Mikrotubuli sind filamentöse intrazelluläre Polymere, die als grundlegende Bestandteile subzellulärer Strukturen in Eukaryoten dienen. Diese Studie verwendet einen vergleichenden Ansatz, um zu untersuchen, wie sich die intrinsischen dynamischen und biochemischen Eigenschaften von Tubulin zwischen verschiedenen Spezies unterscheiden, und zeigt ihre Konsequenzen in zwei verschiedenen physiologischen Kontexten: 1) Bestimmung der Spindelgröße bei Fröschen der Gattung Xenopus und 2) Spezifität von Mikrotubuli-Inhibitoren für Plasmodium falciparum-Mikrotubuli über denen ihres menschlichen Wirts. In den Eiern der Froschgattung Xenopus wird die Länge der meiotischen Spindel biochemisch festgelegt und erreicht unabhängig von räumlichen Einschränkungen eine Obergrenze. Messungen der Dynamik von Xenopus-Mikrotubuli zeigen, dass X. laevis-Mikrotubuli sowohl schneller wachsen als auch länger leben als die von X. tropicalis. Darüber hinaus spielt die Quantifizierung der Länge und Massenverteilung der Xenopus-Mikrotubuli zusammen mit den Reaktionen der Eiextrakt-Spindelanordnung eine Rolle für die intrinsische Dynamik der Mikrotubuli bei der Modulation der Spindellänge. Mikrotubuli sind auch Wirkstofftargets bei Pilz- und parasitären Helmintheninfektionen und haben in den letzten Jahrzehnten die Aufmerksamkeit als potenzielles Wirkstoffziel beim Malariaparasiten Plasmodium falciparum auf sich gezogen. Um die Dynamik und Medikamentspezifität von Mikrotubuli von P. falciparum zu charakterisieren, haben wir Tubulin direkt von den Parasiten gereinigt. Zum ersten Mal wurden hier dynamische P. falciparum-Mikrotubuli in vitro rekonstituiert und eine parasitenspezifische Unterdrückung der Dynamik von Mikrotubuli durch Oryzalin und Amiprofos-Methyl direkt nachgewiesen. Diese Studie legt einen experimentellen Rahmen fest, um direkt auf parasitenspezifische Hemmung von Mikrotubuli zu testen, die bisher unter Verwendung bestehender in-vitro-Ansätze nicht beobachtet wurden. / Microtubules are filamentous intracellular polymers that are fundamental components of subcellular structures including the spindle, the cytoskeleton, and flagella in eukaryotes. This study uses a comparative approach to investigate how the intrinsic dynamic and biochemical characteristics of tubulin vary between species and demonstrates their consequences in two different physiological contexts: 1) Spindle size control in Xenopus frogs, and 2) The specificity of microtubule inhibitors for Plasmodium falciparum microtubules over those of their human host. In Xenopus frog eggs, the length of the spindle is biochemically controlled and reaches an upper limit independent of spatial constraints. In this study, in vitro measurements of Xenopus microtubule dynamics show that X. laevis microtubules are both faster-growing and longer-lived X. tropicalis, independent of the influence of microtubule-associated proteins. Furthermore, quantification of Xenopus microtubule length and mass distributions, combined with egg extract spindle assembly reactions, establishes a role for intrinsic microtubule dynamics in modulating spindle length. Microtubules are also established drug targets in fungal and parasitic helminth infections and have in the past decades drawn attention as a potential drug target in the malaria parasite Plasmodium falciparum. In order to characterize P. falciparum microtubule dynamics, structure, and drug specificity, we have used an affinity chromatography-based approach to purify tubulin directly from blood-stage parasites. For the first time, dynamic P. falciparum microtubules have been reconstituted in vitro and parasite-specific suppression of microtubule dynamics by oryzalin and amiprofos methyl has been directly demonstrated. This study establishes an experimental framework to directly test for parasite-specific microtubule inhibition, microtubule structure, and interactions with MAPs that previously have not observed using existing in vitro approaches.

