L’infection chronique par le virus de l’hépatite C (VHC) conduit au développement de pathologies hépatiques, telles que la fibrose dont le terme évolutif est la cirrhose sur laquelle peut se développer un carcinome hépatocellulaire. Les observations cliniques indiquent que le VHC interfère avec la voie de signalisation du Transforming Growth Factor β (TGFβ). Entre autres fonctions, cette cytokine induit la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), ce qui favorise la migration cellulaire et l'invasion tumorale. Le but de cette thèse est d'analyser l'impact des protéines non structurales du VHC sur la voie de signalisation du TGFβ.Nous avons montré que le réplicon subgénomique du VHC induit une augmentation de la signalisation du TGFβ résultant en une plus forte expression de gènes associés à l’EMT et induisant un phénotype d’EMT. L’expression de la protéase virale NS3-4A seule, augmente et prolonge la phosphorylation de Smad2/3 en aval du récepteur du TGFβ et renforce l’expression de certains gènes cibles du TGFβ. L’analyse des interactions entre les protéines du VHC et les protéines de la voie du TGFβ a permis d’identifier l’interaction entre NS3-4A et la protéine Smurf2. Le réplicon subgénomique ou la protéase NS3-4A ont des rôles antagonistes à la protéine Smurf2 sur la voie de signalisation du TGFβ. L’analyse globale des gènes régulés par le TGFβ dans les cellules exprimant le réplicon subgénomique a permis d’identifier, que dans ces cellules, le TGFβ induit une réponse pro-tumorale.Ces résultats montrent que NS3-4A induit une plus forte réponse des cellules au TGFβ, en inhibant la fonction de Smurf2 dans le rétrocontrôle négatif de la voie du TGFβ. Ce nouveau mécanisme d’interférence du VHC avec la voie du TGFβ pourrait contribuer à l’EMT des cellules hépatocytaires infectées favorisant ainsi la cancérisation. Ce travail apporte de nouvelles pistes dans la compréhension des mécanismes associés à la cancérisation chez les patients chroniquement infectés par le VHC. / Chronic infection by hepatitis C virus (HCV) leads to the development of hepatic diseases like fibrosis which evolves into cirrhosis on which can develop hepatocellular carcinoma. Clinical observations indicate that HCV interferes with the TGFβ signaling pathway. Among other functions this cytokine induces epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) promoting cell migration and tumor invasion. The aim of this study is to analyze the impact of HCV non structural proteins on TGFβ signaling pathway. We have demonstrated that the HCV subgenomic replicon induces an enhancement of the TGFβ signaling pathway resulting in a strong expression of EMT associated genes and inducing EMT phenotype. The expression of the NS3-4A viral protein alone enhances and stabilizes Smad2/3 phosphorylation downstream TGFβ receptor and increases the expression of some TGFβ target genes. The analysis of interactions between HCV proteins and proteins of the TGFβ signaling pathway has shown the interaction of NS3-4A with Smurf2 protein. HCV subgenomic replicon and NS3-4A have antagonistic roles to Smurf2 on TGFβ signaling pathway. The global analysis of genes regulated by TGFβ in cells expressing HCV subgenomic replicon indicates that in these cells TGFβ induces a pro-tumor answer.These results show that NS3-4A enhances TGFβ answer by inhibiting Smurf2 functions in the negative feedback loop of the TGFβ pathway. This new mechanism of HCV interference with the TGFβ pathway can contribute to EMT in infected hepatocytes thus promoting carcinogenesis. This work provides new leads to understand the mechanisms associated to carcinogenesis in HCV chronically infected patients.

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Le VHC est une cause majeure de cancer du foie. Le traitement actuel est caractérisé par à un cout élevé, la présence de toxicité et l’émergence de résistance virale. Dans la 1ère partie de ma thèse, je me suis intéressé à l’entrée virale. L’entrée est nécessaire pour l’initiation ; la dissémination et le maintien de l’infection et représente ainsi une cible intéressante dans le développement de thérapies antivirales : CD81 et SRBI sont les 1ers facteurs décrits comme importants pour l’entrée : Nous avons confirmé leur rôle clé dans l’entrée et les étapes suivant l’entrée. De plus, nous avons montré leur rôle crucial dans la transmission cellule/cellule. Le VHC infecte principalement les hépatocytes, nous avons étudié en seconde partie de ma thèse le tropisme restreint du VHC aux hépatocytes. En définissant les facteurs essentiels à l’infection de cellules non hépatiques et en développant un modèle cellulaire afin d’identifier de nouveaux facteurs d’assemblage et de réplication du VHC. / HCV infection is the leading cause of chronic liver disease. The current SOC is still limited by high costs, toxicity and emergence of viral resistance. In the first part of my thesis we focused our workon viral entry. Viral entry is required for initiation, spread, and maintenance of infection, and thus is a promising target for the development of new antiviral therapies. CD81 and SR-BI are the first entry factors identified as important for HCV entry. In our work we confirmed their crucial role in entry, especially at the post-binding step. In addition we proved their key role in viral dissemination through the cell-cell transmission. As HCV mainly infects hepatocytes, we studied in the second part of my thesis, the restricted cellular tropism of HCV to hepatocytes and we defined the minimal host factors rendering non hepatic cell lines susceptible to HCV infection by the establishment of a powerful tool to identify new assembly and replication factors.

Accès limité / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le virus de l'hépatite C (HCV) représente un problème de santé publique à l'échelle mondiale. Les thérapies actuelles ne permettent pas de guérir tous les patients infectés par le HCV et certains antiviraux ont des effets secondaires importants. Dans la première partie de ma thèse, nous avons identifié des combinaisons d'antiviraux à action directe (DAA) et d'inhibiteurs d'entrée caractérisés par un effet synergique dans la prévention et le traitement du HCV dans des modèles de culture cellulaire et les souris uPA-SCID avec un foie chimérique. Ceci représente une nouvelle stratégies de lutte contre l'infection par le HCV. Dans la seconde partie de ma thèse, nous avons démontré que le mode de transmission du HCV de cellule à cellule est la voie de transmission dominante dans les modèles de culture cellulaire. De plus, les virus résistant aux DAA se propagent efficacement grâce à la transmission de cellule à cellule. L'inhibition de la transmission de cellule à cellule en utilisant des inhibiteurs d'entrée est un moyen efficace pour empêcher l'émergence de virus résistant aux DAA et pour potentialiser l'efficacité antivirale des DAA pour éradiquer l'infection par le HCV. / Hepatitis C virus (HCV) poses a threat to global health with infecting about 170 million people. Current therapies cannot cure all the patients infected with HCV and have obvious side effects. In the first part of my thesis, we uncovered combinations of direct-acting antivirals (DAAs) and entry inhibitors caracterized by a synergistic effect in prevention and treatment of HCV infection using HCV cell culture models and human liver chimeric uPA-SCID mice, thereby providing a new strategy to control HCV infection. In the second part of my thesis, we demonstrated that HCV cell-cell transmission is the dominant transmission route in cell culture models and that DAA-resistant HCV spread efficiently through cell-cell transmission to develop viral resistance. Blocking cell-cell transmission using entry inhibitors allows to prevent the emergence of DAA-resistant virus and potentiates the antiviral efficacy of DAAs to clear HCV infection. In summary, we provide novel strategies to enhance antiviral efficacy by combining entry inhibitors and DAAs and to prevent viral resistance by blocking viral cell-cell transmission.

Les vascularites cryoglobulinémiques associées au virus de l'hépatite C (VC-VHC) sont caractérisées par une expansion clonale de lymphocytes B mémoires anergiques CD27+IgM+CD21-/low (Bm21-), un défaut quantitatif en lymphocytes T régulateurs (Tregs) et une polarisation Th1. Les antiviraux d'action directe sans interferon (DAAs) sont très efficaces chez les patients VC-VHC mais leur mécanisme d'action sur l'immunité cellulaire reste inconnu. Nous montrons que les DAAs normalisent la plupart des perturbations de l'homéostasie lymphocytaire B et T, en diminuant l'expansion des Bm21- et T folliculaires, et en augmentant les T régulateurs (Tregs). Nous avons étudié l'effet des Bm21- sur les sous-populations lymphocytaires T, et les réactivités de leur récepteur B. Nous montrons que les Bm21- stimulés par le CpG favorisent la sécrétion d'IFNγ par les T effecteurs et induisent leur prolifération. Inversement, les Bm21- stimulés par CpG diminuent la capacité proliférative des Tregs. Nous montrons la diversité intraclonale des IgM mutés des Bm21-, conduite par maturation d'affinité antigène dépendante. Les anticorps (Ac) des Bm21- ont une activité facteur rhumatoïde (FR) mais ne sont ni polyréactifs, ni autoréactifs contre les autoantigènes ubiquitaires. Les Ac des Bm21- ne présentent pas de réactivité croisée contre des antigènes viraux du VHC. Les Bm21- stimulés par CpG ont une signature transcriptomique révélant un phénotype non tolérogène. Ainsi, ces résultats suggèrent le rôle majeur des Bm21- dans le défaut tolérance des patients CV-VHC, à la fois par la stimulation CpG conduisant à une réactivation des Bm21- anergiques, et par l'expression clonale des IgM à activité FR. / Hepatitis C virus-associated cryoglobulinemia vasculitis (HCV-CV) is characterized by an abnormal clonal expansion of anergic CD27+IgM+CD21-/low memory B cell (Bm21-), a quantitative defect in regulatory T cells (Tregs) and Th1 profile. Interferon-free direct-acting antivirals (DAAs) proved to be very effective in patients with HCV-CV but their mechanisms of action and their effects on cellular immunity remain poorly defined. Our results indicate that DAAs effectively normalizes many of the disturbances in peripheral B- and T-lymphocyte homeostasis of HCV-CV patients, by reducting Bm21- and T follicular helper expansion and promoting Tregs. Then, we investigated the effects of Bm21- on T-cell subpopulations and study the reactivities of their B-cell receptors. We show that CpG-stimulated Bm21- promote the secretion of IFNγ by effector T cells and induce their proliferation. Conversely, stimulated Bm21- reduce the proliferative capacity of regulatory T cells. Bm21- B-cell expansions show intraclonal diversity of highly mutated IgM antibodies that were shape by an antigen-driven maturation process. Bm21- antibodies possess rheumatoid factor activity but are neither polyreactive nor recognize ubiquitous autoantigens. No crossreactivity of Bm21- antibodies against several HCV antigens was observed. We also identify a transcriptional signature in CpG-stimulated Bm21- revealing a phenotype sufficient to break the immune tolerance. Thus, these results strongly suggest a major role for Bm21- in defective tolerance of HCV-CV patients, both through CpG stimulation leading to reactivation of anergic Bm21-, and through the clonal expression of IgM antibodies with RF activity.

Résumé confidentiel / Résumé confidentiel

Le virus de l’hépatite C (VHC) est l’un des principaux facteurs étiologiques du carcinome hépatocellulaire. Le traitement des hépatites virales C a été récemment amélioré grâce à une trithérapie (interféron, ribavirine et anti-protéase virale). Néanmoins l’importance des effets secondaires et l’émergence de mutants résistants nécessitent de découvrir de nouveaux antiviraux. Dans ce contexte, notre équipe a récemment découvert que les phosphatidylinositol 4-kinases de type III (PI4KIIIα et PI4KIIIβ) étaient indispensables à la propagation du virus dans une lignée hépatique humaine, et ce, à 2 étapes de son cycle biologique : l’entrée et la réplication. L’objectif du présent travail était de poursuivre la validation de ces nouvelles cibles thérapeutiques potentielles, en approfondissant nos connaissances sur la dépendance du virus à l’égard de ces kinases au cours de son entrée. Pour cela, nous avons utilisé le modèle des hépatocytes humains primaires, système in vitro plus proche du contexte physiologique que les modèles utilisés jusqu’à présent et qui étaient basés sur l’exploitation de lignées. Deux axes ont été développés : Vérification de l’importance de l’activité kinase des PI4KIIIs au cours de l’entrée du VHC dans les hépatocytes humains primaires, à travers une approche chimique ; Validation de l’implication de ces kinases et de leur activité enzymatique au cours de l’entrée virale grâce à une approche génétique basée sur l’ARN interférence et la restauration de phénotype. En parallèle, nous avons étudié l’expression de PI4KIIIα au cours de pathologies hépatiques. Nos résultats suggèrent une implication de PI4KIIIα au cours de l’entrée du VHC dans les hépatocytes humains primaires, mais restent à confirmer quant à l’implication de PI4KIIIβ. Par ailleurs, l’analyse de l’expression de PI4KIIIα dans le carcinome hépatocellulaire (CHC) conduit à proposer cette kinase comme un nouveau marqueur moléculaire, qui pourrait améliorer les modèles de pronostic déjà établis et pourrait conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients atteints d’un CHC, quelque soit l’étiologie. / Hepatitis C virus (HCV) is one of the leading causes of hepatocellular carcinoma. Therapeutic treatment against the virus has been recently improved by a tritherapy including pegylated interferon, ribavirin and antiviral protease. Nevertheless, the importance of side effects and the emergence of resistant mutants require the development of new antivirals. In this context, our team has recently discovered that Type III phosphatidylinositol 4-kinases (PI4KIIIα and PI4KIIIβ) are essential for the propagation of the virus in a human hepatic cell line at the entry and replication steps. To further characterize these potential therapeutic targets, we investigate the implication of these kinases during the HCV entry, using primary human hepatocytes, a model closer to the in vivo conditions. Two lines of research were developed: Verification of the importance of the kinase activity of PI4KIIIs during HCV entry in primary human hepatocytes, through a chemical approach; Validation of the involvement of these kinases and their enzymatic activity during viral entry through a genetic approach based on RNA interference and phenotype rescue. In parallel, we studied the expression of PI4KIIIα in liver diseases. Our results suggest the involvement of PI4KIIIα in HCV entry; the involvement of PI4KIIIIβ needs to be confirmed. The analysis of PI4KIIIα expression in hepatocellular carcinoma led us to propose this kinase as a new molecular marker, which could improve the already established prognosis models and could lead to the development of new therapeutic approaches.

L'identification de biomarqueurs et de nouvelles cibles thérapeutiques constitue un enjeu majeur de la recherche biomédicale visant au développement de la médecine personnalisée. L'objectif de cette thèse est d'étudier, à l'aide de puces à ADN, les modulations transcriptionnelles associées à la pathogénèse et à la réponse thérapeutique dans le cas de deux pathologies: l'infection par le Virus de l'Hépatite C (VHC) et la Polyarthrite Rhumatoïde (PR).Des biomarqueurs prédictifs de la réponse au traitement standard interféron ont été identifiés grâce à un modèle cellulaire ex vivo. Par ailleurs, l'analyse de données d'expression de deux modèles d'infection par le VHC (réplicon et infectieux) a permis de mettre en évidence les modulations transcriptionnelles résultant de l'activité antivirale de la chloroquine, une alternative potentielle anti-VHC. Dans le cas de la PR, nous avons identifié des biomarqueurs dont l'expression est corrélée au succès thérapeutique de l'anti-TNF Enbrel. / The identification of biomarkers and new therapeutic targets is a major challenge of biomedical research for the development of personalized medicine. The objective of this thesis is to study, using DNA microarrays, transcriptional modulations associated with the pathogenesis and therapeutic response in the case of two diseases: infection with Hepatitis C Virus (HCV) and Rheumatoid Arthritis (RA).Predictive biomarkers of response to standard interferon treatment were identified using an ex vivo cell model. Furthermore, analysis of expression data of two models of infection with HCV (replicon and infectious) has highlighted the transcriptional modulations resulting from the antiviral activity of chloroquine, a potential anti-HCV alternative. In the case of RA, we have identified biomarkers whose expression correlates with the therapeutic success of Enbrel anti-TNF drug.

La modélisation de maladies métaboliques hépatiques et les approches de thérapie cellulaire nécessitent de disposer d’une source fiable et illimitée d’hépatocytes. Grâce à leurs propriétés spécifiques, les cellules souches pluripotentes peuvent représenter une telle source. Nous avons tout d’abord mis au point une approche originale pour différencier une lignée de cellules souches embryonnaires humaines européenne, générée en conditions GMP-compatibles, en hépatocytes fonctionnels in vitro et in vivo après transplantation dans un modèle murin d'insuffisance hépatique aiguë. Nous avons ensuite utilisé les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) spécifiques d’un patient homozygote pour une mutation entrainant une absence de récepteur des lipoprotéines de basse densité (RLDL) afin de modéliser l'hypercholestérolémie familiale (HF) in vitro. Nous avons amélioré notre approche pour différencier ces iPSC en hépatocytes plus matures et polarisés car les hépatocytes sont les seules cellules capables de dégrader le cholestérol via la bile. Nous avons montré que ce modèle reproduit la physiopathologie de l'HF et établit la preuve de concept de la correction génétique ciblée par la technologie CRISPR/Cas au locus AAVS1 par la restauration de l’expression, inductible par les statines, et de la fonctionnalité du récepteur. Nous avons également mis en évidence que le RLDL ne semble pas impliqué dans l'entrée du virus de l'hépatite C (VHC) mais plutôt dans les étapes tardives de la morphogénèse virale. Ce modèle pourra désormais servir à l’étude physiopathologique de différents patients HF, au criblage de nouvelles drogues hypocholestérolémiantes et antivirales ainsi qu'à de nouvelles approches thérapeutiques. / Liver metabolic diseases modeling and cell therapy approaches require a a reliable and well-characterized cell source. Due to their specific properties, pluripotent stem cells represent a credible alternative to primary human hepatocytes. Thus, we have defined a new approach to differentiate a European human embryonic stem cell line, generated in GMP-compatible conditions, into hepatocytes that are functional in vitro and in vivo after transplantation into a murine model of acute liver failure. We have then used induced pluripotent stem cells from a homozygous patient with a mutation leading to an absence of the low-density lipoproteins receptor (LDLR) to model familial hypercholesterolemia type IIA (FH) in vitro. As hepatocytes are the only cells able to metabolize cholesterol into bile acids, we have improved our approach to differentiate these iPSC into hepatocytes displaying cell functional organization and polarization. We have shown that our model reproduced FH physiopathology and have also restored, by the genetic targeted correction at the AAVS1 locus using CRISPR/Cas technology and subsequent hepatocyte differentiation, the LDLR expression – inducible by statins - and functionality. Moreover, we have demonstrated that the LDLR does not seem to be involved in hepatitis C virus entry or replication but rather in viral morphogenesis steps. This model will be useful to develop new cholesterol-lowering and antiviral drugs as well as new cell therapy options. Furthermore, it can be applied to similar studies for other liver metabolic disorders.