Orientadores: Gonçalo A. Guimarães Pereira, Francisco Javier Medrano Martin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T07:53:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cabrera_OdalysGarcia_D.pdf: 6336814 bytes, checksum: 10a8f8e8b80239f363cbb4eda5d2746e (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A doença Vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao) é causada pelo fungo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa e atualmente constitui um dos maiores problemas fitopatológicos do Brasil. Análises do genoma de M. perniciosa permitiram identificar três genes codificadores para proteínas indutoras de necrose e etileno (NEPs) descritas em oomicetos, bactérias e alguns fungos ascomicetos. Os genes codificadores das proteínas NEP de M. perniciosa (MpNEPs) parecem estar localizados no mesmo cromossomo e foram nomeados 1 e 2 (o terceiro gene está incompleto) segundo a descoberta no genoma (1) ou em uma biblioteca de cDNA de interação M. perniciosa-cacaueiro (2). Os genes codificadores para estas proteínas foram clonados, e expressos usando um sistema de expressão heterólogo em E. coli produzindo proteínas de fusão a cauda de histidinas. As proteínas recombinantes foram purificadas usando colunas de afinidade a metais. MpNEP1 e MpNEP2 apresentam alta similaridade em sua seqüência de aminoácidos e são capazes de induzir necrose e síntese de etileno tanto em folhas de tabaco quanto em cacau. Ambas as MpNEPs apresentam perfis de expressão diferencial nas fases de vida do fungo: MpNEP1 é expressa de forma similar nas fases biotrófica e saprofítica enquanto que MpNEP2 é mais expressa na fase biotrófica. Importantes diferenças no comportamento físico das proteínas foram detectadas: MpNEP1 se comporta como um agregado (dímero ou trímero) em solução e é sensível a tratamento térmico enquanto que MpNEP2 se comporta como monômero e mantém a atividade de necrose depois de submetida a altas temperaturas. Estas diferenças sugerem que estas proteínas podem ter funções complementares durante o desenvolvimento da doença. Esta é a primeira vez que se descreve a presença desta família de proteínas em fungos basidiomicetos e seu estudo pode ser de grande importância para a compreensão dos mecanismos da doença Vassoura-de-bruxa / Abstract: The hemibiotrophic basidiomycete Moniliophthora perniciosa is the causal agent of Witches¿ broom disease of Theobroma cacao, which constitutes one of the main phytopathological problems of Brazil. An analysis of the M. perniciosa draft genome led to the identification of three putative genes encoding Necrosis and Ethylene inducing Proteins, which have been described in oomycetes, bacteria, and some species of ascomycetous fungi. The NEP proteins of M. perniciosa (MpNEPs) are apparently located on the same chromosome and were named 1 and 2 according to their discovery in the genome (1) or in a cDNA library containing transcripts from the interaction M. perniciosa-cacao (2). The genes codifying MpNEPs were cloned and expressed using a heterologous expression system in E. coli producing recombinant proteins with a minimal N-terminal His-tagged fusion peptide. MpNEPs were purified using nickel affinity columns. MpNEP1 and 2 have highly similar amino acid sequences and are able to induce necrosis and ethylene emission in both tobacco and cacao leaves. These MpNEPs showed different expression profiles according to the developmental stage of the fungus: MpNEP1 was expressed in a similar way in the biotrophic and saprotrophic mycelias, while MpNEP2 was preferentially expressed in the biotrophic phase. Furthermore, important differences were also detected in the physical properties of these two proteins. MpNEP1 in solution behaves as an oligomer (dimer or trimer) and is very sensitive to temperature. On the other hand, MpNEP2 in solution behaves as a monomer and is able of rapid renaturation after boiling, thus keeping its necrotic activity. These differences indicate that these highly similar NEPs may have complementary roles during disease development. This is the first report of NEP1-like proteins in basidiomycetes and their study will be of great importance in order to acquire a better understanding of the molecular mechanisms underlying Witches¿ broom disease / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Fitoplasmas são procariotos sem parede celular e habitantes de floema, agentes de doenças que causam danos consideráveis em diversas culturas. O maracujazeiro é uma espécie tropical cultivada em diversas regiões brasileiras. As doenças estão entre os fatores que podem causar danos à cultura e o superbrotamento do maracujazeiro tem se revelado como sendo uma das mais importantes. Esta doença, associada com fitoplasma, foi reportada somente no Brasil, onde foi registrada nos estados do Rio de Janeiro e de Pernambuco, no início da década de oitenta. Embora alguns estudos sobre o assunto tenham sido feitos anteriormente, o presente estudo foi conduzido para: demonstrar a presença constante do agente em associação com plantas doentes; revelar a ocorrência do fitoplasma em algumas áreas pertencentes a alguns estados; identificar, classificar e estudar filogeneticamente o fitoplasma; e demonstrar a patogenicidade do fitoplasma do superbrotamento do maracujazeiro. Em 2005-2006, plantas sintomáticas suspeitas de estarem infectadas por fitoplasma foram amostradas em algumas áreas do estado de São Paulo e vários outros estados brasileiros. A detecção e identificação por PCR duplo foi conduzida com os pares de oligonucleotídeos universais para fitoplasmas R16mF2/mR1-R16 F2n/R2 e pelo par específico R16(III) F2/R1, repectivamente. Para as análises de RFLP foram usadas as enzimas de restrição AluI, HhaI, KpnI, HinfI, HpaII, MseI, RsaI e MboI. Análises filogenéticas foram baseadas nas seqüências de