Praziquantel ist das Mittel der Wahl bei der Behandlung der Bilharziose. Für die Wirksamkeit des Medikaments spielt die Immunantwort des Wirts eine wichtige Rolle. Mikronährstoffe sind wichtig für die Funktion des Immunsystems. In Endemiegebieten der Bilharziose findet sich meist ein Mikronährstoffmangel. In dieser Studie wurde untersucht, ob ein Ausgleich des Mikronährstoffmangels das Behandlungsergebnis optimieren kann und Reinfektionen vermindert werden können. Für die randomisierte Interventionsstudie wurden 331 infizierte Kinder zwischen acht und 14 Jahren mit einer Eiausscheidung von über 30 Schistosoma haematobium Eiern pro 10 ml Urin ausgewählt. Die Kinder wurden zuvor in einer an zehn Grundschulen erhobenen Querschnittsstudie in einem blasenbilharzioseendemischen Gebiet in Tansania identifiziert. Die Interventionsgruppe erhielt vier Wochen lang ein Mikronährstoffpräparat und wurde danach mit Praziquantel behandelt, die Kontrollgruppe erhielt nur Praziquantel. Bei der Kontrolle des Therapierfolgs fanden sich keine signifikanten Unterschiede zwischen der Interventions- und der Kontrollgruppe hinsichtlich der Heilungsraten und der Infektionsstärke der Nichtgeheilten. Nach zehn Monaten wurden die Kinder nochmalig auf Eier im Urin untersucht, um Reinfektionen festzustellen. Fehlende bzw. spärliche Niederschläge machten jedoch Neuinfektionen fast unmöglich, da sich kaum Wasserstellen gebildet hatten, welche die Habitate von Bulinus nasutus - dem Zwischenwirt von S. haematobium im Untersuchungsgebiet - darstellen. Es waren nur 10 % der Kinder reinfiziert mit sehr geringen Infektionsstärken ohne signifikante Unterschiede zwischen den Studiengruppen. Es konnte nicht nachgewiesen werden, dass eine Mikronährstoffgabe den Therapieerfolg nach der Behandlung mit Praziquantel verbessern kann. Ob Reinfektionen verringert werden können, ließ sich aufgrund der anhaltenden Dürre in den Jahren 1999 und 2000 in dieser Studie nicht feststellen, sollte aber Gegenstand weiterer Studien sein. / Praziquantel is the drug of choice for schistosomiasis chemotherapy. The immune response of the host is an important factor in drug efficacy. Micronutrients are essential for an effective response of the immune system. In areas endemic for S. haematobium people often suffer from micronutrient deficiency. It was investigated whether a compensation of micronutrient deficiency can improve chemotherapy and reduce the rate and levels of reinfection. 331 children aged 8 to 14, highly infected with S. haematobium were selected for the randomised intervention-study. Children were identified in a cross-sectional study in 10 primary schools in Tanzania in an area endemic for S. haematobium. The intervention-group received a four weeks micronutrient supplementation followed by treatment with Praziquantel. The control-group was only treated with Praziquantel. The results showed no significant differences concerning cure rate and intensity of infection between the two study groups. The children were examined for reinfection ten months after treatment. Only ten percent of the children were reinfected with rather low levels of infection. There were no significant differences between the studied groups. Scarce rain during the rainy season inhibited the formation of the usual puddles, that form the essential habitat for Bulinus nasutus - the intermediate host of S. heamatobium. This substantially reduced the probability for new infections. It could not be confirmed whether micronutrient supplementation could improve the results after chemotherapy with Praziquantel. A decrease of reinfections due to micronutrient supplementations could not be confirmed due to the drought in 1999 and 2000, but should be a field for further investigations.

Die meisten Lebewesen nutzen zur Abwehr von pathogenen Mikroorganismen u.a. ein weites Spektrum von antimikrobiellen, oft kationischen Peptiden. Etliche dieser natürlichen und künstlichen Peptide sind in der Lage, Bakterienprodukte wie das Lipopolysaccharid (LPS) Gram-negativer Bakterien zu binden. LPS ist als potenter Stimulator des Immunsystems ein bedeutender Faktor bei der Entstehung von Infektion und Entzündung. LPS-bindende kationische Peptide, zu denen auch von der LPS-Bindungssequenz des Limulus-anti-LPS-Faktors (LALF) abgeleiteten Ringpeptide gehören, wirken synergistisch zu den klassischen Antibiotika, ohne jedoch wie diese zu einer vermehrten LPS-Freisetzung zu führen. LALF-Peptide zeigten in bisher veröffentlichten Versuchen vielversprechende Ergebnisse bei der Bindung von LPS und in murinen Sepsismodellen. In der vorliegenden Arbeit wird in Versuchen mit humanen Monozyten und murinen Makrophagen gezeigt, dass neuartige LALF-Peptide eine durch LPS induzierte Ausschüttung des Zytokins TNF-alpha und des vasoaktiv wirksamen Stickstoffoxids wirkungsvoll unterdrücken können. Ferner wird in LPS-Bindungsassays nachgewiesen, dass dies durch eine Blockierung der LPS-Erkennung durch das LPS bindende Protein (LPB) verursacht wird. Die Verwendung von D-Aminosäuren verspricht dabei in ersten in vitro Experimenten eine Optimierung der Peptid-Eigenschaften. Die Entschlüsselung der Wirkmechanismen dieser neuartigen Peptide könnte Auswirkungen auf die Entwicklung neuer therapeutischer Interventionsstrategien bei Infektion und Sepsis haben. / In host defense against pathogenic microorganisms most organisms employ a broad spectrum of antimicrobial, often cationic peptides. Several of these natural or synthetic peptides are able to bind bacterial products like Lipopolysaccharide (LPS) of Gram-negative bacteria. As a potential stimulator of the immune system LPS is an important pathogenetic factor for infection and inflammation. Cationic LPS-binding peptides like cyclic peptides corresponding to the LPS-binding domain of the Limulus-anti-LPS-factor (LALF) have been shown to act synergistic to classic antibiotics. An advantage of these compounds, however, may be their lack of induction of LPS release. In previous studies LALF-peptides have shown promising results for binding LPS, and in murine sepsis models. Here we show in experiments with human monocytes and murine macrophages that novel LALF-derived peptides are able to effectively block the LPS-induces release of the cytokine TNF-alpha and of the vasoactive nitric oxide. In addition it is shown here by employing an LPS-binding assay that this activity is caused by inhibition of LPS-recognition brought about by the LPS binding protein (LBP). In first in vitro experiments the use of D-amino acids looks promising as they improve peptide quality. To further elucidate the mode of action of these novel peptides could lead to the development of new therapeutic strategies against infection and sepsis.

