<p>Problem – The expansion of global trade and supply chain integration has put great emphasison logistics, particularly in the intermediary sector, freight forwarders. Whilst in developedcountries freight forwarders benefit from competitive markets and trade facilitatingpolicies, this sector in West coast Africa exhibits low logistics performance levels. Inorder to address such issues, one needs to analyse the problem and identify the causes; thisthesis focuses on identifying the bottlenecks in the freight-forwarding sector in west coastAfrica.Purpose – The main purpose of this study is to identify the bottleneck/s within thefreight-forwarding industry in west coast Africa, namely: Angola, Cameroon, DR of Congo,Gabon, and Nigeria.Method – This thesis employs a pre-study and case study method, to ensure sufficient collectionof relevant material, taking into account the lack of research in this subject. We usedthe material obtained from the interviews and the secondary source, to structure our purpose,research questions, and to define the case of our study.Results – The study concludes with a series of interesting findings; First, the activity of aFreight Forwarder depends on a series of factors that do not depend on the Freight Forwarderper se. And second, Freight Forwarders in order to accomplish their tasks, have accessto services that are shared by all providers, and that are beyond their control. To conclude,the study identifies infrastructure as a major bottleneck in the Freight Forwarding sector.</p>

Kanalrhodopsine (ChRs) sind lichtgesteuerte Ionenkanäle, welche nach Absorption eines Photons durch den Retinal-Cofaktor einen passiven Ionentransport über die Zellmembran katalysieren. Im Zuge von optogenetischen Anwendungen wird diese Reaktion für die Beeinflussung der Ionenhomöostase von verschiedenen Zelltypen und Geweben ausgenutzt. Zu Beginn dieser Arbeit wurden lichtinduzierte Strukturänderungen und Protontransferschritte in einem breiten Zeitbereich (Nanosekunden bis Minuten) in dem grün-absorbierenden ChR ReaChR mithilfe von stationärer und transienter UV-vis- und Fourier-Transform-Infrarot-Spektroskopie (FTIR) untersucht. Auf Basis der experimentellen Daten wurde ein komplexes Photozyklus-Modell konzipiert. Anschließend wurde die IR-aktive, nichtkanonische Aminosäure p-Azido-L-phenylalanin (azF) mittels Stopp-Codon-Suppression ortsspezifisch an mehreren Positionen innerhalb der vermuteten ionenleitenden Kanalpore in ReaChR inkorporiert und mit FTIR untersucht. azF ist sensitiv gegenüber Polaritätsänderungen und absorbiert in einem hochfrequenten Bereich (~2100 cm-1). Aufgrund der großen spektralen Separation zu endogenen Proteinschwingungen (< 1800 cm-1) können globale Konformations- und lokale Hydratisierungsänderungen simultan detektiert werden. Die erhobenen Daten leisten einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der Bildung einer temporären Wasserpore in ChRs und demonstrieren zum ersten Mal den erfolgreichen in-vivo-Einbau einer artifiziellen Aminosäure in mikrobielle Rhodopsine und dessen schwingungsspektroskopische Analyse. Die Methode bietet aufgrund ihrer hohen Ortsauflösung ein großes Potential für die Studie von Mikroumgebungen innerhalb komplexer Proteinensemble. / Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated ion channels. Upon absorption of a photon, the retinal chromophore isomerizes and drives conformational changes within the protein, which lead to a passive ion transport across the cell membrane. This capability is used for optogenetic applications to manipulate ionic homeostasis of different cell types and entire organisms. Within the work, light-induced structural changes and proton transfer steps were studied in the green-absorbing ChR ReaChR in great detail by steady-state and transient UV-vis and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). The data were merged into a complex photocycle model. Next, the IR-active, unnatural amino acid p-azido-L-phenylalanine (azF) was site-specifically introduced at several sites of the putative ion pore of ReaChR by stop codon suppression. azF is sensitive to polarity changes and absorbs in a clear spectral window lacking endogenous protein vibrations. Thus, FTIR measurements of labeled mutants report for global conformational changes (< 1800 cm-1) and local hydration changes (~2100 cm-1) simultaneously. The presented findings reveal crucial insights regarding formation of a transient water pore in ChRs and demonstrate the first report of the successful in-vivo incorporation of an artificial amino acid into a microbial rhodopsin and its subsequent spectroscopic investigation. Additionally, the so far unprecedented spatial resolution renders this methodology superior over conventional FTIR methods to study microenvironments within complex protein ensembles.

In den Firmicutes wird der Induktorausschluss (Katabolitrepression) durch das am Serin46 phosphorylierte HPr (PTS) vermittelt. Der genaue Mechanismus war jedoch unklar. Um diese Frage auf der Grundlage von isolierten Proteinen zu klären, wurde ein zum Escherichia coli Maltose-/Maltodextrin-ABC-Transporter homologes System aus Lactobacillus casei BL23 (MalE1-MalF1G1K12) als Modellsystem genutzt. Im Rahmen der Promotion wurde über isothermale Titrationskalorimetrie und Fluoreszenzspektroskopie gezeigt, dass das Bindeprotein MalE1 lineare und zyklische Maltodextrine, aber keine Maltose bindet. Experimentell ermittelte dreidimensionale Strukturen von MalE1 im Komplex mit diesen Zuckern belegten eine vergleichbar geschlossene Konformation und dienten zusätzlich als Grundlage, um die fehlende Maltosebindung zu erklären. Die Stimulierung der ATPaseaktivität des in Liposomen und Nanodiscs eingebauten Komplexes wurde jedoch hauptsächlich durch eine MalE1-Beladung mit linearen Maltodextrinen bewirkt. Eine bis zu 85 %ige Inhibierung der ATPaseaktivität durch P-Ser46-HPr belegte erstmals in vitro eine Interaktion von mehr als einem phosphorylierten Protein mit dem Transporter. Analog zum EIIAGlc-Inhibitor des homologen Systems aus E. coli wurden über Quervernetzungsexperimente und massenspektrometrische Analysen Interaktionen mit dem MalK1-Dimer als interagierende Komplexeinheit in der Nähe des Walker A-Motivs nachgewiesen. Über Fluoreszenzmessungen in Anwesenheit des ATP-Analogons TNP-ATP wurde eine unbeeinflusste ATP-Bindung und damit eine fehlende Blockade der γ-Phosphatbindestelle des Walker-A Motivs durch die Phosphorylgruppe von P-Ser46-HPr bestimmt. Die folgende Substitution verschiedener positiv geladener MalK1-Reste, die als potenzielle Interaktionsstellen für die Phosphorylgruppe fungieren könnten, identifizierte K63 in der Nähe des Walker A-Motivs als ersten möglichen Partner. Der genaue Mechanismus der Inhibierung bleibt jedoch unklar. / Catabolite repression is a global mechanism which controls the utilization of carbohydrates in bacteria. In Firmicutes HPr, a component of the phosphoenolpyruvate carbohydrate phosphotransferase system, prevents the uptake of less preferred sugars but only when it is phosphorylated at serine46. However the exact mechanism was unclear. To address this question the purified ATP-binding cassette transporter from Lactobacillus casei BL23 (MalE1-MalF1G1K12) was used as a model system, which is homologous to the Escherichia coli maltose/maltodextrin ABC importer. Isothermal titration calorimetry and fluorescence spectroscopy revealed that the binding protein MalE1 binds linear and cyclic maltodextrins but not maltose. Experimentally determined three-dimensional structures from MalE1 in complex with these sugars show a comparably closed conformation and served as a basis to explain the lack of maltose binding. The stimulation of the ATPase activity of the transporter incorporated in liposomes and nanodiscs however, was mainly caused by MalE1 loaded with linear maltodextrins. For the first time an inhibition of ATPase activity by P-Ser46-HPr up to 85 % and an interaction of more than one phosphorylated protein with the transporter was demonstrated. Analogous to the EIIAGlc inhibitor of the homologous system from E. coli, cross-linking experiments and mass spectrometric analyzes revealed interactions with the MalK1 dimer near the Walker A motif. Fluorescence measurements in the presence of the ATP analogue TNP-ATP, however, revealed an unaffected ATP binding and thus a lack of blockade of the γ-phosphate binding site (Walker A motif) by the phosphoryl group from P-Ser46-HPr. The following substitution of several positively charged MalK1 residues that could act as potential sites of interaction for the phosphoryl group, identified K63 near the Walker A motif as the first potential partner. The exact mechanism of inhibition, however, remains unclear.

A thesis submitted to the Faculty of Humanities, University of the Witwatersrand, Johannesburg, in fulfilment of the requirements for the degree of Master of Arts in African Languages. Wits University, Johannesburg, 2015 / This report interrogates the representation of blackness in post-1994 black-centred films in South Africa. With a particular focus on Khalo Matabane’s films, I analyse Conversations on a Sunday Afternoon (2005), When We Were Black (2007) and State of Violence (2011) across a spectrum of themes. I also interrogate and introduce several critical concepts such as ‘blackness’, ‘the image of blackness’, ‘black identity’, ‘masculinity’, ‘femininity’, ‘the Gaze’ and ‘Otherness’. These concepts are interlinked in ways that bring about an understanding of the concept of black-centred films, which is central to the research report. Amidst the different interpretations of black-centred films, the vantage point from which the concept is used is interested in black-centred films as films that are made by a black filmmaker, whose content addresses issues of blackness and is targeted at a black audience. However, these three factors need not always resonate in a single film in order for it to be considered and analysed as a black-centred film. The lens through which Matabane holds the camera questions his representation of the black image and whether it is from an insider or outsider’s perspective. The view from which Matabane holds the camera is important in establishing whether he has purported to represent historically stereotypical images of blackness, or whether his endeavours in filmmaking are occupied by the relentless pursuit to present new images of blackness.

Der (Pro)Renin Rezeptor (PRR) ist ein hoch konservierter Transmembranrezeptor, der ursprünglich beschrieben wurde Renin und Prorenin zu binden. Durch Bindung an Renin und Prorenin beeinflusst der PRR das Renin-Angiotensin-Systems und induziert eine MAP-Kinase-Signaltransduktion. Teile des PRR sind assoziiert mit der vakuolären H+-ATPase (vATPase), welche wichtig für die Azidifizierung zellulärer Organellen ist. Kürzlich wurde eine neue Funktion des PRR für den WNT/β-catenin Signalweg beschrieben. Hier dient der PRR als Verbindungsglied zwischen den WNT Rezeptoren und der vATPase. Die Mechanismen der Funktionen des PRR sind noch nicht verstanden, aber es wird angenommen, dass der PRR in die Regulation verschiedenster zellulärer Mechanismen involviert ist. Es gibt bis jetzt keine biochemische und strukturelle Charakterisierung des PRR. In der vorliegenden Arbeit wurden strukturelle Studien mit verschiedenen Konstrukten des extrazellulären Teils des PRR durchgeführt. Alle PRR Konstrukte (hsPRR (170-303), hsPRR (101-257) und hsPRR (166-257)) zeigten eine alpha-helikale Faltung und konnten nicht an Renin oder Prorenin binden. Der hsPRR (101-257) liegt in einem Konzentrations- und pH-abhängigen Monomer-/Oligomerequilibrium vor, während der hsPRR (166-257) als Monomer/Dimerequilibrium vorkommt. Diese Daten bilden die Grundlage für weitere strukturelle und funktionelle Untersuchungen. Konditionelle KO Mäuse sind eine exzellente Methode, um die physiologische Rolle des PRR in vivo zu untersuchen. Eines der wichtigsten Proteine des Wnt/β-catenin Signaltransduktionsweges, β-catenin, ist fundamental für die T-Zell Entwicklung. Aus diesem Grund wurde untersucht, ob die Deletion des PRR in T-Zellen ebenfalls zu einem Verlust von T-Zellen und zu einer Entwicklungsstörung führt. Die Ergebnisse zeigen, dass der PRR wichtig für eine vollständige T-Zellentwicklung ist und unterstützen die Hypothese, dass der PRR eine Rolle für Wnt/β-catenin Singaltransduktion in T-Zellen spielt. / The (pro)renin receptor (PRR) is an evolutionary conserved transmembrane receptor that was first discovered to bind renin and prorenin. Upon binding, PRR was shown to influence the activity of the renin-angiotensin-system (RAS) and to induce MAP kinase signalling. It was previously shown that a truncated, transmembrane part of PRR was associated to vacuolar H+-ATPase (vATPase), a proton pump which is important for acidification. Recently, a new function of PRR in the WNT/β-catenin signalling pathway was described. Here, the PRR was shown to be an adaptor between WNT receptors and the vATPase. The precise mechanisms by which PRR functions, are still elucidative but the PRR is supposed to regulate various cellular processes. Currently, no biochemical characterization or structural analysis is available for PRR. In order to gain understanding of the function of the PRR, structural studies were performed with several truncated proteins of the extracellular part of the PRR. All PRR proteins (hsPRR170-303, hsPRR 101-257 or hsPRR 166-257) showed an overall alpha helical folding and did not bind renin or prorenin. The oligomeric assembly of the proteins was investigated. The hsPRR (101-257) was shown to be in a concentration and pH dependent monomer/oligomer equilibrium, whereas hsPRR (166-257) is only present in a monomer/dimer equililibrium. These data are the basics for further structural and functional studies. Additionally, conditional KO animals are an excellent tool to investigate the physiological role of the PRR in vivo. As the major mediator of the Wnt/β-catenin signaling pathway, β-catenin, is crucial for T cell maturation, a conditionel deletion of PRR in T cells was analyzed. PRR deletion resulted in a loss of mature T cells. Moreover, a defect in T cell maturation in the thymus was determined. Our data showed that PRR is critical for proper T cell development and support the hypothesis that PRR contributes to Wnt/β-catenin signaling in T cells.

Diese Studie untersucht die Bedeutung von Angiotensin II- und Endothelin-1-vermittelten Mechanismen, die im Rahmen von hämodynamischen, hormonellen und renalen Reaktionen bei einen akuten Blutverlust einsetzen. Es wurden wache Hunde mit und ohne Vorbehandlung mit Angiotensin II Typ 1 (AT1) und/oder Endothelin-A (ETA) Rezeptorblockern untersucht. Protokoll 1: Nach einer 60-minütigen Kontrollstunde wurde den Hunden 25% ihres Blutes zügig entzogen. Nach einer Stunde wurde das Blut retransfundiert und die Datenaufzeichnung für eine weitere Stunde fortgesetzt. Protokoll 2: Wie Protokoll 1, aber mit AT1 Blockade durch Losartan i.v. Protokoll 3: Wie Protokoll 1, aber mit ETA Blockade durch ABT-627 i.v. Protokoll 4: Wie Protokoll 1, aber mit kombinierter AT1 plus ETA Blockade. In der Kontrolle sinkt der arterielle Mitteldruck (MAP) nach dem Blutentzug um ~25%, das Herzzeitvolumen (HZV) um ~40%, das Urinvolumen um ~60%, während die Plasmakonzentrationen von Angiotensin II (3.1-fach), Endothelin-1 (1.13-fach), Vasopressin (116-fach) und Adrenalin (3.2-fach) ansteigen. Unter AT1 Blockade kommt es zu einem überproportionalen Abfall des arteriellen Mitteldrucks und die glomeruläre Filtrationsrate (GFR) sinkt. Beim Blutentzug unter ETA Blockade steigt Noradrenalin und nicht Adrenalin an, und der Wiederanstieg des MAP infolge Retransfusion ist unvollständig. In allen Protokollen sinkt das HZV um den gleichen Betrag. Schlussfolgerungen: Für die kurzfristige Regulation des Blutdrucks und die renale Autoregulation der GFR nach Blutverlust spielt Angiotensin II eine wichtigere Rolle als Endothelin-1. Andererseits ist ein intaktes Endothelinsystem eine wichtige Voraussetzung für die vollständige Restitution des arteriellen Mitteldrucks in der Retransfusionsphase. Darüber hinaus scheint Endothelin-1 nach dem Blutentzug die Freisetzung von Adrenalin zu erleichtern, die Freisetzung von Noradrenalin jedoch zu mildern. Die bei einem akuten Blutverlust einsetzenden Kompensationsmechanismen scheinen den Blutfluss (HZV) viel effektiver aufrecht zu erhalten als den Blutdruck (MAP), denn das HZV, nicht aber der arterielle Mitteldruck, sank in allen Protokollen um den gleichen Betrag. / This study investigates angiotensin II and endothelin-1 mediated mechanisms involved in the hemodynamic, hormonal, and renal response towards acute hypotensive hemorrhage. Conscious dogs were pretreated with angiotensin II type 1 (AT1) and/or endothelin-A (ETA) receptor blockers or not. Protocol 1. After a 60 min baseline period, 25% of the dog's blood was rapidly withdrawn. The blood was retransfused 60 min later and data recorded for another hour. Protocol 2. Likewise, but preceded by AT1 blockade with i.v. Losartan. Protocol 3. Likewise, but preceded by ETA blockade with i.v. ABT-627. Protocol 4. Likewise, but with combined AT1 plus ETA blockade. In Controls, hemorrhage decreased mean arterial pressure (MAP) by ~25%, cardiac output by ~40%, and urine volume by ~60%, increased angiotensin II (3.1-fold), endothelin-1 (1.13-fold), vasopressin (116-fold), and adrenaline concentrations (3.2-fold). Glomerular filtration rate and noradrenaline concentrations remained unchanged. During AT1 blockade, the MAP decrease was exaggerated (-40%) and glomerular filtration rate fell. During ETA blockade, noradrenaline increased after hemorrhage instead of adrenaline, and the MAP recovery after retransfusion was blunted. The decrease in cardiac output was similar in all protocols. Conclusions: Angiotensin II is more important than endothelin-1 for the short-term regulation of MAP and glomerular filtration rate after hemorrhage, whereas endothelin-1 seems necessary for complete MAP recovery after retransfusion. After hemorrhage, endothelin-1 seems to facilitate adrenaline release and to blunt noradrenaline release. Hemorrhage-induced compensatory mechanisms maintain blood flow more effectively than blood pressure, since the decrease in cardiac output - but not MAP - was similar in all protocols.

Wie in anderen Zellen sind auch bei Säugerspermien spezifische Lipide und Proteine der Zellmembran aufgrund ihrer heterogenen lateralen Verteilung in speziellen Domänen angereichert, die in unterschiedlichen räumlichen und zeitlichen Dimensionen existieren und der Zelle funktionale Variabilität ermöglichen. Aufgrund der fehlenden aktiven Proteinbiosynthese bietet dies den Spermien eine Möglichkeit, auf unterschiedliche Anforderungen zu reagieren. In der vorliegenden Arbeit wurden daher sogenannte detergenzresistente Membrandomänen (DRMs) aus Eberspermien unterschiedlicher Reifestadien präpariert und untersucht. Dabei stieg bereits in den Dichtegradienten mit zunehmender Reife die Dichte, bei der die opaleszenten Banden auftraten. Eine Analyse dieser mittels 31P-NMR zeigte mit zunehmender Reife eine Anreicherung an Glycerophosphatidylethanolamin und Phosphatidylinositol bei den Glycerophospholipiden, der Gehalt an Sphingomyelin hingegen nahm während der Nebenhodenreifung und auch nach der Ejakulation ab. Diese Veränderungen könnten auf eine Destabilisierung von Membrandomänen hindeuten, um eine Zusammenlagerung zu größeren Domänenclustern zu erleichtern, möglicherweise in Vorbereitung auf Kapazitation und Akrosomenreaktion. Zunächst werden die destabilisierten Membrandomänen jedoch durch die Anlagerung von Seminalplasmaproteinen geschützt, was vermutlich für das verringerte Lipid- zu Proteinverhältnis der DRMs bei Ejakulatspermien sorgt. Aufgrund der generellen Kälteempfindlichkeit von Eberspermien findet ihre Lagerung üblicherweise bei 16°C statt. Dies ist aus mikrobiologischer Sicht nachteilig gegenüber einer kälteren Lagerungstemperatur. Eine Untersuchung der Spermien von 64 Ebern zeigte jedoch bei 10% der Ejakulate eine individuum-spezifische Resistenz gegenüber der Lagerung bei 4°C. Die DRMs der kälteresistenten Spermien hatten einen erhöhten Anteil an langkettigen, mehrfach ungesättigten Fettsäuren, wie 31P-NMR und MALDI-TOF MS Analysen zeigten. / The lateral distribution of lipids and proteins in the plasma membrane is heterogeneous. Therefore specific lipids and proteins in membranes of mammalian spermatozoa are enriched in special domains of varying size and different time scales enabling the cell’s membrane functional variability. Being transcriptional inactive this is especially relevant for spermatozoa in responding to multiple challenges on their way to fertilization. Therefore so called detergent resistant membrane domains (DRMs) from boar spermatozoa of different developmental stages were investigated. Already in the sucrose density gradients differences were visible, so the opalescent bands of more maturated sperm had a higher density. An analysis of these bands by 31P-NMR showed an enrichment of glycerophosphatidylethanolamine and phosphatidylinositol during maturation and a decrease of sphingomyelin during maturation in the epididymis and even after ejaculation. This suggests destabilization of DRMs and hence of putative membrane domains. This could enable clustering to bigger membrane domain platforms in preparation for capacitation and acrosome reaction. First, however, seminal fluid proteins cover the spermatozoa protecting the membrane with the destabilized membrane domains. This could have led to the detected decrease of the lipid to protein ratio in DRMs of ejaculated sperm. Boar spermatozoa are sensitive to storage at cold temperatures and are therefore usually stored at 16°C, which is especially disadvantageous with regard to growing of bacteria. A screening of sperm from 64 boars showed a ratio of 10% individuals with cold resistant sperm which could be stored at 4°C without quality loss. The DRMs of cold resistant sperm had a higher proportion of longchained, polyunsaturated fatty acids, as shown by analysis with 31P-NMR und MALDI-TOF MS.

Veränderungen in phosphorylierungsabhängigen Signalwegen, Akkumulation von Proteinaggregaten im Gehirn und neuronaler Zelltod sind Neurodegenerationskennzeichen und Indikatoren für überlappende molekulare Mechanismen. Um Einblicke in die involvierten Signalwege zu erhalten, wurde mit Hilfe eines modifizierten Hefe-Zwei-Hybrid (Y2H)-Systems für 71 Proteine, die mit neurologischen Erkrankungen assoziiert sind, proteomweit nach Protein-Protein Interaktionen (PPIs) gesucht. Für 21 dieser Proteine wurden PPIs identifiziert. Das Gesamtnetzwerk besteht aus 79 Proteinen und 90 PPIs von denen 5 phosphorylierungsabhängig sind. Ein Teil dieser PPIs wurde in unabhängigen Interaktionsassays mit einer Validierungsrate von 66 % getestet. Der netzwerkbasierte Versuch verbindet erfolgreich neurologische Erkrankungen untereinander aber auch mit zellulären Prozessen. Ser/Thr-Kinase abhängige PPIs verknüpfen zum Beispiel das Parkinson Protein 7 (PARK7, DJ1) mit den E3 Ligase Komponenten ASB3 und RNF31 (HOIP). Die Funktion dieser Proteine bekräftigt den Zusammenhang zwischen dem Ubiquitin-Proteasom-System und der Parkinson Krankheit (PD). Neurofibromin 2 (NF2, merlin) Isoformen und PARK7 interagieren mit der regulatorischen PI3K Untereinheit p55-gamma (PIK3R3). Diese PPIs basieren auf Tyr-Kinase Aktivität im modifizierten Y2H System und funktionellen PIK3R3 pTyr-Erkennungsmodulen (SH2 Domänen) in co-IP und Venus PCA Versuchen. Dies verknüpft den PI3K/AKT Überlebenssignalweg mit zwei unterschiedlichen neurologischen Erkrankungsphenotypen: dem PD assoziierten neuronalen Zelltod und der Neurofibromatose Typ 2-assoziierten Tumorentstehung. Die vergleichende Beobachtung von PIK3R3, AOF2 (KDM1A, LSD1) Interaktionen auf NF2 Isoformlevel offenbart eine Bevorzugung von Isoform 7 bei zytoplasmatischer Lokalisation, wohingegen Isoform 1 PPIs an der Membran lokalisiert sind. Das modifizierungsabhängige und isoformspezifische PPI Netzwerk ermöglichte neue Hypothesen zu molekularen Pathomechanismen. / Alterations in phosphorylation-dependent signalling pathways, accumulation of aggregated proteins in the brain and neuronal apoptosis are common to neurodegeneration and implicate overlapping molecular mechanism. To gain insight into involved pathways, a modified yeast-two hybrid (Y2H) system was applied to screen 71 proteins associated with neurological disorders in a proteome-wide manner. For 21 of these proteins interactions were identified including 5 phosphorylation-dependent ones. In total, the network connected 79 proteins through 90 protein-protein interactions (PPIs). A fraction of these Y2H PPIs was tested in secondary interaction assays with a validation rate of 66 %. The described network-based approach successfully identified proteins associated with more than one disorder and cellular functions connected to specific disorders. In particular, the network revealed Ser/Thr kinase-dependent PPIs between the Parkinson protein 7 (PARK7, DJ1) and the E3 ligase components ASB3 and RNF31 (HOIP). The function of these proteins further substantiates the established connection between Parkinson’s disease (PD) and ubiquitination-mediated proteasome (dis)functions. Neurofibromin 2 (NF2, merlin) isoforms and PARK7 were identified as PI3K regulatory subunit p55-gamma (PIK3R3) interactors. These PPIs required Tyr kinase coexpression in the modified Y2H system and functional PIK3R3 pTyr-recognition modules (SH2 domains) in co-IP and Venus PCA experiments. This finding implicates the PI3K/AKT survival pathway in PD-associated neuronal apoptosis and Neurofibromatosis type 2-associated tumour formation. Investigation of PIK3R3, AOF2 (KDM1A, LSD1) and EMILIN1 PPIs on NF2 isoform level revealed preferential isoform 7 binding and cytoplasmic or membrane localisation of these PPIs for isoform 7 or 1, respectively. The generated modification-dependent and isoform-specific PPI network triggered many hypotheses on the molecular mechanisms implicated in neurological disorders.

G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) sind Rezeptoren mit 7 Transmembrandomänen. Nach Bindung ihres Liganden werden über die Kopplung von G-Proteinen rezeptorspezifisch Signaltransduktionswege aktiviert. Ein bislang nicht ausreichend verstandener Prozess für die Funktion von GPCR ist deren Oligomerisierung. Für einige GPCR konnte gezeigt werden, dass die Oligomerisierung den Rezeptortransport und/oder die Dynamik der Rezeptoraktivierung moduliert. Dabei ist noch nicht aufgeklärt, ob die entsprechenden GPCR ausschließlich als Oligomere oder in einem bestimmten Monomer-Dimer Verhältnis (M/D) vorliegen und welcher Dynamik dieses Verhältnis unterliegt. In dieser Arbeit wurde die Homo-Oligomerisierung des Endothelin-B-Rezeptors (ETBR), des Vasopressin-V2-Rezeptors (V2R) und der Corticotropin-Releasing-Factor-Rezeptoren Typ 1 (CRF1R) und Typ 2(a) (CRF2(a)R) analysiert. Im Anschluss an diese Untersuchungen wurde das M/D der GPCR bestimmt. Zur Detektion der Protein-Protein Interaktionen wurden die biophysikalischen Methoden Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) und Fluoreszenz-Kreuzkorrelations-Spektroskopie (FCCS) eingesetzt. Mit Hilfe der FCCS konnte das spezifische M/D der GPCR bestimmt und über FRET ein Unterschied in der Interaktions-Dynamik zwischen den GPCR der Familie 1 (am Bsp. des V2R) und der Familie 2 (am Bsp. des CRF1R) ermittelt werden. Des Weiteren lieferten die genutzten Methoden den Nachweis, dass der zum CRF1R homologe CRF2(a)R ausschließlich als Monomer vorliegt. Zusätzliche Untersuchungen an Signalpeptidmutanten des CRF1R und des CRF2(a)R weisen darauf hin, dass das Pseudosignalpeptid des CRF2(a)R, welches bislang einzigartig in der Superfamilie der GPCR ist, die Oligomerisierung des Rezeptors verhindert. Zusätzlich zu diesen neuen Daten konnte in dieser Arbeit erstmals ein Zusammenhang zwischen Rezeptorinteraktion und G-Protein Selektivität für den CRF1R und den CRF2(a)R festgestellt werden / The heptahelical G protein-coupled receptors (GPCRs) are important drug targets. Following activation by their ligands, they exert their function via the binding of G proteins and activation of specific signal transduction cascades. To date, the functional significance of the oligomerization of GPCRs is not completely understood. For some GPCRs it could be shown that the oligomerization modulates receptor transport and/or the dynamics of receptor activation. Most importantly, it is not clear whether the GPCRs exist exclusively as oligomers or in a certain monomer-dimer ratio (M/D) or whether a given ratio is dynamic. In this work, the homo-oligomerization of the endothelin-B-receptor (ETBR), the vasopressin-V2-receptor (V2R) and the corticotropin-releasing-factor-receptors type 1 (CRF1R) and type 2(a) (CRF2(a)R) was analysed. In addition, the M/D of these GPCRs was determined. For the detection of the protein-protein interactions, the following biophysical methods were established: fluorescence-resonance-energy-transfer (FRET) and fluorescence-crosscorrelation-spectroscopy (FCCS). With the help of FCCS, a specific M/D could be determined for each of the GPCRs. Using FRET, differences in the interaction dynamics between family 1 (V2R) and family 2 GPCRs (CRF1R) could be described. Moreover, it was experimentally verified that the CRF2(a)R is exclusively expressed as a monomer, in contrast to the other GPCRs and even the highly homologous CRF1R. Using signal peptide swap experiments, it could be demonstrated that the N-terminal pseudo signal peptide of the CRF2(a)R, which is so far unique in the superfamily of GPCRs, prevents oligomerization of the receptor. In addition, a relation of receptor oligomerization and G protein coupling selectivity was established for the CRF1R and the CRF2(a)R which is novel for the GPCR protein family.

Der G Protein-gekoppelte Rezeptor 30 (GPR30) wurde vornehmlich im Kontext von schnellen Östrogeneffekten auf zelluläre Signaltransduktionskaskaden untersucht und stellt möglicherweise einen neuen Östrogenrezeptor dar. Die physiologische Funktion von GPR30 in vivo konnte jedoch bisher nicht ermittelt werden. Daher wurde in dieser Arbeit ein Gpr30-defizientes Mausmodell charakterisiert, bei dem ein Teil der kodierenden Sequenz durch einen LacZ-Reporter ersetzt wurde (Gpr30-lacZ). Die Integration des Konstruktes in den Gpr30-Locus wurde mittels Southern blotting und Real-time PCR verifiziert. Gpr30-positive Zelltypen wurden durch Kolokalisation von LacZ mit zelltyp-spezifischen Markerproteinen identifiziert. Weitere Versuche dienten der Aufklärung des Phänotyps von Gpr30-lacZ Mäusen. Zur Identifizierung von Proteinen des GPR30-Signalkomplexes wurden Yeast-Two-Hybrid Analysen mit der N- bzw. C-terminalen Domäne des Rezeptors durchgeführt. Die wesentlichen LacZ-positiven Zellpopulationen waren (i) Endothelzellen in kleinen arteriellen Gefäßen, (ii) glatte Muskelzellen, Perizyten und neuronale Subpopulationen im Gehirn, (iii) Hauptzellen in der Magenschleimhaut, (iv) Zellpopulationen in der Adenohypophyse und dem Hypophysenzwischenlappen sowie (vi) chromaffine Zellen im Nebennierenmark. Während der Phenotypisierung des Mausmodells wurde eine Reduktion der CD62L+ T-Zellen von ca. 50% im peripheren Blut festgestellt. Mittels Yeast Two-Hybrid Analyse wurden Pals1-associated tight junction protein (PATJ) und FUN14 domain-containing 2 (FUNDC2) als mögliche Interaktionspartner identifiziert. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit eine zelluläre Basis für die Funktion von Gpr30 in vivo ermittelt. Der Phänotyp in Gpr30-lacZ Mäusen ist wahrscheinlich durch eine verringerte Produktion von naiven T-Zellen im Thymus bedingt. PATJ bindet die C-terminalen Aminosäuren von GPR30 mit einer PDZ-Domäne und könnte ein Gerüst-protein des GPR30-Signal¬komplexes darstellen. / The orphan G protein coupled receptor 30 (GPR30) was predominantly analyzed in the context of membrane-initiated estrogen signaling suggesting that GPR30 represents a novel estrogen receptor. However, the physiological function of GPR30 in vivo remained unknown. To unravel the physiological role of murine Gpr30 in vivo, a Gpr30-deficient mouse model was analyzed that harbors a LacZ reporter (Gpr30-lacZ) within the Gpr30 locus. The targeting of Gpr30 was verified by Southern blotting and real-time PCR. Gpr30-expressing cell types were identified by colocalization of LacZ along with cell type-specific markers. Further experiments aimed to decipher the phenotype of Gpr30-lacZ mice. To gain information about the signaling complex of human GPR30, yeast two-hybrid screenings were performed with the N- and C-terminal domains as bait. The main LacZ-positive cell populations were (i) endothelial cells in small arterial vessels of various tissues, (ii) smooth muscle cells, pericytes, and neuronal subpopulations in the brain, (iii) gastric chief cells in the stomach, (iv) cells in the intermediate and anterior pituitary, and (v) chromaffin cells in the adrenal glands. Extensive phenotype screening at the German Mouse Clinic revealed reduced numbers of T cells in the peripheral blood of Gpr30-lacZ mice. Especially the proportion of CD62L+ cells was decreased by approx. 50%. Yeast two-hybrid screening led to the identification of Pals1-associated tight junction protein (PATJ) and FUN14 domain-containing 2 (FUNDC2). In conclusion, this study provides a cellular basis for the function of Gpr30 in vivo. Since CD62L+ cells represent the naive T cell compartment, the phenotype of Gpr30-lacZ mice suggests an impaired production of T cells in the thymus. PATJ likely binds the C-terminus of GPR30 with one of its PDZ domains and may represent a scaffolding protein of the GPR30 signaling complex.