nucleotídeos do 16S rDNA de fitoplasmas pertencentes a grupos e subgrupos distintos. Os ensaios de patogenicidade foram feitos usando-se enxertia de tecido. Amplificações de fragmentos de DNA de 1,2kb usando-se os oligonuclotídeos universais revelaram a presença de fitoplasma nas plantas sintomáticas de todas as regiões amostradas. Amplificações de fragmentos de DNA de 0,8kb pelos oligonucleotídeos específicos indicaram que o fitoplasma detectado era afiliado ao grupo 16SrIII, enquanto as análises de RFLP confirmaram a identificação feita com base no PCR e mostraram que o fitoplasma pode ser classificado como um membro do subgrupo 16SrIII-B. Sequenciamento e análises filogenéticas revelaram que o fitoplasma do superbrotamento do maracujazeiro é um típico representante do grupo 16SRIII, quando comparado com fitoplasmas de outros grupos. A patogenicidade foi demonstrada através da observação de sintomas típicos da doença, seguida da detecção molecular do fitoplasma in plantas sadias enxertadas com ramos de plantas infectadas. Os resultados obtidos no presente estudo permitiram: confirmar a diagnose baseada na sintomatologia; revelar a associação constante entre planta doente e fitoplasma, confirmando investigações anteriores conduzidas com microscopia eletrônica; identificar o fitoplasma como um membro do grupo 16SrIII-B; demonstrar que o fitoplasma é o agente causal do superbrotamento do maracujazeiro; e mostrar a ocorrência atual do patógeno nos estados da Bahia, do Paraná, Rio de Janeiro, Sergipe e São Paulo. / Phytoplasmas are cell wall-less prokaryotes and phloem-inhabitants associated with diseases that affect several crops. Passion fruit plant is a tropical species cultivated in various Brazilian regions. Diseases are among factors that may cause damage to this crop and the passion fruit witches\' broom has been revealed as very important one. That disease, associated with phytoplasma, was reported only in Brazil, where it was registered in Rio de Janeiro and Pernambuco States in the beginning of eighty decade. Although some studies about that subject have been made previously, the present study was conducted in order to: demonstrate the constant presence of the agent in association with diseased plants; reveal the occurrence of fitoplasma in some areas belonging to some States; identify, classify and study phylogenetically the phytoplasma; and demonstrate the pathogenicity of passion fruit witches\' broom phytoplasma. In 2005-2006, symptomatic plants suspected of phytoplasma infection were sampled in some areas of São Paulo State and various other Brazilian States. The detection and identification by nested PCR were performed with the universal primer pair R16mF2/mR1-16F2n/R2 and specific pair R16(III)F2/R1, respectively. For RFLP analyses were used the restriction enzymes AluI, HhaI, KpnI, HinfI, HpaII, MseI, RsaI e MboI. Phylogenetic analyses were based on the nucleotide sequences of the 16S rDNA from phytoplasmas belonging to distinct groups and subgroups. Pathogenecity assays were made by using grafting of tissue. Amplifications of DNA fragments of 1.2kb by using universal primer pairs revealed the presence of phytoplasma in the symptomatic plants from all sampled regions. Amplifications of DNA fragments of 0,8kb by specific primer pair indicated that the detected phytoplasma is affiliated to the group 16SrIII, while RFLP analyses confirmed the identification based on PCR and showed that phytoplasma may be classify as a member of the subgroup 16SRIII-B. Sequencing and phylogenetic analysis revealed that the passion fruit witches\'broom phytoplasma is a typical representative of group 16SRIII, when compared with phytoplasmas from other groups. Pathogenicity was demonstrated through the observation of typical symptoms of the disease followed by molecular detection of the phytoplasma in healthy plants grafted with shoots from infected plants. The results obtained in the present study allowed: to confirm the diagnosis based on the symptomatology; to reveal the firm association between diseased plant and phytoplasma, confirming previous investigations conduced by electron microscopy; to identify the phytoplasma as a member of the group 16SRIII-B; to demonstrate that phytoplasma is the causal agent of passion fruit witches\' broom; and to show the present occurrence of the pathogen in the States of Bahia, Paraná, Rio de Janeiro, Sergipe, and São Paulo

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T13:53:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ReisJunior_Osvaldo_M.pdf: 4891818 bytes, checksum: f9d97822f44db63385219e9c927eaf29 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As tecnologias de sequenciamento de segunda geração geram um grande número de sequências em um curto espaço de tempo e com baixo custo. O sequenciamento em larga escala de cDNA, conhecido como RNA-seq, tem permitido análises precisas de transcriptomas inteiros sem a necessidade de conhecimento prévio sobre sequências genômicas, conforme exigido pela tecnologia de microarranjos. No entanto, existem muitas discussões sobre os métodos utilizados para o alinhamento de reads, identificação de genes diferencialmente expressos e montagem de transcriptomas. Desde 2000, o Laboratório de Genômica e Expressão (LGE), tem estudado a doença da vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao), que é causada pelo fungo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa. Recentemente, 54 bibliotecas RNA-seq da interação planta-patógeno foram sequenciadas pelo nosso grupo, a fim de ajudar na elucidação da complexa biologia da doença. Desta forma, este trabalho tem como objetivo gerar informações sobre o perfil de transcrição do M. perniciosa e do T. cacao durante a doença vassoura-de-bruxa. Os resultados estão divididos em três seções principais, sendo que na primeira