentes ocorridos com humanos. Os acidentes com T mattogrossensis são considerados de pequena gravidade devido ao baixo grau de reação ã picada e de poucos casos registrados. A peçonha de escorpiões é uma mistura complexa de moléculas bioativas, porém, os componentes mais importantes são os peptideos neurotóxicos, que agem em canais iónicos de Na*, K* e Ca2'. As toxinas de escorpiões que agem em canais para Na' voltagem dependentes são divididas em duas famílias: as a-toxinas de escorpiões (a-NaScTx) que agem no sitio 3 do domínio IV do canal para sódio e com isso deixam a inativaçâo do canal mais lenta ou causam o bloqueio da inativaçâo; e as B-toxinas escorpiônicas (B-NaScTx) que se ligam ao sítio 4 do domínio II do canal e alteram o potencial para a ativação dos canais para Na*. Até o momento, não existem trabalhos com a caracterização da peçonha de Tityus mattogrossensis e o presente trabalho tem como objetivo caracterizar química e eletrofisíologicamente os peptideos componentes da peçonha do escorpião dessa espécie, com ênfase na caracterização de duas toxinas para canais Na,. A peçonha bruta foi fracionada mediante CLAli mostrou a presença de 65 facões, sendo 7 frações mais abundantes, que foram testadas de forma bioguiada em nervos de rã, por meio da técnica "Single Sucrose-Gap". Onde foram observadas quatro frações com atividade: uma que causou um relardo da repolarização do potencial de ação e três com atividade de redução do potencial de ação. Dessas, duas frações F5 (7308,5 m/z) e F6 (7108,0 m/z) tornaram-se foco do trabalho. As suas seqüências foram parcialmente obtidas por meio de sequenciamento "de novo" em MALDI-TOF/MS. E tiveram alta similaridade com outras toxinas de escorpiões do tipo B do gênero Tityus. Foram feitos testes preliminares eletroflsiológicos em "patch clamp" e a toxina F5, mostrou alta atividade em canais Nav 1.3, Nav 1.6, DUM e baixa atividade em DRG. A toxina F6 apresentou alta atividade em Nav 1.3 e essa atividade foi aumentada com um pré-pulso despolarizante. A F6 também apresentou ação em DRG. Porém, mais testes deveram ser feitos. A peçonha do escorpião T. mattagrassensis possui duas toxinas abundantes que agem sobre canais para sódio voltagem dependentes. E podem ser as primeiras toxinas descritas com atividade de bloqueio de Nav jâ descritas no gênero Tityus. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The endemic Brazilian cerrado scorpion Tityus mactagrossensis Borelli (1901), belongs to Buthidae family, and is found in the Brazil Midwest, Bahia and north of Minas Gerais states. The species of the Buthidae family are the main responsible for humans accidents. T. mattograssensis sting are considered as small gravity due to the low degree of reaction and the few recorded cases. The scorpion venom is a complex mixture of bioactive molecules, however, the most important components are neurotoxic peptides, which act on ion channels of Na\ K' and Ca2'The toxins of scorpions that act on channels for Na* voltage-dependent are divided into two families: the a-scorpions toxins (a-NaScTx) act at the site 3 domain IV of the channel to sodium, and thus slowing the channel inactivation level causing blockage or inactivation, and the |i scorpion toxins (8- NaScTx) that bind to site 4 of the domain II of the channel and changing the potential of activation of Na* channels. There are no characterization studies of T. mattogrossensis venom, this present work aims to characterize chemical and electrophysiological peptides of scorpion venom components of this species, with emphasis on the characterization of two scorpion sodium channel toxins. The crude venom fractionated by high performance liquid chromatography (HPLC) showed the presence of 65 fractions, with seven more abundant, which were bio-guided tested, using the technique Single Sucrose-Gap with frog's ciatic nerve. Four fractions showed neurotoxicity in this preparation: one caused a delay of action potential repolarization and three with reduced activity of the action potential. From these two fractions F5 (7308.5 m/z) and F6 (7108.0 m/z) became the focus of this study. Their sequences were obtained by partially sequencing "de novo" in MALDI-TOF/MS. Both had high identity with others Tityus B-scorpions toxins, suggesting theirs activity. Preliminary electrophysiological tests were performed in patch clamp and the toxin F5 showed high activity channels Nav 1.3, Na, 1.6 and DUM. and low activity in DRG. The toxin F6 showed high activity in Na, 1.3 and this activity was increased by a depolarizing pre-pulse. The F6 also presented action in DRG. However, further tests will be done. The two major toxins of T. mattogrossensis venom action on voltage-dependent sodium channels, and toxins can be the first already described with activity block Nar Tityus genus.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-11-14T11:55:11Z No. of bitstreams: 1 2012_CarolineBarbosaFariasMourao.pdf: 5439112 bytes, checksum: 09bc9fa597576b8a38b218e890515d36 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-11-14T12:18:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_CarolineBarbosaFariasMourao.pdf: 5439112 bytes, checksum: 09bc9fa597576b8a38b218e890515d36 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-14T12:18:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_CarolineBarbosaFariasMourao.pdf: 5439112 bytes, checksum: 09bc9fa597576b8a38b218e890515d36 (MD5) / Aranhas produzem em sua peçonha uma complexa mistura de moléculas, as quais, devido a seus potenciais neurotoxicos, tem despertado o interesse para a prospecção de novos fármacos e pesticidas. No entanto, poucos estudos são realizados com a peçonha de aranhas caranguejeiras, em especial de espécies encontradas no Brasil. O presente estudo teve como objetivo a caracterização da peçonha bruta da aranha caranguejeira Acanthoscurrio poulensis em busca de peptídeos neuroativos, sendo este o primeiro estudo completo realizado com essa peçonha. A peçonha de A. paulensis apresentou um total de 58 frames cromatograficas e 97 massas moleculares distintas, variando de m/z 601,4 a 21.932,3. A dose letal media em camundongos foi de 25,45 ± 2,42 µg/g. Nos ensaios em coração de rã (coração in situ e fatias isoladas de ventrículo), a peçonha bruta e a "fração de baixa massa molecular" (FBMM) promoveram efeitos semelhantes ao do estímulo vagal, os quais foram bloqueados na presença de atropina, um antagonista muscarinico. A fração protéica (FP) da pegonha não apresentou atividade similar nessas preparações. Um peptídeo denominado Ap1a, eluído aos 41% de acetonitrila no fracionamento da peçonha bruta, foi isolado e caracterizado. A seqüência precursora da Apia apresentou um peptídeo sinal e pro-peptídeo contendo 23 e 27 resíduos de aminoácidos, respectivamente, e 48 resíduos de aminoácidos, com seis cisteínas, referentes ao peptídeo maduro. Esse peptídeo, com massa molecular monoisotopica ([M+H]+) de 5.457,79, apresentou de 60 a 84% de identidade com toxinas da família da HWTX-II. Diferentemente do padrão estrutural proposto para essas toxinas, a Ap1a apresentou um arranjo das pontes dissulfeto típico do motivo ICK. A Ap1a induziu um efeito paralítico dependente da dose em lagartas Spodoptero frugiperda, com DE50 de 13,01 ± 4,21 µg/g. No circuito da Fibra Gigante de Drosophilo melonogoster, a Ap1a causou a redução de freqüência e amplitude nas respostas das vias GF-TTM e GF-DLM, indicando uma ação na junção neuromuscular de Drosophilo, a qual e mediada por receptores glutamatergicos. A Apia foi também letal a camundongos (30 mg/animal via intracranial), causando hipermotilidade com movimentos circulares e saltos e crises tônicas generalizadas com status epiiepticus e morte entre 25 e 35 min, sendo esses efeitos semelhantes aos reportados com a administração via i.c.v. de NMDA, um agonista glutamatergico. A Ap1a (1 µM) não alterou a resposta induzida por acetilcolina na preparação com células de rabdomiossarcoma, e seus efeitos foram mínimos nos canais hNav1.2, hNav1.4, hNav1.5 e hNav1.6. Dessa forma, o presente estudo proporcionou a caracterização química e biológica de uma nova molécula neuroativa da peçonha da aranha A. paulensis, com possível ação na neurotransmissao glutamatergica, e também a caracterização da peçonha bruta, mostrando uma grande variedade de compostos que podem ser futuramente estudados visando a melhor compreensão de canais iônicos ou receptores celulares e o desenvolvimento de novos fármacos e pesticidas. / Spiders produce in their venoms a complex mixture of molecules which, due to their neurotoxic potential, have raised interest in prospecting new drugs and pesticides. Nevertheless, few studies are carried out with tarantula venoms, especially with species found in Brazil. The present study aimed to characterize the crude venom from Aconthoscurria paulensis tarantula venom in search of neuroactive peptides, being this the first complete study performed with this venom. The venom of A. paulensis presented a total of 58 chromatographic fractions and 97 different molecular masses ranging from m/z 601.4 to 21,932.3. The median lethal dose in mice was 25.45 ± 2.42 |ig/g. On the frog heart assays [in situ and isolated ventricle slices), the crude venom and the "low molecular mass fraction" (LMMF) promoted effects similar to vagal stimulation, which were blocked in the presence of atropine, a muscarinic antagonist. The proteic fraction did not show similar effects on frog heart tissue. A peptide named Apia, eluted with 41% acetonitrile in the crude venom fractionation was isolated and characterized. The Apia showed 48 amino acid residues, with six cysteines, and a precursor sequence showing a signal peptide and pro¬peptide containing 23 and 27 residues, respectively. This peptide, with a monoisotopic molecular mass ([M+H]+) of 5457.79, presented 60 to 84% identity with toxins from the HWTX-II family. Unlike the structural pattern proposed for these toxins, Apia presented an arrangement of disulfide bonds typical of the ICK motif. The Apia induced a dose-dependent paralytic effect in Spodoptera frugiperda caterpillars, with and ED50 of 13.01 ± 4.21 ng/g. In the Drosophilo melonogaster Giant Fiber circuit, Apia has reduced both the amplitude and frequency of responses from GF-TTM and GF-DLM pathways, indicating an action at the Drosophilo neuromuscular junction, which is mediated by glutamatergic receptors. The Apia was also lethal to mice (30 |_ig/animal by intracranial route), causing hypermotility with circular and jump movements and generalized tonic seizures with status epilepticus and death between 25 and 35 min. These effects were similar to those reported with the administration by i.e.v. route of NMDA, a glutamatergic agonist. The Apia (1 yiM) did not alter the response induced by acetylcholine on the rhabdomyosarcoma cells preparation, and it presented minimal effects on hNavl.2, hNavl.4, hNavl.5 and hNavl.6 channels. Thus, this study provided chemical and biological characterization of a new neuroactive molecule from A. paulensis spider venom, with possible action on glutamatergic neurotransmission, and also the crude venom characterization, showing a wide variety of compounds that can be further studied in order to better understanding ion channels or cell receptors and to the design of new drugs and pesticides.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2009. / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2010-03-05T17:31:42Z No. of bitstreams: 1 2009_CarlaSimoneVizzotto.pdf: 3539881 bytes, checksum: b07d43eaf6ed86b3ae63ef89eab91b2f (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-03-06T00:48:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_CarlaSimoneVizzotto.pdf: 3539881 bytes, checksum: b07d43eaf6ed86b3ae63ef89eab91b2f (MD5) / Made available in DSpace on 2010-03-06T00:48:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_CarlaSimoneVizzotto.pdf: 3539881 bytes, checksum: b07d43eaf6ed86b3ae63ef89eab91b2f (MD5) Previous issue date: 2009 / A peçonha de aranhas constitui-se como um conjunto diverso de moléculas bioativas, usado para subjugar a presa e eventualmente para defesa. Essas moléculas atuam de formas variadas em muitos sistemas biológicos e despertam interesse pelo seu potencial para a prospecção de produtos naturais. Pouco se sabe sobre as peçonhas de aranhas caranguejeiras do Brasil. Este estudo apresenta a caracterização de componentes da peçonha de Lasiodora sp. bem como sua atividade biológica. Foram detectados 191 componentes na peçonha de Lasiodora sp. com predominância de componentes com massa molecular menor que 1000 Da e entre 4000 e 8500 Da. A atividade cardiotóxica foi atribuída aos componentes de baixo peso molecular da peçonha. Quatro peptídeos tiveram sua estrutura primária parcialmente elucidada. A análise de similaridade desses peptídeos isolados e caracterizados sugeriu a atividade em canais iônicos, que não foi detectada nos ensaios eletrofisiológicos. A peçonha bruta de Lasiodora sp. inibiu de maneira significativa o crescimento das bactérias Escherichia coli e Staphylococcus aureus. A atividade antibacteriana foi identificada em oito frações cromatográficas e em um grupo de frações com baixa massa molecular (JL1), sendo que não foi possível a determinação de MIC. Este estudo contribui para a compreensão da diversidade e complexidade da peçonha da aranha Lasiodora sp., bem como preenche lacunas até então não esclarecidas para essa espécie. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The spider venom is a diverse set of bioactive molecules, used to subdue the prey and possibly for defense. These molecules act in various forms in many biological systems and arouse interest in its potential for the exploration of natural products. Little is known about the Tarantula venoms from Brazil. This study presents the characterization of components from the venom of Lasiodora sp. and its biological activity. We identified 191 molecular mass components in the Lasiodora sp. venom, with prevalence of components smaller than 1000 Da and between 4000 and 8500 Da. The cardiotoxic activity was attributed to low molecular weight components. Four peptides had their primary structure partially elucidated. The analysis of similarity of these isolated and characterized peptides suggest activity on ion channels, which was not detected in the electrophysiological testing. The Lasiodora sp. crude venom significantly inhibited the bacteria Escherichia coli and Staphylococcus aureus growth. The antibacterial activity was identified in eight chromatographic fractions, and in a group of low molecular weight fractions (JL1), which was not possible to determine MIC. This study contributes to understanding the diversity and complexity of the venom of the spider Lasiodora sp. and then fills gaps unclear for this species.

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Orientador : Osvaldo Augusto Sant'Anna / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-28T08:39:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Stephano_MarcoAntonio_M.pdf: 5348385 bytes, checksum: cc9b6a49e17db4782e79d2f71f8449d4 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: Este trabalho objetivou identificar e demonstrar a razão dos baixos títulos neutralizantes da atividade letal, do soro antiveneno de Lachesis muta, produzido pelo Instituto Butantan. O veneno de Lachesis muta é responsável por 400 acidentes anuais no Brasil e o único tratamento, comprovadamente eficaz, é a soroterapia com antiveneno específico. Os baixos títulos de anticorpos encontrados nos plasmas de equídeos levam a uma descontinuidade de produção ou a um produto com alta concentração de proteína. Estudaram-se também as possibilidades dos venenos de Bothrops jararaca e Crotalus durissus terrificus possuírem o mesmo efeito supressor. Na tentativa de elucidar a possível atividade imunossupressora do veneno de Lachesis muta, foram utilizados como modelo experimental, camundongos selecionados para boa resposta imune humoral (linhagens HQP) e um antígeno não relacionado, no caso o erítrócito de carneiro (EC). O teste de hemoaglutinação foi escolhido para se comparar o efeito do veneno de Lachesis muta na resposta imune a antígenos não relacionados. Grupos de animais receberam veneno de Lachesis muta 24h e 72h antes e concomitante ao EC. Após os primeiros ensaios, em que se verificou a presença de um fator que inibia a produção de anticorpos a um antígeno não relacionado e que este era dose-dependente, o veneno de Lachesis muta foi fracionado por cromatografia de gel filtração em Superdex® 75. Seis frações foram obtidas, porém as frações 4 e 5 apresentaram atividade imunossupressiva. Os venenos obtidos sem as frações 4 e 5 foram utilizados na imunização de equídeos e o título destes animais foi pelo menos, cinco vezes superior ao título obtido por animais imunizados com veneno total. Os resultados obtidos levam-nos às seguintes conclusões: o veneno de Lachesis muta muta apresenta um efeito imunossupressor parcial; pelo menos duas frações distintas apresentam esta atividade; a atividade imunossupressora é dose-dependente; as frações imunossupressoras quando removidas do veneno, faz com que este aumente em cinco vezes os títulos neutralizantes da atividade letal no plasma eqüino / Abstract: In order to study the effect of Lachesis muta venom on the antibody response to unrelated antigens we first made an experimental analysis on mice genetically selected for high antibodies" production (HGP lines), to determine the effect of Lachesis muta venom on the anti-sheep erythrocytes (SE) response. Groups of mice received lOOug of venom in 0,5ml by intraperitoneal (ip) route 72, 24 hs before or simultaneously with 5 X 108 SE/0,5ml ip. In a second test, we repeated the same experiment as described above with B. jararaca and C. d. terrificus venoms using 18ug/0,5ml and 0,6ug/0,5ml respectively, in order to observe wether the inhibitory effect was present in venoms of other species. To elucidate if the depletory effect was present only in a particular venom fraction, around 120mg of Lachesis muta muta venom was applied to a Superdex® 75 column. Six fractions were studied for their biological activity and biochemical aspects (polyacrilamide gel electrophoresis). The results showed that in relation to the control groups (SE only) the total Lachesis muta venom promoted a clear, significant (P < 0.001) and persistent decrease in the anti-SE antibody response, mainly in the group that received venom 72hs before. The venoms of B. jararaca and C. d. terrificus did not show any inhibitory effect. After the chromatographic separation fraction 4 (molecular mass between 24 and 30 kDa) and 5 (molecular mass between 10 and 14 kDa) showed a significant supressive effect (P < 0.001 and P < 0.01 respectively). These data showed an inhibitory effect of Lachesis muta venom on an unrelated antigen. The activity is dose dependent and is present only in this species of Crotalidae family. The experiment with select mice has got subject to be applied in antivenom production. When horses were immunized with Lachesis muta venom without supressive frations, the sera were three times more effetive than the same sera from the horses which received total Lachesis muta venom / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Albetiza Lobo de Araujo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T21:44:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Stroka_Alessandra_M.pdf: 5695207 bytes, checksum: 81505eb22e83ba5221b3adf2e6bb373a (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Envenenamentos por serpentes das subfamílias Crotalinae e Viperinae são caracterizados por um complexo quadro fisiopatológico, em que a hemorragia é freqüentemente observada. Neste trabalho, purificamos e caracterizamos uma proteína hemorrágica (BlaH1) da peçonha de Bothrops lanceolatus. A hemorragina foi purificada utilizando-se uma combinação de Cromatografias de gel filtração, afinidade e interação hidrofóbica. Em SDS-PAGE, a enzima apresentou uma massa molecular estimada em 28 kDa, tanto na ausência quanto na presença de j3-mercaptoetanol, indicando assim que a proteína não possui subunidades. A reação da BlaH1 com anticorpo foi confirmada pelos ensaios de imunobloting, ELlSA, imunoeletroforese e imunodifusão, onde o antisoro botrópico comercial foi capaz de reconhecer a proteína hemorrágica. BlaH1 possui atividade hemorrágica e caseinolítica. O uso do agente quelante EDTA inibiu as atividades hemorrágica e caseinolítica, sugerindo que a hemorragina é uma metaloproteinase. O pH ótimo da enzima foi de 8,0 e a temperatura ótima entre 30-40°C. Esses resultados mostram que a hemorragina isolada da peçonha de B. lanceolatus apresenta propriedades semelhantes a outras hemorraginas isoladas de peçonhas ofídicas / Abstract: Bothrops snake venoms contain metalloproteinases that contribute to the local effects seen after envenoming. In this work, a hemorrhagic metalloproteinase (BlaH1) was purified from the venom of the snake Bothrops lanceolatus by a combination of gel filtration, affinity (metal chelating) and hydrophobic interaction chromatographies. The hemorrhagin was homogeneous by SDS-PAGE and had a molecular mass of 28 kDa that was unaltered by treatment with beta-mercaptoethanol. BlaH1 gave a single band in immunodiffusion, immunoelectrophoresis and immunoblotting using commercial bothropic antivenom. This reactivity was confirmed by ELlSA. BlaH1 had hemorrhagic, caseinolytic, fibrinogenolytic, collagenolytic and elastinolytic activities, but no phospholipase A2 activity. The hemorrhagic and caseinolytic activities were inhibited by EDTA, indicating that they were metal ion-dependent. In contrast, aprotinin, benzamidine and PMSF did not affect these activities. The caseinolytic activity of BlaH1 had a pH optimum of 8.0 and was stable in solution at up to 40°C; activity was completely lost at >70°C. The hemorrhagic activity was neutralized by commercial bothropic antivenom. These properties suggest that this new hemorrhagin belongs to class P-I snake venom metalloproteinases / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Sergio Marangoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:13:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bonfim_VeraLucia_M.pdf: 864621 bytes, checksum: a69159638df711b5aa8e490b77c0ddee (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Bothrops jararacussu é uma espécie de grande importância epidemiológica no estado do Rio de Janeiro. No entanto a sua distribuição é ampla, pois pode ser encontrada nos estados de Santa Catarina, Paraná, Mato Grosso, São Paulo, Minas Gerais, Espírito Santo, Sul da Bahia e também na Argentina, Paraguai e Bolívia. De um modo geral, os venenos botrópicos das espécies brasileiras foram pouco estudados tanto em relação aos seus componentes isolados como quanto ao veneno total, devido 'a falta de otimização das técnicas de purificação capazes de revelar a presença de novos componentes ou de suas isoformas. Desta forma justifica-se o interesse no isolamento e caracterização de duas novas isoformas de BthTX-II PLA2 (D49), lembrando que esta última citada é uma fração importante no veneno de Bothrops jararacussu. As isoformas foram isoladas em uma coluna de troca iônica catiônica (Protein Pack SP 5PW Waters) acoplada a um sistema LC 650 (Waters), sendo caracterizadas como isoformas de BthTX-II e denominadas como Bj-IV e Bj-V. O alto grau de pureza foi revelado ao serem re-purificadas em uma coluna de hidrofobicidade µ-Bondapack C18 acoplada a um sistema de HPLC de fase reversa, sendo eluídas em tempos de retenção muito próximos (Bj-IV 31,25 ± 0,31 minuto e para Bj-V 31,31 ± 0,28 minuto). A caracterização físico-química revelou o fato de serem isoformas, pois apresentaram vários fatores similares como, a tendência para a formação de dímeros na eletroforese com ausência de redutores, sendo que o valor de massa molecular relativa encontrada para isoformas foi de ~14 kDa, através da eletroforese em SDS-PAGE Tricina (16,5%) também, a basicidade semelhante e o alto grau de hidrofobicidade, confirmados pela composição de aminoácidos. A caracterização cinética das isoformas de BthTX-II PLA2 (D49) mostrou que tais isoformas são altamente estáveis e apresentam um pH ótimo ao redor de 8,0 e temperatura próxima a 37ºC. Frente a diferentes concentrações de substrato as isoformas mostraram um comportamento tipo alostérico, em nossas condições experimentais. Na ausência de Ca+2 (1Mm) e na presença de alguns íons divalentes tais como Mn+2, Mg+2, Zn+2, Cu+2 (na concentração de 10 mM) as isoformas Bj-IV e V foram inibidas, já na presença de Ca+2 (1mM) e com os mesmos íons divalentes citados elas mostraram uma discreta atividade. Também foi demonstrado o efeito inibitório de crotapotinas crotálicas sobre a atividade PLA2 das isoformas, fato que sugere a possível presença de crotapotinas ¿like¿ no veneno botrópico. A análise da composição de aminoácidos confirmou o comportamento estável de sua atividade cinética, ao mostrar um alto conteúdo de aminoácidos hidrofóbicos, assim como a presença de 14 cisteínas envolvidas em possíveis sete pontes dissulfeto. A presença de um alto conteúdo de aminoácidos básicos como Lys, His e Arg, também confirmaram o caráter básico das isoformas, característica própria do veneno deste tipo de víperide sul americano. O estudo de homologia seqüencial da região N-terminal entre ambas isoformas e também com outras PLA2 (D49) revelou um alto grau de homologia, no entanto, foram encontradas algumas substituições que não contribuíram com diferenças significativas, tanto com relação à atividade catalítica quanto neurotóxica. O efeito neurotóxico das isoformas de BthTX-II PLA2 (D49) Bj-IV e V, foi avaliado usando-se duas preparações farmacológicas: nervo frênico-diafragma isolado de camundongo e biventer cervicis de pintainho. Foram encontradas diferenças em ambas preparações, pois o efeito de bloqueio da resposta contrátil evidenciou-se de maneira significativa na preparação nervo frênico-diafragma isolado de camundongo, nas concentrações empregadas (50 e 100 µg/mL), enquanto que na preparação biventer não houve efeito notório. No entanto, para a dosagem de 100 µg/mL, no caso do veneno total na preparação biventer cervicis de pintainho evidenciou-se um efeito miotóxico indireto pois, foi observada uma diminuição nas respostas contraturante dadas pela diminuição das curvas de KCl e Acetilcolina (ACh). A importância do isolamento das isoformas de BthTX-II, Bj-IV e V, está apoiada no fato de ter sido possível a obtenção destas duas novas isoformas, usando-se métodos que garantiram a manutenção da sua atividade biológica, sendo assim possível correlacionar a estrutura e a função desta família de proteínas / Abstract: Bothrops jararacussu is a species of great importance in the state of Rio de Janeiro, but its has a wide distribution: from Argentina, state of Santa Catarina, Paraná, Mato Grosso, São Paulo, Minas Gerais, Espírito Santo, south of Bahia, Paraguay and Bolivia. In a general the venom botropics of the Brazilian species, were probably rarely studied in relation to their isolated components as the total venom, due to a lack in the optimization of technologies to isolate the presence of new components or isoforms. In this way it justified to isolate and to characterize two new isoforms of these of BthTX-II PLA2 (D49) is a important fraction in the venom of Bothrops jararacussu, which were isolated through a column of exchange cationic (Protein Pack SP 5 PW Waters) coupled to a system LC 650 (Waters), being characterized as isoforms of BthTX-II and denominated Bj- IV and Bj-V. The high degree of purity was revealed and was eliminated in very close times of retention (Bj-IV 31.25 ± 0.31 minutes and Bj-V 31.31 ± 0.28). The physical-chemistry characterization revealed the reason of being isoforms, because they present several similar factors, such as the tendency of forming aggregates through the electrophoreses PAGE in the absence of SDS, as well as the mass is around 14 kDa characterized in the electrophoreses SDS-PAGE Tricina (16%). The kinetic characterization of the isoforms of BthTX-II PLA2 (D49) showed that isoforms are higly stable and they present good pH around 8,0 and a good temperature around 37 0C. Different concentration substrates showed a behavior type allosteric under our experimental conditions. In the presence of some ions such divalents as Mn+2, Mg+2, Zn+2, Cu+2 (in the concentration of 10 Mm) and in the absence of Ca+2 the isoforms Bj-IV and Bj-V, were inhibited. But in the presence of Ca+2 (1mM) the isoforms showed a discreet activity. The effect of the inhibition of crotapotins crotalics were also demonstrated in the activity PLA2, it is suggested that there is probably a presence crotapotin in these PLA2. The analysis composition of amino acids confirmed the stable behavior of its enzymatic kinetics when showing a high content of amino acids hidrophobics, as well as the presence of 14 cysteine involved in 14 bridges disulfide. The presence of a high content of basic amino acids as Lys, His and Arg confirmed the basic character of the isoforms. The study of the N-terminal region of both isoforms in relation to other PLA2 reveals a high homology degree, nevertheless some substitutions observed didn't show significant differences in the catalytic and neurotoxic activity. The neurotoxic effect of the isoforms of BthTX-II PLA2 (D49): Bj-IV and Bj-V were evaluated using two pharmacological preparations: nerve isolated frenic-diaphragm a mouse and a chick biventer cervicis muscle. There were differences in both preparations, because the blockade effect of the concentration was more significant in the preparation of the mouse. It observed in the 100 ug/ml dose to total venom a indirect effect miotoxic in the preparation chick biventer cervicis. The importance of the isolation of the isoforms of BthTX-II Bj-IV and Bj-V are not restricted to the fact of having used optimized methodologies that guaranteed the biological function of these, being able to correlate the structure and function in this proteins family of great importance in the study of venom of snakes / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular