Circadiane Uhren sind endogene Oszillatoren, die tägliche Rhythmen in Physiologie, Metabolismus und Verhalten steuern. Auf molekularem Level wird die Dynamik der circadianen Oszillation über ein genregulatorisches Netzwerk aus transkriptionellen-translationalen Rückkopplungsschleifen gesteuert. Posttranslationale Modifikationen von Uhrproteinen sind für eine präzise Justierung der circadianen Periode essentiell. Dabei spielt die Phosphorylierung von Uhrproteinen für die Regulation von Aktivität, Stabilität und intrazellulärer Lokalisation eine wichtige Rolle. Bisher sind verschiedene Kinasen als Modulatoren der circadianen Uhr charakterisiert worden, jedoch ist eine funktionale Rolle von Protein Phosphatasen bisher nur unzureichend untersucht. In dieser Arbeit wurde mittels eines RNAi-basierten Screenings in oszillierenden humanen Zellen untersucht, ob sich die gezielte Depletion katalytischer Untereinheiten der Serin/Threonin-Phosphatasen auf die normale Oszillationsdynamik auswirkt und welche Rolle ausgewählte Phosphatase-Kandidaten für die posttranslationale Kontrolle des molekularen Oszillators spielen. Die RNAi vermittelte Depletion von Protein Phosphatase 4 führte gewebe- und speziesübergreifend zu einer signifikant kurzen circadianen Periode, während die Überexpression von wildtypischer Pp4c in einer stark reprimierten Amplitude resultierte. Mechanistische Untersuchungen zur funktionellen Relevanz von PP4c für die Regulation der circadianen Uhr zeigten, dass PP4c womöglich eine duale Rolle spielt: Einerseits ist PP4c in die direkte Aktivierung des Bmal1-Promotors über RRE-Elemente involviert. Anderseits wirkt PP4c inhibierend auf die CLOCK/BMAL1-vermittelte, E-Box getriebene Genexpression. Ein favorisiertes Modell fundiert auf der Vermutung, dass eine durch PP4c induzierte Modulation des Phosphorylierungsstatus von BMAL1 zu einem stabilen, aber transktiptionsinaktiven BMAL1 und damit zu einer verstärkten Repression der Uhrgentranskription führt. / Circadian clocks are endogenous oscillators that drive daily rhythms in physiology, metabolism and behavior. On the molecular level the dynamics of circadian oscillations are regulated by a transcriptional-translational gene-regulatory network. Posttranslational modifications of clock proteins are essential for the precise timing of an about 24 hour-period. Among these modifications, protein phosphorylation plays an important role in regulating activity, stability and intracellular localization of clock proteins. Several kinases were characterized as regulators of the circadian clock. However, the function of protein phosphatases, which balance phosphorylation events, in the mammalian clock mechanism is less well understood. By using a systematic RNAi-based approach in oscillating human cells, this work aimed to study the impact of catalytic subunits of Serine/Threonin-phosphatases on normal circadian dynamics and the functional role of potential candidates in the posttranslational control of the mammalian molecular oscillator. This study demonstrates, that genetic depletion of the catalytic subunit of protein phosphatase 4 results independently from tissue and species in a significant shorter period, whereas overexpression of wildtype PP4c results in a severely reduced amplitude rhythm. Mechanistic experiments to uncover the functional relevance of PP4c in the regulation of the circadian clock showed, that PP4c plays a dual role: Firstly, PP4 is involved in the direct activation of the Bmal1-promotor via RRE elements. Secondly, PP4c is inhibiting the CLOCK/BMAL1-mediated gene expression. A favored model is based on the assumption, that PP4c-induced modulation of the phosphorylation status of BMAL1 leads to a more stable and transcriptional inactive protein and thereby to a repression of the transcription of clock genes.

Viele biologische Prozesse im Verhalten von ganzen Organismen, aber auch in den Prozessen und der biochemischen Zusammensetzung von Zellen zeigen einen zirkadianen Rhythmus, also einen Rhythmus mit einer Periode von etwa 24 Stunden. Diese 24-Stunden-Rhythmen sind in der Genexpression auf allen Ebenen zu finden: von der Tran- skriptionsinitiation bis zur Proteindegradation. Auf Transkriptebene, zirkadiane mRNA-Produktion und mRNA-Abundanz ist umfassend gemessen. Auf der anderen Seite, zirkadiane posttranskriptionelle Regulation ist weit weniger verstanden. In dieser Arbeit untersuche ich, wie bisher ungemessene, posttranskriptionelle Prozesse die rhythmischen Eigenschaften der Genexpression beeinflussen. Dazu beschreibe ich die Lebensstadien eines Bio-Moleküls mit einem Modell-Motiv, einer einfachen Differentialgleichung mit zeitabhängigen, rhythmischen Raten. Als erstes diskutiere ich die Einschränkungen von Phase und Amplitude zirkadianer Transkripte, die nur von konstanter PTR beeinflusst werden. Bei vielen gemessenen Transkripten sind diese Einschränkungen verletzt. In diesen Fällen muss es eine rhythmische PTR geben. Ich untersuche, welche rhythmische PTR diese Fälle erklären können und führe einen statistischen Test ein, der auf unbeobachtete, rhythmische PTR testet. Durch die Analyse zweier Datensätze von Mausleber und -niere finde ich, dass 18% aller zirkadianen Gene in Niere und 34% in Leber rhythmisch posttranskriptionell reguliert sind. Im zweiten Teil analysiere ich weitere Aspekte von PTR in einem Hypothesen-getriebenen Ansatz. Ich zeige, dass Spleißen mit einem Rhythmus von 24 Stunden 12 Stunden-Rhythmen in der Abundanz von mRNA erzeugen kann. Als nächstes schlage ich ein Modell vor, das rhythmische Degradation von Mitgliedern der zirkadianen Uhr beschreibt. Schließlich erweitere ich das Modell-Grundmotiv zu einer partiellen Differentialgleichung (PDG), die das “Altern” von Molekülen beschreibt. / In almost all organisms on Earth, many behavioral, physiological, and biochemical activities oscillate with a circadian rhythm, a rhythm with a period of about 24 hours. In gene expression, the 24-hour-rhythm can be found on all stages: from transcription initiation to protein degradation. On the transcript level, circadian mRNA production and mRNA abundance are comprehensively charted through numerous genome-wide high throughput studies. Circadian post-transcriptional regulation, however, is less well understood. In this thesis, I will investigate how unobserved post-transcriptional processes influence rhythmic properties of gene expression. To this end, I quantify the life-stages of biomolecules using one modeling motif, a simple ordinary differential equation describing production and degradation with time-dependent rhythmic rates. This basic modeling motif is systematically varied to examine and discuss various influences of post-transcriptional regulation (PTR) on circadian mRNA expression. I first discuss the restrictions of rhythmic phase and amplitude of circadian transcripts influenced by non-rhythmic PTR. For many genes these restrictions are violated and we have to assume the existence of a rhythmic PTR. I discuss which rhythmic PTR can explain these findings and further introduce a statistical test to quantify the extent of unobserved rhythmic PTR. Analyzing two data sets on mouse liver and kidney, I find that 18% of circadian genes in kidney and 34% in liver are under rhythmic post-transcriptional control. In a second part, I analyze more specific aspects of PTR in a hypothesis-driven approach. Firstly, I find that splicing with a rhythm of 24 hours is able to generate 12-hour rhythms in abundance of mature mRNA. Secondly, I propose and analyze a model to investigate rhythmic degradation of core clock genes. And finally, I extend the core modeling motif to a partial differential equation (PDE) model that accounts for the “aging” process of molecules.

Das Cyanobakterium Synechococcus elongatus PCC 7942 besitzt eine circadiane Uhr, die aus nur drei Proteinen besteht: KaiA, KaiB und KaiC. Durch 24stündige Phosphorylierungs- und ATPase-Zyklen des KaiC wird u. a. die globale Genaktivität gesteuert. Der Anteil circadian regulierter Gene sowie die Zahl und Organisation der kai-Gene scheinen in Cyanobakterien stark zu variieren. Um die Komponenten eines potenziell komplexeren Kai-Systems zu untersuchen, wurde in der vorliegenden Arbeit Synechocystis sp. PCC 6803 als Modell ausgewählt. In dessen Genom werden ein KaiA- sowie jeweils drei divergierte KaiB- und KaiC-Proteine kodiert. Durch in vitro Studien konnte die Aktivität von KaiC1 und KaiC3 erstmals charakterisiert werden: KaiC1 zeigte eine KaiA-abhängige Kinase-Aktivität und bildet mit KaiA und KaiB1 vermutlich einen „Standard-Oszillator“. KaiC3 wies die typischen Kinase-, ATP-Synthase- und ATPase-Aktivitäten des KaiC aus Synechococcus auf. Deren Ausprägung erschien jedoch modifiziert. Ferner wurde die zeitliche und räumliche intrazelluläre Verteilung des KaiA sowie der KaiC-Proteine aufgeklärt. Die Kai-Proteine verhielten sich insgesamt abweichend von den Homologen aus Synechococcus, was das Fehlen einer circadianen Rhythmik unter den gewählten Wachstumsbedingungen erklärt. Angesichts kontroverser Diskussionen über die molekularen Details der Assemblierung von KaiC und KaiB aus Synechococcus wurde in einem ergänzenden Projekt demonstriert, dass die gesteigerte Phosphorylierung des KaiC bei 4°C zur Bildung stabiler KaiC-KaiB-Komplexe führt. Die dabei etablierte Methode erlaubt Untersuchungen der KaiC-KaiB-Interaktion unter Verwendung der Wildtyp-Proteine. / The cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 harbors a circadian clock consisting of only three proteins: KaiA, KaiB and KaiC. 24hour phosphorylation and ATPase cycles of KaiC control global gene activity. The number of circadian regulated genes as well as the number and organization of kai-genes seem to vary strongly among cyanobacteria. To analyze the components of a probably more complex Kai-system, Synechocystis sp. PCC 6803 was chosen as a model in the present study. Its genome encodes one KaiA- and each three KaiB and KaiC proteins. The activity of KaiC1 and KaiC3 was – for the first time - characterized by in vitro studies: KaiC1 displayed a KaiA-dependent kinase activity and builds a ,standard oscillator‘ together with KaiA and KaiB1. KaiC3 displayed the typical kinase, ATP synthase and ATPase activities of KaiC from Synechococcus. However, the characteristics of the activities appeared to be modified. Moreover, the temporal and spatial intracellular distribution of KaiA and the KaiC proteins was elucidated. Altogether, the Kai proteins performed different from their Synechococcus homologs, explaining the lack of circadian rhythms under the chosen growth conditions. In view of the controversial discussions about the assembly of KaiC and KaiB from Synechococcus, an additional project was set up to demonstrate that increased auto-phosphorylation of KaiC at 4 °C leads to the formation of stable KaiC-KaiB-complexes. In this context, a protocol was established that allows to analyse KaiC-KaiB interactions using wild-type proteins.

Hämoxygenasen (HO) katalysieren unter der Aufnahme von molekularen Sauerstoff und der Freisetzung von Kohlenmonoxid (CO) und Eisen (Fe2+) die Oxidation von Häm zu Biliverdin. HO-1, eine induzierbare Isoform der HO, wird durch ihre Aktivität mit zellschützenden, antiinflammatorischen und antiapoptotischen Eigenschaften in Verbindung gebracht. Dabei gilt insbesondere das CO als Mediator dieser Eigenschaften. Die molekularen Wechselwirkungen und genregulatorischen Funktionen von CO sind allerdings noch weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurden mittels cDNA Microarray-Technologie Gene identifiziert, die in der murinen Leber nach Inhalation von CO oder nach pharmakologischer Induktion von mHO-1 eine differentielle Expression der mRNA aufwiesen. Diese Gene konnten in einen Zusammenhang mit der circadianen Uhr gebracht werden und führten zu der Hypothese, dass CO einen direkten Einfluss auf den molekularen Oszillator der Inneren Uhr hat. Dies konnte in primären Hepatozyten durch eine veränderte circadiane Expression der essentiellen Uhrgene mPer2 und mRev-erba nach CO-Behandlung bestätigt werden. Weiterhin wurde für mHo-1 eine, bisher unbekannte, circadian regulierte Genexpression in primären Hepatozyten und der murinen Leber gezeigt. Es konnte die Funktionalität einer speziesübergreifend, konservierten E-Box im Promotor von mHo-1 nachgewiesen werden, die diese Regulation initiieren kann. Bezüglich der circadianen Oszillation von essentiellen Komponenten der circadianen Uhr zeigten mHo-1 Knockout-Fibroblasten eine veränderte Genexpression. Die Ergebnisse dieser Arbeit demonstrieren eine enge Kopplung des Häm-Metabolismus mit der circadianen Uhr. HO-1 scheint dabei in diesem regulativen Netzwerk eine funktionale Rolle zu spielen. Einerseits könnte diese Verbindung eine weitere Kommunikation der circadianen Uhr mit metabolischen Prozessen darstellen und bietet andererseits eine neue Sichtweise bezüglich der Aufklärung der zellschützenden Eigenschaften von HO-1. / Heme oxygenases (HO) catalyze the oxidation of heme and generate the bile pigment biliverdin, ferric iron and carbon monoxide (CO). Endogenous produced CO, especially due to the activity of the inducible isoform HO-1, has been associated with cytoprotective, anti-inflammatory and –apoptotic functions. CO is a signalling molecule, but the molecular interactions and gene regulatory functions are still unknown. In the present thesis a cDNA microarray identified genes in murine liver which were expressed differentially after inhalation of CO and pharmacological induction of HO-1. Interestingly, the expression of the candidate genes is directly controlled by the molecular circadian clockwork, and led to the hypothesis that CO has an influence on the molecular oscillator of the circadian clock. It was shown, that CO influences the gene expression of essential clock genes in primary hepatocytes. Furthermore, it was demonstrated that the gene expression and activity of mHO-1 is circadian regulated in primary hepatocytes and liver, and is reasonably based on a functional E-box in the promoter of the mHO-1 gene. The deficiency of HO-1 in HO-1 knockout mice displayed differential gene expression profiles in magnitude and amplitude of the circadian oscillations of essential clock and output genes. In this work it was shown, that the heme metabolism is coupled very close to the molecular circadian oscillator. HO-1 plays a functional role in the regulation of this regulatory network, which could provide insights into the understanding of cytoprotective properties of HO-1.

Die zirkadiane Uhr ist ein endogenes Zeitmesssystem, das die Anpassung physiologischer Prozesse an die geophysikalische Zeit ermöglicht. Die zirkadiane Uhr besteht aus einem zentralen Schrittmacher und peripheren Uhren in jeder Zelle. Bei Säugern ist eine bestimmte Anzahl von Uhr-Genen in regulatorischen Schleifen miteinander verbunden, wodurch Oszillationen in der Expression der Uhr-Gene sowie in zahlreichen Zielgenen erzeugt werden. Zielgene der zirkadianen Uhr sind unter anderem an zellulären Prozessen beteiligt, die eine Rolle bei der Tumorentstehung und -progression spielen. Funktionsstörungen der zirkadianen Uhr stehen im Zusammenhang mit verschiedenen Krankheitsbildern, unter anderem Krebs. Ziel dieses Projekts war es, die Rolle der zirkadianen Uhr bei der Tumorentstehung und entwicklung zu untersuchen. Der Fokus lag dabei auf tumorspezifischen Stoffwechselwegen. Die Rolle einer deregulierten zirkadianen Uhr wurde in einem in vitro Zellmodel untersucht. Die SW480 Zelllinie wurde aus einem Primärtumor isoliert und die SW620 Zelllinie aus einer Lymphknotenmetastase desselben Patienten. Die untersuchten Zelllinien zeigten deutliche Unterschiede in Bezug auf ihre Uhr Phänotypen mit globalen Konsequenzen auf oszillierende Gene und Stoffwechselwege. Die Runterregulation des Uhrgens Bmal1 führte in SW480 Zellen zu einem metastatischen Phänotyp, der stark dem von SW620 Wildtypzellen ähnelte. Darüber hinaus führte die Runterregulation von Bmal1 zu einer Veränderung des metabolischen Phänotyps und zu einer modifizierten Antwort auf die Behandlung mit einem Glykolyseinhibitor. Die in diesem Projekt erzielten Ergebnisse unterstützen die postulierte Rolle von Bmal1 als Tumorsuppressor und verdeutlichen das reziproke Wechselspiel zwischen der zirkadianen Uhr und dem Stoffwechsel von Krebszellen und zeigen mögliche Auswirkungen einer deregulierten Uhr auf den Zellmetabolismus während der Tumorentwicklung. / The circadian clock is an internal timing system that allows the entrainment of physiological and behavioural processes to the geophysical time with a periodicity of about 24 hours. It consists of a central pacemaker and peripheral clocks in every cell. In mammals, a distinct set of genes is interconnected in regulatory feedback loops, thereby generating oscillations in gene expression in the core-clock itself as well as in many target genes. Clock target genes are, among others, involved in cellular processes connected to tumour development and progression, including metabolic pathways, drug response pathways and the cell cycle. Malfunctions of the circadian clock are associated with different pathologies including cancer. The aim of this project was to study the role of the circadian clock in tumour development and progression with a focus on cancer metabolism and treatment response. The role of a deregulated clock was investigated in SW480 cells derived from a primary tumour and SW620 cells derived from a lymph node metastasis of the same patient. The investigated cell lines showed clear differences with respect to their clock phenotypes with consequences on global oscillating gene expression and alterations in metabolic pathways. A knockdown of the core-clock gene Bmal1 in SW480 cells induced a metastatic phenotype similar to SW620 wild type cells, as indicated by faster proliferation, lower apoptosis rate and a highly energetic metabolic phenotype. Furthermore, Bmal1-KD induced metabolic phenotype rewiring as seen by altered glycolytic activity and mitochondrial respiration and modified treatment response to metabolism-targeting anticancer treatment. The results obtained in this project reinforce the postulated role of Bmal1 as a tumour suppressor and elucidate a reciprocal interplay between the circadian clock and cancer metabolism with implications in metabolic phenotype rewiring during tumour progression.

Zirkadiane Uhren sind Zell-autonome Oszillatoren. Aus diesem Grund ist deren interzelluläre Kopplung essentiell, um die Synchronität zirkadianer Oszillatornetzwerke zu erhalten und die Störung zirkadianer Gewebsfunktionen zu verhindern. Neuronale Oszillatoren des Nucleus suprachiasmaticus (SCN), der Schrittmacher-Uhr im Zentralnervensystem der Säugetiere, koppeln interzellulär und über den Austausch sekretierter Neurotransmitter. Die Fähigkeit zirkadianen Oszillatoren peripherer Gewebe interzellulär zu koppeln ist hingegen stark umstritten und molekulare Mechanismen sind unbekannt. In dieser Dissertation zeigen wir, dass periphere Oszillatoren in der Tat interzellulär über den Austausch sekretierter Signalmoleküle koppeln und identifizieren TGF-b als peripheren Kopplungsfaktor. Weiterhin zeigen wir, dass TGF-b die cAMP Enhancer-Motiv abhängige, als auch Immediate Early Expression des Uhr-Gens PER2 induziert und folglich die Phasenanpassung molekularer zirkadianer Oszillationen reguliert. Genetische und pharmakologische Störeinflüsse verursachen die Dysregulation des TGF-b Signalweges und begünstigen die Desynchronisierung zellulärer Oszillatoren, welche sich in Amplitudenreduktion und verstärkter Sensitivität gegenüber Zeitgeber-Signalen äußert. Die in dieser Dissertation präsentierten Ergebnisse, legen einen bisher unbekannten molekularen Mechanismus intrazellulärer Kopplung peripherer zirkadianer Oszillatoren dar und eröffnen neue Perspektiven auf die Bedeutung der Synchronität peripher zirkadianer Uhren für rhythmische Organfunktionen und zirkadiane Gesundheit. / Circadian clocks are cell-autonomous oscillators. Intercellular coupling is crucial to prevent desynchronization of oscillator networks and thus, the disruption of circadian tissue functions. While neuronal oscillators within the mammalian central clock, the suprachiasmatic nucleus (SCN), couple intercellularly via the exchange of secreted neurotransmitters, intercellular coupling among peripheral oscillators is highly debated and molecular mechanisms are unknown. Here, we show that peripheral circadian oscillators couple intercellularly via exchange of secreted signaling molecules and identify TGF-ß as peripheral coupling factor. TGF-ß signaling induces the cAMP response element dependent, immediate-early expression of the clock gene PER2, thereby phase-adjusting the molecular circadian oscillator. Genetic or pharmacologic disruption of TGF-ß signaling causes desynchronization of cellular oscillators resulting in amplitude reduction and increased sensitivity towards Zeitgeber cues. Our findings reveal a previously unknown mechanism of peripheral coupling and open new perspectives on the importance of peripheral clock synchrony for rhythmic organ functions and circadian health.

Die dynamische Regulation von Protein-Protein Interaktionen (PPIs) ist wichtig für den Ablauf von biologischen Prozessen. Die circadiane Uhr, die einen ~24 Stunden Rhythmus generiert und eine Vielzahl von physiologischen Parametern steuert kann auch die Dynamik von PPIs regulieren. Um neue Erkenntnisse über regulatorische Mechanismen innerhalb des molekularen Oszillators zu gewinnen, habe ich zunächst alle möglichen PPIs zwischen 46 circadianen Komponenten mittels eines systematischen yeast-two-hybid (Y2H) Screens bestimmt. Dabei habe ich 109 bis dahin noch unbekannte PPIs identifiziert und einen repräsentativen Anteil mittels Co-Immunopräzipitationsexperimenten in humanen Zellen validiert. Unter den neuen PPIs habe ich bis dahin unbekannte Modulatoren der CLOCK/BMAL1 Transaktivierung identifiziert und dabei die Rolle der Proteinphosphatase 1 (PP1) als dynamischen Regulator der BMAL1 Stabilität funktionell charakterisiert. Das experimentelle PPI Netzwerk wurde mit bereits aus der Literatur bekannten PPIs und Interaktionspartnern ergänzt. Eine systematische RNAi Studie belegte außerdem die Relevanz der aus der Literatur stammenden Interaktoren für die ~24 Stunden Periodizität. Um eine Aussage über die Dynamik der PPIs im Netzwerk treffen zu können, wurden circadiane mRNA Expressionsdaten in das PPI Netzwerk integriert. Systematische Perturbationsstudien, in denen alle Komponenten des experimentellen Netzwerkes mittels RNAi herunterreguliert oder überexprimiert wurden, zeigten eine essentielle Bedeutung für die dynamischen PPIs innerhalb des circadianen Oszillators auf. Desweiteren wurden im circadianen PPI Netzwerk funktionelle Module identifiziert, welche dynamisch organsiert sind. Durch eine systemweite Analyse des humanen Proteoms wurden viele dynamische PPIs identifiziert, die biologische Prozesse wie z.B. Signaltransduktion und Zellzyklus miteinander verbinden. Rhythmische PPIs sind daher von Bedeutung für die zeitliche Organisation zellulärer Physiologie. / Essentially all biological processes depend on protein-protein interactions (PPIs). Timing of such interactions is crucial for regulatory function. Although circadian (~24 hrs) clocks constitute fundamental cellular timing mechanisms regulating important physiological processes PPI dynamics on this timescale are largely unknown. To elucidate so far unknown regulatory mechanisms within the circadian clockwork, I have systematically mapped PPIs among 46 circadian components using high-throughput yeast-two-hybrid (Y2H) interaction experiments. I have identified 109 so far uncharacterized interactions and successfully validated a sub-fraction via co-immunoprecipitation experiments in human cells. Among the novel PPIs, I have identified modulators of CLOCK/BMAL1 function and further characterized the role of protein phosphatase 1 (PP1) in the dynamic regulation of BMAL1 abundance. Furthermore, to generate a more comprehensive circadian PPI network, the experimental network was enriched and extended with additional interactions and interaction partners from literature, some of which turned out to be essential for normal circadian dynamics. The integration of circadian mRNA expression profiles allowed us to determine the interaction dynamics within our network. Systematic genetic perturbation studies (RNAi and overexpression in oscillating human cells) revealed a crucial role of dynamic regulation (via rhythmic PPIs) for the molecular clockwork. Furthermore, dynamic modular organization as a pervasive circadian network feature likely contributes to time-of-day dependent control of many cellular processes. Global analysis of the proteome regarding circadian regulation of biological processes via rhythmic PPIs revealed time-of-day dependent organization of the human interactome. Circadian PPIs dynamically connect many important cellular processes like signal transduction and cell cycle, which contribute to temporal organization of cellular physiology.

Cyanobakterien sind meist photoautotroph lebende Prokaryoten, welche nahezu alle Biotope der Welt besiedeln. Sie gehören zu den wichtigsten Produzenten der weltweiten Nahrungskette. Um sich auf den täglichen Wechsel von Tag und Nacht einzustellen, besitzen Cyanobakterien eine innere Uhr, bestehend aus den Proteinen KaiA, KaiB und KaiC, deren biochemische Interaktionen zu einem 24-stündigen Rhythmus von Phosphorylierung und Dephosphorylierung führen. Die circadiane Genexpression im Modellorganismus Synechocystis sp. PCC 6803 habe ich mittels drei verschiedener Zeitserienexperimente untersucht, wobei ich einen genauen Zeitplan der Genaktivierung in einer Tag-Nacht-Umgebung, aber keine selbsterhaltenden Rhythmen entdecken konnte. Allerdings beobachtete ich einen überaus starken Anstieg der ribosomalen RNA in der Dunkelheit. Aufgrund ihrer hohen Wachstumsraten und der geringen Anforderungen an die Umwelt bilden Cyanobakterien eine gute Grundlage für die nachhaltige Erzeugung von Biokraftstoffen, für einen industriellen Einsatz sind aber weitere Optimierung und ein verbessertes Verständnis des Metabolismus von Nöten. Hierfür habe ich die Orthologie von verschiedenen Cyanobakterien sowie die Konservierung von Genen und Stoffwechselwegen untersucht. Mit einer neu entwickelten Methode konnte ich gemeinsam vorkommende Gene identifizieren und zeigen, dass diese Gene häufig an einem gemeinsamen biologischen Prozess beteiligt sind, und damit bisher unbekannte Beziehungen aufdecken. Zusätzlich zu den diskutierten Modulen habe ich den SimilarityViewer entwickelt, ein grafisches Computerprogramm für die Identifizierung von gemeinsam vorkommenden Partnern für jedes beliebige Gen. Des Weiteren habe ich für alle Organismen automatische Rekonstruktionen des Stoffwechsels erstellt und konnte zeigen, dass diese die Synthese von gewünschten Stoffen gut vorhersagen, was hilfreich für zukünftige Forschung am Metabolismus von Cyanobakterien sein wird. / Cyanobacteria are photoautotrophic prokaryotes populating virtually all habitats on the surface of the earth. They are one of the prime producers for the global food chain. To cope with the daily alternation of light and darkness, cyanobacteria harbor a circadian clock consisting of the three proteins KaiA, KaiB, and KaiC, whose biochemical interactions result in a phosphorylation cycle with a period of approximately 24 hours. I conducted three time-series experiments in the model organism Synechocystis sp. PCC 6803, which revealed a tight diurnal schedule of gene activation. However, I could not identify any self-sustained oscillations. On the contrary, I observed strong diurnal accumulation of ribosomal RNAs during dark periods, which challenges common assumptions on the amount of ribosomal RNAs. Due to their high growth rates and low demand on their environment, cyanobacteria emerged as a viable option for sustainable production of biofuels. For an industrialized production, however, optimization of growth and comprehensive knowledge of the cyanobacterial metabolism is inevitable. To address this issue, I analyzed the orthology of multiple cyanobacteria and studied the conservation of genes and metabolic pathways. Systematic analysis of genes shared by similar subsets of organisms indicates high rates of functional relationship in such co-occurring genes. I designed a novel approach to identify modules of co-occurring genes, which exhibit a high degree of functional coherence and reveal unknown functional relationships between genes. Complementing the precomputed modules, I developed the SimilarityViewer, a graphical toolbox that facilitates further analysis of co-occurrence with respect to specific cyanobacterial genes of interest. Simulations of automatically generated metabolic reconstructions revealed the biosynthetic capacities of individual cyanobacterial strains, which will assist future research addressing metabolic engineering of cyanobacteria.

Durch ihren Einfluß auf die Genexpression reguliert die zirkadiane Uhr physiologische Funktionen vieler Organe. Obwohl der zugrundeliegende allgemeine Uhrmechanismus gut untersucht ist, bestehen noch viele Unklarheiten über die gewebespezifische Regulation zirkadianer Gene. Neben ihrer gemeinsamen 24-h-Periode im Expressionsmuster unterscheiden diese sich darin, zu welcher Tageszeit sie am höchsten exprimiert sind und in welchem Gewebe sie oszillieren. Mittels Überrepräsentationsanalyse lassen sich Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren identifizieren, die an der Regulation ähnlich exprimierter Gene beteiligt sind. Um diese Methode auf zirkadiane Gene anzuwenden, ist es nötig, Untergruppen ähnlich exprimierter Gene genau zu definieren und Vergleichsgene passend auszuwählen. Eine hierarchische Methode zur Kontrolle der FDR hilft, aus der daraus entstehenden Menge vieler Untergruppenvergleiche signifikante Ergebnisse zu filtern. Basierend auf mit Microarrays gemessenen Zeitreihen wurde durch Promotoranalyse die gewebespezifische Regulation von zirkadianen Genen zweier Zelltypen in Mäusen untersucht. Bindungsstellen der Transkriptionsfaktoren CLOCK:BMAL1, NF-Y und CREB fanden sich in beiden überrepräsentiert. Diesen verwandte Transkriptionsfaktoren mit spezifischen Komplexierungsdomänen binden mit unterschiedlicher Stärke an Motivvarianten und arrangieren dabei Interaktionen mit gewebespezifischeren Regulatoren (z.B. HOX, GATA, FORKHEAD, REL, IRF, ETS Regulatoren und nukleare Rezeptoren). Vermutlich beeinflußt dies den Zeitablauf der Komplexbildung am Promotor zum Transkriptionsstart und daher auch gewebespezifische Transkriptionsmuster. In dieser Hinsicht sind der Gehalt an Guanin (G) und Cytosin (C) sowie deren CpG-Dinukleotiden wichtige Promotoreigenschaften, welche die Interaktionswahrscheinlichkeit von Transkriptionsfaktoren steuern. Grund ist, daß die Affinitäten, mit denen Regulatoren zu Promotoren hingezogen werden, von diesen Sequenzeigenschaften abhängen. / A circadian clock in peripheral tissues regulates physiological functions through gene expression timing. However, despite the common and well studied core clock mechanism, understanding of tissue-specific regulation of circadian genes is marginal. Overrepresentation analysis is a tool to detect transcription factor binding sites that might play a role in the regulation of co-expressed genes. To apply it to circadian genes that do share a period of about 24 hours, but differ otherwise in peak phase timing and tissue-specificity of their oscillation, clear definition of co-expressed gene subgroups as well as the appropriate choice of background genes are important prerequisites. In this setting of multiple subgroup comparisons, a hierarchical method for false discovery control reveals significant findings. Based on two microarray time series in mouse macrophages and liver cells, tissue-specific regulation of circadian genes in these cell types is investigated by promoter analysis. Binding sites for CLOCK:BMAL1, NF-Y and CREB transcription factors are among the common top candidates of overrepresented motifs. Related transcription factors of BHLH and BZIP families with specific complexation domains bind to motif variants with differing strengths, thereby arranging interactions with more tissue-specific regulators (e.g. HOX, GATA, FORKHEAD, REL, IRF, ETS regulators and nuclear receptors). Presumably, this influences the timing of pre-initiation complexes and hence tissue-specific transcription patterns. In this respect, the content of guanine (G) and cytosine (C) bases as well as CpG dinucleotides are important promoter properties directing the interaction probability of regulators, because affinities with which transcription factors are attracted to promoters depend on these sequence characteristics.

In dieser Arbeit wurden die Morpho-Physiologie und das Verhalten zweier Arten Afrikanischer schwach elektrischer Fische, Marcusenius victoriae und Petrocephalus degeni, im Labor und in einem ihrer natürlichen Habitate im Lwamunda Sumpf in Uganda untersucht. Die zwei Hauptziele dieser Arbeit waren (i) tageszeitabhängige Verhaltensrhythmen (Aktivität, Habitatnutzung) im Labor und im Freiland zu untersuchen und (ii) die Ausprägung und Plastizität der morpho-physiologischen Merkmale von P. degeni zu untersuchen, die ihnen erlauben bei natürlich vorkommender, geringer Sauerstoffverfügbarkeit (Hypoxie) zu überleben. Tageszeitabhängige Verhaltensrhythmen beider Arten wurden im Labor über 42 Stunden und im natürlichen Habitat dieser Fische für sechs Tage erfasst. In den Laborversuchen verbrachten beide Arten tagsüber annähernd 100% der Zeit in einem bereitgestellten Versteck und schwammen nachts heraus um aktiv ihre Umwelt zu erkunden. Im Habitat wurden die meisten Fische in strukturell komplexen Habitaten unter schwimmenden Pflanzen detektiert. Nachts schwammen die Fische aktiv in die offenen und ungeschützten Bereiche der Lagune, vermutlich um nach Futter zu suchen und zu interagieren. Die Begleitende in-situ Messung der Sauerstoffverfügbarkeit zeigte, dass beide Arten präsent und vermutlich sogar am aktivsten waren während Phasen extremer nächtlicher Hypoxie. Zur Untersuchung der respiratorischen Merkmale von P. degeni wurden Respirometrieversuche mit hypoxie-akklimatisierten Tieren durchgeführt, Hämoglobin- und Laktatkonzentration im Blut gemessen, und morphologische Parameter an den ersten beiden Kiemenbögen erfasst. Die Fische zeigten niedrige Sauerstoffverbrauchsraten, welche sie bis zu einem sehr niedrigem äußeren Sauerstoffpartialdruck aufrechterhielten. Zusätzlich zeigten sie hohe Hämoglobin- und Laktatkonzentrationen im Blut. Bis zu 75 Tage Normoxie-Akklimatisierung führte zu reduzierter Hämoglobinkonzentration und kürzeren Kiemenfilamenten. / In this thesis, I investigated the morpho-physiology and behavior of two species of African mormyrid weakly electric fish, Marcusenius victoriae and Petrocephalus degeni, in the laboratory and in one of their natural habitats, the Lwamunda Swamp in Uganda. The two main objectives of this work were to (i) observe behavioral rhythms and habitat use patterns of both species under natural and laboratory conditions, and (ii) assess expression and plasticity of morpho-physiological traits that might enable P. degeni to survive naturally occurring low oxygen conditions (hypoxia). Behavioral rhythms were recorded in the laboratory over 42 hours and in the habitat on six sampling days. In the laboratory, both species spent close to 100% of the time in their shelter during the day and actively explore their environment at night. In the swamp lagoon, fish were most often encountered in structurally complex habitats under floating vegetation and ventured into open and unsheltered areas of the lagoon at night, presumably to forage and interact. Concomitant in-situ oxygen measurements revealed that these fish were present, and presumably most active during periods of extreme nocturnal hypoxia in their swamp habitat. To investigate respiratory traits of swamp-dwelling P. degeni, I conducted respirometry experiments and measured blood lactate and hemoglobin and gill morphometrics on the first two gill arches. Fish showed low routine oxygen consumption rates, which they maintained until a very low ambient oxygen partial pressure was reached. Additionally, they had high concentrations of hemoglobin and lactate in their blood. Up to 75 days of normoxia exposure reduced blood hemoglobin and gill filament length.