apresentamos uma análise de alinhamento e expressão gênica nas condições e tecidos amostrados. Na segunda, analisamos o estágio inicial da doença, conhecido como vassoura-verde, onde através da análise de expressão diferencial identificamos genes relacionados aos mecanismos de interação entre o cacaueiro e o fungo M. perniciosa. Na ultima seção, desenvolvemos uma estratégia para identificar sequências de possíveis RNAs não codificantes longos (lncRNA) e aplicamos esta estratégia no fungo M. perniciosa. De uma maneira geral estes dados apresentam um importante avanço no estudo desta doença e poderão ser utilizados em trabalhos futuro / Abstract: Next-generation sequencing technologies generate large numbers of sequences in a short time and at low cost. The high-throughput sequencing of cDNA, known as RNA-seq, has allowed precise analyses of entire transcriptomes without the need of previous knowledge on genomic sequences, as required by microarrays. However, there are many discussions about the methods used for read alignment, identification of differentially expressed genes and assembly of transcriptomes. Since 2000, the Genomics and Expression Laboratory (LGE), has been studying the Witches' Broom Disease (WBD) of cacao (Theobroma cacao), which is caused by the basidiomycete fungus Moniliophthora perniciosa. Recently, 54 RNA-seq libraries of this plant-pathogen interaction were sequenced by our group in order to help in the elucidation of the complex biology of the disease. Thus, this work aims to generate information about the transcription profile of M. perniciosa and T. cacao during the Witches' Broom Disease (WBD). The results are divided into three main sections, the first is an analysis of alignment and gene expression under the conditions and sampled tissues. In the second section, we analyze the initial stage of the disease, known as green broom, where through differential expression analysis we could identify genes related to mechanisms of interaction between cacao and the fungus M. perniciosa. In the last section, we developed a strategy to identify possible sequences of long noncoding RNAs (lncRNA) and applied this strategy in the fungus M. perniciosa. In general these data present an important advance in the study of this disease and may be used in future work / Mestrado / Bioinformatica / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Jorge Maurício Costa Mondego / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T03:53:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franco_SulamitadeFreitas_D.pdf: 3383952 bytes, checksum: e4041edb080f1a645fcbd6eacdc51378 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A cultura do cacau é de grande importância econômica em países produtores da semente e produtores de chocolate, e move um mercado que alcança hoje ao redor de U$ 50 bilhões. As doenças fúngicas são um fator importante na redução de produção de cacau. No Brasil, o principal responsável pela perda na produção é o basidiomiceto Moniliophthora perniciosa, agente etiológico da doença conhecida como vassoura de bruxa, que arrasou a produção brasileira na década de 90. A doença tem como característica a não elicitação de resposta hipersensitiva (HR), o que permite a colonização de tecidos vegetais pelo fungo. HR é uma resposta que desencadeia a indução da expressão de proteínas denominadas PRs (pahtogenesis related), que agem contra patógenos. Entre as PRs encontram-se as PR5, conhecidas como taumatinas. Análise do genoma de M. perniciosa resultou na anotação de 13 genes que codificam proteínas Taumatina- like (MpTLPs). Apesar de serem bem descritas como proteínas antifúngicas em plantas, estudos em fungos basidiomicetos apontam seu envolvimento no remodelamento celular durante a formação cogumelos. M. perniciosa é a espécie de fungo com o maior número de TLPs descritos até o momento, tendo 6 deles organizados em clusters, indicando eventos de duplicação. Análise filogenética revelou uma maior quantidade de TLPs em basidiomicetos, quando comparado a ascomicetos, indicando sua participação na formação de cogumelos. No geral, MpTLPs são transcritas durante a fase de vassoura seca da doença, onde o galho seco está sujeito a infecção de fungos oportunistas, indicado a contribuição dessas proteínas no combate contra esses fungos, além de poder estar participando no desenvolvimento de sua parede para formação de basidiocarpo e na degradação da parede celular da planta. Além das MpTLPs, análise de transcriptoma revelou um total de 35 MpCSEPs (Proteínas Candidatas a Efetores de Patogenicidade Secretados pelo fungo) com valor de RPKM >50 foram identificadas em plantas de cacau infectadas. Esses genes são expressos preferencialmente na fase inicial da doença (Vassoura verde), onde encontramos o fungo ainda em fase biotrófica. Em geral, esses genes codificam proteínas pequenas e ricas em cisteínas que são características típicas de efetores de virulência (AVRs), podendo ser uma evidência de que esses genes codificam potenciais efetores. Após triagem, 16 desses genes foram escolhidos para a caracterização estrutural. Destes, sete foram clonados para expressão de proteína heteróloga, o que resultou ao final do estudo a cristalização de 2 proteínas (MpCSEP 5 e MpCSEP 14). Os cristais obtidos até o momento foram testados em linha de luz MX1 e MX2, mas não apresentou difração e os processos de refinamento dos cristais deverão ser continuados. As proteínas obtidas nesse estudo poderão ser utilizadas em testes enzimáticos em trabalhos futuros, para sua completa caracterização estrutural e funcional / Abstract: The cocoa cultivation have great economic importance in the seed and chocolate producing countries , moving a market that presently reaches around $50 billion. Fungal diseases are the major factor in reducing cocoa production. In