Malaria ist noch immer die häufigste parasitäre Erkrankung in den Tropen. Vor allem afrikanische Kinder < 5 Jahren sind betroffen. Die steigende Chloroquinresistenz ist für einen deutlichen Anstieg der Kindersterblichkeit verantwortlich. Mehrere Studien belegen, dass die Kombination von Chloroquin (CQ) mit Sulfadoxin-Pyrimethamin (SP) in Afrika bei niedriggradiger CQ-Resistenz die therapeutische Wirksamkeit erhöht und damit auch die Resistenzentwicklung gegenüber beiden Medikamenten verzögern kann. Bei 315 Kindern im Alter von 6-59 Monaten wurde von Nov. 2000 bis Nov. 2001 eine Studie zur Epidemiologie der Malaria und zum Therapieausgang von CQ und SP in Tamale/Nord-Ghana durchgeführt. Bei Vorliegen einer Malaria wurde mit CQ und SP behandelt und der Therapieausgang gemäß eines modifizierten WHO-Protokolls von 1996 ermittelt. Die Gesamtzahl der Malaria-Episoden im Zeitraum betrug 836. In der Regenzeit erkrankte mit 23,7% ein signifikant höherer Anteil der Kinder an Malaria als in der Trockenzeit mit 9,4%. Ein frühes Therapieversagen (ETF) wurde in 5% der Fälle beobachtet, ein spätes Therapieversagen (LTF) in 19,5% der Fälle. 211 Fälle (68,7%) hatten einen klinischen Therapieerfolg (ACR). Alter < 3 Jahren war ein unabhängiger Einflussfaktor für ETF und Gesamttherapieversagen. Eine hohe Parasitendichte war ein unabhängiger Einflussfaktor für LTF und Gesamttherapieversagen. Das Risiko, ein Gesamttherapieversagen (ETF + LTF) zu entwickeln, war in der Regenzeit um das 6-fache gegenüber der Trockenzeit erhöht. Bei allen erstmalig mit CQ und SP behandelten Fällen (n = 206) war der ACR (72,3%) statistisch grenzwertig höher als bei zweiter oder mehrfacher Behandlung (61,4%; n = 101). Bei den mehrfach therapierten Fällen bestand mit 27% gegenüber 16% bei den erstmalig therapierten Fällen ein signifikant höheres Risiko, ein LTF zu entwickeln. Die Erholung des Hb-Gehalts bei den erfolgreich therapierten Fällen betrug 0,6 g/dl und unterschied sich signifikant vom Hb-Anstieg (0,4 g/dl) bei Fällen mit LTF. Ein Vergleich des ACR der beschriebenen Studie mit einer zuvor durchgeführten CQ-Studie ergab keinen signifikanten Unterschied. Die Ergebnisse dieser Studie legen die Schlussfolgerung nahe, dass sich die Therapie aus CQ und SP wegen der hohen CQ-Resistenz und der sich rasch entwickelnden SP-Resistenz zumindest in Nordghana nicht eignet. / Malaria remains the most frequent parasite disease in the tropics. Especially African children under 5 years are at risk. The rising chloroquine resistance is the cause for a significant increase in childhood mortality. Several studies indicate that the combination of chloroquin (CQ) and sulfadoxine-pyrimethamine (SP) in Africa with low-grade CQ resistance increases the therapeutic efficacy and can thus slow down the development of resistance to both drugs. The epidemiology of malaria and the therapeutic outcome of CQ and SP was assessed in a cohort study of 315 children aged 6-59 months from November 2000-November 2001 in Tamale/Northern Ghana. In the case of malaria a combination therapy of CQ and SP was given and the therapeutic outcome was assessed in a modified WHO protocol. The total number of all malaria episodes in the observation period was 836. In the rainy season, the amount of the children with malaria was significantly higher than in the dry season (23,7% vs. 9,4%). Early treatment failure (ETF) was observed in 5% of the cases and late treatment failure (LTF) in 19,5%. 211 cases (68,7%) fulfilled the criteria for adequate clinical response (ACR). Age under 3 years was an independent predictor for ETF and overall therapeutic failure. High initial parasite density was an independent predictor for LTF and overall therapeutic failure. The risk of developing an overall therapeutic failure (ETF + LTF) was 6 times greater in the rainy season than in the dry sason. In all cases with the first treatment of CQ and SP (n = 206), the percentage of ACR (72,3%) was significantly greater than in cases treated twice or more (61,4%, n = 101). Cases with 2 or more treatments were at a significantly higher risk of developing a LTF than cases with one treatment (27% vs. 16%). The recovery of the hb levels in cases with successful treatment was 0,6 g/dl and was significantly different from the haemoglobin increase in cases with LTF. A comparison between the therapeutic success of CQ and SP with CQ alone did not show a significant difference. The results of this study indicate that the combination therapy of CQ and SP is no longer useful for treatment of uncomplicated malaria in Northern Ghana because of the high CQ resistance and the increasing resistance of SP.

Malaria ist die Erkrankung, die durch Infektion eines Säugetiers mit dem eukaryotischen Parasiten Plasmodium entsteht. Die Symptome dieser Erkrankungen reichen von Fieber und Gelenkschmerzen bis zu schweren Organschäden in Hirn, Lunge, Niere und Leber bei einem geringen Teil der Erkrankten. Diese klinischen Symptome treten nur auf, während der Parasit sich asexuell in roten Blutzellen vermehrt. Die Zerstörung von Erythrozyten und die daraus resultierende Freisetzung von Zytokinen sind die Verursacher der malariatypischen wiederkehrenden Fieberzyklen. Der Mechanismus, der zur Entstehung von Gewebsschäden führt, ist hingegen nur unzureichend bekannt. Eine notwendige Bedingung für das Auftreten von Gewebeschäden ist, dass infizierte rote Blutzellen an das Endothel der Mikrovaskulatur bin. Die Schwere der Erkrankung ist direkt mit dem extrazellulären Auftreten von Stoffen verbunden, die normalerweise von neutrophilen Granulozyten im Zellinnern gespeichert werden. Neutrophile sind dafür bekannt sind, ein ganzes Arsenal an Waffen bereitwillig durch Degranulierung oder programmierten Zelltod einzusetzen. In dieser Studie berichten wir von einem direkten kausalen Zusammenhang zwischen dem aktiven inflammatorischen Zelltod (NETose) von Neutrophilen und der Entstehung von Organschäden bei einer Plasmodium-Infektion. Wir zeigen, dass NETs in Zirkulation freigesetzt und von extrazellulären DNase verdaut werden. Dadurch werden systemisch Aktivierungssignale für eine weitere Immunantwort zur Verfügung gestellt und es kommt zur Freisetzung von Zytokinen, Notfallgranulopoese und der Hochregulierung von zellulären Adhäsionsmarkern auf Endothelzellen. Dies erlaubt das Binden von infizierten Erythrozyten und Immunzellen an die Mikrovaskulatur bestimmter Organe. Wir zeigen außerdem, dass eine Intervention mit der Entstehung von NETs oder der Freisetzung neuer Neutrophiler diesen Prozess unterbindet und einen vielversprechenden therapeutischen Ansatz darstellt. / Malaria is the disease caused by an infection of a mammalian host by the mosquito borne eukaryotic parasite Plasmodium. The symptoms of the disease are diverse, ranging from fever and rigor in most patients to severe damage in solid organs such as brain, lung, kidney and liver in a small fraction of the afflicted. Clinical symptoms of the disease only occur when the parasite undergoes asexual replication within the red blood cells of the host. Destruction of these cells and subsequent release of cytokines are responsible for the recurring fever cycles of mild malaria. The mechanism underlying the occurrence of tissue damage however, remain mostly elusive. The adhesion of infected red blood cells to the endothelial wall of the microvasculature in the affected organs is a necessary requirement and pathology is associated with the activation of specific immune cells residing within the blood stream. Severity of disease is linked to extracellular accumulation of neutrophil proteins. Neutrophils are abundant white blood cells, known to readily deploy an arsenal of weaponry either by degranulation or by externalization of chromatin. In this study we report a direct causal relationship between the active inflammatory neutrophil cell death (NETosis) and the development of organ damage during a Plasmodium infection. We show that NETs are released in circulation, digested by extracellular DNase and thereby supply immune activation signals that drive inflammation. The systemic dissemination of these factors leads to the release of cytokines, emergency granulopoiesis and upregulation of cellular adhesion markers on endothelial cells thereby allowing for the binding of both infected red blood cells and immune cells to the microvasculature of specific organs. Furthermore we supply evidence, that repression of NETosis or inhibition of granulopoiesis abrogate these processes and present promising therapeutic strategies.

RIBEIRO, Sandra Mara Serafim. Transformação genética de plantas de fumo (Nicotiana tabacum var. Xanthi) com a seqüência CV1887 de Chromobacterium violaceum. 2009. 90 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2009. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-11T12:29:18Z No. of bitstreams: 1 2009_dis_smsribeiro.pdf: 1692746 bytes, checksum: 683e626eb9d261fd4a3e1f97ecdd84fe (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:19:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_dis_smsribeiro.pdf: 1692746 bytes, checksum: 683e626eb9d261fd4a3e1f97ecdd84fe (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:19:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_dis_smsribeiro.pdf: 1692746 bytes, checksum: 683e626eb9d261fd4a3e1f97ecdd84fe (MD5) Previous issue date: 2009 / The genetic transformation of plants represents today an important tool to investigate the function of genes of diverse origins like plants, fungi, virus, nematodes and bacteria. Those that come from bacteria are the most representative ones. Within this context, sequences coding to domains containing YD (tyrosine - asparatate) repetitions, that have similarities with nematicide proteins, were detected in the Chromobacterium violaceum strain ATCC 12472 genome. Among these sequences, the ORF CV1887 (4.155 bp) was selected for cloning and expression in the heterologous system, in the attempt to validate its activity determined in silico in the C. violaceum genome's annotation. The experimental strategy consisted in cloning the complete (4.155 bp) and the partial sequence (2.642 bp) of the ORF in the binary vector pBI121. The recombinant vectors w ere introduced in Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 cells by electroporation. By utilizing agroinfection system, leaves segments of Nicotiana tabacum var. Xanthi were transformed and used as propagles for regeneration of the firsts transformants. Th e confirmation of the genetic transformation was achieved by PCR with the genomic DNA extracted from of the selected clones, followed of a PCR reaction. The visualization of bands in the agarose gel electrophoresis showed that from the 19 clones with the p artial sequence cv1887 that were selected, 84% showed bands with approximate size of 2.642 bp, and from the 13 clones with the complete sequence CV1887 that were selected, 78% showed bands with approximate size of 4.155 bp. For the expression analysis, the following were selected: three transformed clones with partial sequence CV1887, two transformed clones with complete sequence CV1887, three clones transformed with the reporter gene gus, which encodes for the enzyme b - glucoronidase, and two control clone s of non - transformed plants. The RNA from the selected clones was used in a RT - PCR reaction for cDNA synthesis and amplification of the corresponding sequences. The products of the amplification were analyzed in an agarose gel electrophoresis, showing the presence of bands with 2.642 bp for the three clones transformed with partial sequence CV1887 and 1.812 bp for the three clones transformed with gus and it is confirmed the presence of these sequences in the transformed cells. It was not confirmed the pres ence in transformed clones, the complete sequence CV1887. / A transformação genética de plantas atualmente representa uma importante ferramenta para investigação da função de genes de diversas origens como plantas, fungos, vírus, nematóides e bactérias, sendo os de origem bacteriana os mais representativos. Dentro desse contexto, seqüências codificando para domínios contendo repetições YD (tirosina- ácido aspártico), que possuem similaridades com proteínas nematicidas, foram previamente detectadas no genoma de Chromobacterium violaceum estirpe ATCC 12472. Dentre essas seqüências, a ORF CV1887 (4.155 pb) foi selecionada para clonagem e expressão no sistema heterólogo, objetivando validar a atividade determinada in silico na anotação do genoma de C. violaceum. A estratégia experimental consistiu em clonar as seqüências completa (4.155 pb) e parcial (2.642 pb) da ORF CV1887 no vetor binário pBI121. Os vetores recombinantes foram introduzidos em células de Agrobacterium tumefaciens estirpe LBA4404, por eletroporação. Empregando-se o sistema de agroinfecção, segmentos foliares de Nicotiana tabacum var. Xanthi foram transformados e usados como propágulos para regeneração dos transformantes primários. A confirmação da transformação genética foi feita por reação da polimerase em cadeia (PCR), sendo usado como molde, o DNA genômico extraído de clones selecionados em meio de cultura contendo canamicina. Pela visualização das bandas no gel de agarose, dos 19 clones selecionados de CV1887 parcial, 84% apresentaram bandas no tamanho aproximado de 2.642 pb e dos 13 clones selecionados de CV1887 completo, 78% apresentaram bandas no tamanho aproximado de 4.155 pb. Para a análise da expressão, foram selecionados três clones transformados com a seqüência CV1887 parcial, dois clones transformados com a seqüência CV1887 completa, três clones transformados com o gene repórter gus, que codifica para a enzima β-glucoronidase, e dois clones de plantas controle não transformadas. O RNA extraído dos clones selecionados foi utilizado em uma reação de RT-PCR para a síntese do cDNA e amplificação das seqüências correspondentes. Os produtos da amplificação foram analisados por meio de eletroforese em gel de agarose, constatando-se a presença de bandas no tamanho aproximado de 2.642 pb para os três clones transformados com a seqüência CV1887 parcial e no tamanho de 1.812 pb para os três clones transformados com gus, confirmando-se a presença dessas seqüências nas células transformadas. Não foi confirmada a presença, nos clones transformados, da seqüência CV1887 completa.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / A transformaÃÃo genÃtica de plantas atualmente representa uma importante ferramenta para investigaÃÃo da funÃÃo de genes de diversas origens como plantas, fungos, vÃrus, nematÃides e bactÃrias, sendo os de origem bacteriana os mais representativos. Dentro desse contexto, seqÃÃncias codificando para domÃnios contendo repetiÃÃes YD (tirosina- Ãcido aspÃrtico), que possuem similaridades com proteÃnas nematicidas, foram previamente detectadas no genoma de Chromobacterium violaceum estirpe ATCC 12472. Dentre essas seqÃÃncias, a ORF CV1887 (4.155 pb) foi selecionada para clonagem e expressÃo no sistema heterÃlogo, objetivando validar a atividade determinada in silico na anotaÃÃo do genoma de C. violaceum. A estratÃgia experimental consistiu em clonar as seqÃÃncias completa (4.155 pb) e parcial (2.642 pb) da ORF CV1887 no vetor binÃrio pBI121. Os vetores recombinantes foram introduzidos em cÃlulas de Agrobacterium tumefaciens estirpe LBA4404, por eletroporaÃÃo. Empregando-se o sistema de agroinfecÃÃo, segmentos foliares de Nicotiana tabacum var. Xanthi foram transformados e usados como propÃgulos para regeneraÃÃo dos transformantes primÃrios. A confirmaÃÃo da transformaÃÃo genÃtica foi feita por reaÃÃo da polimerase em cadeia (PCR), sendo usado como molde, o DNA genÃmico extraÃdo de clones selecionados em meio de cultura contendo canamicina. Pela visualizaÃÃo das bandas no gel de agarose, dos 19 clones selecionados de CV1887 parcial, 84% apresentaram bandas no tamanho aproximado de 2.642 pb e dos 13 clones selecionados de CV1887 completo, 78% apresentaram bandas no tamanho aproximado de 4.155 pb. Para a anÃlise da expressÃo, foram selecionados trÃs clones transformados com a seqÃÃncia CV1887 parcial, dois clones transformados com a seqÃÃncia CV1887 completa, trÃs clones transformados com o gene repÃrter gus, que codifica para a enzima &#946;-glucoronidase, e dois clones de plantas controle nÃo transformadas. O RNA extraÃdo dos clones selecionados foi utilizado em uma reaÃÃo de RT-PCR para a sÃntese do cDNA e amplificaÃÃo das seqÃÃncias correspondentes. Os produtos da amplificaÃÃo foram analisados por meio de eletroforese em gel de agarose, constatando-se a presenÃa de bandas no tamanho aproximado de 2.642 pb para os trÃs clones transformados com a seqÃÃncia CV1887 parcial e no tamanho de 1.812 pb para os trÃs clones transformados com gus, confirmando-se a presenÃa dessas seqÃÃncias nas cÃlulas transformadas. NÃo foi confirmada a presenÃa, nos clones transformados, da seqÃÃncia CV1887 completa. / The genetic transformation of plants represents today an important tool to investigate the function of genes of diverse origins like plants, fungi, virus, nematodes and bacteria. Those that come from bacteria are the most representative ones. Within this context, sequences coding to domains containing YD (tyrosine - asparatate) repetitions, that have similarities with nematicide proteins, were detected in the Chromobacterium violaceum strain ATCC 12472 genome. Among these sequences, the ORF CV1887 (4.155 bp) was selected for cloning and expression in the heterologous system, in the attempt to validate its activity determined in silico in the C. violaceum genome's annotation. The experimental strategy consisted in cloning the complete (4.155 bp) and the partial sequence (2.642 bp) of the ORF in the binary vector pBI121. The recombinant vectors w ere introduced in Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 cells by electroporation. By utilizing agroinfection system, leaves segments of Nicotiana tabacum var. Xanthi were transformed and used as propagles for regeneration of the firsts transformants. Th e confirmation of the genetic transformation was achieved by PCR with the genomic DNA extracted from of the selected clones, followed of a PCR reaction. The visualization of bands in the agarose gel electrophoresis showed that from the 19 clones with the p artial sequence cv1887 that were selected, 84% showed bands with approximate size of 2.642 bp, and from the 13 clones with the complete sequence CV1887 that were selected, 78% showed bands with approximate size of 4.155 bp. For the expression analysis, the following were selected: three transformed clones with partial sequence CV1887, two transformed clones with complete sequence CV1887, three clones transformed with the reporter gene gus, which encodes for the enzyme b - glucoronidase, and two control clone s of non - transformed plants. The RNA from the selected clones was used in a RT - PCR reaction for cDNA synthesis and amplification of the corresponding sequences. The products of the amplification were analyzed in an agarose gel electrophoresis, showing the presence of bands with 2.642 bp for the three clones transformed with partial sequence CV1887 and 1.812 bp for the three clones transformed with gus and it is confirmed the presence of these sequences in the transformed cells. It was not confirmed the pres ence in transformed clones, the complete sequence CV1887.

Bei 85 Patienten (61 % Männer, 39 % Frauen, Altersmedian: 49 Jahre) nach Leber- (38), Herz- (34) und Lungentransplantation (13) wurde die orale Besiedlung mit Candida-Spezies und deren Biotypen sowie klinische Manifestationen einer Candidiasis bestimmt. Eine orale Candidiasis wurde bei 21/85 Patienten (24,7 %) diagnostiziert (pseudomembranöse Form: 15,3 %; erythematöse Form: 9,4 %; Cheilitis angularis: 3,5 %). Bei 63/85 Patienten (74,1%) wurden Candida spp. nachgewiesen. Von allen gefundenen Candida-Isolaten war C. albicans die am häufigsten isolierte Spezies (73 %), gefolgt von C. glabrata, C. krusei und C. famata (9,5 %; 6,3 %; 3,2 %). Außerdem wurden C. lusitaniae, C. guilliermondii, C. kefyr, C. magnoliae, Pichia ohmeri und C. dubliniensis, eine Spezies, die anfänglich nur bei HIV-positiven Individuen auftrat, identifiziert. Für C. albicans konnten sieben Biotypen nachgewiesen werden. Eine Korrelation der klinischen Manifestationen der Candidiasis und der identifizierten Spezies bzw. Biotypen konnte nicht gefunden werden. Während bei Patienten ohne Antimykotikatherapie neben C. albicans (87 %) nur drei verschiedene non-albicans-Spezies (C. glabrata: 8%; C. dubliniensis: 3 % und C. famata 3 %) identifiziert wurden, konnten bei Patienten mit Antimykotikatherapie sieben verschiedene non-albicans-Spezies nachgewiesen werden. C. albicans wurde nur noch zu 50 %, andere Spezies, wie C. krusei und C. glabrata, jedoch vermehrt identifiziert (C. krusei: 17 %; C. glabrata: 13 %; C. famata, C. guilliermondii, C. kefyr, C. lusitaniae C. magnoliae: 4 %). Die vorliegende Studie weist darauf hin, dass eine Dauertherapie bzw. notwendig verbreitete prophylaktische Gabe von Antimykotika (Amphotericin B; Fluconazol/Itraconazol) das Auftreten von non-albicans-Spezies fördert. Resistenzentwicklung und das Auftreten bisher apathogener Spezies und Biotypen spielen bei Patienten nach Organtransplantation eine bedeutende Rolle. / For evaluation of Candida carriage, oral swabs were taken from the tongue of 85 patients after liver- (38), heart- (34) and lung transplantation (13) (61 % men, 39 % women, median age: 49 years). Oral candidiasis was found in 21/85 patients (24,7 %) (pseudomembranous form: 15,3 %; erythematous form: 9,4 %; angular cheilitis: 3,5 %). Candida species were cultured in 63/85 patients (74,1 %). C. albicans was the most common isolate (73 %), followed by C. glabrata, C. krusei and C. famata (9,5 %; 6,3 %; 3,2 %). Other isolated species were C. lusitaniae, C. guilliermondii, C. kefyr, C. magnoliae, Pichia ohmeri and C. dubliniensis, the latter being a species first described in oral cavities of HIV-infected individuals. According to the API 20C AUX assimilation profiles seven different phenotypes were identified. No correlation was seen between clinical features and isolated species or biotypes. In patients without antimycotic therapy four different Candida species (C. albicans: 87 %; C. glabrata: 8 %; C. dubliniensis: 3 % and C. famata: 3 %) were identified, whereas, in patients with antifungal therapy eight different Candida species (C. famata, C. guilliermondii, C. kefyr, C. lusitaniae C. magnoliae: 4 %) were isolated. In only 50 % of the latter group C. albicans was detected, while C. glabrata in 17 % and C. krusei in 13 % were identified Long-term therapy and prophylaxis with antifungal agents (amphotericin B; fluconazole/itraconazole) to suppress fungal infections in immunosuppressed patients have contributed to a significant increase in non-albicans-infections because of the high incidence of resistance of the species to these drugs. On the other hand, risk of infection caused by less virulent species is increasing.

Malariakontrolle ist von Resistenzen gegen Malariamedikamente wie Chloroquin (CQ) und Artemisininderivaten (ART) bedroht. Hier untersuchten wir das Ausmaß dieser Resistenzen in Fünf Feldstudien in Nigeria, Ruanda und Südwestindien unter Beurteilung der Prävalenzen Arzneimittelresistenz-assoziierter Mutation der Plasmodium-Parasiten (P. falciparum: K13, dhps, dhfr, mdr1 und P. vivax: mdr1) z.T. in Korrelation mit klinischen Patientendaten und ex-vivo Überlebensraten (ÜLR) unter Zugabe von ART. K13 wurde in 360 zwischen 2010-2018 gesammelte ruandischen P. falciparum Isolaten genotypisiert. Erstmals fanden wir dort niedrige Frequenzen der mit ART-Resistenz assoziierten K13-Mutation. Jedoch lassen Mutation mit niedrigen ÜLR, sowie ein Isolat mit hohen ÜLR aber ohne K13-Mutation eines Patienten der die Infektion unter Therapie nicht eliminieren konnte, Fragen offen. Ca.100 indische P. falciparum und P. vivax Isolaten aus 2015 wurden auf Mutationen in P. falciparum Markern für die Resistenz gegen Sulfadoxin-Pyrimethamin (SP) (d.h. pfdhps/pfdhfr), Artesunat (AS) (d.h. K13) und Lumefantrin (d.h. pfmdr1) sowie P. vivax Marker für CQ-Resistenz (pvmdr1) untersucht. Der Großteil der Isolate zeigt Mutationen die SP-Resistenz hervorrufen, daher könnte die Effizienz der AS+SP-Therapie begrenzen sein. Außerdem eignet sich Lumefantrin nicht als alternatives Medikament auf Grund der beobachteten Dominanz des pfmdr1-Haplotyps „NFD“. Die Abwesenheit der pvmdr1-Mutation Y976F und erfolgreiche Behandlungen zeigen, die Wirksamkeit von CQ gegen vivax Malaria im Studiengebiet. Auch Isolate von nigerianischen Schwangeren mit asymptomatischer P. falciparum Infektion zeigten hohe Prävalenzen von pfdhfr/pfdhps Vier- und Fünffachmutanten darum ist die Wirksamkeit der präventiver Therapie Schwangerer mit SP in Nigeria ernsthaft gefährdet. Die Daten spiegeln die Häufigkeit der Resistenzen gegen Malariamittel in diesen Gebieten wieder mit großen Unterschieden zwischen Regionen und Medikamenten. / The spread of resistance to antimalarial drugs such as chloroquine (CQ) and artemisinins (ART) is a great threat to malaria control. Here, we investigated the extent of such resistance in Nigeria, Rwanda and south-western India. We assessed the prevalence of mutations in few Plasmodium parasites’ markers of resistance, namely P. falciparum genes K13 (ART), pfdhps/pfdhfr (sulfadoxine-pyrimethamine, SP) and pfmdr1 (lumefantrine) as well as P. vivax gene pvmdr1 (CQ) in 5 field studies conducted in 2010-2018, and partially correlated the results to patients’ clinical outcome. Few isolates from Rwanda, were also evaluated for their parasite ex vivo survival rates (SR) upon exposure to ART. We tracked ART resistance in Rwanda by genotyping K13 in 360 P. falciparum isolates from 2010-2018. We showed for the first time that K13 mutations associated with ART resistance are present here, thus in Africa, at a low frequency. However, mutations occurred in patients who recovered and/or had low SR. Of note, one patient with high SR but no K13 mutation was still parasitemic after ART treatment. Moreover, we assessed the presence of mutations in K13, pfdhps/pfdhfr, pfmdr1 and pvmdr1 in ca 100 P. falciparum and 100 P. vivax isolates from south-western India. Most of P. falciparum isolates carried pfdhfr/pfdhps mutations conferring SP resistance, menacing the efficacy of SP-ART treatment. Also, the high prevalence of pfmdr1 haplotype “NFD” advised against the introduction of lumefantrine. The low rates of P. vivax pvmdr1 Y976F and patients’ successful parasite clearance, indicated that CQ remains effective in the area. Finally, a high rate of pfdhfr/pfdhps quadruple and quintuple mutant was observed in Nigerian pregnant women with asymptomatic P. falciparum infection, hence the effectiveness of preventive treatment with SP in pregnancy might be threatened. The data reflected the abundance of antimalarials resistance in these areas with important differences between regions and drugs.

Influenzavirus (IV)-Infektionen der unteren Atemwege induzieren virale Pneumonien, die häufig in akutem Lungenversagen resultieren. Merkmale einer IV-induzierten Pneumonie sind Schädigungen des Alveolarepithels und eine Ansammlung von Ödemflüssigkeit im Alveolarraum, wodurch der Gasaustausch beeinträchtigt wird. In Abhängigkeit eines Natriumgradienten, aufgebaut durch die basolaterale Na,K-ATPase (NKA) und den apikalen epithelialen Natriumkanal (ENaC), wird unter normalen Bedingungen die Ödemflüssigkeit aus dem Alveolarraum entfernt. In Folge einer IV-Infektion werden verschiedene Membranionenkanäle dysreguliert und eine verringerte alveoläre Flüssigkeitsresorption (AFC) beobachtet. Eine IV-Infektion führt u.a. zu einer reduzierten NKA-Expression in nicht-infizierten Nachbarzellen, sowie zu einer Dislokation der NKA zur apikalen Zellmembran in infizierten Zellen. Co-Immunopräzipitationsstudien identifizierten das virale M2-Protein als NKA-Bindepartner. Mittels Mutationsanalyse konnten drei Aminosäuren im zytoplasmatischen Teil von M2 als kritisch für die NKA-Bindung identifiziert werden. Rekombinante IV mit gestörter NKA Bindung zeigten im Vergleich zu IV WT in polarisierten Calu 3 Zellen in vitro sowie in Mäusen in vivo eine verbesserte AFC. Eine mutationsbedingte Glykosylierung des M2-Proteins führte jedoch unerwartet zu einer verstärkten Immunantwort in vivo, die trotz verbesserter AFC zu einem schwereren Krankheitsverlauf führte. Grund dafür könnte eine Aktivierung der Unfolded Protein Response aufgrund der Glykosylierung sein. Die Erkenntnis, dass M2 ein wichtiger Modulator in der Regulation der alveolären Flüssigkeitshomöostase ist, könnte dennoch helfen, neue therapeutische Ansätze für IV-induzierte Pneumonien zu definieren. Darüber hinaus unterstreicht es die Relevanz einer in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Surfactome-Analyse zur Identifizierung neuer potentieller Angriffspunkte an der Zelloberfläche IV-infizierter Zellen, die in der antiviralen Therapie von Bedeutung sein könnten. / Influenza Virus (IV) infections of the lower respiratory tract can induce viral pneumonia resulting in acute lung injury (ALI/ARDS) with fatal outcome. Characteristics of an IV-induced pneumonia are alveolar epithelial cell (AEC) damage and accumulation of protein-rich edema fluid in the alveolar compartment impairing gas exchange. Depending on a sodium gradient established by the basolateral Na,K-ATPase (NKA) and the apical epithelial sodium channel (ENaC) edema fluid is removed from the alveolar space under normal conditions. However, after IV-infection various ion channels are dysregulated and reduced alveolar fluid clearance (AFC) is observed. An IV-infection leads to a reduced NKA expression in the non-infected neighbouring cells and to a mistargeting of the NKA to the apical cell membrane in IV-infected cells. Co immunoprecipitation (co-IP) studies identified the viral M2 protein as NKA binding partner and mutational analysis presented three amino acids in the cytoplasmic tail of M2 directly abutting the transmembrane domain as critical for NKA binding. A recombinant IV mutant with disrupted NKA binding showed in comparison to IV WT an increased fluid transport in polarized Calu 3 cells in vitro as well as in mice in vivo. However, mutation-induced glycosylation of the M2 protein unexpectedly led to an enhanced immune response in vivo, resulting in a more severe disease course despite improved AFC. The reason for this could be an activation of the unfolded protein response by the glycosylation of M2. Nevertheless, the finding that M2 appears to be an important modulator in the regulation of alveolar fluid homeostasis might provide new potential approaches for therapeutics of an IV induced pneumonia. Moreover, it highlights the relevance of a surfactome analysis performed in the present work to identify novel potential targets on the cell surface of IV-infected cells which could play an important role in antiviral therapy.