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Molekulare Charakterisierung der Carboanhydrase Nce103 im Kontext des CO2 induzierten Polymorphismus in Candida albicans / Molecular characterisation of the carbonic anhydrase Nce103 in the context of carbon dioxide induced polymorphism in Candida albicans

Klengel, Torsten January 2008 (has links) (PDF)
Die Detektion von Umweltsignalen und die gezielte zelluläre Reaktion ist eine zentrale und für das Überleben aller Lebewesen essentielle Fähigkeit. Candida albicans, als dominierender humanpathogener Pilz, ist hochgradig verschiedenen biochemischen und physikalischen Umweltbedingungen ausgesetzt, welche sowohl die Zellmorphologie als auch die Virulenz dieses Erregers beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Kohlendioxid, als ubiquitär vorkommendes Gasmolekül, auf die Zellmorphologie und Virulenz untersucht. Erhöhte Konzentrationen von Kohlendioxid stellen ein äußerst robustes Umweltsignal dar, welches die morphologische Transition vom Hefewachstum zum hyphalen Wachstum, einem Hauptvirulenzfaktor, in Candida albicans stimuliert. In diesem Zusammenhang wurde die Rolle der putativen Carboanhydrase Nce103 durch die Generation von knock – out Mutanten untersucht. Die Disruption von NCE103 in C. albicans führt zu einem Kohlendioxid – abhängigen Phänotyp, welcher Wachstum unter aeroben Bedingungen (ca. 0,033% CO2) nicht zulässt, jedoch unter Bedingungen mit einem erhöhten CO2 Gehalt von ca. 5% ermöglicht. NCE103 ist also für das Wachstum von C. albicans in Wirtsnischen mit aeroben Bedingungen essentiell. Durch Untersuchungen zur Enzymkinetik mittels Stopped – flow wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass Nce103 die Funktion einer Carboanhydrase erfüllt. Die biochemische Funktion dieser Carboanhydrase besteht in der Fixation von CO2 bzw. HCO3ˉ in der Zelle zur Unterhaltung der wesentlichen metabolischen Reaktionen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Induktion hyphalen Wachstums durch CO2 in C. albicans nicht durch den Transport von CO2 mittels des Aquaporins Aqy1 beeinflusst wird. CO2 bzw. HCO3ˉ aktiviert in der Zelle direkt eine Adenylylcyclase (Cdc35), welche sich grundlegend von den bisher gut charakterisierten G-Protein gekoppelten Adenylylcylasen unterscheidet. Die Generation von cAMP beeinflusst in der Folge direkt die Transkription hyphenspezifischer Gene und nachfolgend die morphologische Transition vom Hefewachstum zum elongierten, hyphalen Wachstum. Dieser Mechanismus konnte sowohl in Candida albicans als auch in Cryptococcus neoformans nachgewiesen werden, was auf einen panfungal konservierten Signaltransduktionsmechanismus schliessen lässt. Die Inhibition dieser spezifischen Kaskade eröffnet neue Ansätze zur Entwicklung spezifischer antimykotischer Wirkstoffe. / Detection of environmental signals and subsequently directed reaction is essential for the survival of all living organisms. Candida albicans, as the predominant human fungal pathogen is exposed to severely different physical and chemical conditions, which influence cell morphology as well as virulence in human. In the present work, the influence of carbon dioxide as ubiquitous gaseous molecule on virulence and cell morphology was analysed. Elevated concentrations of carbon dioxide are a robust signal to induce the morphological transition from yeast growth to an elongated hyphal growth form, which is believed to be one of the main virulence factors in Candida albicans. The role of the putative carbonic anhydrase Nce103p in carbon dioxide signalling is reviewed by generating knockout mutant strains, which exhibited a carbon dioxide dependent phenotype. Growth under aerobic conditions (0,033 % carbon dioxide) is inhibited but feasible in 5% carbon dioxide. Therefore, Nce103p is essential for growth in host niches with aerobic conditions. Analysis of the biochemical properties of Nce103p by stopped – flow kinetics revealed carbonic anhydrase activity. It is hypothesised, that Nce103p is essential for fixation of carbon dioxide and bicarbonate within the cell in order to sustain basic metabolic reactions. Furthermore, the induction of hyphal growth was independent of aquaporine-mediated transport of carbon dioxide. Bicarbonate rather carbon dioxide activates directly the adenylyl cyclase Cdc35p generating cyclic AMP as second messenger and influencing the transcription of hyphal specific genes in Candida albicans thus promoting the morphological transition from yeast growth to elongated hyphal growth. This signal transduction cascade is present in Candida albicans as well as Cryptococcus neoformans and it is believed to be a pan fungal signal transduction cascade. The specific inhibition of carbon dioxide mediated polymorphism may serve as a new target for antifungal therapeutic agents.
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Evaluation von Granulozyten Kolonie-stimulierendem Faktor (G-CSF) und einem monoklonalen Antikörper gegen Kapselpolysaccharid zur Therapie der experimentellen Klebsiella pneumoniae-Pneumonie

Held, Thomas 20 June 2001 (has links)
G-CSF besitzt direkte Effekte auf die Aktivierung bakterizider Eigenschaften neutrophiler Granulozyten und verbessert das Überleben bakteriell infizierter Tiere. Daher wurde in der hier vorliegenden Arbeit der Effekt einer prophylaktischen oder therapeutischen Gabe von G-CSF bei experimenteller Pneumonie durch Klebsiella pneumoniae in Mäusen untersucht. Unerwarteterweise verschlechterte aber eine prophylaktische G-CSF-Gabe das Überleben und führte dosisabhängig zu einer Steigerung der bakteriellen Dissemination von der Lunge in Leber und Milz. Im Gegensatz dazu konnte ein spezifisch gegen K2-Kapselpolysaccharid (K2-KPS) von K. pneumoniae gerichteter monoklonaler Antikörper signifikant die Vermehrung der Bakterien in Lunge, Leber und Milz reduzieren. Die Blockierung von TNF?? durch Pentoxifyllin hingegen verzögerte die Letalität nach Induktion der Pneumonie, verhinderte sie jedoch nicht. In vitro konnte hier nachgewiesen werden, daß G-CSF spezifisch an K. pneumoniae bindet und daß diese Bindung an mehrere Proteine mit einem Molekulargewicht von 41, 25 und 21 kDa erfolgt. Die Bindung von G-CSF an K. pneumoniae führte zu einer signifikant erhöhten Produktion des wichtigsten Virulenzfaktors, K2-KPS. Dies verminderte in vitro signifikant eine Phagozytose der Bakterien durch neutrophile Granulozyten. Damit gelang es zum ersten Mal, die Bindung von G-CSF an ein gram-negatives Bakterium, K. pneumoniae, nachzuweisen und zu zeigen, daß diese Bindung in vitro zu einer erhöhten Produktion des wichtigsten Virulenzfaktors und in vivo zur Verschlechterung einer experimentellen Pneumonie durch erhöhte bakterielle Disseminierung bei prophylaktischer Gabe von G-CSF vor Infektion führt. Die weitere Untersuchung dieser Phänomene hinsichtlich einer möglichen Bindung von G-CSF auch an andere Bakterien könnte zu einer differenzierten supportiven Therapie bakterieller Infektionen mit G-CSF in nicht neutropenischen Patienten führen. / Besides its well-established effects on granulocytopoiesis, granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) has been shown to have direct effects on the recruitment and bactericidal ability of neutrophils, resulting in improved survival of experimentally infected animals. The effect of G-CSF on the course of experimental pneumonia induced by Klebsiella pneumoniae was studied. Using a highly reproducible murine model, the paradoxical finding that mortality from infection was significantly increased when animals received G-CSF before induction of pneumonia could be demonstrated. Administration of G-CSF promoted replication of bacteria in the liver and spleen, thus indicating an impairment rather than an enhancement of antibacterial mechanisms. By contrast, a monoclonal antibody against Klebsiella K2 capsule significantly reduced bacterial multiplication in the lung, liver, and spleen, and abrogated the increased mortality caused by G-CSF. Blocking of TNF-? with pentoxifylline, however, could not prevent increased mortality caused by G-CSF. In vitro studies showed a direct effect of G-CSF on K pneumoniae resulting in inreased capsular polysaccharide (CPS) production. When bacteria were coincubated with therapeutically achievable concentrations of G-CSF, phagocytic uptake and killing by neutrophils was impaired. Western blot analysis showed three binding sites of G-CSF to K pneumoniae. Thus, in this model, the direct effect of G-CSF on a bacterial virulence factor, CPS production, outweighed any beneficial effect of G-CSF on recruitment and stimulation of leukocytes. Further investigations of possible binding of G-CSF to other bacteria might influence a differentiated supportive therapy of bacterial infections in non-neutropenic patients with this growth factor.
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The effect of cell wall structure on pneumococcal virulence

Gehre, Florian 11 February 2010 (has links)
Streptococcus pneumoniae ist ein gram-positives Bakterium und ein Krankheitserreger des Menschen. Ein Charakteristikum des Bakteriums ist, dass es Cholin-Reste in seine dicke Zellwand einbaut. Das Ziel meiner Doktorarbeit war herauszufinden, inwiefern diese Cholin-Reste zur Virulenz des Bakteriums während experimenteller Sepsis und Meningitis beitragen. Dabei konnte ich feststellen, das cholinierte Wildtyp-Bakterien hoch virulent waren, ungestört im Wirt wachsen konnten und letztendlich zu einer massiven Überaktivierung des Wirts-Immunsystems (gemessen anhand der Zytokine IL-1beta, IL-6, IL-12, TNFalpha) sowie zum Tode der Versuchtiere führten. Im Gegensatz dazu waren cholin-freie Bakterien nicht in der Lage eine permanente Infektion im Wirt zu etablieren. So wuchsen sie nur anfangs und wurden vom Wirts-Immunsystem kontrolliert und beseitigt, sodass alle Tiere überlebten. Die Injektion von cholin-freien und cholinierten, hoch aufgereinigten Zellwänden, führte zu der Schlussfolgerung, dass Cholin in der Zellwand ein Immunevasionsmechanismus der Bakterien sein muss. Ausserdem waren cholin-freie Bakterien in der Lage einen protektiven, serotyp-spezifischen Immunschutz im Wirt zu induzieren. / Streptococcus pneumonia is a major human pathogen. Since it is a gram positive bacterium it is characterized by the production of a thick cell wall. Being auxotrophic for choline, the pneumococcus attaches this aminoalcohol to its teichoic acids thus decorating its surface with choline-residues. The aim of this work was to investigate the role that these choline residues play in the virulence of the bacterium. By using an isogenic choline-containing and choline-free pair of S. pneumoniae I was able to demonstrate that surface bound choline is essential for the virulence of the bacterium in animal models of experimental sepsis and meningitis. In either model choline-containing bacteria were able to persistently grow within the host system, continuously stimulate the production of proinflammatory cytokines (IL-1beta, IL-6, IL-12, TNFalpha) and eventually led to the death of all infected animals within 24h. In contrast, choline-free bacteria showed only transient growth within the host and induced only moderate and limited expression of cytokines. Consequently, the bacterium was virtually avirulent and all animals survived. Intracisternal application of highly purified cholinated and choline-free cell wall preparations, induced a comparable activation of the immune system. These findings led to the conclusion that choline residues contribute to an immunevasion strategy that allows the bacteria to grow despite an ongoing immune response. Although being avirulent choline-free bacteria were able to induce serotype specific immunity in the animals.
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Charakterisierung Patatin-ähnlicher Proteine des Lungenpathogens Legionella pneumophila

Auraß, Philipp 25 August 2009 (has links)
Legionella pneumophila ist ein fakultativ intrazellulär replizierendes Bakterium und der Erreger der Legionärskrankheit, einer schweren Pneumonie. Das Typ IVB Dot/Icm Proteinsekretionssystem und dessen Effektoren sind wesentlich an der Virulenz des Bakteriums beteiligt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung der Patatin-ähnlichen Proteine von L. pneumophila - insbesondere von PatA, das vom Dot/Icm Sekretionssystem in Wirtszellen eingeschleußt wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurden folgende Ergebnisse erzielt: Die 11 Patatin-ähnlichen Proteine von L. pneumophila zeigen hauptsächlich Lysophospholipase A-Aktivität. PatA besitzt außerdem Phosphatidylglyzerol-spezifische Phospholipase A-Aktivität. Serin-72, welches in ein G-X-S-X-G Lipasemotiv eingebettet ist, ist für die Aktivität des Proteins essentiell. PatA ist nach Expression in A549 Epithelzellen in der Zytoplasmamembran oder einer damit eng assoziierten Struktur lokalisiert, die lipolytische Aktivität ist hierfür nicht entscheidend. Die Deletion einer C-terminalen Proteinregion führt zum Verlust der membranständigen Lokalisation. Virulenzattenuierte L. pneumophila Mutanten bilden unter Präsenz von Amöben - im Gegensatz zu Wildtypstämmen - eine Koloniemorphologie aus, die Scattermorphologie genannt wurde. Auf Basis der Scattermorphologie wurde eine Transposon-mutagenisierte Legionella Klonbank auf Wirtszellkolonisationsdefekte überprüft. Dabei wurden 119 kolonisationsdefekte Mutanten isoliert und 70 neue putative Wirtszellkolonisationsgene, darunter zwei Gene Patatin-ähnliche Proteine (patD, patF), identifiziert. patD befindet sich in einem Operon mit bdhA, dem Gen einer putativen 2-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase. Das Operon spielt eine Rolle im Poly-Beta-Hydroxybutyrat (PHB) Stoffwechsel des Bakteriums und wird für die Replikation in Wirtszellen benötigt. Die Studie liefert die ersten experimentell fundierten Ergebnisse, die die Bedeutung des PHB-Metabolismus für die Virulenz des Bakteriums belegen. / Legionella pneumophila is the causative agent of Legionnaires’ disease, a potentially fatal pneumonia. One mayor virulence determinant is the Dot/Icm Type IVB secretion system and its effector proteins. Aim of the present work was the characterization of patatin-like proteins of L. pneumophila, and in particular PatA, which is carried by the Dot/Icm secretion system into host cells. Within this work following results were obtained: The 11 patatin-like proteins of L. pneumophila possess majorly lysophospholipase A activity. L. pneumophila PatA additionally shows Phosphatidylglycerole-specific phospholipase A activity. Serin-72, which is embedded in an G-X-S-X-G lipase motiv is essential for the lipolytic activity of PatA. PatA locates to, or close to, the cytoplasmic membrane when expressed in A549 epithelial cells. The lipolytic activity of PatA is not required for membrane targeting and deletion of a C-terminal region abolishes proper targeting. Virulence attenuated L. pneumophila mutants, develop an easy recognizable phenotype during co-culture with A. castellanii on agar plates that was named „scatterphenotype“. On the basis of the scatterphenotype, a new assay was developed allowing screening of huge clone banks with respect to amoebae sensitivity, a marker for reduced virulence. Here, a collection of several thousand transposon mutagenized L. pneumophila clones was screened and a total of 119 amoebae sensitive mutants was isolated. Among those, 70 novel putative host cell colonization and virulence genes were identified including two members of the patatin-like protein family (patD, PatF). patD is cotranscribed with bdhA, therefore forming an operon. bdhA encodes a putative 3-hydroxybutyrate dehydrogenase. The operon is involved in the poly-beta-hydroxybutyrate (PHB) metabolism of L. pneumophila and is needed for replication in host cells. The study provides the first experimentally funded data showing the linkage of PHB metabolism and virulence of L. pneumophila.
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Untersuchungen zur Wirksamkeit insektenpathogener Pilze gegen die vorratsschädlichen Motten Ephestia Kuehniella und Plodia interpunctella (Lepidptera: Pyralidae)

Bischoff, Reinhard 05 June 1998 (has links)
In der vorliegenden Arbeit wurden anhand von Labor- und praxisnahen Flugversuchen die Möglichkeiten der biologischen Bekämpfung der Dörrobstmotte, Plodia interpunctella HÜBNER, und der Mehlmotte, Ephestia kuehniella (ZELLER), mit entomopathogenen Pilzen der Ordnung Hyphomycetales untersucht. Getestet wurden Pilzstämme von Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana, Paecilomyces farinosus und Paecilomyces fumosoroseus. Hauptgegenstand der experimentellen Arbeit war die Untersuchung verschiedener Einflußfaktoren auf die Wirksamkeit der Pilze unter Lagerbedingungen unter besonderer Berücksichtigung des Auftretens von Wechselwirkungen zwischen Erreger, Wirtsinsekt und Umwelt. Die Stammeigenschaften der getesteten Pilze wurden neben den herrschenden Umweltbedingungen als ein Hauptfaktor identifiziert, der die Wirksamkeit des Einsatzes entomopathogener Pilze gegen vorratsschädliche Motten entscheidend beeinflußt. Darüber hinaus sind der Ernährungszustand der Pilze, die Anfälligkeit der Wirtsinsekten sowie die Inokulumdichte verantwortlich für das Zustandekommen bedeutsamer Bekämpfungseffekte. Für eine praktische Nutzung wurden als mögliche Anwendungstechnologien die Kontamination von Verpackungen, die Behandlung von Fraß- bzw. Brutsubstrat unter Ausnutzung deren Lockwirkung sowie die Verwendung pheromonbeköderter Kontaminationsherde untersucht. Herausgestellt werden konnte, daß für nachhaltige kurative Bekämpfungserfolge die Dichte von P. interpunctella im Lager gering sein muß. Die Verwendung von pheromonbeköderten Kontaminatinsherden führte bei über 50% der Weibchen und etwa 80% der Männchen von P. interpunctella zur Inokulation und kann somit die Effizienz entomopathogener Pilze im Vorratsschutz erhöhen. / Strains of the entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana, Paecilomyces farinosus and Paecilomyces fumosoroseus were tested against the stored product infesting moths Plodia interpunctella HÜBNER, and Ephestia kuehniella (ZELLER). The potential of the strains was assessed by conducting experiments investigating the different factors influencing their effectiveness under stored conditions. The quality of virulence and the environmental conditions are the mean factors for a successful use of entomopathogenic fungi. Furthermore, the nutritional state of the fungi, the susceptibility of the moths and the density of inoculum influence the effect of a fungi treatment. The contamination of packing, the treatment of food and the use of contaminated TDA pheromone places was assessed for a practical method. The control of P. interpunctella is successful with slow population density of moths. The inoculation of Plodia interpunctella males and females showed that the combined action of pheromone and fungi spores could serve as potential method in the biological control of stored product infesting moths.
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Untersuchungen zur Antibiotikaresistenz und Virulenz von Aliarcobacter cryaerophilus- und Aliarcobacter butzleri-Isolaten von Wassergeflügel aus Thüringen

Müller, Eva 17 August 2021 (has links)
Einleitung: Aliarcobacter (A.) cryaerophilus und Aliarcobacter butzleri gelten weltweit als lebensmittelbedingte und zoonotische Krankheitserreger, die vorrangig über kontaminierte Lebensmittel oder Trinkwasser übertragen werden. Beim Menschen stellt sich die Infektion meist als selbstlimitierende Enteritis dar, wohingegen sie bei Tieren neben gastrointestinalen Erkrankungen mit Mastitiden, Aborten und Reproduktionsstörungen assoziiert wird. Aufgrund der engen Verwandtschaft mit den thermophilen Campylobacter spp., deren antimikrobielle Resistenz in den letzten Jahren einen starken Anstieg verzeichnet, ist es wichtig, das Resistenz- und Virulenzprofil dieser beiden Spezies zu untersuchen. Ziel der Untersuchungen: Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung der phänotypischen und genotypischen Antibiotikaresistenz sowie die Ermittlung der Virulenzprofile von Aliarcobacter cryaerophilus- und Aliarcobacter butzleri-Stämmen, die aus Kotproben von Wassergeflügel aus Thüringen isoliert worden waren. Tiere, Material und Methoden: In die Untersuchung gingen insgesamt 250 Kotproben von 135 Gänsen, 45 Flugenten, 40 Mularden und 30 Pekingenten ein, die in den Jahren 2016 und 2017 von zehn verschiedenen Wassergeflügel-Betrieben in Thüringen, Deutschland, gesammelt und auf Aliarcobacter spp. untersucht wurden. Die mit MALDI-TOF MS und multiplex-PCR identifizierten Aliarcobacter-Isolate wurden anschließend mithilfe des Epsilometertest (E-Test) auf ihre antimikrobielle Empfindlichkeit gegenüber acht verschiedenen Antibiotika getestet. Nach der DNA-Isolierung und Gesamtgenom-Sequenzierung wurde die phylogenetische Verwandtschaft sowie die Anwesenheit von potentiellen Resistenz- und Virulenzgenen mit Hilfe bioinformatischer Programme untersucht. Ergebnisse: Aus 55 Aliarcobacter-positiven Kotproben wurden mittels MALDI-TOF MS und multiplex-PCR 27 A. cryaerophilus- und 47 A. butzleri-Isolate identifiziert. Die hier untersuchten A. cryaerophilus-Stämme gehören dem Cluster I und somit dem Genomovar A. cryaerophilus gv. pseudocryaerophilus an. Zusätzlich wurde durch die phylogenetischen Untersuchungen deutlich, dass beide Aliarcobacter-Spezies eine hohe genetische Diversität aufweisen. Gleichzeitig bildeten einige A. cryaerophilus- und A. butzleri-Isolate Untergruppen. In diesen waren die einzelnen Bakterienstämme, welche zum Teil aus unterschiedlichen Betrieben stammten, nur wenige Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) voneinander entfernt. Die Bestimmung der phänotypischen antimikrobiellen Empfindlichkeit offenbarte, dass allen 74 Aliarcobacter-Isolaten die Cefotaxim-Resistenz gemein war. Ferner waren mehr als drei Viertel der Aliarcobacter-Stämme resistent gegen Streptomycin. Die 27 A. cryaerophilus-Stämme zeichneten sich durch eine Empfindlichkeit gegenüber Erythromycin, Gentamicin sowie Ampicillin und somit durch ein homogenes Resistenzprofil aus. Im Gegensatz dazu zeigten die 47 A. butzleri-Stämme ein heterogenes Resistenzprofil. Während die A. butzleri-Stämme eine deutlich höhere Resistenzrate gegenüber den Tetracyclinen aufwiesen, waren die A. cryaerophilus-Stämme vermehrt gegen Ciprofloxacin resistent. In beiden Aliarcobacter-Spezies wurde ein großes Arsenal an potentiellen Resistenzgenen identifiziert. Neben mehreren Effluxpumpen wurden verschiedene β-Laktamase-Gene sowie die bekannte Ciprofloxacin-Resistenz vermittelnde Punktmutation an Position 254 in der Chinolon-Resistenz-bestimmenden Region im gyrA-Gen detektiert. Des Weiteren wurde eine Vielzahl an potentiellen Virulenzgenen in beiden Aliarcobacter-Spezies ermittelt. Zum Repertoire gehören unter anderem ein komplettes Chemotaxis-System, ein Urease-Cluster, mehrere Flagellum-Gene sowie ein Lipid-A-Cluster. Schlussfolgerungen: Obwohl die untersuchten Isolate auf eine Region (Thüringen), einen bestimmten Wirtstyp (Wassergeflügel) und eine kurze Studienzeit (2 Jahre) begrenzt waren, deuten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit auf ein hohes Maß an genetischer Diversität unter den A. cryaerophilus- und A. butzleri-Stämmen hin. Dabei ist die Stammdiversität innerhalb beider Spezies unabhängig von der geographischen Lage, dem Ursprung der Isolate und der Wirtsart. Aliarcobacter-Isolate, die aus dem selben Betrieb stammen, wurden aufgrund ihrer klonalen Verwandtschaft der gleichen Untergruppe zugeordnet. Die Existenz phylogenetisch ähnlicher Stämme aus mehreren Betrieben, weist auf eine mögliche epidemiologische Verbindung zwischen den einzelnen Betrieben hin. Durch die Untersuchungen wurde deutlich, dass auf die Bestimmung der phänotypischen antimikrobiellen Empfindlichkeit zugunsten der genotypischen Resistenzbestimmung nicht verzichtet werden kann, da der Genotyp nur in einem beschränken Umfang mit der phänotypischen Charakterisierung übereinstimmt. Ein direkter Zusammenhang zwischen der Anwesenheit einer bekannten Mutation im gyrA-Gen und der phänotypischen Ciprofloxacin-Resistenz konnte nur bei den A. butzleri-Stämmen festgestellt werden. Die im Rahmen dieser Studie erstellte Resistenz- und Virulenzdatenbank, ermöglicht eine unkomplizierte Bestimmung des genotypischen Resistenz- und Virulenzprofiles von A. butzleri-Stämmen.
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Untersuchungen zur Virulenzassoziation des Flagellenregulons von Legionella pneumophila

Schulz, Tino 22 October 2012 (has links)
Im Fokus dieser Arbeit stand die Analyse von Faktoren, die den Zusammenbau des Flagellenapparates von Legionella pneumophila (Lp) regulieren. Mit einem kombinierten Replikations-/ Überlebensversuchs mit Lp Corby oder Lp Paris und ihren zugehörigen Regulationsmutanten wurde eine verminderte Fitness für dfliA und erstmals für drpoN, dfleQ defiziente Stämme nachgewiesen. Zur Validierung von Microarray-Daten aus Lp Paris wurden wachstumsphasenabhängige Transkriptions- und Translationsanalysen mit Lp Corby Wildtyp und drpoN, dfleQ, dfliA und dflaA defizienten Stämmen durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass die basale Expression von fliA in den späteren Phasen unabhängig von RpoN und FleQ stattfindet. In dieser Arbeit konnte erstmals der Transkriptionsstartpunkt des Hauptregulators FliA bestimmt werden. Es zeigte sich eine putative RpoD (S70) Bindungsstelle. Ein Modell zur Regulation der fliA Expression wurde weiterentwickelt. Demnach kommt es in der exponentiellen Phase durch das Zusammenwirken von RpoD und DksA, aber unabhängig von FleQ, zur basalen fliA Promotoraktivität. Durch den Übergang in die transmissive Phase und direkte oder indirekte Interaktion mit FleQ sowie dem Alarmon ppGpp scheint es zu einem Austausch des Sigmafaktors S70 gegen SS und zu einer Aktivierung der fliA Expression zu kommen. Elektronenmikroskopische Studien zeigten, dass drpoN und dfleQ defiziente Mutanten wahrscheinlich aufgrund des fehlenden Basalkörpers nicht flagelliert sind. Mutanten für dfliA, dflaA und dfliD hatten ebenfalls keine Flagelle, zeigten aber eine ungewöhnliche, gerade Hook Struktur, die den Zusammenbau des Basalkörpers demonstriert. Weiterhin wurden durch in silico Studien 15 Legionella Spezies in Bezug auf das Flagellensystem und ein putatives Chemotaxissystem untersucht. So konnte L. oakridgensis als erste Art ohne beide Systeme sequenziert werden. Andererseits konnten mit LLAP12, L. bozemanii, L. gormanii und L. lytica Stämme beschrieben werden, die beide Systeme tragen. / This work focused on the analysis of factors contributing to the regulation of the flagellum self-assembly of Legionella pneumophila (Lp). With a combined replication/survival assay with Lp Corby or Lp Paris and their corresponding regulatory mutants a reduced fitness could be verified for dfliA and for the first time for drpoN, dfleQ deficient strains. For validation of microarray-data for Lp Paris with strain Lp Corby a growth phase dependent analysis of transcription and translation rates was done with wild-type and the drpoN, dfleQ, dfliA and dflaA deficient strains. A regulation of basal fliA expression independently from RpoN and FleQ was shown in the later growth phases. Furthermore the transcriptional start site of fliA could be shown for the first time. A RpoD (S70) binding site could be identified. According to a further developed model for the regulation of the fliA expression RpoD and DksA lead to a basal fliA promotor activity, independently from FleQ. Most likely, during transition to stationary phase, direct or indirect interaction with FleQ and the alarmone ppGpp results in the exchange of the sigma factor S70 and the binding of RpoS. This leads to the activation of fliA expression. Electron microscopic studies revealed that drpoN and dfleQ deficient mutants are not flagellated caused by the missing basal body. Mutants of dfliA, dflaA and dfliD were also aflagellated, but there was a uncommon straight hook structure visible which demonstrates a filament-independent assembly of the basal body. Furthermore, in silico analysis was done with 15 Legionella species with regard to the flagellum regulation system and a putative chemotaxis system. Analysis revealed that the strain L. oakridgensis is the first strain lacking both systems. On the other hand the strains LLAP12, L. bozemanii, L. gormanii and L. lytica could be characterized as strains carrying both systems.
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Role of undecaprenyl phosphokinase in mycobacteria

Röse, Lars 12 July 2004 (has links)
Die Familie der Mykobakterien setzt sich aus pathogenen und apathogenen Vertretern zusammen. In dieser Arbeit wurden 3 Mitglieder dieser Familie für Untersuchungen herangezogen: ihr prominentester pathogener Vertreter Mycobacterium tuberculosis, der Erreger der Tuberkulose, das als Impfstoff eingesetzte Mycobacterium bovis BCG, das durch Attenuierung aus dem Rindertuberkulose-Erreger Mycobacterium bovis hervorging und das apathogene Bodenbakterium Mycobacterium smegmatis. Ein Schlüssel zum Verständnis der Mykobakterien und speziell ihrer Widerstandsfähigkeit ist die Kenntnis ihrer komplexen Zellwand. Peptidoglycan als deren Bestandteil und insbesondere der mittels Undecaprenyl-Monophosphat bewerkstelligte Transport von Peptidoglycan-Vorläufern aus dem Cytoplasma an die Zelloberfläche steht dabei im Zentrum der Zellwandbildung. In M. tuberculosis, M. bovis BCG und M. smegmatis wurden Deletionsmutanten für die Undecaprenyl-Phosphokinase (Upk) hergestellt. Für M. smegmatis wurde gezeigt, daß die delta upk Deletionsmutante, in Übereinstimmung mit Deletionsmutanten homologer Gene in anderen Bakterien, eine erhöhte Sensitivität gegenüber dem die Zellwandsynthese hemmenden Antibiotikum Bacitracin aufwies. Überraschenderweise zeigte M. tuberculosis delta upk diesen Phänotyp nicht. Weiterhin ließ sich für M. smegmatis delta upk im Vergleich zum M. smegmatis Wildtyp Peptidoglycan an der Zelloberfläche in geringerem Maße nachweisen. Eindrucksvoll zeigte sich die Bedeutung der Undecaprenyl Phosphokinase in der gestörten Entwicklung von Biofilmen im Falle der M. smegmatis delta upk Mutante. Dies galt sowohl für in vitro Bedingungen als auch für ein, im Rahmen dieser Arbeit, neu entwickeltes in vivo Modell. Vergleiche von M. tuberculosis Wildtyp und M. tuberculosis Mutante auf der Ebene von Proteom- und Transkriptom-Analysen führten zur Identifikation eines zum mykobakteriellen Fettsäure-Synthese II (FASII) System gehörenden Operons, das im Falle der upk-Deletion verstärkt exprimiert wurde und damit möglicherweise einen Kompensationsmechanismus für die fehlende Phosphokinase darstellt. Eine reduzierte Persistenz von M. smegmatis delta upk in infizierten Makrophagen legte nahe, daß Upk bei mykobakteriellen Infektionen eine entscheidende Rolle für das Überleben der Bakterien und ihre Virulenz spielt. Dies konnte erstmals für M. tuberculosis im Rahmen von Maus-Infektionsversuchen gezeigt werden. M. tuberculosis delta upk ließ sich als neues Mitglied in eine Reihe von als growth in vivo (giv) klassifizierten Mutanten einreihen. Die Herstellung von Deletionsmutanten wird als Möglichkeit betrachtet, verbesserte Impfstoffe herzustellen. Die physiologische Konsequenz der Deletion sollte bestenfalls neben einer Attenuierung des Ausgangsbakteriums (gilt besonders für M. tuberculosis) eine Überexpression protektionsrelevanter Antigene zur Folge haben. Im Vergleich zum bestehenden Impfstoff M. bovis BCG führte die Impfung von Mäusen mit M. bovis BCG delta upk sowohl zu geringerer bakterieller im Anschluß an die Vakzinierung als auch zu einer verbesserten Langzeit-Protektion gegen Tuberkulose. / The family of mycobacteria is composed of pathogenic and apathogenic bacteria. This study was performed with 3 members of this family, the most prominent pathogenic member, Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis, the vaccine strain Mycobacterium bovis BCG which was developed by attenuation of the bovine tuberculosis agent Mycobacterium bovis, and Mycobacterium smegmatis which is apathogenic and widely distributed in soil. A key to understanding mycobacteria and, especially, their resistance is to understand the complexity of their cell wall. Peptidoglycan is a major component of the cell wall and the transport of peptidoglycan precursors out of the cytoplasm to the bacterial surface by undecaprenyl monophosphate is central to cell wall synthesis. Therefore, deletion mutants of the undecaprenyl phosphokinase gene (upk) were generated in M. tuberculosis, M. bovis BCG, and M. smegmatis. In the case of M. smegmatis it was shown that a delta upk deletion mutant, as with deletion mutants of homologous genes in other bacteria, exhibited an increased sensitivity to the antibiotic bacitracin, indicating that cell wall synthesis was hampered. Surprisingly, M. tuberculosis delta upk did not exhibit this phenotype. Furthermore, a lower level of peptidoglycan was detected on the cell surface of an M. smegmatis delta upk mutant compared to M. smegmatis wildtype. Relevance of the undecaprenyl phosphokinase was demonstrated by impaired biofilm development in the case of the M. smegmatis delta upk mutant. This was observed in vitro as well as in vivo using an animal model which was newly developed in this thesis. A fatty acid synthase II (FASII) system related operon revealed by comparative proteome- and transcriptome-analyses comparing M. tuberculosis wildtype and M. tuberculosis delta upk mutant, and may reflect a compensatory mechanism for the loss of upk. Reduced persistence of M. smegmatis in infected macrophages suggested a decisive role of Upk in mycobacterial infection concerning survival and virulence of bacteria. This was later demonstrated to be true for M. tuberculosis in a mouse model. M. tuberculosis delta upk was, therefore, classified as a new member of the group of growth in vivo (giv) mutants. Construction of deletion mutants is a strategy to identify improved vaccines. Ideally, the physiologic consequences of a gene deletion would result in attenuation of the modified bacterium (especially in the case of M. tuberculosis) and overexpression of antigens relevant for protection. Compared to the existing vaccine M. bovis BCG, vaccination of mice with M. bovis BCG delta upk exhibited a lower bacterial load upon vaccination as well as an improved long-lasting protection against M. tuberculosis infection.

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