Brazil, the main responsible for the production loss is the basidiomycete Moniliophthora perniciosa, known as the etiological agent of witches' broom disease , which devastated the Brazilian production in the 90's disease. The disease is characterized by not eliciting a hypersensitive response (HR), which allows the plant tissue colonization by the fungus. HR is a response that triggers the induction of the expression proteins called PRs (pahtogenesis related), which act against pathogens. Among the PRs, PR5 are known as thaumatins. M. perniciosa genome analysis resulted in the annotation of 13 genes encoding proteins Thaumatin - like (MpTLPs). Despite being well described as antifungal proteins in plants, fungi basidiomycetes studies suggest its involvement in cellular remodeling during mushroom formation. M. perniciosa fungal is the species with the highest number of TLPs described so far, with 6 of them organized in clusters, indicating duplication events. Phylogenetic analysis revealed a greater number of TLPs in basidiomycetes when compared to ascomycetes, indicating their involvement in the formation of mushrooms. Overall, MpTLPs are transcribed during the dry broom disease, where the dead branch is subject to opportunistic fungal infection, indicating the contribution of these proteins in the fight against these fungi, and can be participating in the development of your wallpaper for training basidiocarp and in the cell wall degradation of the plant. Besides MpTLPs, transcriptome analysis revealed a total of 35 MpCSEPs (candidate secreted effectors of pathogenicity protein by the fungus) with RPKM value > 50 have been identified in infected cocoa plants. These genes are preferentially expressed in the early phase of the disease (Green Broom), where we found the fungus still in biotrophic phase. In general, these genes encode small and rich in cysteine that are typical characteristics of virulence effector (AVRs) proteins, which can be evidence that these genes encode potential effectors. After screening, 16 of these genes were chosen for structural characterization. Of these, seven were cloned for expression of heterologous protein, resulting at the end of the study the crystallization of 2 proteins (MpCSEP 5 and 14). The crystals obtained so far been tested in MX1 and MX2 light line, but showed no diffraction and processes of crystals refinement should continue. The proteins obtained in this study may be used in enzymatic assays in future work to its full structural and functional characterization / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T10:59:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Formighieri_EduardoFernandes_D.pdf: 7946045 bytes, checksum: f2194ed5a131ce1c4510fba4a7bbea5f (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O genoma mitocondrial (mtDNA) do fungo Moniliophthora perniciosa foi completamente seqüenciado e contém 109103 pb, com 31% de bases GC, porcentagem menor que a encontrada nas seqüências do genoma nuclear (47%). É o maior genoma mitocondrial de fungos descrito até o momento, e seu tamanho é conseqüência de grande espaço intergênico, que contém diversas ORFs com possibilidade de serem confirmadas como novos genes. Análises computacionais indicam a presença de variação no número de mtDNAs/célula nas diferentes bibliotecas, com tendência significativa de menor número de mtDNAs/célula no grupo de bibliotecas proveniente de culturas submetidas a repetidas repicagens. A maioria dos genes típicos (atp6, atp9, nad1-6, nad4L, cox1-3, cob, sendo a exceção o atp8), todos os rRNAS, tRNAS (foi encontrado pelo menos um para cada aminoácido) e genes das ORFs intrônicas estão orientados no sentido horário. Foram identificados também um gene rps3 e um grupo de ORFs com características semelhantes às dos genes típicos. Surpreendentemente o mtDNA apresenta uma região ocupada por uma estrutura de invertron característica de plasmídeos kalilo-like, integrado de maneira estável ao genoma em todas as variedades do biótipo C, e presente nos demais biótipos testados. Esta seqüência está disponível no GenBank através do número de acesso: AY376688. A outra linha de trabalho foi desenvolvida juntamente com outros bioinformatas do Laboratório de Genômica e Expressão. Foram desenvolvidas ferramentas de mineração e anotação de genes para projetos genoma, sendo os maiores destaques o Gene Projects, que permite mineração e anotação de genes durante o processo de seqüenciamento, e a nova interface de anotação, desenvolvida para otimizar a qualidade e a eficiência da anotação de genes / Abstract: The mitochondrial genome (mtDNA) of the fungus Moniliophthora perniciosa was completely sequenced and it contains 109103 bases pair, with 31% of bases GC, smaller percentage than found in the sequences of the nuclear genome (47%). It is the largest mitochondrial genome of fungus described to the moment, and its size is consequence of great intergenic space, with several ORFs who can be confirmed as new genes. Computational analyses show the presence of variation in the number of mtDNAs / cell in different libraries, with significant tendency of smaller mtDNAs / cell number in group of libraries originating from cultures undergoes to repeatedly reply. Most of the typical genes (atp6, atp9, nad1-6, nad4L, cox1-3, cob, being the exception the atp8), all of the rRNAS, tRNAS (it was found at least one for each amino acid) and genes of the intronic ORFs are guided in the hourly sense. Surprisingly the mtDNA presents one region occupied for a structure of invertron, characteristic of plasmids kalilo-like, integrated in stable way to the genome in all of the varieties of the biotype C, and present in other tested biotypes. This sequence is available in the GenBank through the accession number: AY376688. The other work line was developed together with other bioinformatics of the Genomic and Expression Laboratory. Data mining and annotation of genes tools were developed for projects genome, being the largest prominences the Gene Projects, that allows mining and annotation of genes during the sequencing process, and the new annotation interface, developed to optimize the quality and the efficiency of the annotation of genes / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

O basidiomiceto Moniliophthora perniciosa é conhecido por causar a doença vassoura-debruxa no cacau (Theobroma cacao), responsável por grandes perdas de produção nessa cultura. A população de M. perniciosa apresenta variabilidade devido à sua capacidade de colonização de outras espécies de plantas, o que permite a identificação de biótipos e conseqüente agrupamento de isolados com base no hospedeiro. A caracterização de biotipos do fungo contribui para melhor conhecimento da estrutura populacional e sua dispersão, o que é importante para utilização em programas de melhoramento. Com esse objetivo foi avaliada a variabilidade genética e fisiológica de isolados do fungo correspondentes a três biotipos considerando a análise de taxas de crescimento pelo desenvolvimento micelial em diferentes meios e ambientes de cultivo in vitro, como a incorporação de cisteína, metionina e lisina e das fontes de nitrogênio tartarato de amônio e nitrato de potássio, iluminação, suscetibilidade a fungicidas, compatibilidade somática (SCG Grupo de Compatibilidade Somática), análise de perfis protéicos por SDS-PAGE e seqüenciamento parcial do 28S rDNA. A história evolutiva do patógeno não está registrada em seqüências de genes ribossomais e proteínas totais. Além disso, crescimento e produção de pigmentos são características compartilhadas pelos biótipos, não sendo fatores primários para adaptação do patógeno, porém com provável papel na colonização do hospedeiro. / The Basidiomycete Moniliophthora perniciosa is known as the pathogen for witches\' broom disease in cocoa (Theobroma cacao), responsible for large yield losts. Population of M. perniciosa presents variability due to its ability to colonize other plant species, which allows biotype identification and strains grouping, based upon the host specie. Fungi biotype characterization contributes to the knowledge of population and its dispersion and epidemiological methods, important for breeding programs. To aim the genetic and physiological variability of three strains, characteristics as growing rates, measured by the mycelia spreading at different culture media and different culture conditions in vitro, cysteine, methionine, lysine, nitrogen sources ammonium tartrate and potassium nitrate incorporation, light, fungicide susceptibility, somatic compatibility (SCG), protein patterns by SDS-PAGE and partial sequencing of rRNA 28S region were done. The evolutional history of it is pathogen is not printed into ribosomal genes sequences and total proteins. Besides that, growing and dye production are characteristics shared by the biotypes and can not be a primary adaptation factor but it can play a role in the host colonization process.

O basidiomiceto Moniliophthora perniciosa é conhecido por causar a doença vassoura-debruxa no cacau (Theobroma cacao), responsável por grandes perdas de produção nessa cultura. A população de M. perniciosa apresenta variabilidade devido à sua capacidade de colonização de outras espécies de plantas, o que permite a identificação de biótipos e conseqüente agrupamento de isolados com base no hospedeiro. A caracterização de biotipos do fungo contribui para melhor conhecimento da estrutura populacional e sua dispersão, o que é importante para utilização em programas de melhoramento. Com esse objetivo foi avaliada a variabilidade genética e fisiológica de isolados do fungo correspondentes a três biotipos considerando a análise de taxas de crescimento pelo desenvolvimento micelial em diferentes meios e ambientes de cultivo in vitro, como a incorporação de cisteína, metionina e lisina e das fontes de nitrogênio tartarato de amônio e nitrato de potássio, iluminação, suscetibilidade a fungicidas, compatibilidade somática (SCG Grupo de Compatibilidade Somática), análise de perfis protéicos por SDS-PAGE e seqüenciamento parcial do 28S rDNA. A história evolutiva do patógeno não está registrada em seqüências de genes ribossomais e proteínas totais. Além disso, crescimento e produção de pigmentos são características compartilhadas pelos biótipos, não sendo fatores primários para adaptação do patógeno, porém com provável papel na colonização do hospedeiro. / The Basidiomycete Moniliophthora perniciosa is known as the pathogen for witches\' broom disease in cocoa (Theobroma cacao), responsible for large yield losts. Population of M. perniciosa presents variability due to its ability to colonize other plant species, which allows biotype identification and strains grouping, based upon the host specie. Fungi biotype characterization contributes to the knowledge of population and its dispersion and epidemiological methods, important for breeding programs. To aim the genetic and physiological variability of three strains, characteristics as growing rates, measured by the mycelia spreading at different culture media and different culture conditions in vitro, cysteine, methionine, lysine, nitrogen sources ammonium tartrate and potassium nitrate incorporation, light, fungicide susceptibility, somatic compatibility (SCG), protein patterns by SDS-PAGE and partial sequencing of rRNA 28S region were done. The evolutional history of it is pathogen is not printed into ribosomal genes sequences and total proteins. Besides that, growing and dye production are characteristics shared by the biotypes and can not be a primary adaptation factor but it can play a role in the host colonization process.

A vassoura-de-bruxa é a doença mais importante da cultura do cacaueiro, nos países onde ela ocorre. Em 1989 foi constatada pela primeira vez a presença do patógeno causador dessa doença na principal região produtora do Brasil. A falta de medidas de controle eficientes resultou, nos últimos anos, em menor produção, mudanças no uso da terra, venda de propriedades, diminuição do nível de emprego e danos ao meio ambiente. Em vista do pouco conhecimento sobre aspectos epidemiológicos da doença nas condições do sudeste da Bahia, elaborou-se o presente trabalho com os seguintes objetivos: estudar o gradiente de infecção da vassoura-de-bruxa em ramos e frutos em cacaueiros enxertados; comparar o efeito de genótipos e três tratamentos (poda fitossanitária semestral, poda fitossanitária mensal e poda fitossanitária aliada a aplicação de fungicida mensais) no controle da doença; estudar o progresso da vassoura-de-bruxa no tempo, quantificado em ramos e frutos doentes. O experimento foi conduzido em Uruçuca, BA, em área contendo 16 genótipos diferentes, adjacente a uma área com cacaueiros abandonados com alta incidência da doença. A área experimental foi dividida em três partes, as quais receberam os seguintes tratamentos: poda fitossanitária semestral, poda fitossanitária mensal e poda fitossanitária aliada a aplicação de fungicida mensal. Pelo menos uma vez por mês foram contados os ramos e frutos com vassoura. Os resultados mostraram a ausência de evidência clara da existência de gradiente de doença. Os níveis de resistência genética à vassoura-de-bruxa de ramos e frutos não foram correlacionados entre si. Houve bom ajuste do progresso da doença ao modelo monomolecular. As menores taxas de crescimento foram obtidas no tratamento com poda e aplicação de fungicida mensal. O tratamento que combinou poda e pulverização com fungicida apresentou diferença significativa na redução do percentual de frutos com vassoura. Os genótipos NO-34, NO-17 e NO-02 foram os que apresentaram menores percentagens de frutos com vassoura, sendo significativamente diferentes dos genótipos NO-24 e NO-13. / Witches' broom is the most important disease of cocoa, in the countries where it occurs. In 1989, it was verified for the first time the presence of the pathogen in the main producing area of Brazil. The lack of efficient control measures resulted, in the last years, in losses in the production, changes in the use of the soil, sale of properties, decrease of the employment level and damages to the environment. In view of the little knowledge on epidemic aspects of the disease in the conditions of the southeast of Bahia, the present work was elaborated with the following objectives: to study the gradient of the witches' broom infection in flushes and pods in grafted cocoa; to compare the effect of genotypes and three treatments (half-yearly phytosanitation, monthly phytosanitation and monthly phytosanitation allied to fungicide application) in the control of the disease; to study the witches' broom temporal progress, quantified in flushes and pods. Trials were carried out in Uruçuca, BA, in area contends 16 different genotypes, adjacent an area with abandoned cocoa with high incidence of the disease. The experimental area was divided in three parts, which received the following treatments: half-yearly phytosanitation, monthly phytosanitation and monthly phytosanitation allied to fungicide application. At least once a month, flushes and pods with broom were counted. Results showed the absence of clear evidence of the existence of disease gradient. The levels of genetic resistance to the witches' broom of flushes and pods were not correlated to each other. There was good adjustment of progress of the disease to the monomolecular model. The smallest growth rates were obtained in the treatment with monthly phytosanitation and fungicide application. The treatment that allied phytosanitation and fungicide application presented significant difference in the reduction of the percentage of witches' broom infected pods. The genotypes NO-34, NO-17 and NO-02 presented smaller percentages of diseased pods, being significantly different from the genotypes NO-24 and NO-13.

Frequentemente, fitoplasmas têm sido associados com doenças em cucurbitáceas, tanto cultivadas, como silvestres e daninhas. Em abobrinha-de-moita cultivada no Vale do Ribeira, Estado de São Paulo, foi observado superbrotamento de hastes, malformação da parte aérea e folhas deformadas e enrugadas, sugerindo uma possível infecção por fitoplasmas. A associação de fitoplasmas com morangueiro parece ser rara no Brasil. No entanto, nos municípios de Domingos Martins e Santa Maria de Jetibá, Estado do Espírito Santo, foram observadas plantas de morango apresentando expressiva filodia de frutos, sintoma suspeito de infecção por fitoplasmas. O presente trabalho teve por objetivos detectar e identificar molecularmente os possíveis fitoplasmas associados às plantas doentes. O DNA total das amostras, extraído com um kit comercial ou pelo protocolo 2X CTAB, foi amplificado por dupla PCR com os primers universais P1/Tint e R16F2n/R16R2. Os produtos amplificados com o primeiro par de primers foram reamplificados usando os pares R16(I)F1/R16(I)R1 e R16(III)F2/R16(III)R1, visando a identificação e os produtos de dupla PCR, amplificados com o segundo par de primers, utilizados na análise por RFLP e no sequenciamento. Para as análises filogenéticas adotaram-se seqüências nucleotídicas de fitoplasmas pertencentes a diversos grupos. Observações feitas ao microscópio eletrônico de transmissão revelaram a presença de corpúsculos pleomórficos típicos de fitoplasmas no floema de morangueiro. Por dupla PCR com os primers universais, foi consistentemente detectada a presença de fitoplasmas nos tecidos das plantas doentes. Com o uso dos primers específicos foi possível a identificação de um fitoplasma afiliado ao grupo 16SrIII em abobrinha-de-moita e de fitoplasmas afiliados aos grupos 16SrI e 16SrIII em morangueiro. A análise por RFLP confirmou os resultados obtidos com os primers específicos e demonstrou a presença de um fitoplasma afiliado ao grupo 16SrXIII nas amostras de morangueiro. O sequenciamento permitiu a obtenção de duas seqüências a partir das amostras de morangueiro. A primeira seqüência nucleotídica, SFP-Br1 (EU719107), apresentou 99% de similaridade com as seqüências dos fitoplasmas afiliados ao grupo 16SrIII e a análise filogenética mostrou um maior relacionamento com o subgrupo 16SrIII-B. A segunda seqüência nucleotídica, SFP-Br-3 (EU719109), apresentou 98% de similaridade com as seqüências dos fitoplasmas afiliados ao grupo 16SrXIII. A análise filogenética mostrou este fitoplasma como um representante do grupo 16SrXIII, porém localizado em um novo ramo, diverso daqueles conhecidos para representantes deste grupo. Os coeficientes de similaridade calculados para SFP-Br3 e para os subgrupos 16SrXIII-A, 16SrXIII-B e 16SrXIII-C variaram de 0,91 a 0,96, o que distinguiu o fitoplasma presente no morangueiro dos outros subgrupos de fitoplasmas afiliados ao grupo 16SrXIII já existentes. Assim, através de análise molecular, foi possível relatar a abobrinha-de-moita como um novo hospedeiro de fitoplasmas do grupo 16SrIII, bem como detectar e identificar distintos fitoplasmas nas plantas de morango, inclusive um novo representante, aqui denominado de 16SrXIII-D. / Phytoplasmas have been associated with some diseases of cucurbit as cultivated as sylvester and weed species. Symptoms of witches broom and leaf malformation were observed in summer squash cultivated in the Vale do Ribeira, São Paulo State, suggesting infection by phytoplasma. The association of phytoplasmas with strawberry diseases seems to be rare in Brazil. Nevertheless, in Domingos Martins and Santa Maria de Jetibá cities, located in Espirito Santo State, strawberries plants with expressive fruit phyllody were observed. This kind of symptom also suggested infection associated to phytoplasma. So, the present work was conducted in order to detect and identify possible phytoplasmas associated to simptomatic plants through molecular analysis. The DNA, extracted with a commercial kit or through 2X CTAB protocol, was amplified by nested PCR with universal primers P1/Tint and R16F2n/R16R2. The amplified products with the first primers pairs were reamplified using the primers R16(I)F1/R16(I)R1 and R16(III)F2/R16(III)R1 for specific identification; and the products of nested PCR, amplified from second primers pair, were submitted to RFLP analysis and to sequencing. For phylogenetic analysis were included sequences of phytoplasmas belonging to many groups. Results showed that pleomorphic bodies were present in the phloem of diseased strawberries plants, by using electronic microscopy. The amplifications by nested PCR with universal primers allowed the detection of phytoplasmas in the tissues of symptomatic strawberry and squash plants. PCR assays with specific primers revealed a phytoplasma of 16SrIII group in summer squash and phytoplasmas of 16SrI and 16SrIII groups in strawberry plants. RFLP analysis confirmed the occurrence of a member of 16SrIII group in summer squash and demonstrated the presence of phytoplasmas affiliated to 16SrI, 16SrIII and 16SrXIII groups in strawberry samples. The sequencing allowed the attainment of two sequences from strawberries samples. The first sequence, designated SFP-Br1 (EU719107) representing a phytoplasma affiliated to 16SrIII group, showed 99% of similarity with other sequences of phytoplasmas affiliated with this group. The phylogenetic analysis showed that this phytoplasma was more related with the subgroup 16SrIII-B. The second sequence, designated SFP-Br3 (EU719109) representing a phytoplasma affiliated to 16SrXIII group, showed 98% of similarity with members of this group. The phylogenetic analysis revealed this phytoplasma belonging to 16SrXIII group, but located on a new different branch from those previously known. The similarity coefficient indicated variations between SFP-Br3 and the three phytoplasmas affiliated to 16SrXIII-A, 16SrXIII-B and 16SrXIII-C sub-groups, varying on 0.91 to 0.96, distinguishing the strawberry phytoplasma from the other sub-groups of phytoplasma affiliated with the 16SrXIII group already existing. This way, through molecular analysis, it was possible to relate summer squash as a new host of 16SrIII group phytoplasma, as well as detecting and identifying distinct phytoplasmas on strawberry plants and characterize a new 16SrXIII-D subgroup.

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T16:13:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rincones_Johana_D.pdf: 3507237 bytes, checksum: b5905da7ffa8ea3a869dd3090e9a1d1f (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A Vassoura-de-Bruxa do cacaueiro constitui um patosistema complexo e até o momento não foi estabelecido um plano de controle efetivo na região produtora da Bahia. O objetivo principal deste trabalho foi aprimorar os conhecimentos sobre a interação C. perniciosa-Cacaueiro com informações referentes à: 1) tamanho e organização do genoma através da obtenção do cariótipo molecular do fungo; 2) variabilidade genética deste fitopatógeno a nível cromossômico na região produtora da Bahia; e 3) expressão gênica do fungo em presença de extratos do hospedeiro. O cariótipo molecular foi estabelecido por eletroforese em gel de campo pulsado. Esta mesma metodologia foi utilizada em combinação com análise tipo microsatélites para um estudo de variabilidade a nível cromossômico de 38 isolados provenientes de três biótipos e diferentes regiões geográficas. Para análise da expressão gênica foram seqüenciadas quatro bibliotecas de cDNA do fungo sob diferentes condições de cultivo e em diferentes estágios do desenvolvimento, incluindo uma biblioteca subtrativa obtida por SSH. Como resultados, apresentamos o cariótipo molecular de C. perniciosa e a existência de polimorfismos cromossômicos. A análise dos 38 isolados permitiu observar que o cariótipo do biótipo-C é estável ao longo do tempo e sua variabilidade na região da Bahia é baixa, mostrando assim a fragilidade do programa de melhoramento genético do cacaueiro na Bahia, onde os clones resistentes selecionados no campo foram desafiados contra apenas dois genótipos do patógeno. Com relação à análise da expressão do fungo, obtivemos 1427 unigenes e sua análise por similaridade com as bases de dados permitiu a identificação de diversos mecanismos pelos quais o fungo poderia estar manipulando o metabolismo da planta para seu benefício e em detrimento da produção de cacau. Assim, consideramos que a partir deste trabalho foi possível obter uma maior compreensão dos mecanismos utilizados por C. perniciosa no desenvolvimento da Vassoura-de-Bruxa em cacaueiro e estudos mais aprofundados, baseados nos resultados aqui obtidos, deverão auxiliar no desenvolvimento de estratégias de controle para esta importante doença / Abstract: Witches' broom disease of cocoa is a complex pathosystem that has evaded an efficient control program in the cacao-producing region of Bahia, Brazil. The main goal of this work was to acquire a better understanding of the C. perniciosa-Cacao interaction by providing new data regarding: 1) the size and organization of the fungal genome through molecular karyotyping; 2) the genetic variability of this phytopathogen at the chromosomal level in the cacao-producing region of Bahia; and 3) the gene expression of the fungus in the presence of host extracts. The molecular karyotype was obtained through pulsed-field gel electrophoresis. This same technique was applied in combination with microsatellite PCR analysis of 38 isolates from different biotypes and geographic regions in order to study the chromosomal-level genetic variability of this pathogen. For the gene expression analysis, four cDNA libraries of the fungus grown under different culture conditions and developmental stages, including a subtractive library using SSH, were sequenced and searched for similarities in the public databases. As results, we present the molecular karyotype of C. perniciosa and the existence of chromosome-length polymorphism. The analysis of the 38 isolates showed that the karyotype of the C-biotype is very stable in time and that the variability of the pathogen in Bahia is very low, thus indicating the fragility of the current cacao-breeding program in Bahia, where the resistant cacao clones selected in the field were challenged against only two different genotypes of the pathogen. With regards to the gene expression analysis, we obtained 1427 unigenes and the similarity searches allowed the identification of various mechanisms through which the fungus might be manipulating the metabolism of the plant for its own benefit and in detriment of cocoa production. Therefore, we consider that this work allowed us to acquire a better understanding of the molecular mechanisms used by C. perniciosa during witches' broom development in cacao and more detailed studies, based on the results presented here, might aid in the development of novel control strategies for this important disease / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular